Summary
Представлен протокол определения многоклеточной хиральности in vitro с использованием методики микроструктурирования. Этот анализ позволяет автоматически количественно определять смещения влево-вправо различных типов клеток и может использоваться для целей скрининга.
Abstract
Хиральность — это внутреннее клеточное свойство, которое изображает асимметрию с точки зрения поляризации вдоль лево-правой оси клетки. Поскольку это уникальное свойство привлекает все большее внимание из-за его важной роли как в развитии, так и в заболевании, стандартизированный метод количественной оценки для характеристики хиральности клеток будет способствовать исследованиям и потенциальным приложениям. В этом протоколе мы описываем многоклеточный анализ характеристик хиральности, который использует микроструктурированные массивы клеток. Сотовые микрошарики изготавливаются на стеклянных слайдах с титановым/золотым покрытием с помощью микроконтактной печати. После посева на геометрически определенных (например, кольцеобразных) островах, покрытых белком, клетки направленно мигрируют и образуют смещенное выравнивание в сторону либо по часовой стрелке, либо против часовой стрелки, которое может быть автоматически проанализировано и количественно определено с помощью специально написанной программы MATLAB. Здесь мы подробно описываем изготовление микроструктурированных субстратов, посев клеток, сбор изображений и анализ данных и показываем репрезентативные результаты, полученные с использованием клеток NIH/3T3. Этот протокол ранее был подтвержден в нескольких опубликованных исследованиях и является эффективным и надежным инструментом для изучения хиральности клеток in vitro.
Introduction
Лево-правая (LR) асимметрия клетки, также известная как клеточная рука или хиральность, описывает полярность клетки в оси LR и признается фундаментальным, сохраненным, биофизическим свойством 1,2,3,4,5. Хиральность клеток наблюдалась как in vivo, так и in vitro в нескольких масштабах. Предыдущие результаты показали хиральное закручивание актинового цитоскелета в одиночных клетках, посеянных на круглых островах6, смещенную миграцию и выравнивание клеток в пределах ограниченных границ 7,8,9,10,11 и асимметричное зацикливание куриной тепловой трубки 12.
На многоклеточном уровне хиральность клеток может быть определена по направленной миграции или выравниванию, клеточному вращению, динамике цитоскелета и позиционированию органелл клеток 7,8,9,10,11,12,13. Мы создали анализ14 на основе микроструктурирования для эффективной характеристики хирального смещения адгезивных клеток 7,8,9,10. С кольцеобразными микроструктурами, геометрически ограничивающими кластеры клеток, клетки в совокупности демонстрируют направленную миграцию и смещенное выравнивание. Была разработана программа MATLAB для автоматического обнаружения и измерения выравнивания клеток на фазоконтрастных изображениях кольца. Направление локального выравнивания ячейки количественно определяется с углом смещения в зависимости от его отклонения от окружного направления. После статистического анализа кольцевая картина клеток обозначается либо как смещения против часовой стрелки (CCW), либо как смещения по часовой стрелке (CW).
Этот анализ был использован для характеристики хиральности нескольких клеточных фенотипов (таблица 1), и было обнаружено, что асимметрия клеток LR является фенотип-специфической 7,11,15. Более того, нарушение динамики и морфологии актина может привести к обращению вспять хирального смещения 7,8, а окислительный стресс может также изменить хиральность клеток9. Из-за простоты процедуры и надежности подхода 7,8,9,10, этот 2D-анализ хиральности обеспечивает эффективный и надежный инструмент для определения и изучения многоклеточной хиральности in vitro.
Целью данного протокола является демонстрация использования данного метода для характеристики хиральности клеток. Этот протокол описывает, как изготавливать узорчатые сотовые массивы с помощью метода микроконтактной печати и проводить анализ хиральности автоматическим способом с помощью программы MATLAB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление марок полидиметилсилоксана (PDMS)16
- Нарисуйте массив микромасштабных колец с помощью программного обеспечения CAD с внутренним диаметром 250 мкм и внешним диаметром 450 мкм. Шаблон, используемый в этом протоколе, представляет собой массив 10 x 10 с расстоянием между кольцами 850 мкм.
- Распечатайте маску прозрачности узора в нужном разрешении с помощью сервиса печати масок компании микрофабрикации (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Было доказано, что предоставленные размеры кольца работают для многих типов клеток7. - Проводят ультрафиолетовую (УФ) фотолитографию с помощью маски, содержащей желаемые признаки, чтобы сделать отрицательный фоторезист формы (например, СУ-8)8.
