Summary
We presenteren een protocol voor het bepalen van meercellige chiraliteit in vitro, met behulp van de micropatterning-techniek. Deze test maakt automatische kwantificering van de links-rechts vooroordelen van verschillende soorten cellen mogelijk en kan worden gebruikt voor screeningsdoeleinden.
Abstract
Chiraliteit is een intrinsieke cellulaire eigenschap, die de asymmetrie weergeeft in termen van polarisatie langs de links-rechts as van de cel. Omdat deze unieke eigenschap steeds meer aandacht trekt vanwege zijn belangrijke rol in zowel ontwikkeling als ziekte, zou een gestandaardiseerde kwantificeringsmethode voor het karakteriseren van celchiraliteit onderzoek en potentiële toepassingen bevorderen. In dit protocol beschrijven we een meercellige chiraliteitskarakteriseringstest die gebruik maakt van microgepatterde arrays van cellen. Cellulaire micropatronen worden vervaardigd op titanium / goud gecoate glasplaten via microcontactprinten. Na het zaaien op de geometrisch gedefinieerde (bijv. ringvormige), eiwit-gecoate eilanden, migreren cellen richtingsgewijs en vormen een bevooroordeelde uitlijning naar de klok mee of de tegen de klok in richting, die automatisch kan worden geanalyseerd en gekwantificeerd door een op maat geschreven MATLAB-programma. Hier beschrijven we in detail de fabricage van microgepatterde substraten, celzaaien, beeldverzameling en gegevensanalyse en tonen we representatieve resultaten verkregen met behulp van de NIH / 3T3-cellen. Dit protocol is eerder gevalideerd in meerdere gepubliceerde studies en is een efficiënt en betrouwbaar hulpmiddel voor het bestuderen van celchiraliteit in vitro.
Introduction
Links-rechts (LR) asymmetrie van de cel, ook bekend als cellulaire handvaardigheid of chiraliteit, beschrijft de celpolariteit in de LR-as en wordt erkend als een fundamentele, geconserveerde, biofysische eigenschap 1,2,3,4,5. Celchiraliteit is zowel in vivo als in vitro op meerdere schalen waargenomen. Eerdere bevindingen onthulden chirale werveling van actinecytoskelet in enkele cellen gezaaid op cirkelvormige eilanden6, bevooroordeelde migratie en uitlijning van cellen binnen begrensde grenzen 7,8,9,10,11 en asymmetrische lusing van kippenwarmtebuis 12.
Op meercellig niveau kan celchiraliteit worden bepaald aan de hand van directionele migratie of uitlijning, cellulaire rotatie, cytoskeletale dynamica en celorganelpositionering 7,8,9,10,11,12,13. We hebben een op micropatterning gebaseerde14-assay opgesteld om de chirale bias van aanhangende cellen efficiënt te karakteriseren 7,8,9,10. Met de ringvormige micropatronen die celclusters geometrisch beperken, vertonen de cellen gezamenlijk directionele migratie en bevooroordeelde uitlijning. Er is een MATLAB-programma ontwikkeld om automatisch de celuitlijning te detecteren en te meten in fasecontrastbeelden van de ring. De richting van de lokale celuitlijning wordt gekwantificeerd met een bevooroordeelde hoek, afhankelijk van de afwijking van de omtrekrichting. Na statistische analyse wordt het ringpatroon van cellen aangeduid als contraklokkend (CCW) biases of met de klok mee (CW) biases.
Deze test is gebruikt om de chiraliteit van meerdere celfenotypen te karakteriseren (tabel 1) en de LR-asymmetrie van cellen is fenotypespecifiekgebleken 7,11,15. Bovendien kan verstoring van de actinedynamica en morfologie resulteren in een omkering van chirale bias 7,8, en oxidatieve stress kan ook de celchiraliteit veranderen9. Vanwege de eenvoud van de procedure en de robuustheid van de benadering 7,8,9,10, biedt deze 2D-chiraliteitstest een efficiënt en betrouwbaar hulpmiddel voor het bepalen en bestuderen van meercellige chiraliteit in vitro.
