Summary
Vi presenterer en protokoll for å bestemme multicellulær chirality in vitro, ved hjelp av mikropatteringsteknikken. Denne analysen muliggjør automatisk kvantifisering av venstre-høyre-fordommene til ulike typer celler og kan brukes til screeningformål.
Abstract
Chirality er en iboende cellulær egenskap, som skildrer asymmetrien når det gjelder polarisering langs cellens venstre høyre akse. Ettersom denne unike egenskapen tiltrekker seg økende oppmerksomhet på grunn av sine viktige roller i både utvikling og sykdom, vil en standardisert kvantifiseringsmetode for karakterisering av celle chirality fremme forskning og potensielle applikasjoner. I denne protokollen beskriver vi en multicellulær chirality karakteriseringsanalyse som bruker mikropatterned matriser av celler. Cellulære mikropatterner fremstilles på titan-/gullbelagte glasssklier via mikrokontakttrykk. Etter sådd på de geometrisk definerte (f.eks. ringformede), proteinbelagte øyer, migrerer celler retningsbestemt og danner en partisk justering mot enten urviseren eller mot klokken, som automatisk kan analyseres og kvantifiseres av et spesialskrevet MATLAB-program. Her beskriver vi i detalj fabrikasjonen av mikropatterned substrater, cellesåing, bildeinnsamling og dataanalyse og viser representative resultater oppnådd ved hjelp av NIH / 3T3-cellene. Denne protokollen har tidligere blitt validert i flere publiserte studier og er et effektivt og pålitelig verktøy for å studere celle chirality in vitro.
Introduction
Venstre-høyre (LR) asymmetri av cellen, også kjent som cellulær handedness eller chirality, beskriver cellepolariteten i LR-aksen og er anerkjent for å være en grunnleggende, bevart, biofysisk egenskap 1,2,3,4,5. Celle chirality har blitt observert både in vivo og in vitro på flere skalaer. Tidligere funn avdekket chiral virveling av aktin cytoskeleton i enkeltceller frøet på sirkulære øyer6, partisk migrasjon og justering av celler innenfor begrensede grenser 7,8,9,10,11, og asymmetrisk looping av kylling varmerør12.
På multicellulært nivå kan celle chiralitet bestemmes fra retningsbestemt migrasjon eller justering, cellulær rotasjon, cytoskeletal dynamikk og celleorganellposisjonering 7,8,9,10,11,12,13. Vi har etablert en mikropatterning-basert14 analyse for effektivt å karakterisere chiral bias av adherent celler 7,8,9,10. Med de ringformede mikropatternene som geometrisk begrenser celleklynger, viser cellene samlet retningsvandring og partisk justering. Et MATLAB-program ble utviklet for automatisk å oppdage og måle cellejustering i fasekontrastbilder av ringen. Retningen for lokal cellejustering kvantifiseres med en partisk vinkel, avhengig av avviket fra omkretsretningen. Etter statistisk analyse betegnes ringmønsteret av celler enten som mot klokken (CCW) skjevheter eller med klokken (CW) skjevheter.
Denne analysen har blitt brukt til å karakterisere kiraliteten til flere cellefenotyper (tabell 1), og LR-asymmetrien av celler har vist seg å være fenotype-spesifikke 7,11,15. Videre kan forstyrrelser i aktindynamikk og morfologi føre til en reversering av kiral bias 7,8, og oksidativt stress kan også endre celle chiralitet samt9. På grunn av enkelheten i prosedyren og robustheten til tilnærmingen 7,8,9,10, gir denne 2D chirality-analysen et effektivt og pålitelig verktøy for å bestemme og studere multicellulær chirality in vitro.
Formålet med denne protokollen er å demonstrere bruken av denne metoden for å karakterisere celle chiralitet. Denne protokollen beskriver hvordan man fremstiller mønstrede cellulære arrayer via mikrokontaktutskriftsteknikk og utfører chiralitetsanalyse på en automatisert måte ved hjelp av MATLAB-programmet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabrikasjon av polydimetylsiloksan (PDMS) frimerker16
- Tegn en rekke mikroskalaringer ved hjelp av CAD-programvare, med en indre diameter på 250 μm og en ytre diameter på 450 μm. Mønsteret som brukes i denne protokollen er en 10 x 10 matrise med en avstand på 850 μm mellom ringer.
- Skriv ut en gjennomsiktighetsmaske av mønsteret med ønsket oppløsning ved hjelp av et mikrofabrikasjonsfirmas maskeutskriftstjeneste (se Materialfortegnelse).
