Summary
Apresentamos um protocolo para determinar a quiralidade multicelular in vitro, utilizando a técnica de micropatterning. Este ensaio permite quantificação automática dos vieses esquerdo-direito de vários tipos de células e pode ser usado para fins de triagem.
Abstract
A quiralidade é uma propriedade celular intrínseca, que retrata a assimetria em termos de polarização ao longo do eixo esquerda-direita da célula. Como essa propriedade única atrai cada vez mais atenção devido aos seus importantes papéis no desenvolvimento e na doença, um método padronizado de quantificação para caracterizar a quiralidade celular avançaria na pesquisa e em aplicações potenciais. Neste protocolo, descrevemos um ensaio de caracterização de quiralidade multicelular que utiliza matrizes micropattered de células. Micropatterns celulares são fabricados em lâminas de vidro revestidas de titânio/ouro por impressão de microcontatos. Após a semeadura na direção geométrica definida (por exemplo, em forma de anel), ilhas revestidas de proteínas, as células migram direcionalmente e formam um alinhamento tendencioso em direção ao sentido horário ou ao sentido anti-horário, que pode ser automaticamente analisado e quantificado por um programa MATLAB escrito sob medida. Aqui descrevemos em detalhes a fabricação de substratos micropatterados, semeadura celular, coleta de imagens e análise de dados e mostramos resultados representativos obtidos usando as células NIH/3T3. Este protocolo já foi validado anteriormente em vários estudos publicados e é uma ferramenta eficiente e confiável para estudar a quiralidade celular in vitro.
Introduction
A assimetria esquerda-direita (LR) da célula, também conhecida como mão celular ou quiralidade, descreve a polaridade celular no eixo LR e é reconhecida como uma propriedade fundamental, conservada, biofísica 1,2,3,4,5. A quiralidade celular tem sido observada tanto in vivo quanto in vitro em múltiplas escalas. Achados anteriores revelaram o redemoinho quiral de citesqueleto de actina em células únicas semeadas em ilhas circulares6, migração tendenciosa e alinhamento de células dentro dos limites confinados 7,8,9,10,11, e looping assimétrico do tubo de calor de frango 12.
No nível multicelular, a quiralidade celular pode ser determinada a partir da migração ou alinhamento direcional, rotação celular, dinâmica citoesqueletal e posicionamento de organela celular 7,8,9,10,11,12,13. Estabelecemos um ensaio baseado em micropatterning14 para caracterizar eficientemente o viés quiral das células aderentes 7,8,9,10. Com os micropatterns em forma de anel geometricamente confinando aglomerados celulares, as células exibem coletivamente migração direcional e alinhamento tendencioso. Um programa MATLAB foi desenvolvido para detectar e medir automaticamente o alinhamento celular em imagens de contraste de fase do anel. A direção do alinhamento celular local é quantificada com um ângulo tendencioso, dependendo de seu desvio da direção circunferencial. Após a análise estatística, o padrão do anel das células é designado como vieses no sentido anti-horário (CCW) ou no sentido horário (CW).
Este ensaio tem sido usado para caracterizar a quiralidade de fenótipos de células múltiplas (Tabela 1), e a assimetria LR das células tem sido encontrada como fenótipo específico 7,11,15. Além disso, a interrupção da dinâmica da actina e da morfologia pode resultar em uma reversão do viés quiral 7,8, e o estresse oxidativo pode alterar a quiralidade celular também9. Devido à simplicidade do procedimento e à robustez da abordagem 7,8,9,10, este ensaio de quiralidade 2D fornece uma ferramenta eficiente e confiável para determinar e estudar a quiralidade multicelular in vitro.
O objetivo deste protocolo é demonstrar o uso deste método para caracterizar a quiralidade celular. Este protocolo descreve como fabricar matrizes celulares padronizadas através da técnica de impressão de microcontatos e realizar análises de quiralidade de forma automatizada usando o programa MATLAB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricação de selos de polidimetilsiloxano (PDMS)16
- Desenhe uma matriz de anéis de microescala usando o software CAD, com um diâmetro interno de 250 μm e um diâmetro externo de 450 μm. O padrão usado neste protocolo é uma matriz 10 x 10 com uma distância de 850 μm entre os anéis.
- Imprima uma máscara de transparência do padrão na resolução desejada usando o serviço de impressão de máscaras de uma empresa de microfabização (ver Tabela de Materiais).