Het doel van dit protocol is om het gebruik van deze methode aan te tonen om celchiraliteit te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe patroon cellulaire arrays kunnen worden vervaardigd via microcontactdruktechniek en chiraliteitsanalyses op een geautomatiseerde manier kunnen worden uitgevoerd met behulp van het MATLAB-programma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vervaardiging van polydimethylsiloxaan (PDMS) stempels16
- Teken een reeks microschaalringen met BEHULP VAN CAD-software, met een binnendiameter van 250 μm en een buitendiameter van 450 μm. Het patroon dat in dit protocol wordt gebruikt is een array van 10 x 10 met een afstand van 850 μm tussen ringen.
- Druk een transparantiemasker van het patroon af met de gewenste resolutie met behulp van de maskerafdrukservice van een microfabricagebedrijf (zie Materialentabel).
OPMERKING: Het is bewezen dat de meegeleverde afmetingen van de ring werken voor veel celtypen7. - Voer ultraviolette (UV) fotolithografie uit met behulp van het masker dat de gewenste kenmerken bevat om een negatieve fotoresistente mal te maken (zoals SU-8)8.
- Bedek een silicium wafer met fotoresistcoating met het transparantiemasker dat in de stappen 1.1-1.2 is vervaardigd.
- Polymeriseer op een UV-contact aligner de fotoresist onder transparante gebieden van het masker door UV-licht.
OPMERKING: Na verdere was- en ontwikkeling wordt de hoofdmal met de gewenste functies vervaardigd8. Operationele details zijn afhankelijk van de specifieke apparatuur die wordt gebruikt.
- Bereid PDMS-elastomeerprepolymeren door te mengen met het uithardingsmiddel in een verhouding van 10: 1 en giet het mengsel vervolgens op de vorm in een petrischaal.
- Plaats de schaal gedurende 30 minuten in een vacuümkamer om luchtbellen in PDMS te verwijderen en bak in een oven op 60 °C gedurende ten minste 2 uur.
- Nadat PDMS volledig is uitgehard, snijdt u de patroonarrays in stempels.
OPMERKING: Dikkere stempels (ongeveer 1 cm) kunnen de voorkeur hebben vanwege het gebruiksgemak bij de latere stappen van het afdrukken van microcontacten.
2. Coating van glasplaten
- Maak de glasglijbanen schoon. Week de glaasjes in een 100% ethanolbad, ultrasoonapparaat gedurende 5 minuten en spoel vervolgens af met water.
- Herhaal deze stap eerst met aceton, dan met isopropanol, gevolgd door drogen in een stikstofstroom.
- Gebruik een elektronenbundel (E-beam) verdampingsapparatuur om titanium- en goudlagen op glasglijbanen te coaten.
OPMERKING: Voor de titaniumlaag is de gewenste dikte 15 Å (1 Å = 10-10 m). Voor de goudlaag is de gewenste dikte 150 Å. Coat eerst titanium en dan goud, omdat de titaniumlaag dient als lijm tussen goud en de glasplaat. - Plaats de gereinigde platen in de verdampingskamer en plaats gouden en titanium smeltkroezen onder de luiken.
- Pomp de kamer naar beneden om een vacuüm van minder dan 10-5 Pa te creëren voordat metalen worden gesmolten. Richt de elektronenbundel op het metaal en pas het vermogen aan zodat de afzettingssnelheid geschikt is voor het regelen van de depositiedikte.
- Open de sluiter om de metaalafzetting te starten. Sluit de sluiter wanneer de gewenste dikte is bereikt.
- Schakel smeltkroezen tussen sequentiële verdamping van twee metalen.
- Wacht tot de smeltkroezen zijn afgekoeld zoals vereist door de apparatuur, ontlucht de kamer en haal de met goud beklede glasdia's eruit.
- Pomp de kamer weer naar beneden voor onderhoud van de apparatuur.
OPMERKING: Operationele details kunnen afhankelijk zijn van een specifieke E-beam verdamper. Het hebben van een goed gecontroleerde, lage afzettingssnelheid van titanium is belangrijk. Een dikke titaniumlaag leidt vaak tot slecht zicht, vooral voor fluorescentiebeeldvorming van de cellen. Na coating kunnen de titanium/goudgecoate glasplaten gedurende ten minste 1 maand in een droge vacuümkamer bij kamertemperatuur worden bewaard.
