Summary
Presentamos un protocolo para determinar la quiralidad multicelular in vitro, utilizando la técnica de micropatronaje. Este ensayo permite la cuantificación automática de los sesgos izquierda-derecha de varios tipos de células y se puede utilizar con fines de detección.
Abstract
La quiralidad es una propiedad celular intrínseca, que representa la asimetría en términos de polarización a lo largo del eje izquierda-derecha de la célula. Como esta propiedad única atrae cada vez más atención debido a sus importantes funciones tanto en el desarrollo como en la enfermedad, un método de cuantificación estandarizado para caracterizar la quiralidad celular avanzaría en la investigación y las aplicaciones potenciales. En este protocolo, describimos un ensayo de caracterización de quiralidad multicelular que utiliza matrices de células con micropatrones. Los micropatrones celulares se fabrican en portaobjetos de vidrio recubiertos de titanio / oro a través de la impresión de microcontacto. Después de la siembra en las islas geométricamente definidas (por ejemplo, en forma de anillo) recubiertas de proteínas, las células migran direccionalmente y forman una alineación sesgada hacia la dirección en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj, que puede analizarse y cuantificarse automáticamente mediante un programa MATLAB escrito a medida. Aquí describimos en detalle la fabricación de sustratos micropatronados, la siembra celular, la recopilación de imágenes y el análisis de datos y mostramos resultados representativos obtenidos utilizando las células NIH/3T3. Este protocolo ha sido validado previamente en múltiples estudios publicados y es una herramienta eficiente y fiable para estudiar la quiralidad celular in vitro.
Introduction
La asimetría izquierda-derecha (LR) de la célula, también conocida como mano celular o quiralidad, describe la polaridad celular en el eje LR y se reconoce que es una propiedad biofísica fundamental y conservada 1,2,3,4,5. La quiralidad celular se ha observado tanto in vivo como in vitro a múltiples escalas. Hallazgos previos revelaron remolinos quirales de citoesqueleto de actina en células individuales sembradas en islas circulares6, migración sesgada y alineación de células dentro de límites confinados 7,8,9,10,11 y bucle asimétrico del tubo de calor de pollo 12.
A nivel multicelular, la quiralidad celular se puede determinar a partir de la migración o alineación direccional, la rotación celular, la dinámica citoesquelética y el posicionamiento de orgánuloscelulares 7,8,9,10,11,12,13. Hemos establecido un ensayo basado en micropatrones14 para caracterizar eficientemente el sesgo quiral de las células adherentes 7,8,9,10. Con los micropatrones en forma de anillo confinando geométricamente los grupos celulares, las células exhiben colectivamente migración direccional y alineación sesgada. Se desarrolló un programa MATLAB para detectar y medir automáticamente la alineación celular en imágenes de contraste de fase del anillo. La dirección de la alineación celular local se cuantifica con un ángulo sesgado, dependiendo de su desviación de la dirección circunferencial. Después del análisis estadístico, el patrón de anillo de las células se designa como sesgos en sentido contrario a las agujas del reloj (CCW) o sesgos en el sentido de las agujas del reloj (CW).
Este ensayo se ha utilizado para caracterizar la quiralidad de fenotipos celulares múltiples (Tabla 1), y se ha encontrado que la asimetría LR de las células es específica del fenotipo 7,11,15. Además, la interrupción de la dinámica y la morfología de la actina puede resultar en una reversión del sesgo quiral 7,8, y el estrés oxidativo también puede alterar la quiralidad celular9. Debido a la simplicidad del procedimiento y la robustez del enfoque 7,8,9,10, este ensayo de quiralidad 2D proporciona una herramienta eficiente y confiable para determinar y estudiar la quiralidad multicelular in vitro.
El propósito de este protocolo es demostrar el uso de este método para caracterizar la quiralidad celular. Este protocolo describe cómo fabricar matrices celulares con patrones a través de la técnica de impresión de microcontacto y realizar análisis de quiralidad de forma automatizada utilizando el programa MATLAB.