NOTA: As dimensões fornecidas do anel foram comprovadamente funcionas para muitos tiposde células 7. - Realizar fotolitografia ultravioleta (UV) usando a máscara contendo características desejadas para fazer um molde fotoresistista negativo (como SU-8)8.
- Cubra um wafer de silício revestido com fotoresist pela máscara de transparência fabricada nas etapas 1.1-1.2.
- Em um alinhador de contato UV, polimerize o fotoresist sob regiões transparentes da máscara por luz UV.
NOTA: Após mais lavagem e desenvolvimento, o molde mestre com características desejadas é fabricado8. Os detalhes operacionais dependem do equipamento específico utilizado.
- Prepare os prepolímeros elastoméricos PDMS misturando-se com seu agente de cura em uma proporção de 10:1 e, em seguida, lançe a mistura sobre o molde em uma placa de Petri.
- Coloque o prato em uma câmara de vácuo por 30 minutos para remover bolhas de ar em PDMS e assar em forno a 60 °C por pelo menos 2 h.
- Após a cura completa do PDMS, corte as matrizes de padrão em selos.
NOTA: Selos mais grossos (cerca de 1 cm) podem ser preferidos devido à facilidade de manuseio nas etapas posteriores da impressão de microcontatos.
2. Revestimento de lâminas de vidro
- Limpe as lâminas de vidro. Mergulhe os slides em um banho de 100% etanol, sonicate por 5 min, e depois enxágue com água.
- Repita este passo primeiro com acetona, depois com isopropanol, seguido de secagem em um fluxo de nitrogênio.
- Use um equipamento de evaporação de feixe de elétrons (E-beam) para revestir camadas de titânio e ouro em lâminas de vidro.
NOTA: Para a camada de titânio, a espessura desejada é de 15 Å (1 Å = 10-10 m). Para a camada de ouro, a espessura desejada é de 150 Å. Cubra primeiro o titânio e depois o ouro, pois a camada de titânio serve como um adesivo entre o ouro e o deslizamento de vidro. - Coloque os slides limpos na câmara de evaporação e insira cadinhos de ouro e titânio sob as persianas.
- Bombeie a câmara para criar um vácuo inferior a 10-5 Pa antes de derreter metais. Concentre o feixe de elétrons no metal e ajuste a potência para que a taxa de depósito seja apropriada para controlar a espessura da deposição.
- Abra o obturador para iniciar o depoimento de metal. Feche o obturador quando a espessura desejada for atingida.
- Troque cadinhos entre evaporação sequencial de dois metais.
- Aguarde que os cadinhos esfriem conforme necessário pelo equipamento, desabafem na câmara e levem os slides de vidro revestidos de ouro.
- Bombeie a câmara novamente para manutenção do equipamento.
NOTA: Os detalhes operacionais podem depender de um evaporador específico do feixe E. Ter uma taxa de depósito bem controlada e baixa de titânio é importante. Uma camada de titânio espessa muitas vezes leva à baixa visibilidade, especialmente para a imagem de fluorescência das células. Após o revestimento, os slides de vidro revestidos de titânio/ouro podem ser armazenados em uma câmara de vácuo seco à temperatura ambiente por pelo menos 1 mês.
3. Impressão de microcontato
- Corte o slide revestido de titânio/ouro em pedaços menores, se desejar. Uma forma quadrada de 12 mm x 12 mm é recomendada para uma aplicação típica (Figura 1B).
- Use um cortador de vidro para deslizar pela superfície para deixar uma faixa amassada, em seguida, segure o deslizamento de vidro em ambos os lados e dobre no amassado para quebrar em pequenos quartos. Evite tocar na superfície revestida com ouro.
NOTA: Para determinar visualmente qual lado do vidro é a superfície revestida em caso de tombamento acidental, compare o reflexo da luz em ambos os lados. A superfície coberta de ouro mostrará um reflexo mais brilhante, enquanto o lado não revestido terá um reflexo mais dimmer (da camada de titânio do outro lado do vidro). Uma maneira alternativa é observar as bordas do slide, e o lado do revestimento pode ser determinado a partir da superfície de corte vertical. - Limpe os slides mergulhando em 100% de etanol em uma placa de Petri com o lado dourado em um agitador orbital por pelo menos 10 minutos. Aspire o etanol, depois seque cada lâmina soprando com um fluxo de nitrogênio.
- Limpe os selos PDMS com água com sabão e depois 100% etanol. Seque os selos com gás nitrogênio.