3. Microcontact printen
- Knip de titanium/goud gecoate glijbaan desgewenst in kleinere stukjes. Een vierkante vorm van 12 mm x 12 mm wordt aanbevolen voor een typische toepassing (figuur 1B).
- Gebruik een glassnijder om over het oppervlak te glijden om een gedeukt spoor achter te laten, houd vervolgens de glasplaat aan beide zijden vast en buig bij de deuk om in kleine kwartjes te breken. Vermijd het aanraken van het met goud beklede oppervlak.
OPMERKING: Om visueel te bepalen welke kant van het glas het gecoate oppervlak is in geval van per ongeluk kantelen, vergelijkt u de reflectie van licht aan beide zijden. Het met goud bedekte oppervlak zal een helderdere reflectie vertonen, terwijl de niet-gecoate kant een dimmere reflectie zal hebben (van de titaniumlaag aan de andere kant van het glas). Een alternatieve manier is om de randen van de dia te observeren en de coatingzijde kan worden bepaald aan de hand van het verticale snijoppervlak. - Reinig de dia's door gedurende ten minste 10 minuten in een petrischaaltje 100% ethanol te weken met de gouden kant naar boven op een orbitale shaker. Zuig de ethanol op en droog vervolgens elke dia door te blazen met een stikstofstroom.
- Reinig de PDMS-stempels met een sopje en vervolgens 100% ethanol. Droog de stempels met stikstofgas.
- Bereid 2 mM octadecanethiol (C18) oplossing door 5,74 mg C18 poeder op te lossen in 10 ml 100% ethanol.
OPMERKING: Verzegel en bewaar C18-oplossing bij kamertemperatuur. Printpatronen met C18 creëren een zelfklevende zelfgeassembleerde monolaag waarvoor de fibronectine en cellen zich bij voorkeur hechten. - Week de PDMS-stempels in C18-oplossing met het patroonoppervlak gedurende 10 s naar beneden gericht en droog voorzichtig met stikstofgas gedurende 60 s.
OPMERKING: Plaats tijdens het drogen de stroom eerst weg van de stempel (ongeveer 1 m) totdat de meeste vloeistof is verdampt en verplaats de stroom vervolgens langzaam dichterbij om de stempel volledig te drogen. Dit om te voorkomen dat de C18-oplossing wordt weggeblazen in plaats van op de stempel te drogen. - Leg de stempel met de voorkant naar beneden op de gouden platen gedurende 60 s voordat u ze verwijdert.
- Om een goede stempeling te garanderen, tikt u het pincet voorzichtig op de stempels om de patronen op de juiste manier over te brengen. Duw niet te hard naar beneden en het gewicht van een pincet is meestal voldoende.
OPMERKING: Visuele inspectie van de stempel tijdens het tikken zal ervoor zorgen dat de stempel en glasplaat gelijkmatig contact hebben gemaakt. - Bereid vochtkamers voor.
- Pipetteer 1 ml 70% ethanol in een omgekeerd petrischaaldeksel en leg een stuk parafilm neer om het oppervlak te bedekken (bedekt met het gezicht naar boven).
- Gebruik een pincet om op te tillen, leg parafilm neer om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen zijn en verwijder overtollige ethanol indien nodig.
- Bereid 2 mM HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3) oplossing: Verdun 5 μL stamoplossing in 5 ml 100% ethanol.
OPMERKING: De verdunde EG3-oplossing kan worden verzegeld en bewaard bij 4 °C, en onverdunde EG3-voorraad moet worden bewaard bij -20 °C. De EG3-behandeling wordt gebruikt om het glasgebied zonder C18 niet-klevend te maken voor cellen. - Micropipette 40 μL druppels EG3 voor elk kwart glas glijden op de parafilm in de vochtigheidskamer, waardoor er voldoende ruimte tussen de druppels overblijft om rekening te houden met de afstand van de gouden dia's.
- Gebruik een pincet om C18-bedrukte gouden dia's met de voorkant naar beneden op de druppels te plaatsen en zorg ervoor dat er geen bubbels onder de dia's vallen. Duw de glijders voorzichtig tegen elkaar zonder ze op te tillen om verdamping te minimaliseren.