- Накройте силиконовую пластину, покрытую фоторезистом, прозрачной маской, изготовленной на этапах 1.1-1.2.
- На УФ-контактном элайнере полимеризуйте фоторезист под прозрачными областями маски ультрафиолетовым светом.
ПРИМЕЧАНИЕ: После дальнейшей стирки и разработки изготавливается мастер-форма с желаемыми характеристиками8. Эксплуатационные детали зависят от конкретного используемого оборудования.
- Приготовьте эластомерные преполимеры PDMS, смешав с его отверждающим агентом в соотношении 10:1, а затем отлил смесь на форму в чашке Петри.
- Поместите посуду в вакуумную камеру на 30 мин для удаления пузырьков воздуха в PDMS и выпекайте в духовке при 60 °C в течение не менее 2 ч.
- После полного отверждения PDMS вырежьте массивы узоров на штампы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстые штампы (около 1 см) могут быть предпочтительными из-за простоты обращения на более поздних этапах микроконтактной печати.
2. Покрытие стеклянных горок
- Очистите стеклянные горки. Замочите горки в 100% этаноловой ванне, обработайте ультразвуком в течение 5 минут, а затем промойте водой.
- Повторите этот шаг сначала с ацетоном, затем с изопропанолом, с последующей сушкой в потоке азота.
- Используйте электронно-лучевое (E-лучевое) испарительное оборудование для покрытия слоев титана и золота на стеклянных слайдах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для титанового слоя желаемая толщина составляет 15 Å (1 Å = 10-10 м). Для золотого слоя желаемая толщина составляет 150 Å. Покройте сначала титан, а затем золото, так как титановый слой служит клеем между золотом и стеклянной горкой. - Поместите очищенные слайды в испарительную камеру и вставьте золотые и титановые тигли под жалюзи.
- Откачайте камеру для создания вакуума ниже 10-5 Па перед плавкой металлов. Сфокусируйте электронный пучок на металле и отрегулируйте мощность таким образом, чтобы скорость осаждения соответствовала контролю толщины осаждения.
- Откройте затвор, чтобы начать осаждение металла. Закройте затвор, когда будет достигнута желаемая толщина.
- Переключайте тигли между последовательным испарением двух металлов.
- Подождите, пока тигли остынут, как того требует оборудование, проветрите камеру и выньте стекла с золотым покрытием.
- Снова откачайте камеру для обслуживания оборудования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксплуатационные детали могут зависеть от конкретного испарителя e-beam. Важно иметь хорошо контролируемую, низкую скорость осаждения титана. Толстый слой титана часто приводит к плохой видимости, особенно для флуоресцентной визуализации клеток. После нанесения покрытия стеклянные слайды с титановым/золотым покрытием можно хранить в сухой вакуумной камере при комнатной температуре не менее 1 месяца.
3. Микроконтактная печать
- При желании разрежьте слайд с титановым/золотым покрытием на более мелкие кусочки. Квадратная форма размером 12 мм x 12 мм рекомендуется для типичного применения (рисунок 1B).
- Используйте стеклорез, чтобы скользить по поверхности, чтобы оставить помятый след, затем держите стеклянную горку с обеих сторон и согните вмятину, чтобы разбиться на небольшие четверти. Избегайте прикосновения к поверхности, покрытой золотом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы визуально определить, с какой стороны стекла находится поверхность с покрытием в случае случайного опрокидывания, сравните отражение света с обеих сторон. Покрытая золотом поверхность будет показывать более яркое отражение, тогда как сторона без покрытия будет иметь более тусклое отражение (от титанового слоя на другой стороне стекла). Альтернативным способом является наблюдение за краями скольжения, а сторона покрытия может быть определена по вертикальной режущей поверхности. - Очистите слайды, замочив в 100% этаноле в чашке Петри золотой стороной вверх на орбитальном шейкере не менее 10 минут. Аспирируйте этанол, затем высушите каждую горку, продувая потоком азота.
- Очистите штампы PDMS мыльной водой, а затем 100% этанолом. Высушите штампы газообразным азотом.
