Summary
نقدم بروتوكولا لتحديد التناهية متعددة الخلايا في المختبر ، باستخدام تقنية التنميط الدقيق. يسمح هذا الفحص بالقياس الكمي التلقائي للتحيزات بين اليسار واليمين لأنواع مختلفة من الخلايا ويمكن استخدامه لأغراض الفحص.
Abstract
Chirality هي خاصية خلوية جوهرية ، والتي تصور عدم التماثل من حيث الاستقطاب على طول المحور الأيسر الأيمن للخلية. نظرا لأن هذه الخاصية الفريدة تجذب اهتماما متزايدا بسبب أدوارها المهمة في كل من التطور والمرض ، فإن طريقة القياس الكمي الموحدة لتوصيف الخلية من شأنها أن تعزز الأبحاث والتطبيقات المحتملة. في هذا البروتوكول ، نصف اختبار توصيف chirality متعدد الخلايا الذي يستخدم صفائف الخلايا المجهرية النمطية. يتم تصنيع الأنماط الدقيقة الخلوية على شرائح زجاجية مطلية بالتيتانيوم / الذهب عبر الطباعة المتناغمة الدقيقة. بعد البذر على الجزر المحددة هندسيا (على سبيل المثال ، على شكل حلقة) ، المغلفة بالبروتين ، تهاجر الخلايا في الاتجاه وتشكل محاذاة متحيزة نحو اتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة ، والتي يمكن تحليلها تلقائيا وتحديدها كميا بواسطة برنامج MATLAB مكتوب خصيصا. هنا نصف بالتفصيل تصنيع الركائز المجهرية ، وبذر الخلايا ، وجمع الصور ، وتحليل البيانات وإظهار النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام خلايا NIH / 3T3. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول سابقا في العديد من الدراسات المنشورة وهو أداة فعالة وموثوقة لدراسة الخلية في المختبر.
Introduction
يصف عدم تناسق الخلية من اليسار إلى اليمين (LR) ، المعروف أيضا باسم اليد الخلوية أو chirality ، قطبية الخلية في محور LR ومن المعترف به أنه خاصية فيزيائية حيوية أساسية ومحفوظة1،2،3،4،5. وقد لوحظت الخلية في كل من الجسم الحي والمختبر على مستويات متعددة. وكشفت النتائج السابقة عن دوران الهيكل الخلوي للأكتين في خلايا مفردة مزروعة في جزر دائرية6 ، وهجرة متحيزة ومحاذاة الخلايا داخل الحدود المحصورة7،8،9،10،11 ، وحلقة غير متماثلة لأنبوب حرارة الدجاج 12.
على المستوى متعدد الخلايا ، يمكن تحديد الخلية من الهجرة الاتجاهية أو المحاذاة ، والدوران الخلوي ، وديناميكيات الهيكل الخلوي ، وتحديد مواقع عضيات الخلية7،8،9،10،11،12،13. لقد أنشأنا14 فحصا قائما على الأنماط الدقيقة لتوصيف التحيز الدائري للخلايا الملتصقة بكفاءة7،8،9،10. مع الأنماط الدقيقة على شكل حلقة تحصر هندسيا مجموعات الخلايا ، تظهر الخلايا بشكل جماعي هجرة اتجاهية ومحاذاة متحيزة. تم تطوير برنامج MATLAB للكشف تلقائيا عن محاذاة الخلايا وقياسها في صور تباين الطور للحلقة. يتم تحديد اتجاه محاذاة الخلايا المحلية بزاوية متحيزة ، اعتمادا على انحرافها عن الاتجاه المحيطي. بعد التحليل الإحصائي ، يتم تعيين نمط الحلقة للخلايا إما على أنه تحيزات عكس اتجاه عقارب الساعة (CCW) أو تحيزات في اتجاه عقارب الساعة (CW).
وقد استخدم هذا الفحص لتوصيف الأنماط الظاهرية للخلايا المتعددة (الجدول 1)، ووجد أن عدم تناسق الخلايا LR خاص بالنمط الظاهري 7,11,15. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تعطيل ديناميكيات الأكتين والمورفولوجيا إلى عكس التحيز الدائري 7,8 ، ويمكن أن يؤدي الإجهاد التأكسدي إلى تغيير الخلية وكذلك9. بسبب بساطة الإجراء ومتانة النهج7،8،9،10 ، يوفر هذا الفحص 2D chirality أداة فعالة وموثوقة لتحديد ودراسة chirality متعددة الخلايا في المختبر.