OPMERKING: Plaats een rand van het glas naar beneden in de buurt van de druppel en laat vervolgens langzaam het andere uiteinde van de glasplaat naar beneden zakken. Als er een bel aanwezig is, duw dan op de gouden dia zonder deze op te tillen totdat de bel niet meer aanwezig is. - Sluit de petrischaal goed af met parafilm en laat deze minstens 3 uur op kamertemperatuur staan.
OPMERKING: Als uitgebreide incubatie gewenst is, sluit u de petrischaal dubbel af en laat u deze tot 24 uur staan. - Plaats in een bioveiligheidskast gouden dia's met de voorkant naar boven in een petrischaal, week en spoel 3 keer in 70% ethanol om EG3 te verwijderen en laat vervolgens 10 minuten in ethanol voor sterilisatie.
- Zuig de ethanol op en vervang deze door steriel PBS.
- Bereid een andere vochtigheidskamer voor zoals beschreven in stap 3.9, met PBS in plaats van ethanol.
OPMERKING: Vanwege het verschil in oppervlaktespanning is het gemakkelijker om eerst 4-5 ml PBS toe te voegen om parafilm neer te leggen en bellen te verwijderen en vervolgens het overtollige op te zuigen. - Bereid de 50 μg/ml fibronectine-oplossing (andere eiwitten, indien gewenst) in steriele PBS en micropipette 50 μL druppels fibronectine-oplossing voor elke kwartschuif op de parafilm, waarbij er enige ruimte tussen de druppels overblijft.
OPMERKING: Fibronectine coating vergemakkelijkt cel hechting aan patroonoppervlakken. - Gebruik een waferpincet om dia's met de voorkant naar beneden op de druppels te plaatsen en zorg ervoor dat er geen bubbels onder de dia's vallen. Duw de glijbanen voorzichtig tegen elkaar zonder ze op te tillen.
OPMERKING: Glazen schuifpincetten of waferpincetten met rechte brede uiteinden worden aanbevolen voor het hanteren van de dia's. - Laat de petrischaal 30 min in de bioveiligheidskast staan.
- Plaats na 30 minuten de gouden dia's na 3 keer spoelen met de voorkant naar boven in PBS.
OPMERKING: Dia's met fibronectinepatroon kunnen ongeveer een maand in PBS bij 4 °C worden bewaard.
4. Cellen zaaien op microgepatterde dia's
- Warm de celkweekmedia en trypsine op in een waterbad van 37 °C.
OPMERKING: De volgende beschrijving van subcultuur is voor NIH / 3T3-cellen. Kweekomstandigheden kunnen variëren afhankelijk van celtypen. - (Optioneel) Week patroondia's in kweekmedia in een 12-well plaat, warm op tot 37 °C in een incubator voorafgaand aan trypsinisatie van cellen voor een betere celaanhechting.
- Trypsiniseren van de cellen, neutraliseren met FBS-bevattende media, centrifugeren bij 100 x g gedurende 3 minuten en vervolgens resuspenderen door goed te mengen met verse media.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen volledig van elkaar zijn gescheiden. - Tel de cellen, verdun tot 200.000 cellen / ml en voeg 0,5 ml van de celsuspensie toe aan elke put met één gouden dia.
- Schud de putplaat een paar keer voorzichtig voor uniforme celzaaiing en bewaar deze gedurende 15 minuten in een incubator om celaanhechting mogelijk te maken.
- Controleer na 15 minuten de celaanhechting onder een microscoop. Houd rekening met extra tijd, indien nodig.
OPMERKING: De aangehechte cellen zullen zich op het oppervlak verspreiden met zichtbaar filopodium of afplatting en zullen niet van het oppervlak bewegen wanneer de putplaat voorzichtig wordt getikt of verplaatst. - Adem de media met niet-aangebonden cellen uit elke put en voeg 1 ml kweekmedia toe. Voor medicamenteuze behandeling, vul extra reagentia aan kweekmedia aan bij deze stap.
- Kweek de cellen in de incubator gedurende 24 uur en controleer de samenvloeiing om te bepalen of chiraliteit zich heeft gevormd.
OPMERKING: Meer dan 75% confluentie wordt aanbevolen voor de meeste celtypen, en over-confluentie kan de chiraliteitskarakterisering beïnvloeden.
5. Beeldverzameling
- Fixeer de cellen op confluentie.
- Verwijder kweekmedia van de putplaat en spoel eenmaal af met PBS.