- Prepare a solução de octadesetol de 2 mM (C18) dissolvendo 5,74 mg de pó C18 em 10 mL de 100% etanol.
NOTA: Vedar e armazene a solução C18 em temperatura ambiente. Padrões de impressão com C18 criam uma monocamada auto-montada adesivo para a qual a fibronectina e as células serão preferencialmente anexadas. - Mergulhe os selos PDMS na solução C18 com a superfície padronizada voltada para baixo para 10 s e suavemente seco com gás nitrogênio para 60 s.
NOTA: Ao secar, coloque o fluxo longe primeiro do selo (cerca de 1 m) até que a maior parte do líquido seja evaporada e, em seguida, mova lentamente o fluxo mais perto de secar totalmente o carimbo. Isto é para evitar que a solução C18 seja explodida em vez de secar no selo. - Coloque o selo de cara para baixo nos slides de ouro por 60 s antes da remoção.
- Para garantir a correta estampagem, bata suavemente as pinças nos selos para transferir corretamente os padrões. Não empurre para baixo muito forte, e o peso da pinça é tipicamente suficiente.
NOTA: A inspeção visual do selo durante a batida garantirá que o selo e o slide de vidro tenham feito contato uniformemente. - Preparem câmaras de umidade.
- Pipeta 1 mL de 70% de etanol em uma tampa de placa de Petri invertida e deitar um pedaço de parafilme para cobrir a superfície (rosto coberto para cima).
- Use pinças para levantar, deite parafilm para garantir que não haja bolhas de ar e remova o excesso de etanol, se necessário.
- Prepare a solução de 2 mM HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3): Diluir a solução de estoque de 5 μL em 5 mL de 100% de etanol.
NOTA: A solução EG3 diluída pode ser selada e armazenada a 4 °C, e o estoque EG3 não diluído deve ser armazenado a -20 °C. O tratamento EG3 é usado para tornar a região de vidro sem C18 não adesivo para as células. - Micropipette 40 μL gotículas de EG3 para cada quarto de vidro desliza para o parafilme na câmara de umidade, deixando espaço suficiente entre gotículas para explicar o espaçamento dos slides de ouro.
- Use pinças para colocar lâminas de ouro impressas em C18 de frente para as gotículas e garantir que não haja bolhas sob os slides. Empurre suavemente os slides juntos sem levantá-los para minimizar a evaporação.
NOTA: Coloque uma borda do vidro desliza para baixo perto da gota e, em seguida, abaixando lentamente a outra extremidade do vidro deslize para baixo. Se uma bolha estiver presente, empurre o deslizamento de ouro sem levantá-la até que a bolha não esteja mais presente. - Sele firmemente a placa de Petri com parafilm e deixe-a em temperatura ambiente por pelo menos 3 h.
NOTA: Se for desejada incubação extensiva, sele duas vezes a placa de Petri e deixe-a por até 24h. - Em um armário de biossegurança, coloque lâminas de ouro de frente para cima em uma placa de Petri, mergulhe e enxágue 3 vezes em 70% de etanol para remover o EG3, em seguida, deixe no etanol por 10 minutos para esterilização.
- Aspire o etanol e substitua-o por PBS estéril.
- Prepare outra câmara de umidade conforme descrito na etapa 3.9, com PBS em vez de etanol.
NOTA: Devido à diferença na tensão superficial, é mais fácil primeiro adicionar 4-5 mL de PBS para estabelecer parafilm e remover bolhas, em seguida, aspirar o excesso. - Prepare a solução de fibronectina de 50 μg/mL (outras proteínas, se desejar) em PBS e micropipette 50 μL gotículas de solução de fibronectina para cada trimestre deslizar para o parafilme, deixando algum espaço entre gotículas.
NOTA: O revestimento da fibronectina facilita a adesão celular a superfícies padronizadas. - Use pinças de wafer para colocar slides de frente para baixo nas gotículas e garantir que não haja bolhas sob os slides. Empurre suavemente os slides juntos sem levantá-los.
NOTA: Pinças de deslizamento de vidro ou pinças de wafer com pontas largas retas são recomendadas para manusear os slides. - Deixe a placa de Petri no armário de biossegurança por 30 minutos.
- Depois de 30 min, coloque os slides de ouro de frente para cima na PBS depois de enxaguar por 3 vezes.
NOTA: Os slides com padrão fibronectina podem ser armazenados em PBS a 4 °C por cerca de um mês.
4. Semeando células em slides micropatterados
- Aqueça a mídia de cultura celular e experimente em um banho de água de 37 °C.