الغرض من هذا البروتوكول هو إثبات استخدام هذه الطريقة لتوصيف الخلية chirality. يصف هذا البروتوكول كيفية تصنيع صفائف خلوية منقوشة عبر تقنية الطباعة المتناغمة الدقيقة وإجراء تحليل الدائري بطريقة آلية باستخدام برنامج MATLAB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصنيع طوابع بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان (PDMS)16
- ارسم مجموعة من الحلقات الدقيقة باستخدام برنامج CAD ، بقطر داخلي يبلغ 250 ميكرومتر وقطر خارجي يبلغ 450 ميكرومتر. النمط المستخدم في هذا البروتوكول هو صفيف 10 × 10 مع مسافة 850 ميكرومتر بين الحلقات.
- اطبع قناع شفافية للنمط بالدقة المطلوبة باستخدام خدمة طباعة الأقنعة الخاصة بشركة تصنيع دقيق (انظر جدول المواد).
ملاحظة: ثبت أن الأبعاد المقدمة للحلقة تعمل مع العديد من أنواع الخلايا7. - قم بإجراء الطباعة الحجرية الضوئية بالأشعة فوق البنفسجية (UV) باستخدام القناع الذي يحتوي على الميزات المطلوبة لصنع قالب سلبي مقاوم للضوء (مثل SU-8)8.
- قم بتغطية رقاقة السيليكون المغلفة بمغلف بمقاومة للضوء بواسطة قناع الشفافية المصنوع في الخطوات 1.1-1.2.
- على مصفف التلامس بالأشعة فوق البنفسجية ، قم ببلمرة المقاومة للضوء تحت مناطق شفافة من القناع بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: بعد مزيد من الغسيل والتطوير ، يتم تصنيع القالب الرئيسي مع الميزات المطلوبة8. تعتمد التفاصيل التشغيلية على المعدات المحددة المستخدمة.
- تحضير البوليمرات المطاطية PDMS عن طريق الخلط مع عامل المعالجة بنسبة 10: 1 ثم صب الخليط على القالب في طبق بتري.
- ضع الطبق في غرفة فراغ لمدة 30 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء في PDMS واخبزه في فرن على درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
- بعد المعالجة الكاملة لنظام إدارة الأداء (PDMS) ، قم بقطع صفائف النمط إلى طوابع.
ملاحظة: قد يفضل استخدام الطوابع الأكثر سمكا (حوالي 1 سم) نظرا لسهولة التعامل معها في الخطوات اللاحقة للطباعة بالاتصال المصغر.
2. طلاء الشرائح الزجاجية
- تنظيف الشرائح الزجاجية. انقع الشرائح في حمام الإيثانول 100٪ ، سونيكات لمدة 5 دقائق ، ثم اشطفها بالماء.
- كرر هذه الخطوة أولا باستخدام الأسيتون ، ثم باستخدام الأيزوبروبانول ، متبوعا بالتجفيف في تيار النيتروجين.
- استخدم معدات تبخر شعاع الإلكترون (E-beam) لتغطية طبقات التيتانيوم والذهب على شرائح زجاجية.
ملاحظة: بالنسبة لطبقة التيتانيوم ، يكون السمك المطلوب هو 15 Å (1 Å = 10-10 m). بالنسبة للطبقة الذهبية ، فإن السماكة المطلوبة هي 150 Å. قم بتغطية التيتانيوم أولا ثم الذهب ، حيث تعمل طبقة التيتانيوم كمادة لاصقة بين الذهب والشريحة الزجاجية. - ضع الشرائح النظيفة في غرفة التبخر وأدخل بوتقات الذهب والتيتانيوم تحت المصاريع.
- قم بالضخ لأسفل الغرفة لإنشاء فراغ أقل من 10-5 باسكال قبل ذوبان المعادن. ركز شعاع الإلكترون على المعدن واضبط الطاقة بحيث يكون معدل الإيداع مناسبا للتحكم في سمك الترسيب.