- Voeg 4% paraformaldehyde-oplossing toe, incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en spoel vervolgens 3 keer met PBS.
OPMERKING: Als de fixatie de celmorfologie aanzienlijk verandert, wordt beeldvorming vóór fixatie aanbevolen
- Gebruik een fasecontrastmicroscoop met camerafunctionaliteit, beeld elke ring op de dia's op hoge resolutie (10x objectlens is voldoende voor analyse).
6. Karakterisering van de celchiraliteit (figuur 2)
- Download MATLAB-codebestanden voor chiraliteitskarakterisering van de aanvullende bestanden (Aanvullend bestand 1).
OPMERKING: De code is getest voor gebruik met MATLAB_R2015b en latere versies op zowel Windows- als macOS-systemen. De toolbox voor circulaire statistieken is ook vereist om de bestanden uit te voeren, die te vinden zijn in referentie17. - Voeg de codemap en submappen (met cirkelvormige statistische toolbox erin) toe aan het MATLAB-pad en open het bestand "ROI_selection.m". Wijzig in regel 4 de map in de gewenste gegevensmap (schakel voor venstergebruikers "/" in "\" in regel 4 en 5).
- Wijzig de afbeeldingsgrootte in regel 14, waarbij de eerste twee figuren de binnenste cirkelgrootte van de ring vertegenwoordigen, terwijl de andere twee de buitenste vertegenwoordigen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de grootte van alle afbeeldingen in een te analyseren map identiek is. - Klik op de knop Uitvoeren om de MATLAB-code "ROI_selection.m" uit te voeren om het interessegebied (ROI) in fasecontrastafbeeldingen te bepalen.
- Sleep het selectievierkant handmatig om in de ring te passen en dubbelklik vervolgens op de afbeelding om de selectie te bevestigen.
- Herhaal deze stap voor elke afbeelding in de map (de volgende afbeelding verschijnt automatisch na bevestiging van de ROI-selectie van een vorige afbeelding); er wordt een ".mat"-bestand gegenereerd om de ROI-informatie voor elke afbeelding op te slaan.
- Open het bestand "Analysis_batch.m" en wijzig de map van de map hetzelfde als stap 6.2. (Voor venstergebruikers schakelt u voor het eerste gebruik "/" in "\" in de regels 5, 6, 124 en 130)
- Klik op de knop Uitvoeren om de code "Analysis_batch.m" uit te voeren om de chiraliteit van meerdere cellulaire ringpatronen te bepalen. Er wordt een "datatoexcel.txt" -bestand gegenereerd, met cirkelvormige statistieken voor elke ring en de aantallen ringen met de klok mee, niet-chirale en tegen de klok in.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een kwartier na het zaaien van NIH/3T3-cellen werd de celadhesie op het ringpatroon visueel bevestigd door fasecontrastbeeldvorming. Na een daaropvolgende kweek van 24 uur werden cellen op de patronen confluent en langwerpig met duidelijk asymmetrische uitlijningen, vertekend naar de richting met de klok mee (figuur 2). Directionele migratie van gehechte cellen wordt geregistreerd door time-lapse beeldvorming, celmotiliteit en morfogenese kunnen worden gekwantificeerd met verdere analyses van de video. Om chiraliteitsanalyses uit te voeren, worden na fixatie fasecontrastbeelden met hoge resolutie genomen (figuur 2A-C) en ingevoerd in het MATLAB-programma. Het programma detecteert intensiteitsgradiënten en berekent overeenkomstige celuitlijningsrichtingen op de ring. Vervolgens wordt de celchiraliteit bepaald op basis van de circulaire statistiek van celuitlijning die afwijkt van de omtrekrichting van de ringen. De cellen kunnen daarom worden aangeduid als met de klok mee (CW), tegen de klok in (CCW) of niet-chiraal (NC) (figuur 2D). Na verwerking toonde de analyse aan dat de meerderheid van de ringen een dominante CW-bias heeft, wat aangeeft dat 3T3-cellen een sterke CW-chiraliteit hebben. Gegenereerde circulaire statistieken bieden ook aanvullende informatie over vertekende hoeken voor verdere analyses indien nodig (figuur 2E).