- Готовят 2 мМ раствора октадеканетиола (С18), растворяя 5,74 мг порошка С18 в 10 мл 100% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Герметизируйте и храните раствор C18 при комнатной температуре. Печать узоров с помощью C18 создает клейкий самосборный монослой, для которого фибронектин и клетки будут предпочтительно прикрепляться. - Замочите штампы PDMS в растворе C18 с узорчатой поверхностью вниз в течение 10 с и аккуратно высушите газообразным азотом в течение 60 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сушке поместите поток подальше от штампа сначала (около 1 м), пока большая часть жидкости не испарится, а затем медленно переместите поток ближе, чтобы полностью высушить штамп. Это делается для того, чтобы раствор C18 не сдувался вместо высыхания на штампе. - Положите штамп лицевой стороной вниз на золотые слайды в течение 60 секунд перед снятием.
- Чтобы обеспечить правильную штамповку, осторожно постучите пинцетом по штампам, чтобы правильно перенести узоры. Не давите слишком сильно, и вес пинцета обычно достаточен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуальный осмотр штампа во время постукивания обеспечит равномерный контакт штампа и стекла. - Подготовьте влажностные камеры.
- Пипетка 1 мл 70% этанола в перевернутую крышку чашки Петри и укладывает кусок парапленки, чтобы покрыть поверхность (покрытую лицевой стороной вверх).
- Используйте пинцет для подъема, уложите парапленку, чтобы убедиться, что нет пузырьков воздуха, и удалите избыток этанола, если это необходимо.
- Готовят 2 мМ HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3) раствор: Разбавляют 5 мкл исходного раствора в 5 мл 100% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавленный раствор EG3 можно герметизировать и хранить при температуре 4 °C, а неразбавленный запас EG3 следует хранить при -20 °C. Обработка EG3 используется для того, чтобы сделать область стекла без C18 неадгезионной к клеткам. - Микропипетки 40 мкл капель EG3 на каждую четверть стекла скользят по парапленке в камере влажности, оставляя достаточно места между каплями, чтобы учесть расстояние между золотыми слайдами.
- Используйте пинцет, чтобы поместить золотые слайды с печатью C18 лицевой стороной вниз на капли и обеспечить отсутствие пузырьков под слайдами. Осторожно сожмите горки вместе, не поднимая их, чтобы свести к минимуму испарение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите один край стекла скользить вниз рядом с каплей, а затем медленно опуская другой конец стекла скользить вниз. Если пузырь присутствует, толкайте золотую горку, не поднимая ее, пока пузырь больше не исчезнет. - Плотно запечатайте чашку Петри парапленкой и оставьте при комнатной температуре не менее 3 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется обширная инкубация, дважды запечатайте чашку Петри и оставьте ее на срок до 24 ч. - В шкафу для биобезопасности поместите золотые слайды лицевой стороной вверх в чашку Петри, замочите и промойте 3 раза в 70% этаноле, чтобы удалить EG3, затем оставьте в этаноле на 10 минут для стерилизации.
- Аспирируйте этанол и замените его стерильным PBS.
- Подготовьте еще одну камеру влажности, как описано в шаге 3.9, с PBS вместо этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за разницы в поверхностном натяжении легче сначала добавить 4-5 мл PBS для укладки парапленки и удаления пузырьков, а затем аспирировать избыток. - Приготовьте раствор фибронектина 50 мкг/мл (другие белки, при желании) в стерильном PBS и микропипетке 50 мкл капель раствора фибронектина на каждую четверть скользить по парапленке, оставляя некоторое пространство между каплями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фибронектиновое покрытие облегчает адгезию клеток к узорчатым поверхностям. - Используйте вафельный пинцет, чтобы поместить слайды лицом вниз на капли и обеспечить отсутствие пузырьков под слайдами. Осторожно сдвиньте горки вместе, не поднимая их.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки слайдов рекомендуются стеклянные скользящие пинцеты или вафельные пинцеты с прямыми широкими наконечниками. - Оставьте чашку Петри в шкафу биобезопасности на 30 минут.
- Через 30 мин поместите золотые горки лицевой стороной вверх в PBS после промывки в течение 3 раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды с фибронектиновым узором могут храниться в PBS при 4 °C в течение примерно месяца.
4. Посев клеток на микроструктурированные слайды
- Разогрейте среду для культивирования клеток и трипсин на водяной бане при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующее описание субкультуры относится к клеткам NIH/3T3. Условия культивирования могут варьироваться в зависимости от типов клеток. - (Необязательно) Замачивайте узорчатые слайды в культуральной среде в 12-луночной пластине, нагревайте до 37 °C в инкубаторе перед трипсинизацией клеток для лучшего прикрепления клеток.