- افتح الغالق لبدء ترسيب المعدن. أغلق الغالق عند الوصول إلى السماكة المطلوبة.
- تبديل البوتقات بين التبخر المتسلسل لمعدنين.
- انتظر حتى تبرد البوتقات كما هو مطلوب من قبل المعدات ، وتنفيس الغرفة ، وأخرج الشرائح الزجاجية المطلية بالذهب.
- ضخ أسفل الغرفة مرة أخرى لصيانة المعدات.
ملاحظة: قد تعتمد التفاصيل التشغيلية على مبخر شعاع E محدد. من المهم وجود معدل إيداع منخفض ومضبوط بشكل جيد من التيتانيوم. غالبا ما تؤدي طبقة التيتانيوم السميكة إلى ضعف الرؤية ، خاصة بالنسبة للتصوير الفلوري للخلايا. بعد الطلاء ، يمكن تخزين الشرائح الزجاجية المطلية بالتيتانيوم / الذهب في غرفة فراغ جافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 شهر على الأقل.
3. الطباعة ميكروكونتاكت
- قطع الشريحة المطلية بالتيتانيوم/الذهب إلى قطع أصغر، إذا رغبت في ذلك. يوصى باستخدام شكل مربع يبلغ 12 مم × 12 مم لتطبيق نموذجي (الشكل 1B).
- استخدم قاطع زجاجي للانزلاق عبر السطح لترك مسار مسننة ، ثم أمسك الشريحة الزجاجية على كلا الجانبين وانحني عند الانحناء لاقتحام أرباع صغيرة. تجنب لمس السطح المطلي بالذهب.
ملاحظة: لتحديد أي جانب من الزجاج هو السطح المطلي بصريا في حالة الانقلاب العرضي ، قارن انعكاس الضوء على كلا الجانبين. سيظهر السطح المغطى بالذهب انعكاسا أكثر إشراقا ، في حين أن الجانب غير المطلي سيكون له انعكاس باهتة (من طبقة التيتانيوم على الجانب الآخر من الزجاج). طريقة بديلة هي مراقبة حواف الشريحة ، ويمكن تحديد جانب الطلاء من سطح القطع الرأسي. - نظف الشرائح عن طريق نقع الإيثانول بنسبة 100٪ في طبق بتري مع الجانب الذهبي لأعلى على شاكر مداري لمدة 10 دقائق على الأقل. استنشق الإيثانول ، ثم جفف كل شريحة عن طريق النفخ بتيار النيتروجين.
- نظف طوابع PDMS بالماء والصابون ثم الإيثانول 100٪. تجفيف الطوابع بغاز النيتروجين.
- تحضير محلول 2 mM octadecanethiol (C18) عن طريق إذابة 5.74 ملغ من مسحوق C18 في 10 مل من الإيثانول 100 ٪.
ملاحظة: قم بإغلاق وتخزين محلول C18 في درجة حرارة الغرفة. تخلق أنماط الطباعة باستخدام C18 طبقة أحادية لاصقة ذاتية التجميع يتم إرفاق الفيبرونيكتين والخلايا بها بشكل تفضيلي. - انقع طوابع PDMS في محلول C18 مع السطح المزخرف المواجه لأسفل لمدة 10 ثوان وجففه بلطف بغاز النيتروجين لمدة 60 ثانية.
ملاحظة: عند التجفيف، ضع التيار بعيدا عن الختم أولا (حوالي 1 متر) حتى يتبخر معظم السائل، ثم حرك التيار ببطء بالقرب من الطابع. هذا لتجنب تفجير محلول C18 بدلا من التجفيف على الختم. - ضع الختم على الشرائح الذهبية لمدة 60 ثانية قبل الإزالة.
- لضمان الختم السليم ، انقر برفق على الملقط على الطوابع لنقل الأنماط بشكل صحيح. لا تضغط لأسفل بشدة ، وعادة ما يكون وزن الملقط كافيا.
ملاحظة: سيضمن الفحص البصري للختم أثناء النقر أن الختم والشريحة الزجاجية قد اتصلوا بشكل موحد. - إعداد غرف الرطوبة.
- ماصة 1 مل من الإيثانول 70٪ في غطاء طبق بتري مقلوب ووضع قطعة من parafilm لتغطية السطح (تغطية الوجه لأعلى).