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Protocol
1. Fabricación de sellos de polidimetilsiloxano (PDMS)16
- Dibuje una matriz de anillos a microescala utilizando software CAD, con un diámetro interior de 250 μm y un diámetro exterior de 450 μm. El patrón utilizado en este protocolo es una matriz de 10 x 10 con una distancia de 850 μm entre anillos.
- Imprima una máscara de transparencia del patrón a la resolución deseada utilizando el servicio de impresión de máscaras de una empresa de microfabricación (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Se ha demostrado que las dimensiones proporcionadas del anillo funcionan para muchos tipos de células7. - Realice fotolitografía ultravioleta (UV) utilizando la máscara que contiene las características deseadas para hacer un molde fotorresistente negativo (como SU-8)8.
- Cubra una oblea de silicio recubierta con fotorresistente por la máscara de transparencia fabricada en los pasos 1.1-1.2.
- En un alineador de contacto UV, polimerice la fotorresistente bajo regiones transparentes de la máscara mediante luz UV.
NOTA: Después de un mayor lavado y desarrollo, el molde maestro con las características deseadas se fabrica8. Los detalles operativos dependen del equipo específico utilizado.
- Prepare los prepolímeros elastoméricos PDMS mezclándolos con su agente de curado en una proporción de 10: 1 y luego vierta la mezcla sobre el molde en una placa de Petri.
- Coloque el plato en una cámara de vacío durante 30 minutos para eliminar las burbujas de aire en PDMS y hornee en un horno a 60 ° C durante al menos 2 h.
- Después de completar el curado de PDMS, corte las matrices de patrones en sellos.
NOTA: Se pueden preferir sellos más gruesos (aproximadamente 1 cm) debido a la facilidad de manejo en los pasos posteriores de la impresión de microcontactos.
2. Revestimiento de portaobjetos de vidrio
- Limpie los portaobjetos de vidrio. Remoje los portaobjetos en un baño de etanol al 100%, sonice durante 5 minutos y luego enjuague con agua.
- Repita este paso primero con acetona, luego con isopropanol, seguido de secado en una corriente de nitrógeno.
- Utilice un equipo de evaporación de haz de electrones (haz E) para recubrir capas de titanio y oro en portaobjetos de vidrio.
NOTA: Para la capa de titanio, el espesor deseado es de 15 Å (1 Å = 10-10 m). Para la capa de oro, el espesor deseado es de 150 Å. Cubra el titanio primero y luego el oro, ya que la capa de titanio sirve como adhesivo entre el oro y el portaobjetos de vidrio. - Coloque los portaobjetos limpios en la cámara de evaporación e inserte crisoles de oro y titanio debajo de las persianas.
- Bombee por la cámara para crear un vacío inferior a 10-5 Pa antes de fundir los metales. Enfoca el haz de electrones en el metal y ajusta la potencia para que la tasa de depósito sea apropiada para controlar el espesor de la deposición.
- Abra el obturador para iniciar la deposición de metal. Cierre el obturador cuando se alcance el grosor deseado.
- Cambie los crisoles entre la evaporación secuencial de dos metales.
- Espere a que los crisoles se enfríen según lo requiera el equipo, ventile la cámara y saque los portaobjetos de vidrio recubiertos de oro.
- Bombee de nuevo por la cámara para el mantenimiento del equipo.
NOTA: Los detalles operativos pueden depender de un evaporador de haz E específico. Tener una tasa de depósito de titanio bien controlada y baja es importante. Una gruesa capa de titanio a menudo conduce a una mala visibilidad, especialmente para las imágenes de fluorescencia de las células. Después del recubrimiento, los portaobjetos de vidrio recubiertos de titanio / oro se pueden almacenar en una cámara de vacío seca a temperatura ambiente durante al menos 1 mes.
3. Impresión de microcontactos
- Corte la diapositiva recubierta de titanio / oro en trozos más pequeños, si lo desea. Se recomienda una forma cuadrada de 12 mm x 12 mm para una aplicación típica (Figura 1B).