- Трипсинизируют клетки, нейтрализуют FBS-содержащими средами, центрифугируют при 100 х г в течение 3 мин, а затем повторно суспендируют, хорошо смешивая со свежими средами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что клетки полностью диссоциированы друг от друга. - Подсчитайте ячейки, разбавьте до 200 000 клеток/мл и добавьте 0,5 мл клеточной суспензии к каждой лунке, содержащей один золотой слайд.
- Осторожно встряхните пластину лунки несколько раз для равномерного посева клеток и храните ее в инкубаторе в течение 15 минут, чтобы обеспечить прикрепление клеток.
- Через 15 минут проверьте прикрепление клеток под микроскопом. При необходимости выделите дополнительное время.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прикрепленные ячейки будут распространяться по поверхности с видимым филоподием или сплющиванием и не будут перемещаться с поверхности при осторожном постукивании или перемещении плиты скважины. - Аспирируйте среду, содержащую неприкрепленные клетки, из каждой лунки и добавляйте 1 мл культуральной среды. Для медикаментозного лечения добавьте дополнительные реагенты к питательным средам на этом этапе.
- Культивируйте клетки в инкубаторе в течение 24 ч и проверяйте слияние, чтобы определить, сформировалась ли хиральность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства типов клеток рекомендуется слияние выше 75%, а чрезмерное слияние может повлиять на характеристику хиральности.
5. Коллекция изображений
- Фиксируйте клетки при слиянии.
- Удалите питательные среды с пластины лунки и промойте один раз PBS.
- Добавить 4% раствор параформальдегида, инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин, а затем промыть 3 раза PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если фиксация значительно изменяет морфологию клеток, рекомендуется визуализация перед фиксацией
- Используйте фазоконтрастный микроскоп с функциональностью камеры, изображайте каждое кольцо на слайдах с высоким разрешением (для анализа достаточно объектива 10x).
6. Характеристика хиральности клеток (рисунок 2)
- Загрузите файлы кода MATLAB для характеристики хиральности из дополнительных файлов (Дополнительный файл 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Код был протестирован для работы с MATLAB_R2015b и более поздними версиями на системах Windows и macOS. Набор инструментов круговой статистики также необходим для запуска файлов, которые можно найти в ссылке17. - Добавьте папку кода и вложенные папки (с панелью инструментов круговой статистики внутри) в путь MATLAB и откройте файл "ROI_selection.m". В строке 4 измените каталог на нужную папку данных (для пользователей окон переключите "/" на "\" в строках 4 и 5).
- Измените размер изображения в строке 14, причем первые две фигуры представляют размер внутреннего круга кольца, а два других — внешний.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что размеры всех изображений в анализируемой папке идентичны. - Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы выполнить код MATLAB «ROI_selection.m», чтобы определить интересующую область (ROI) в фазоконтрастных изображениях.
- Вручную перетащите квадрат выделения, чтобы он соответствовал кольцу, затем дважды щелкните изображение, чтобы подтвердить выделение.
- Повторите этот шаг для каждого изображения в папке (следующее изображение автоматически появится после подтверждения выбора ROI предыдущего изображения); будет сгенерирован файл ".mat" для хранения информации о рентабельности инвестиций для каждого изображения.
- Откройте файл "Analysis_batch.m" и измените каталог папки так же, как шаг 6.2. (Для пользователей окон при первом использовании переключите "/" на "\" в строках 5, 6, 124 и 130)
- Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы выполнить код «Analysis_batch.m», чтобы определить хиральность нескольких клеточных кольцевых паттернов. Будет сгенерирован файл "datatoexcel.txt", содержащий круговую статистику для каждого кольца, а также числа колец по часовой стрелке, без хиральной и против часовой стрелки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Через пятнадцать минут после посева клеток NIH/3T3 адгезия клеток на кольцевом рисунке была визуально подтверждена фазово-контрастной визуализацией. После последующей культивирования в течение 24 ч клетки на узорах становились сливающимися и вытянутыми с явно асимметричными выравниваниями, смещенными в сторону часовой стрелки (рисунок 2). Направленная миграция прикрепленных клеток регистрируется с помощью покадровой визуализации, подвижность и морфогенез клеток могут быть количественно определены с дальнейшим анализом видео. Для проведения анализа хиральности после фиксации снимаются фазоконтрастные изображения с высоким разрешением (рисунок 2A-C) и подаются в программу MATLAB. Программа определяет градиенты интенсивности и вычисляет соответствующие направления выравнивания ячеек на кольце. Затем хиральность клеток определяется на основе круговой статистики выравнивания клеток, отклоняющихся от окружного направления колец. Таким образом, ячейки могут быть обозначены как ячейки по часовой стрелке (CW), против часовой стрелки (CCW) или нехиральные (NC) (рисунок 2D). После обработки анализ показал, что большинство колец имеют доминирующее смещение CW, что указывает на то, что клетки 3T3 имеют сильную хиральность CW. Полученные циркулярные статистические данные также предоставляют дополнительную информацию о смещенных углах для дальнейшего анализа, если это необходимо (рисунок 2Е).