- استخدم الملقط للرفع ، ووضع parafilm لضمان عدم وجود فقاعات هواء ، وإزالة الإيثانول الزائد إذا لزم الأمر.
- تحضير محلول 2 mM HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3): قم بتخفيف محلول مخزون 5 ميكرولتر في 5 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
ملاحظة: يمكن إغلاق محلول EG3 المخفف وتخزينه عند 4 درجات مئوية، ويجب تخزين مخزون EG3 غير المخفف عند -20 درجة مئوية. يستخدم علاج EG3 لجعل المنطقة الزجاجية بدون C18 غير لاصقة للخلايا. - تنزلق قطرات Micropipette 40 ميكرولتر من EG3 لكل ربع زجاج على البارافيلم في غرفة الرطوبة ، تاركة مساحة كافية بين القطرات لحساب تباعد الشرائح الذهبية.
- استخدم الملقط لوضع شرائح الذهب المطبوعة بواسطة C18 وجها لأسفل على القطرات وضمان عدم وجود فقاعات أسفل الشرائح. ادفع الشرائح معا برفق دون رفعها لتقليل التبخر.
ملاحظة: ضع إحدى حواف الزجاج المنزلقة لأسفل بالقرب من القطرة، ثم اخفض الطرف الآخر من الزجاج ببطء لأسفل. إذا كانت الفقاعة موجودة، ادفع الشريحة الذهبية دون رفعها حتى لا تعود الفقاعة موجودة. - أغلق طبق بتري بإحكام باستخدام البارافيلم واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات على الأقل.
ملاحظة: إذا كنت ترغب في حضانة واسعة النطاق ، فقم بإغلاق طبق بتري مرتين واتركه لمدة تصل إلى 24 ساعة. - في خزانة السلامة الأحيائية ، ضع شرائح الذهب وجها لوجه في طبق بتري ، وانقع وشطف 3 مرات في الإيثانول بنسبة 70٪ لإزالة EG3 ، ثم اتركه في الإيثانول لمدة 10 دقائق للتعقيم.
- استنشاق الإيثانول واستبداله ب PBS معقم.
- قم بإعداد غرفة رطوبة أخرى كما هو موضح في الخطوة 3.9 ، باستخدام PBS بدلا من الإيثانول.
ملاحظة: نظرا للاختلاف في التوتر السطحي ، من الأسهل أولا إضافة 4-5 مل من PBS لوضع parafilm وإزالة الفقاعات ، ثم استنشاق الفائض. - تحضير محلول الفيبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل (بروتينات أخرى ، إذا رغبت في ذلك) في PBS معقمة و micropipette 50 ميكرولتر قطرات من محلول fibronectin لكل ربع ينزلق على parafilm ، تاركا بعض المساحة بين القطرات.
ملاحظة: طلاء الفيبرونيكتين يسهل التصاق الخلايا بالأسطح المنقوشة. - استخدم ملاقط الرقاقة لوضع الشرائح وجها لأسفل على القطرات وضمان عدم وجود فقاعات أسفل الشرائح. ادفع الشرائح معا برفق دون رفعها.
ملاحظة: يوصى باستخدام ملاقط الشرائح الزجاجية أو ملاقط الرقائق ذات الأطراف العريضة المستقيمة للتعامل مع الشرائح. - اترك طبق بتري في خزانة السلامة الأحيائية لمدة 30 دقيقة.
- بعد 30 دقيقة ، ضع شرائح الذهب وجها لوجه في PBS بعد الشطف لمدة 3 مرات.
ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح المنقوشة بالفيبرونيكتين في PBS عند 4 درجات مئوية لمدة شهر تقريبا.
4. بذر الخلايا على شرائح مجهرية
- قم بتسخين وسائط زراعة الخلايا والتريبسين في حمام مائي 37 درجة مئوية.
ملاحظة: الوصف التالي للزراعة الفرعية مخصص لخلايا NIH/3T3. قد تختلف ظروف الزراعة حسب أنواع الخلايا. - (اختياري) انقع الشرائح المنقوشة في وسائط الاستزراع في صفيحة من 12 بئرا ، وقم بتسخينها حتى 37 درجة مئوية في الحاضنة قبل التربسين للخلايا لتحسين ارتباط الخلايا.