- Use un cortador de vidrio para deslizarse a través de la superficie para dejar una pista abollada, luego sostenga el portaobjetos de vidrio a ambos lados y doble en la abolladura para romperse en cuartos pequeños. Evite tocar la superficie recubierta de oro.
NOTA: Para determinar visualmente qué lado del vidrio es la superficie recubierta en caso de vuelco accidental, compare el reflejo de la luz en ambos lados. La superficie cubierta de oro mostrará un reflejo más brillante, mientras que el lado no recubierto tendrá un reflejo más tenue (de la capa de titanio en el otro lado del vidrio). Una forma alternativa es observar los bordes de la diapositiva, y el lado del recubrimiento se puede determinar a partir de la superficie de corte vertical. - Limpie los portaobjetos remojando en etanol al 100% en una placa de Petri con el lado dorado hacia arriba en un agitador orbital durante al menos 10 minutos. Aspire el etanol, luego seque cada diapositiva soplando con una corriente de nitrógeno.
- Limpie los sellos PDMS con agua jabonosa y luego 100% etanol. Secar los sellos con gas nitrógeno.
- Preparar 2 mM de solución de octadecanetiol (C18) disolviendo 5,74 mg de polvo de C18 en 10 ml de etanol al 100%.
NOTA: Selle y almacene la solución C18 a temperatura ambiente. Los patrones de impresión con C18 crean una monocapa adhesiva autoensamblada para la cual la fibronectina y las células se unirán preferentemente. - Remoje los sellos PDMS en solución C18 con la superficie estampada hacia abajo durante 10 s y seque suavemente con gas nitrógeno durante 60 s.
NOTA: Al secarse, coloque la corriente lejos del sello primero (aproximadamente 1 m) hasta que la mayor parte del líquido se evapore y luego mueva lentamente la corriente más cerca para secar completamente el sello. Esto es para evitar que la solución C18 se sople en lugar de secarse en el sello. - Coloque el sello boca abajo en las diapositivas de oro durante 60 s antes de retirarlo.
- Para garantizar un estampado adecuado, toque suavemente las pinzas en los sellos para transferir correctamente los patrones. No empuje hacia abajo con demasiada fuerza, y el peso de las pinzas suele ser suficiente.
NOTA: La inspección visual del sello durante el golpeteo asegurará que el sello y la corredera de vidrio hayan hecho contacto de manera uniforme. - Prepare cámaras de humedad.
- Pipete 1 ml de etanol al 70% en una tapa de placa de Petri invertida y coloque un trozo de parafilm para cubrir la superficie (cubierta boca arriba).
- Use pinzas para levantar, coloque la parapelícula para asegurarse de que no haya burbujas de aire y elimine el exceso de etanol si es necesario.
- Preparar solución 2 mM HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3): Diluir 5 μL de solución madre en 5 mL de etanol al 100%.
NOTA: La solución diluida de EG3 se puede sellar y almacenar a 4 °C, y el caldo de EG3 sin diluir debe almacenarse a -20 °C. El tratamiento EG3 se utiliza para hacer que la región de vidrio sin C18 no sea adhesiva a las células. - Micropipette 40 μL gotas de EG3 por cada cuarto de vidrio se deslizan sobre la parapelícula en la cámara de humedad, dejando suficiente espacio entre las gotas para tener en cuenta el espaciado de las diapositivas de oro.
- Use pinzas para colocar las diapositivas de oro impresas en C18 boca abajo sobre las gotas y asegúrese de que no haya burbujas debajo de las diapositivas. Empuje suavemente las diapositivas juntas sin levantarlas para minimizar la evaporación.
NOTA: Coloque un borde de las diapositivas de vidrio hacia abajo cerca de la gota y luego baje lentamente el otro extremo del deslizamiento de vidrio hacia abajo. Si hay una burbuja presente, empuje el tobogán de oro sin levantarlo hasta que la burbuja ya no esté presente. - Selle bien la placa de Petri con parafilm y déjela a temperatura ambiente durante al menos 3 h.