MERK: Ringens medfølgende dimensjoner har vist seg å fungere for mange celletyper7. - Utfør ultrafiolett (UV) fotolitografi ved hjelp av masken som inneholder ønskede funksjoner for å lage en negativ fotoresistform (for eksempel SU-8)8.
- Dekk en silisiumskive spin-belagt med fotoresist av gjennomsiktighetsmasken fremstilt i trinn 1.1-1.2.
- På en UV-kontaktjustering polymeriserer du fotoresisten under gjennomsiktige områder av masken med UV-lys.
MERK: Etter videre vask og utvikling fremstilles masterformen med ønskede funksjoner8. Driftsdetaljene avhenger av det spesifikke utstyret som brukes.
- Forbered PDMS elastomeriske prepolymerer ved å blande med herdemiddelet med et 10:1-forhold og deretter kaste blandingen på formen i en Petri-tallerken.
- Plasser fatet i et vakuumkammer i 30 min for å fjerne luftbobler i PDMS og bake i en ovn ved 60 °C i minst 2 timer.
- Når du har fullstendig herding av PDMS, klipper du mønstermatrisene i stempler.
MERK: Tykkere frimerker (ca. 1 cm) kan foretrekkes på grunn av enkel håndtering ved de senere trinnene i mikrokontaktutskrift.
2. Belegg av glasssklier
- Rengjør glasssklier. Bløtlegg lysbildene i et 100% etanolbad, soniker i 5 min, og skyll deretter med vann.
- Gjenta dette trinnet først med aceton, deretter med isopropanol, etterfulgt av tørking i en nitrogenstrøm.
- Bruk et elektronstråle (E-beam) fordampningsutstyr for å belegge titan- og gulllag på glasssklier.
MERK: For titanlaget er ønsket tykkelse 15 Å (1 Å = 10-10 m). For gulllaget er ønsket tykkelse 150 Å. Frakk titan først og deretter gull, da titanlaget fungerer som et lim mellom gull og glasssklie. - Plasser de rensede skliene i fordampningskammeret og sett inn gull- og titandigler under skoddene.
- Pump ned kammeret for å lage et vakuum lavere enn 10-5 Pa før du smelter metaller. Fokuser elektronstrålen på metallet og juster kraften slik at avsetningshastigheten er egnet for å kontrollere avsetningstykkelsen.
- Åpne lukkeren for å starte metallavsetningen. Lukk lukkeren når ønsket tykkelse er nådd.
- Bytt digler mellom sekvensiell fordampning av to metaller.
- Vent til diglene avkjøles etter behov av utstyret, luft kammeret og ta ut det gullbelagte glasset.
- Pump ned kammeret igjen for vedlikehold av utstyr.
MERK: Driftsdetaljene kan avhenge av en bestemt E-strålefordamper. Å ha en godt kontrollert, lav avsetningshastighet på titan er viktig. Et tykt titanlag fører ofte til dårlig synlighet, spesielt for fluorescensavbildning av cellene. Etter belegg kan de titan-/gullbelagte glasssklier lagres i et tørt vakuumkammer ved romtemperatur i minst 1 måned.
3. Mikrokontakt utskrift
- Skjær den titan-/gullbelagte sklien i mindre biter, om ønskelig. En firkantet form på 12 mm x 12 mm anbefales for en vanlig påføring (figur 1B).
- Bruk en glasskutter til å gli over overflaten for å etterlate et bulket spor, hold deretter glasssklie på begge sider og bøy ved bulken for å bryte inn i små kvartaler. Unngå å berøre overflaten belagt med gull.
MERK: For å visuelt finne ut hvilken side av glasset som er den belagte overflaten i tilfelle utilsiktet velte over, sammenligne refleksjonen av lys på begge sider. Den gulldekkede overflaten vil vise en lysere refleksjon, mens den ikke-belagte siden vil ha en dimmerrefleksjon (fra titanlaget på den andre siden av glasset). En alternativ måte er å observere kantene på lysbildet, og beleggsiden kan bestemmes fra den vertikale skjæreflaten. - Rengjør skliene ved å suge i 100% etanol i en Petri-tallerken med gullsiden opp på en orbital shaker i minst 10 minutter. Aspirer ut etanolet, og tørk deretter hvert lysbilde ved å blåse med en nitrogenstrøm.