NOTA: A seguinte descrição da subcultura é para células NIH/3T3. As condições de cultura podem variar dependendo dos tipos de células. - (Opcional) Mergulhe slides padronizados em meios culturais em uma placa de 12 poços, aqueça até 37 °C em uma incubadora antes de tentarpsinização de células para melhor fixação celular.
- Trypsinize as células, neutralize com mídia contendo FBS, centrífuga para baixo a 100 x g por 3 min e, em seguida, resuspend misturando-se bem com mídia fresca.
NOTA: Certifique-se de que as células estão totalmente dissociadas umas das outras. - Conte as células, dilua para 200.000 células/mL e adicione 0,5 mL da suspensão celular a cada poço contendo um slide de ouro.
- Agite suavemente a placa do poço algumas vezes para semeadura uniforme da célula e armazene-a em uma incubadora por 15 minutos para permitir a fixação celular.
- Após 15 minutos, verifique o acessório da célula sob um microscópio. Permitir mais tempo, se necessário.
NOTA: As células anexadas se espalharão na superfície com filopodium visível ou achatamento e não se moverão da superfície quando a placa do poço estiver suavemente batizada ou movida. - Aspire a mídia que contém células não-sectadas de cada poço e adicione 1 mL de mídia cultural. Para o tratamento medicamentoso, suplemente reagentes adicionais à mídia cultural nesta etapa.
- Cultume as células na incubadora por 24h e verifique a confluência para determinar se a quiralidade se formou.
NOTA: Acima de 75% a confluência é recomendada para a maioria dos tipos de células, e a super-confluência pode afetar a caracterização da quiralidade.
5. Coleção de imagens
- Fixar as células em confluência.
- Remova a mídia de cultura da placa do poço e enxágue uma vez com PBS.
- Adicione 4% de solução de paraformaldeído, incubar à temperatura ambiente por 15 minutos e enxágue 3 vezes com PBS.
NOTA: Se a fixação mudar significativamente a morfologia celular, a imagem antes da fixação é recomendada
- Use um microscópio de contraste de fase com a funcionalidade da câmera, imagem cada anel nos slides em alta resolução (lente de objeto 10x é suficiente para análise).
6. Caracterização da quiralidade celular (Figura 2)
- Baixe arquivos de código MATLAB para caracterização de quiralidade a partir dos arquivos suplementares (Arquivo Complementar 1).
NOTA: O código foi testado para funcionar com MATLAB_R2015b e versões posteriores nos sistemas Windows e macOS. A caixa de ferramentas de estatísticas circulares também é necessária para executar os arquivos, que podem ser encontrados na referência17. - Adicione a pasta de código e as subpas (com caixa de ferramentas de estatísticas circulares dentro) ao caminho MATLAB e abra o arquivo "ROI_selection.m". Na linha 4, altere o diretório para a pasta de dados desejada (Para usuários de janela, mude "/" para "\" nas linhas 4 e 5).
- Altere o tamanho da imagem na linha 14, com as duas primeiras figuras representando o tamanho do círculo interno do anel, enquanto as outras duas representam o exterior.
NOTA: Certifique-se de que os tamanhos de todas as imagens em uma pasta a serem analisadas são idênticos. - Clique no botão Executar para executar o código MATLAB "ROI_selection.m" para determinar a região de interesse (ROI) em imagens de contraste de fase.
- Arraste manualmente o quadrado de seleção para encaixar o anel e clique duas vezes na imagem para confirmar a seleção.
- Repita esta etapa para cada imagem da pasta (a próxima imagem aparecerá automaticamente após confirmar a seleção do ROI de uma imagem anterior); um arquivo ".mat" será gerado para armazenar as informações do ROI para cada imagem.