NOTA: Si se desea una incubación extensa, selle dos veces la placa de Petri y déjela hasta 24 h. - En un gabinete de bioseguridad, coloque los portaobjetos de oro boca arriba en una placa de Petri, remoje y enjuague 3 veces en etanol al 70% para eliminar EG3, luego deje en etanol durante 10 minutos para la esterilización.
- Aspire el etanol y reemplácelo con PBS estéril.
- Prepare otra cámara de humedad como se describe en el paso 3.9, con PBS en lugar de etanol.
NOTA: Debido a la diferencia en la tensión superficial, es más fácil agregar primero 4-5 ml de PBS para colocar la parapelícula y eliminar las burbujas, luego aspirar el exceso. - Prepare la solución de fibronectina de 50 μg/ml (otras proteínas, si se desea) en PBS estéril y las gotas de micropipeta de 50 μL de solución de fibronectina para cada cuarto se deslizan sobre la parapelícula, dejando algo de espacio entre las gotas.
NOTA: El recubrimiento de fibronectina facilita la adhesión celular a las superficies modeladas. - Use pinzas de oblea para colocar las diapositivas boca abajo sobre las gotas y asegúrese de que no haya burbujas debajo de las diapositivas. Empuje suavemente las diapositivas juntas sin levantarlas.
NOTA: Se recomiendan pinzas deslizantes de vidrio o pinzas de oblea con puntas anchas rectas para manipular las diapositivas. - Deje la placa de Petri en el gabinete de bioseguridad durante 30 min.
- Después de 30 minutos, coloque los toboganes dorados boca arriba en PBS después de enjuagar 3 veces.
NOTA: Las diapositivas con patrón de fibronectina se pueden almacenar en PBS a 4 ° C durante aproximadamente un mes.
4. Siembra de células en portaobjetos con micropatrones
- Calentar los medios de cultivo celular y la tripsina en un baño de agua a 37 °C.
NOTA: La siguiente descripción del subcultivo es para las células NIH/3T3. Las condiciones de cultivo pueden variar según los tipos de células. - (Opcional) Remoje los portaobjetos estampados en medios de cultivo en una placa de 12 pocillos, caliente hasta 37 ° C en una incubadora antes de la tripsinización de las células para una mejor unión celular.
- Tripsinizar las células, neutralizar con medios que contengan FBS, centrifugar a 100 x g durante 3 min, y luego resuspendir mezclando bien con medios frescos.
NOTA: Asegúrese de que las células estén completamente disociadas entre sí. - Cuente las células, diluya a 200,000 células / ml y agregue 0.5 ml de la suspensión celular a cada pozo que contenga un portaobjetos de oro.
- Agite suavemente la placa del pozo varias veces para una siembra celular uniforme y guárdela en una incubadora durante 15 minutos para permitir la unión de la célula.
- Después de 15 minutos, verifique la unión celular bajo un microscopio. Permita tiempo adicional, si es necesario.
NOTA: Las células adheridas se extenderán sobre la superficie con filopodio visible o aplanamiento y no se moverán de la superficie cuando la placa del pozo se golpee o mueva suavemente. - Aspire los medios que contienen células no unidas de cada pozo y agregue 1 ml de medios de cultivo. Para el tratamiento farmacológico, complemente reactivos adicionales a los medios de cultivo en este paso.
- Cultive las células en la incubadora durante 24 h y compruebe la confluencia para determinar si se ha formado quiralidad.
NOTA: Se recomienda una confluencia superior al 75% para la mayoría de los tipos de células, y la sobreconfluencia puede afectar la caracterización de la quiralidad.
5. Colección de imágenes
- Fijar las células en caso de confluencia.
- Retire los medios de cultivo de la placa del pozo y enjuague una vez con PBS.
- Agregue una solución de paraformaldehído al 4%, incube a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego enjuague 3 veces con PBS.