- قم بالتريبسين على الخلايا ، وتحييدها باستخدام الوسائط التي تحتوي على FBS ، وأجهزة الطرد المركزي لأسفل عند 100 × g لمدة 3 دقائق ، ثم أعد تعليقها عن طريق الخلط جيدا مع الوسائط الطازجة.
ملاحظة: تأكد من انفصال الخلايا تماما عن بعضها البعض. - عد الخلايا ، وخفف إلى 200000 خلية / مل وأضف 0.5 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر يحتوي على شريحة ذهبية واحدة.
- رج صفيحة البئر بلطف عدة مرات لبذر الخلايا بشكل موحد وتخزينها في حاضنة لمدة 15 دقيقة للسماح بتركيب الخلية.
- بعد 15 دقيقة، تحقق من مرفق الخلية تحت المجهر. اسمح بوقت إضافي، إذا لزم الأمر.
ملاحظة: سوف تنتشر الخلايا المرفقة على السطح مع الفيلوبوديوم المرئي أو التسطيح ولن تتحرك من السطح عندما يتم النقر على صفيحة البئر أو تحريكها بلطف. - استنشاق الوسائط التي تحتوي على خلايا غير متصلة من كل بئر وإضافة 1 مل من وسائط الاستزراع. للعلاج من تعاطي المخدرات ، استكمل كواشف إضافية لوسائل الإعلام الثقافية في هذه الخطوة.
- استزرع الخلايا في الحاضنة لمدة 24 ساعة وتحقق من الالتقاء لتحديد ما إذا كانت chirality قد تشكلت.
ملاحظة: يوصى بالالتقاء فوق 75٪ لمعظم أنواع الخلايا ، وقد يؤثر الإفراط في الالتقاء على توصيف chirality.
5. جمع الصور
- إصلاح الخلايا عند الالتقاء.
- قم بإزالة وسائط الثقافة من لوحة البئر وشطفها مرة واحدة باستخدام PBS.
- أضف 4٪ من محلول بارافورمالدهيد ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، ثم اشطفه 3 مرات باستخدام PBS.
ملاحظة: إذا كان التثبيت يغير بشكل كبير مورفولوجيا الخلية، يوصى بالتصوير قبل التثبيت
- استخدم مجهر تباين الطور مع وظيفة الكاميرا ، وصور كل حلقة على الشرائح بدقة عالية (عدسة كائن 10x كافية للتحليل).
6. توصيف الخلية (الشكل 2)
- قم بتنزيل ملفات التعليمات البرمجية MATLAB لتوصيف chirality من الملفات التكميلية (الملف التكميلي 1).
ملاحظة: تم اختبار التعليمة البرمجية للعمل مع MATLAB_R2015b والإصدارات الأحدث على كل من نظامي التشغيل Windows و macOS. كما أن مجموعة أدوات الإحصاءات الدائرية مطلوبة لتشغيل الملفات، والتي يمكن العثور عليها في المرجع17. - أضف مجلد التعليمات البرمجية والمجلدات الفرعية (مع مربع أدوات الإحصاءات الدائرية في الداخل) إلى مسار MATLAB وافتح ملف "ROI_selection.m". في السطر 4 ، قم بتغيير الدليل إلى مجلد البيانات المطلوب (بالنسبة لمستخدمي النوافذ ، قم بتبديل "/" إلى "\" في السطرين 4 و 5).
- قم بتغيير حجم الصورة في السطر 14 ، حيث يمثل أول شكلين حجم الدائرة الداخلية للحلقة بينما يمثل الشكلان الآخران الشكل الخارجي.
ملاحظة: تأكد من أن أحجام كافة الصور في مجلد المراد تحليله متطابقة. - انقر فوق الزر "تشغيل" لتنفيذ رمز MATLAB "ROI_selection.m " لتحديد منطقة الاهتمام (ROI) في صور تباين الطور.
- اسحب مربع التحديد يدويا لاحتواء الحلقة، ثم انقر نقرا مزدوجا فوق الصورة لتأكيد التحديد.