- Abra o arquivo "Analysis_batch.m" e altere o diretório da pasta da mesma etapa 6.2. (Para usuários de janelas, para uso pela primeira vez, mude "/" para "\" nas linhas 5, 6, 124 e 130)
- Clique no botão Executar para executar o código "Analysis_batch.m" para determinar a quiralidade de vários padrões de anéis celulares. Um arquivo "datatoexcel.txt" será gerado, contendo estatísticas circulares para cada anel, bem como os números de anéis no sentido horário, não-quiral e anti-horário.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Quinze minutos após a semeadura das células NIH/3T3, a adesão celular no padrão do anel foi confirmada visualmente por imagens de contraste de fase. Após a cultura subsequente de 24 h, as células nos padrões tornaram-se confluentes e alongadas com alinhamentos claramente assimétricos, tendenciosos em direção à direção do sentido horário (Figura 2). A migração direcional de células anexadas é registrada por imagens de lapso de tempo, motilidade celular e morfogênese podem ser quantificadas com análises adicionais do vídeo. Para realizar a análise da quiralidade, imagens de contraste de fase de alta resolução são tiradas após a fixação (Figura 2A-C) e alimentadas no programa MATLAB. O programa detecta gradientes de intensidade e calcula as direções correspondentes de alinhamento celular no anel. Em seguida, a quiralidade celular é determinada com base nas estatísticas circulares do alinhamento celular desviando-se da direção circunferencial dos anéis. As células podem, portanto, ser designadas como no sentido horário (CW), no sentido anti-horário (CCW) ou não-quiral (NC) (Figura 2D). Após o processamento, a análise mostrou que a maioria dos anéis tem um viés cw dominante, indicando que as células 3T3 têm uma forte quiralidade CW. As estatísticas circulares geradas também fornecem informações adicionais de ângulos tendenciosos para análises posteriores, se necessário (Figura 2E).
A quiralidade celular depende de seu fenótipo. Verificou-se que o ensaio de quiralidade do anel é compatível com múltiplos tipos de células 7,8,9,10, incluindo linhas celulares e células primárias, como fibroblastos, míter, células endoteliais e células-tronco (Tabela 1). Curiosamente, como a quiralidade celular é originária das funcionalidades do citoesqueleto de actina, alterações na dinâmica da actina podem impactar o viés quiral das células. Com as células de myoblast C2C12 do rato, descobrimos que, ao interromper a polimerização de actina com tratamento de latrunculina de 50 nM, as células apresentaram uma alteração do viés quiral ccw em CW (Figura 3A). Além disso, as células endoteliais vasculares umbilicais humanas (hUVECs) tratadas com uma droga de molécula pequena, 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetato (TPA), para ativar a proteína quinase c apresentaram uma mudança dependente de dose da quiralidade celular de CW para CCW (Figura 3B). Esses achados demonstram a utilidade do ensaio de quiralidade do padrão de anel desenvolvido experimentalmente, bem como a sensibilidade deste ensaio a alterações no citoesqueleto.
Figura 1. Esquema de micropatterscelular. (A) Procedimento de microfabização e impressão de microcontatos para padronização celular. Um molde fotoresist negativo foi feito por interligação ultravioleta (UV) do fotoresist através de uma máscara contendo recursos de micropatterning (1-2). Pré-iânmeros elastoméricos polidimetilas (PDMS) foram lançados no molde para criar selos (3-4). Em seguida, uma monocamada de auto-montagem adesiva (SAM), octa-decanethiol (C18), foi revestida para o selo e transferida para lâminas de vidro revestidas de ouro via impressão de microcontato (5-7), seguida pelo revestimento de etileno glicol-exterminado não adesivo, SAM, HS-(CH2)11-EG 3 (EG3) (8) e fibronectina (9). As células foram então semeadas para anexar aos padrões (10). (B) As fotos demonstram os principais passos da micropatterning celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Fluxo de trabalho de análises de imagem. (A) Coleção de imagens. Adquira imagens de contraste de fase de cada anel. (B) Insira dados no programa MATLAB executando diretório de configuração de arquivos "ROI_Selection.m" e tamanho da imagem. (C) Selecione regiões de interesse (ROIs) arrastando o quadrado de seleção para caber no anel celular e clique duas vezes para confirmar. (D) Determine o alinhamento celular e os vieses quirais executando o arquivo "Analysis_Batch.m". (E) Exemplos de saídas com um resumo de números de anéis tendenciosos e estatísticas circulares para cada anel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Resultados representativos da quiralidade das células sob tratamento medicamentoso. (A) Imagens de contraste de fase e resultados de caracterização quiralidade das células myoblast C2C12 do mouse: Controle (esquerda) e 50 nM Latrunculin A grupos tratados (à direita). Fonte vermelha arrojada indica quiralidade dominante em p < 0,05 por teste de classificação. Barras de escala: 100 μm. (B) Imagens de contraste de fase e resultados de caracterização quiralidade de células endoteliais vasculares umbilicais humanas (hUVECs) em anéis micro-padronizados: Controle (esquerda) e 30 nM Grupos tratados TPA (à direita). Fonte vermelha arrojada indica quiralidade dominante em p < 0,05 por teste de classificação. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| CW Tendencioso | CCW tendencioso |
| · Células NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) | · C2C12 (ATCC CRL-1772) |
| · Células MC3T3-E1 (ATCC CRL-2593) | · Células musculares esqueléticas humanas (Lonza CC-2661) |
| · Fibroblastos cardíacos de rato | · Uma linha de fibroblasto de câncer de pele humana (ATCC CRL-7762) |
| · Fibroblastos de pele primárias humanas (ATCC PCS-201-012) | · Células epiteliais renais caninas de Madin-Darby (ATCC CCL-34) |
| · Células-tronco derivadas de adiposos humanos | |
| · Células-tronco mesenquimais humanas | |
| · Células endoteliais vasculares umbilicais humanas (Lonza CC-2935) | |
| · Células endoteliais microvasculares do cérebro humano (sistemas celulares ACBRI-376) |
Mesa 1. Vieses quirais de diferentes tipos de células caracterizados pelo ensaio de micropatterning. CW: no sentido horário; CCW: no sentido anti-horário.