NOTA: Si la fijación cambia significativamente la morfología celular, se recomienda la obtención de imágenes antes de la fijación
- Use un microscopio de contraste de fase con funcionalidad de cámara, imagine cada anillo en las diapositivas a alta resolución (la lente del objeto 10x es suficiente para el análisis).
6. Caracterización de la quiralidad celular (Figura 2)
- Descargue los archivos de código de MATLAB para la caracterización de la quiralidad desde los archivos complementarios (Archivo complementario 1).
NOTA: Se ha probado que el código funciona con MATLAB_R2015b y versiones posteriores en sistemas Windows y macOS. La caja de herramientas de estadísticas circulares también es necesaria para ejecutar los archivos, que se pueden encontrar en la referencia17. - Agregue la carpeta de código y las subcarpetas (con la caja de herramientas de estadísticas circulares dentro) a la ruta de MATLAB y abra el archivo "ROI_selection.m". En la línea 4, cambie el directorio a la carpeta de datos deseada (para los usuarios de ventanas, cambie "/" a "\" en las líneas 4 y 5).
- Cambie el tamaño de la imagen en la línea 14, con las dos primeras figuras representando el tamaño del círculo interior del anillo, mientras que las otras dos representan el exterior.
NOTA: Asegúrese de que los tamaños de todas las imágenes de una carpeta que se va a analizar son idénticos. - Haga clic en el botón Ejecutar para ejecutar el código de MATLAB "ROI_selection.m." para determinar la región de interés (ROI) en las imágenes de contraste de fase.
- Arrastre manualmente el cuadrado de selección para que se ajuste al anillo, luego haga doble clic en la imagen para confirmar la selección.
- Repita este paso para cada imagen de la carpeta (la siguiente imagen aparecerá automáticamente después de confirmar la selección de ROI de una imagen anterior); se generará un archivo ".mat" para almacenar la información de ROI de cada imagen.
- Abra el archivo "Analysis_batch.m" y cambie el directorio de la carpeta igual que el paso 6.2. (Para los usuarios de ventanas, para el primer uso, cambie "/" a "\" en las líneas 5, 6, 124 y 130)
- Haga clic en el botón Ejecutar para ejecutar el código "Analysis_batch.m." para determinar la quiralidad de múltiples patrones de anillos celulares. Se generará un archivo "datatoexcel.txt", que contiene estadísticas circulares para cada anillo, así como los números de los anillos en el sentido de las agujas del reloj, no quirales y en sentido contrario a las agujas del reloj.
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Representative Results
Quince minutos después de la siembra de células NIH/3T3, la adhesión celular en el patrón de anillo se confirmó visualmente mediante imágenes de contraste de fase. Después del cultivo posterior de 24 h, las células en los patrones se volvieron confluentes y alargadas con alineaciones claramente asimétricas, sesgadas hacia la dirección de las agujas del reloj (Figura 2). La migración direccional de las células unidas se registra mediante imágenes de lapso de tiempo, la motilidad celular y la morfogénesis se pueden cuantificar con análisis adicionales del video. Para realizar el análisis de quiralidad, se toman imágenes de contraste de fase de alta resolución después de la fijación (Figura 2A-C) y se introducen en el programa MATLAB. El programa detecta gradientes de intensidad y calcula las direcciones de alineación celular correspondientes en el anillo. Luego, la quiralidad celular se determina en función de las estadísticas circulares de alineación celular que se desvía de la dirección circunferencial de los anillos. Por lo tanto, las celdas pueden designarse en el sentido de las agujas del reloj (CW), en sentido contrario a las agujas del reloj (CCW) o no quirales (NC) (Figura 2D). Después del procesamiento, el análisis mostró que la mayoría de los anillos tienen un sesgo CW dominante, lo que indica que las células 3T3 tienen una fuerte quiralidad CW. Las estadísticas circulares generadas también proporcionan información adicional de ángulos sesgados para análisis adicionales si es necesario (Figura 2E).