Хиральность клетки зависит от ее фенотипа. Было подтверждено, что анализ кольцевой хиральности совместим с несколькими типами клеток 7,8,9,10, включая как клеточные линии, так и первичные клетки, такие как фибробласты, миобласты, эндотелиальные клетки и стволовые клетки (таблица 1). Интересно, что, поскольку хиральность клеток происходит от функциональных возможностей актин-цитоскелета, изменения в динамике актина могут влиять на хиральное смещение клеток. С клетками миобласта C2C12 мы обнаружили, что, нарушая полимеризацию актина при обработке 50 нМ латрункулина А, клетки демонстрировали изменение хирального смещения CCW в CW (рисунок 3A). Кроме того, эндотелиальные клетки пупочных сосудов человека (hUVECs), обработанные низкомолекулярным препаратом 12-o-тетрадеканоилфорбол-13-ацетатом (TPA), для активации протеинкиназы c, показали дозозависимый сдвиг хиральности клеток от CW к CCW (рисунок 3B). Эти результаты демонстрируют полезность экспериментального анализа хиральности разработанного кольцевого паттерна, а также чувствительность этого анализа к изменениям в цитоскелете.
Рисунок 1. Схема клеточного микроструктурирования. (A) Процедура микрофабрикации и микроконтактной печати для клеточного моделирования. Негативная фоторезистическая форма была получена ультрафиолетовым (УФ) сшиванием фоторезиста через маску, содержащую микроструктурирующие признаки (1-2). Эластомерные преполимеры полидиметилсилоксана (PDMS) отливали на форму для создания штампов (3-4). Затем клейкий самосборочный монослой (SAM), окта-деканетиол (C18), был нанесен на штамп и перенесен на стеклянные слайды с золотым покрытием с помощью микроконтактной печати (5-7), за которым последовало покрытие неадгезивного sam с этиленгликолем, HS-(CH2)11-EG 3 (EG3) (8) и фибронектина (9). Затем клетки сеяли для прикрепления к паттернам (10). (B) Фотографии демонстрируют ключевые этапы микроструктурирования клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Рабочий процесс анализа изображений. (A) Коллекция изображений. Получайте фазоконтрастные изображения каждого кольца. (B) Ввод данных в программу MATLAB путем запуска каталога настройки файла "ROI_Selection.m" и размера изображения. (C) Выберите интересующие области (ROI), перетащив квадрат выбора в соответствии с сотовым кольцом и дважды щелкнув для подтверждения. (D) Определение выравнивания ячеек и хиральных смещений путем запуска файла "Analysis_Batch.m". E) примеры выходных данных с кратким изложением смещенных номеров колец и циркулярных статистических данных по каждому кольцевому соединению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Репрезентативные результаты хиральности клеток при медикаментозном лечении. (A) Результаты фазово-контрастных изображений и характеристик хиральности клеток миобласта C2C12 мыши: контрольные (слева) и 50 нМ групп, обработанных латрункулином А (справа). Жирным красным шрифтом обозначена доминирующая хиральность при p < 0,05 по ранговому тесту. Шкала: 100 мкм. (B) Результаты фазоконтрастных изображений и характеристик хиральности эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека (hUVECs) на микроструктурированных кольцах: контрольные (слева) и 30 нМ TPA обработанные группы (справа). Жирным красным шрифтом обозначена доминирующая хиральность при p < 0,05 по ранговому тесту. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| CW Предвзятый | Предвзятость КНО |
| · Ячейки NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) | · C2C12 (ATCC CRL-1772) |
| · Ячейки MC3T3-E1 (ATCC CRL-2593) | · Клетки скелетных мышц человека (Lonza CC-2661) |
| · Фибробласты сердца крыс | · Линия фибробластов рака кожи человека (ATCC CRL-7762) |
| · Первичные фибробласты кожи человека (ATCC PCS-201-012) | · Медин-Дарби собачьи эпителиальные клетки почек (ATCC CCL-34) |
| · Стволовые клетки человеческого происхождения, полученные из жировой ткани человека | |
| · Мезенхимальные стволовые клетки человека | |
| · Эндотелиальные клетки пупочных сосудов человека (Lonza CC-2935) | |
| · Микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга человека (Клеточные системы ACBRI-376) |
Таблица 1. Хиральные смещения различных типов клеток характеризуются микроструктурным анализом. CW: по часовой стрелке; КНО: против часовой стрелки.