- كرر هذه الخطوة لكل صورة في المجلد (ستظهر الصورة التالية تلقائيا بعد تأكيد تحديد عائد الاستثمار لصورة سابقة) ؛ سيتم إنشاء ملف ".mat" لتخزين معلومات عائد الاستثمار لكل صورة.
- افتح ملف "Analysis_batch.m" وقم بتغيير دليل المجلد نفسه مثل الخطوة 6.2. (بالنسبة لمستخدمي النوافذ، ولأول مرة، قم بتبديل "/" إلى "\" في الأسطر 5 و6 و124 و130)
- انقر فوق الزر "تشغيل" لتنفيذ الرمز "Analysis_batch.m " لتحديد مدى تناغم أنماط الحلقات الخلوية المتعددة. سيتم إنشاء ملف "datatoexcel.txt" ، يحتوي على إحصائيات دائرية لكل حلقة بالإضافة إلى أرقام الحلقات في اتجاه عقارب الساعة وغير الدائرية وعكس اتجاه عقارب الساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد خمس عشرة دقيقة من بذر خلايا NIH / 3T3 ، تم تأكيد التصاق الخلايا على نمط الحلقة بصريا عن طريق التصوير بتباين الطور. بعد زراعة لاحقة لمدة 24 ساعة ، أصبحت الخلايا الموجودة على الأنماط ملتقية وممدودة مع محاذاة غير متماثلة بشكل واضح ، متحيزة نحو اتجاه عقارب الساعة (الشكل 2). يتم تسجيل الهجرة الاتجاهية للخلايا المرفقة عن طريق التصوير بفاصل زمني ، ويمكن تحديد حركة الخلية وتكوين التشكل مع مزيد من التحليلات للفيديو. لإجراء تحليل التباين الطوري ، يتم التقاط صور تباين الطور عالية الدقة بعد التثبيت (الشكل 2A-C) وإدخالها في برنامج MATLAB. يكتشف البرنامج تدرجات الكثافة ويحسب اتجاهات محاذاة الخلايا المقابلة على الحلقة. ثم يتم تحديد chirality الخلية على أساس الإحصاءات الدائرية لمحاذاة الخلايا المنحرفة عن الاتجاه المحيطي للحلقات. وبالتالي، يمكن تعيين الخلايا على أنها في اتجاه عقارب الساعة (CW)، أو عكس اتجاه عقارب الساعة (CCW)، أو غير دائرية (NC) (الشكل 2D). بعد المعالجة ، أظهر التحليل أن غالبية الحلقات لديها تحيز مهيمن على CW ، مما يشير إلى أن خلايا 3T3 لديها تقارب CW قوي. وتوفر الإحصاءات الدائرية التي تم إنشاؤها أيضا معلومات إضافية عن الزوايا المتحيزة لإجراء مزيد من التحليلات إذا لزم الأمر (الشكل 2 هاء).
تعتمد الخلية على نمطها الظاهري. تم التحقق من أن اختبار الدائري الحلقي متوافق مع أنواع الخلايا المتعددة7،8،9،10 ، بما في ذلك كل من خطوط الخلايا والخلايا الأولية ، مثل الخلايا الليفية ، والأرومة العضلية ، والخلايا البطانية ، والخلايا الجذعية (الجدول 1). ومن المثير للاهتمام ، نظرا لأن الخلية تنشأ من وظائف الهيكل الخلوي للأكتين ، فإن التغييرات في ديناميكيات الأكتين قد تؤثر على التحيز الدائري للخلايا. مع خلايا الفأر myoblast C2C12 ، وجدنا أنه من خلال تعطيل بلمرة الأكتين باستخدام علاج 50 نانومتر من اللاترونكولين A ، أظهرت الخلايا تغييرا في التحيز الدائري CCW إلى CW (الشكل 3A). وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا البطانية الوعائية السرية البشرية (hUVECs) المعالجة بعقار جزيء صغير، 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)، لتنشيط بروتين كيناز ج أظهرت تحولا يعتمد على الجرعة من الجيرالية الخلوية من الأسلحة الكيميائية إلى اتفاقية الأسلحة التقليدية (الشكل 3 باء). توضح هذه النتائج فائدة اختبار نمط الحلقة المطور تجريبيا بالإضافة إلى حساسية هذا الفحص للتغيرات في الهيكل الخلوي.