La quiralidad celular depende de su fenotipo. Se ha verificado que el ensayo de quiralidad en anillo es compatible con múltiples tipos de células 7,8,9,10, incluidas las líneas celulares y las células primarias, como fibroblastos, mioblastos, células endoteliales y células madre (Tabla 1). Curiosamente, debido a que la quiralidad celular se origina a partir de las funcionalidades del citoesqueleto de actina, las alteraciones en la dinámica de la actina pueden afectar el sesgo quiral de las células. Con células C2C12 de mioblastos de ratón, encontramos que al interrumpir la polimerización de actina con el tratamiento con Latrunculina A de 50 nM, las células exhibieron una alteración del sesgo quiral ccW en CW (Figura 3A). Además, las células endoteliales vasculares umbilicales humanas (hUVECs) tratadas con un fármaco de molécula pequeña, 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), para activar la proteína quinasa c mostraron un cambio dependiente de la dosis de quiralidad celular de CW a CCW (Figura 3B). Estos hallazgos demuestran la utilidad del ensayo de quiralidad de patrón de anillo desarrollado experimentalmente, así como la sensibilidad de este ensayo a las alteraciones en el citoesqueleto.
Figura 1. Esquema del micropatronaje celular. (A) Procedimiento de microfabricación e impresión de microcontacto para el modelado celular. Se hizo un molde fotorresistente negativo mediante reticulación ultravioleta (UV) de fotorresistencia a través de una máscara que contenía características de micropatronaje (1-2). Los prepolímeros elastoméricos de polidimetilsiloxano (PDMS) se fundieron sobre el molde para crear sellos (3-4). Luego, se recubrió una monocapa de autoensamblaje adhesivo (SAM), octa-decanetiol (C18), en el sello y se transfirió a portaobjetos de vidrio recubiertos de oro a través de la impresión de microcontacto (5-7), seguido de un recubrimiento de SAM no adhesivo con terminación de etilenglicol, HS-(CH2)11-EG 3 (EG3) (8) y fibronectina (9). Luego se sembraron células para adherirse a los patrones (10). (B) Las fotos demuestran los pasos clave del micropatronaje celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Flujo de trabajo de análisis de imágenes. (A) Colección de imágenes. Adquiere imágenes de contraste de fase de cada anillo. (B) Introduzca datos en el programa MATLAB ejecutando el directorio de configuración de archivos "ROI_Selection.m" y el tamaño de la imagen. (C) Seleccione las regiones de interés (ROI) arrastrando el cuadrado de selección para que se ajuste al anillo celular y haga doble clic para confirmar. (D) Determine la alineación celular y los sesgos quirales ejecutando el archivo "Analysis_Batch.m". (E) Resultados de ejemplo con un resumen de números de anillo sesgados y estadísticas circulares para cada anillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Resultados representativos de la quiralidad de las células bajo tratamiento farmacológico. (A) Imágenes de contraste de fase y resultados de caracterización de quiralidad de células C2C12 de mioblasto de ratón: Grupos tratados con control (izquierda) y 50 nM de Latrunculina A (derecha). La fuente roja en negrita indica quiralidad dominante en p < 0.05 por prueba de rango. Barras de escala: 100 μm. (B) Imágenes de contraste de fase y resultados de caracterización de quiralidad de células endoteliales vasculares umbilicales humanas (hUVEC) en anillos micropatronados: Control (izquierda) y 30 nM TPA grupos tratados (derecha). La fuente roja en negrita indica quiralidad dominante en p < 0.05 por prueba de rango. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| CW Sesgado | CCW Sesgado |
| · Células NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) | · C2C12 (ATCC CRL-1772) |
| · Células MC3T3-E1 (ATCC CRL-2593) | · Células del músculo esquelético humano (Lonza CC-2661) |
| · Fibroblastos cardíacos de rata | · Una línea de fibroblastos de cáncer de piel humana (ATCC CRL-7762) |
| · Fibroblastos de piel primaria humana (ATCC PCS-201-012) | · Células epiteliales del riñón canino madin-Darby (ATCC CCL-34) |
| · Células madre humanas derivadas de tejido adiposo | |
| · Células madre mesenquimales humanas | |
| · Células endoteliales vasculares umbilicales humanas (Lonza CC-2935) | |
| · Células endoteliales microvasculares del cerebro humano (Sistemas celulares ACBRI-376) |
Tabla 1. Sesgos quirales de diferentes tipos de células caracterizados por el ensayo de micropatrones. CW: en el sentido de las agujas del reloj; CCW: en sentido contrario a las agujas del reloj.