Arquivo complementar 1: Arquivos de código MATLAB para caracterização de quiralidade. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivos de codificação suplementar. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O ensaio de padronização em forma de anel descrito aqui fornece uma ferramenta fácil de usar para caracterização quantitativa da quiralidade multicelular, capaz de produzir resultados altamente confiáveis e repetíveis. A geração rápida de microambientes definidos idênticos e análises imparcial permite o processamento automatizado de alto rendimento de grandes tamanhos de amostras. Este protocolo discute a fabricação dos micropatterns do anel, padronização celular e análise automática do alinhamento celular tendencioso e movimento direcional. Este método é compatível com técnicas de imagem ao vivo para estudar motilidade celular e morfogênese quiral e pode ser potencialmente integrado em outras formas de plano para detecção de toxicidade9 ou aplicações de rastreamento de drogas.
Há algumas dicas adicionais para compartilhar. Primeiro, na etapa de impressão de microcontato, o carimbo precisa ser feito no lado dourado do vidro (pode ser difícil distinguir depois que o substrato é cortado em pedaços), e a impressão dupla deve ser evitada. Em segundo lugar, para as células que requerem outras proteínas para o apego adequado, as proteínas preferidas podem ser usadas na etapa 3.17. Em terceiro lugar, para a cultura celular, a densidade celular não deve ser muito alta, e as células não devem ser cultivadas sobre a confluência nos padrões. Caso contrário, as células podem romper o limite interno e preencher o anel em um círculo sólido. Em quarto lugar, se os padrões celulares estiverem quebrados ou incompletos após a semeadura, pode ser devido a uma transferência incompleta de padrão de C18 durante a impressão de contato (etapas 3.7-3.8). Os selos PDMS devem ser examinados por falhas. Aplicar uma força ligeiramente maior ao estampar em slides também pode ser útil. Finalmente, se as células se anexarem a toda a superfície do deslizamento de vidro sem padrões visíveis, a força aplicada na etapa 3.8 pode ser muito alta, resultando em toda a superfície sendo carimbada com C18. Também é possível que os slides estejam defeituosos ou tenham sido armazenados em PBS por muito tempo. Os padrões de monocamadas de automontagem (ou seja, C18 e EG3) devem ser usados dentro de um mês após a impressão.
Embora o ensaio proposto forneça uma ferramenta conveniente para caracterização robusta da quiralidade, existem algumas limitações. Primeiro, o ensaio de padronagem só é compatível com células aderentes. A quiralidade de células não aderentes, como células tumorais circulantes, adipócitos ou células não-mamíferas, poderia ser possivelmente analisada usando o método bicamada 3D Matrigel18,19. Em segundo lugar, para os tipos de células que têm uma forma natural de paralelepípedos e não apresentam alongamento significativo, a precisão da análise pode ser diminuída. No entanto, a quiralidade desses tipos de células pode ser caracterizada pela realização de imagens ao vivo e rastreamento do viésmigratório 7. Finalmente, o ensaio de micropatterning é um método de análise de ponto final, não destinado à cultura celular de longo prazo. Experimentos como o tratamento medicamentoso não devem exceder 72 h após a semeadura em padrões. Para aplicações que requerem tempo de tratamento prolongado, considere pré-tratar células antes da semeadura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (OD/NICHD DP2HD083961 e NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan é um Estudioso de Ciências Biomédicas (PEW 00026185), apoiado pela Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang é apoiado pela American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021).
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