الشكل 1. مخطط الأنماط الدقيقة الخلوية. (أ) إجراء التصنيع الدقيق والطباعة الدقيقة لنقش الخلايا. تم صنع قالب سلبي مقاوم للضوء بواسطة الربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية (UV) للمقاومة الضوئية عبر قناع يحتوي على ميزات النقوش الدقيقة (1-2). تم صب البوليمرات المرنة Polydimethylsiloxane (PDMS) على القالب لإنشاء طوابع (3-4). بعد ذلك ، تم طلاء طبقة أحادية التجميع الذاتي اللاصقة (SAM) ، ثماني عشريات (C18) ، على الختم ونقلها إلى شرائح زجاجية مغلفة بالذهب عبر الطباعة الدقيقة (5-7) ، تليها طلاء SAM غير اللاصق المنهى بالإيثيلين جلايكول ، HS-(CH2) 11-EG 3 (EG3) (8) ، و fibronectin (9). ثم تم زرع الخلايا لتلتصق بالأنماط (10). (ب) توضح الصور الخطوات الرئيسية للتنميط الدقيق للخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. سير عمل تحليلات التصوير. (أ) جمع الصور. احصل على صور تباين الطور لكل حلقة. (ب) إدخال البيانات في برنامج MATLAB عن طريق تشغيل دليل إعداد الملف "ROI_Selection.m" وحجم الصورة. (ج) حدد مناطق الاهتمام (ROIs) عن طريق سحب مربع التحديد ليناسب الحلقة الخلوية وانقر نقرا مزدوجا للتأكيد. (د) تحديد محاذاة الخلايا والتحيزات الدائرية عن طريق تشغيل ملف "Analysis_Batch.m". (ه) أمثلة على النواتج مع موجز لأرقام الحلقات المتحيزة والإحصاءات الدائرية لكل حلقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. النتائج التمثيلية لتشابك الخلايا تحت العلاج بالعقاقير. (أ) صور تباين الطور ونتائج توصيف الجيرالية لخلايا الكتلة العضلية للفأر C2C12: التحكم (يسار) و 50 نانومتر Latrunculin A المجموعات المعالجة (يمين). يشير الخط الأحمر الغامق إلى التناغم المهيمن عند p < 0.05 حسب اختبار الرتبة. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر (B) صور تباين الطور ونتائج توصيف الوعائية الدائرية للخلايا البطانية الوعائية السرية البشرية (hUVECs) على حلقات ذات أنماط دقيقة: التحكم (يسار) والمجموعات المعالجة ب 30 نانومتر TPA (يمين). يشير الخط الأحمر الغامق إلى التناغم المهيمن عند p < 0.05 حسب اختبار الرتبة. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| CW منحازة | اتفاقية الأسلحة التقليدية متحيزة |
| · خلايا NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) | · C2C12 (ATCC CRL-1772) |
| · خلايا MC3T3-E1 (ATCC CRL-2593 ) | · خلايا العضلات الهيكلية البشرية (Lonza CC-2661) |
| · الخلايا الليفية القلبية الفئران | · خط الخلايا الليفية لسرطان الجلد البشري (ATCC CRL-7762) |
| · الخلايا الليفية الجلدية الأولية البشرية (ATCC PCS-201-012) | · الخلايا الظهارية للكلاب في مدينة داربي (ATCC CCL-34) |
| · الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون | |
| · الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية | |
| · الخلايا البطانية الوعائية السرية البشرية (Lonza CC-2935) | |
| · الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للدماغ البشري (أنظمة الخلايا ACBRI-376) |
الجدول 1. التحيزات الدائرية لأنواع الخلايا المختلفة التي تتميز بفحص الأنماط الدقيقة. CW: في اتجاه عقارب الساعة؛ اتفاقية الأسلحة التقليدية: عكس اتجاه عقارب الساعة.