Archivo complementario 1: Archivos de código de MATLAB para la caracterización de la quiralidad. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivos de codificación suplementarios. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El ensayo de patrones en forma de anillo descrito aquí proporciona una herramienta fácil de usar para la caracterización cuantitativa de la quiralidad multicelular, capaz de producir resultados altamente confiables y repetibles. La rápida generación de microambientes definidos idénticos y el análisis imparcial permiten el procesamiento automatizado de alto rendimiento de muestras de gran tamaño. Este protocolo discute la fabricación de los micropatrones de anillo, el modelado celular y el análisis automático de la alineación celular sesgada y el movimiento direccional. Este método es compatible con técnicas de imagen en vivo para estudiar la motilidad celular y la morfogénesis quiral y puede integrarse potencialmente en otras formas de plan para la detección de toxicidad 9 o aplicacionesde detección de drogas.
Hay algunos consejos adicionales para compartir. Primero, en el paso de impresión de microcontacto, el sello debe hacerse en el lado dorado del vidrio (puede ser difícil de distinguir después de que el sustrato se corta en pedazos), y se debe evitar la doble impresión. En segundo lugar, para las células que requieren otras proteínas para una unión adecuada, las proteínas preferidas se pueden usar en el paso 3.17. En tercer lugar, para el cultivo celular, la densidad celular no debe ser demasiado alta, y las células no deben crecer sobreconfluencia en los patrones. De lo contrario, las células podrían romper el límite interno y llenar el anillo en un círculo sólido. Cuarto, si los patrones celulares se rompen o están incompletos después de la siembra, puede deberse a una transferencia incompleta del patrón de C18 durante la impresión por contacto (pasos 3.7-3.8). Los sellos PDMS deben examinarse en busca de defectos. Aplicar una fuerza ligeramente mayor al estampar en diapositivas también puede ser útil. Finalmente, si las células se adhieren a toda la superficie del portaobjetos de vidrio sin patrones visibles, la fuerza aplicada en el paso 3.8 puede ser demasiado alta, lo que resulta en que toda la superficie se estampe con C18. También es posible que las diapositivas estén defectuosas o se hayan almacenado en PBS durante demasiado tiempo. Los patrones de monocapas de autoensamblaje (es decir, C18 y EG3) deben usarse dentro de un mes después de la impresión.
Aunque el ensayo propuesto proporciona una herramienta conveniente para la caracterización robusta de la quiralidad, existen algunas limitaciones. En primer lugar, el ensayo de patrones solo es compatible con células adherentes. La quiralidad de las células no adherentes, como las células tumorales circulantes, los adipocitos o las células no mamíferas, podría analizarse utilizando el método bicapa 3D Matrigel18,19. En segundo lugar, para los tipos de células que tienen una forma de adoquín natural y no muestran un alargamiento significativo, la precisión del análisis podría disminuir. Sin embargo, la quiralidad de estos tipos celulares se puede caracterizar mediante la realización de imágenes en vivo y el seguimiento del sesgo de migración7. Finalmente, el ensayo de micropatronaje es un método de análisis de punto final, no destinado al cultivo celular a largo plazo. Los experimentos como el tratamiento farmacológico no deben exceder las 72 h después de la siembra en patrones. Para aplicaciones que requieren un tiempo de tratamiento prolongado, considere la posibilidad de pretratar las células antes de la siembra.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (OD/NICHD DP2HD083961 y NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan es un Pew Scholar en Ciencias Biomédicas (PEW 00026185), apoyado por Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang cuenta con el apoyo de la American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
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