Celchiraliteit hangt af van het fenotype. De ringchiraliteitstest is geverifieerd als compatibel met meerdere celtypen 7,8,9,10, waaronder zowel cellijnen als primaire cellen, zoals fibroblasten, myoblasten, endotheelcellen en stamcellen (tabel 1). Interessant is dat, omdat celchiraliteit afkomstig is van de functionaliteiten van actinecytoskelet, veranderingen in actinedynamica de chirale bias van cellen kunnen beïnvloeden. Met muismyoblast C2C12-cellen ontdekten we dat door actinepolymerisatie te verstoren met 50 nM Latrunculin A-behandeling, de cellen een verandering van CCW chirale bias in CW vertoonden (figuur 3A). Bovendien vertoonden menselijke navelstreng vasculaire endotheelcellen (hUVEC's) behandeld met een geneesmiddel met kleine moleculen, 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetaat (TPA), om het eiwitkinase c te activeren een dosisafhankelijke verschuiving van celchiraliteit van CW naar CCW (figuur 3B). Deze bevindingen tonen het nut aan van de ontwikkelde ringpatroon chiraliteitstest experimenteel, evenals de gevoeligheid van deze test voor veranderingen in het cytoskelet.
Figuur 1. Schema van cellulaire micropatterning. (A) Procedure voor microfabricage en microcontactprinten voor celpatronen. Een negatieve fotoresistente mal werd gemaakt door ultraviolette (UV) crosslinking van fotoresist via een masker met micropatterning-kenmerken (1-2). Polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeerprepolymeren werden op de mal gegoten om stempels te maken (3-4). Vervolgens werd een zelfklevende monolaag (SAM), octa-decanethiol (C18), op de stempel gecoat en overgebracht op vergulde glasplaten via microcontactdruk (5-7), gevolgd door coating van niet-klevende ethyleenglycol-geëindigde SAM, HS-(CH2) 11-EG 3 (EG3) (8) en fibronectine (9). Cellen werden vervolgens gezaaid om zich aan de patronen te hechten (10). (B) Foto's tonen de belangrijkste stappen van celmicropatterning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Workflow van beeldvormingsanalyses. (A) Beeldverzameling. Verkrijg fasecontrastbeelden van elke ring. (B) Voer gegevens in het MATLAB-programma in door de map "ROI_Selection.m" voor bestandsinstellingen en afbeeldingsgrootte uit te voeren. (C) Selecteer interessegebieden (ROI's) door het selectievak te slepen om in de celring te passen en dubbelklik om te bevestigen. (D) Bepaal de uitlijning van cellen en chirale vooroordelen door het bestand "Analysis_Batch.m" uit te voeren. (E) Voorbeelduitgangen met een samenvatting van bevooroordeelde ringnummers en cirkelvormige statistieken voor elke ring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve resultaten van de chiraliteit van cellen onder medicamenteuze behandeling. (A) Fasecontrastbeelden en chiraliteitskarakteriseringsresultaten van muismyoblast C2C12-cellen: Controle (links) en 50 nM Latrunculine A behandelde groepen (rechts). Vet rood lettertype geeft dominante chiraliteit aan bij p < 0,05 bij rangtest. Schaalstaven: 100 μm. (B) Fasecontrastbeelden en chiraliteitskarakteriseringsresultaten van menselijke navelstreng vasculaire endotheelcellen (hUVEC's) op micropatroonringen: Controle (links) en 30 nM TPA behandelde groepen (rechts). Vet rood lettertype geeft dominante chiraliteit aan bij p < 0,05 bij rangtest. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| CW Bevooroordeeld | CCW Bevooroordeeld |
| · NIH/3T3 cellen (ATCC CRL-1658) | · C2C12 (ATCC CRL-1772) |
| · MC3T3-E1 cellen (ATCC CRL-2593) | · Menselijke skeletspiercellen (Lonza CC-2661) |
| · Hartfibroblasten bij ratten | · Een menselijke huidkanker fibroblast lijn (ATCC CRL-7762) |
| · Menselijke primaire huidfibroblasten (ATCC PCS-201-012) | · Madin-Darby canine nier epitheelcellen (ATCC CCL-34) |
| · Menselijke van vetweefsel afgeleide stamcellen | |
| · Menselijke mesenchymale stamcellen | |
| · Menselijke navelstreng vasculaire endotheelcellen (Lonza CC-2935) | |
| · Microvasculaire endotheelcellen van de menselijke hersenen (Celsystemen ACBRI-376) |
Tabel 1. Chirale vooroordelen van verschillende celtypen worden gekenmerkt door de micropatterning-assay. CW: met de klok mee; CCW: tegen de klok in.