Дополнительный файл 1: Кодовые файлы MATLAB для характеристики хиральности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные файлы кодирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Кольцеобразный анализ паттернов, описанный здесь, обеспечивает простой в использовании инструмент для количественной характеристики многоклеточной хиральности, способный давать высоконадежные и повторяемые результаты. Быстрая генерация идентичных микросред и непредвзятый анализ позволяют автоматизировать высокопроизводительную обработку образцов большого размера. В этом протоколе обсуждается изготовление кольцевых микрошариков, клеточный паттерн и автоматический анализ смещенного выравнивания клеток и направленного движения. Этот метод совместим с методами визуализации в реальном времени для изучения подвижности клеток и хирального морфогенеза и может быть потенциально интегрирован в другие плановые формы для обнаружения токсичности9 или приложений скрининга лекарств.
Есть несколько дополнительных советов, которыми можно поделиться. Во-первых, на этапе микроконтактной печати штамп должен быть изготовлен на золотой стороне стекла (его может быть трудно различить после того, как подложка разрезана на куски), и следует избегать двойной печати. Во-вторых, для клеток, которым требуются другие белки для правильного присоединения, предпочтительные белки могут быть использованы на стадии 3.17. В-третьих, для клеточной культуры плотность клеток не должна быть слишком высокой, и клетки не должны выращиваться при чрезмерном слиянии на узорах. В противном случае клетки могут нарушить внутреннюю границу и заполнить кольцо в сплошной круг. В-четвертых, если клеточные паттерны повреждены или неполны после посева, это может быть связано с неполной передачей рисунка C18 во время контактной печати (этапы 3.7-3.8). Штампы PDMS должны быть проверены на наличие недостатков. Применение немного большей силы при штамповке на слайдах также может быть полезным. Наконец, если ячейки прикрепляются ко всей поверхности стеклянного слайда без видимых узоров, сила, приложенная на шаге 3.8, может быть слишком высокой, в результате чего вся поверхность штампуется C18. Также возможно, что слайды неисправны или хранились в PBS слишком долго. Образцы самосборных монослоев (т.е. C18 и EG3) следует использовать в течение месяца после печати.
Хотя предлагаемый анализ обеспечивает удобный инструмент для надежной характеристики хиральности, существуют некоторые ограничения. Во-первых, анализ паттернов совместим только с адгезивными клетками. Хиральность неадгезивных клеток, таких как циркулирующие опухолевые клетки, адипоциты или немлекопитающие клетки, может быть проанализирована с использованием двухслойного метода 3D Matrigel18,19. Во-вторых, для типов клеток, которые имеют естественную форму булыжника и не показывают значительного удлинения, точность анализа может быть снижена. Однако хиральность этих типов клеток может быть охарактеризована проведением живой визуализации и отслеживанием смещения миграции7. Наконец, анализ микроструктурирования является методом анализа конечных точек, не предназначенным для долгосрочной клеточной культуры. Эксперименты, такие как медикаментозное лечение, не должны превышать 72 ч после посева на узоры. Для применений, требующих длительного времени обработки, рассмотрите возможность предварительной обработки клеток перед посевом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения (OD/NICHD DP2HD083961 и NHBLI R01HL148104). Лео К. Ван является стипендиатом Pew в области биомедицинских наук (PEW 00026185), поддерживаемым благотворительными фондами Pew. Haokang Zhang поддерживается Преддокторской стипендией Американской кардиологической ассоциации (20PRE35210243).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021).
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