الملف التكميلي 1: ملفات رمز MATLAB لتوصيف chirality. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
ملفات الترميز التكميلية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر اختبار النقش على شكل حلقة الموصوف هنا أداة سهلة الاستخدام للتوصيف الكمي للجيرالية متعددة الخلايا ، قادرة على إنتاج نتائج موثوقة للغاية وقابلة للتكرار. يتيح التوليد السريع للبيئات الدقيقة المحددة المتطابقة والتحليل غير المتحيز المعالجة الآلية عالية الإنتاجية لحجم كبير من العينات. يناقش هذا البروتوكول تصنيع الأنماط الدقيقة الحلقية ، ونمط الخلايا ، والتحليل التلقائي لمحاذاة الخلايا المتحيزة والحركة الاتجاهية. هذه الطريقة متوافقة مع تقنيات التصوير الحي لدراسة حركية الخلية والتحول الدائري ويمكن دمجها في أشكال أخرى للكشف عن السمية9 أو تطبيقات فحص الأدوية.
هناك بعض النصائح الإضافية لمشاركتها. أولا ، في خطوة الطباعة الدقيقة ، يجب أن يتم الختم على الجانب الذهبي من الزجاج (قد يكون من الصعب التمييز بعد قطع الركيزة إلى قطع) ، ويجب تجنب الطباعة المزدوجة. ثانيا ، بالنسبة للخلايا التي تتطلب بروتينات أخرى للتعلق السليم ، يمكن استخدام البروتينات المفضلة في الخطوة 3.17. ثالثا ، بالنسبة لزراعة الخلايا ، يجب ألا تكون كثافة الخلايا عالية جدا ، ويجب ألا تنمو الخلايا بشكل مفرط على الأنماط. خلاف ذلك ، قد تخترق الخلايا الحدود الداخلية وتملأ الحلقة في دائرة صلبة. رابعا ، إذا كانت أنماط الخلايا مكسورة أو غير مكتملة بعد البذر ، فقد يكون ذلك بسبب نقل غير مكتمل لنمط C18 أثناء الطباعة التلامسية (الخطوات 3.7-3.8). يجب فحص طوابع PDMS بحثا عن عيوب. يمكن أن يكون تطبيق قوة أعلى قليلا عند الختم على الشرائح مفيدا أيضا. وأخيرا، إذا كانت الخلايا تلتصق بكامل سطح الشريحة الزجاجية دون أنماط مرئية، فقد تكون القوة المطبقة في الخطوة 3.8 مرتفعة جدا، مما يؤدي إلى ختم السطح بأكمله ب C18. من الممكن أيضا أن تكون الشرائح معيبة أو تم تخزينها في PBS لفترة طويلة جدا. يجب استخدام أنماط الطبقات الأحادية ذاتية التجميع (أي C18 و EG3) في غضون شهر بعد الطباعة.
على الرغم من أن الفحص المقترح يوفر أداة ملائمة لتوصيف chirality القوي ، إلا أن هناك بعض القيود. أولا ، لا يتوافق اختبار النقش إلا مع الخلايا الملتصقة. يمكن تحليل تشابك الخلايا غير الملتصقة ، مثل الخلايا السرطانية المتداولة أو الخلايا الشحمية أو الخلايا غير الثديية ، باستخدام طريقة الطبقة الثنائية 3D Matrigel18,19. ثانيا ، بالنسبة لأنواع الخلايا التي لها شكل مرصوف بالحصى الطبيعي ولا تظهر استطالة كبيرة ، قد تنخفض دقة التحليل. ومع ذلك ، يمكن وصف خصوصية هذه الأنواع من الخلايا بإجراء التصوير الحي وتتبع تحيز الهجرة7. وأخيرا ، فإن اختبار الأنماط الدقيقة هو طريقة تحليل نقطة النهاية ، وليس المقصود منها زراعة الخلايا على المدى الطويل. يجب ألا تتجاوز التجارب مثل العلاج بالعقاقير 72 ساعة بعد البذر على الأنماط. بالنسبة للتطبيقات التي تتطلب وقتا طويلا للعلاج ، فكر في المعالجة المسبقة للخلايا قبل البذر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (OD/NICHD DP2HD083961 و NHBLI R01HL148104). ليو كيو وان هو باحث في بيو في العلوم الطبية الحيوية (PEW 00026185) ، بدعم من صناديق بيو الخيرية. يتم دعم Haokang Zhang من قبل زمالة ما قبل الدكتوراه التابعة لجمعية القلب الأمريكية (20PRE35210243).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021).
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