Aanvullend bestand 1: MATLAB-codebestanden voor chiraliteitskarakterisering. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende coderingsbestanden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ringvormige patroontest die hier wordt beschreven, biedt een eenvoudig te gebruiken hulpmiddel voor kwantitatieve karakterisering van meercellige chiraliteit, in staat om zeer betrouwbare en herhaalbare resultaten te produceren. Snelle generatie van identieke gedefinieerde micro-omgevingen en onbevooroordeelde analyse maakt geautomatiseerde high-throughput verwerking van grote hoeveelheden monsters mogelijk. Dit protocol bespreekt de fabricage van de ringmicropatronen, celpatronen en automatische analyse van de bevooroordeelde celuitlijning en directionele beweging. Deze methode is compatibel met live-imaging technieken om celmotiliteit en chirale morfogenese te bestuderen en kan mogelijk worden geïntegreerd in andere planvormen voor toxiciteitsdetectie9 of toepassingen voor geneesmiddelenscreening.
Er zijn nog een paar extra tips om te delen. Ten eerste moet in de microcontactprintstap de stempel op de gouden kant van het glas worden gemaakt (het kan moeilijk te onderscheiden zijn nadat het substraat in stukken is gesneden) en dubbele afdruk moet worden vermeden. Ten tweede, voor de cellen die andere eiwitten nodig hebben voor een goede hechting, kunnen de voorkeurseiwitten worden gebruikt bij stap 3.17. Ten derde, voor celkweek mag de celdichtheid niet te hoog zijn en mogen de cellen niet over-collfluentie op de patronen worden gekweekt. Anders kunnen cellen de binnenste grens doorbreken en de ring in een vaste cirkel vullen. Ten vierde, als celpatronen na het zaaien worden gebroken of onvolledig zijn, kan dit te wijten zijn aan een onvolledige overdracht van het patroon van C18 tijdens het afdrukken van contact (stappen 3.7-3.8). De PDMS-stempels moeten worden onderzocht op gebreken. Het toepassen van iets hogere kracht bij het stempelen op dia's kan ook nuttig zijn. Ten slotte, als cellen zich zonder zichtbare patronen aan het hele oppervlak van de glasplaat hechten, kan de kracht die wordt uitgeoefend bij stap 3.8 te hoog zijn, waardoor het hele oppervlak met C18 wordt gestempeld. Het is ook mogelijk dat de dia's defect zijn of te lang in PBS zijn opgeslagen. Patronen van zelfassemblerende monolagen (d.w.z. C18 en EG3) moeten binnen een maand na het afdrukken worden gebruikt.
Hoewel de voorgestelde test een handig hulpmiddel biedt voor robuuste chiraliteitskarakterisering, zijn er enkele beperkingen. Ten eerste is de patroontest alleen compatibel met aanhangende cellen. De chiraliteit van niet-adherente cellen, zoals circulerende tumorcellen, adipocyten of niet-zoogdiercellen, kan mogelijk worden geanalyseerd met behulp van de 3D Matrigel-bilayer-methode18,19. Ten tweede, voor celtypen die een natuurlijke kasseienvorm hebben en geen significante rek vertonen, kan de analysenauwkeurigheid afnemen. De chiraliteit van deze celtypen kan echter worden gekenmerkt door het uitvoeren van live beeldvorming en het volgen van de migratiebias7. Ten slotte is de micropatterning-assay een eindpuntanalysemethode, niet bedoeld voor celkweek op lange termijn. Experimenten zoals medicamenteuze behandeling mogen niet langer zijn dan 72 uur na het zaaien op patronen. Voor toepassingen die een langere behandelingstijd vereisen, kunt u overwegen om cellen voor te behandelen voordat ze worden gezaaid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health (OD/NICHD DP2HD083961 en NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan is een Pew Scholar in Biomedical Sciences (PEW 00026185), ondersteund door de Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang wordt ondersteund door american heart association predoctoral fellowship (20PRE35210243).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021).
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