- Rengjør PDMS-stemplene med såpevann og deretter 100% etanol. Tørk frimerkene med nitrogengass.
- Forbered 2 mM octadecanethiol (C18) oppløsning ved å oppløse 5,74 mg C18 pulver i 10 ml 100% etanol.
MERK: Forsegle og oppbevar C18-oppløsning ved romtemperatur. Utskriftsmønstre med C18 skaper et selvmontert monolag som fibronektin og celler fortrinnsvis vil feste seg til. - Bløtlegg PDMS-stemplene i C18-oppløsningen med den mønstrede overflaten vendt ned i 10 s og tørk forsiktig med nitrogengass i 60 s.
MERK: Når du tørker, plasser bekken bort fra stempelet først (ca. 1 m) til det meste av væsken fordampes, og beveg deretter bekken sakte nærmere for å tørke stempelet helt. Dette for å unngå at C18-løsningen blåses bort i stedet for å tørke på stempelet. - Legg stempelet med forsiden ned på gullsklier i 60 s før fjerning.
- For å sikre riktig stempling, trykk forsiktig på pinsettene på stemplene for å overføre mønstrene riktig. Ikke trykk for hardt ned, og vekten av pinsett er vanligvis tilstrekkelig.
MERK: Visuell inspeksjon av stempelet under tapping vil sikre at stempelet og glassskuffen har tatt kontakt jevnt. - Forbered fuktighetskamre.
- Pipette 1 ml 70% etanol i et omvendt Petri-parabolens lokk og legg ned et stykke parafilm for å dekke overflaten (dekket med forsiden opp).
- Bruk pinsett til å løfte, legge ned parafilm for å sikre ingen luftbobler, og fjern overflødig etanol om nødvendig.
- Forbered 2 mM HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3)-løsning: Fortynn 5 μL lagerløsning i 5 ml 100% etanol.
MERK: Den fortynnede EG3-oppløsningen kan forsegles og oppbevares ved 4 °C, og ufortynnet EG3-lager skal oppbevares ved -20 °C. EG3-behandlingen brukes til å lage glassområdet uten C18 ikke-lim til celler. - Mikropipette 40 μL dråper EG3 for hvert kvart glass glir på parafilmen i fuktighetskammeret, slik at nok plass mellom dråper til å ta hensyn til avstanden mellom gullsklier.
- Bruk pinsett til å plassere C18-trykte gullsklier med forsiden ned på dråpene og sikre at det ikke er bobler under lysbildene. Skyv lysbildene forsiktig sammen uten å løfte dem for å minimere fordampning.
MERK: Plasser den ene kanten av glasset ned i nærheten av dråpen, og senk deretter den andre enden av glasset langsomt ned. Hvis det er en boble til stede, skyver du gullsklie uten å løfte den til boblen ikke lenger er til stede. - Forsegle Petri-retten tett med parafilm og la den stå ved romtemperatur i minst 3 timer.
MERK: Hvis det ønskes omfattende inkubasjon, forsegler du Petri-retten og lar den stå i opptil 24 timer. - I et biosikkerhetsskap legger du gullsklier med forsiden opp i en Petri-tallerken, suger og skyller 3 ganger i 70% etanol for å fjerne EG3, og la det stå i etanol i 10 minutter for sterilisering.
- Aspirer ut etanolet og erstatt det med steril PBS.
- Forbered et annet fuktighetskammer som beskrevet i trinn 3.9, med PBS i stedet for etanol.
MERK: På grunn av forskjellen i overflatespenning er det lettere å først legge til 4-5 ml PBS for å legge ned parafilm og fjerne bobler, og deretter aspirere ut overskuddet. - Forbered 50 μg/ml fibronektinoppløsning (andre proteiner, om ønskelig) i steril PBS og mikropipette 50 μL dråper fibronektinoppløsning for hvert kvartal glir på parafilmen, og etterlater litt plass mellom dråper.
MERK: Fibronectinbelegg letter celleadhesjon til mønstrede overflater. - Bruk wafer pinsett til å plassere lysbilder med forsiden ned på dråpene og sikre ingen bobler under lysbildene. Skyv lysbildene forsiktig sammen uten å løfte dem.
MERK: Glasssklie pinsett eller wafer pinsett med rette brede spisser anbefales for håndtering av lysbildene. - La Petri-retten stå i biosikkerhetsskapet i 30 min.
- Etter 30 min, plasser gullsklierene med forsiden opp i PBS etter skylling i 3 ganger.
MERK: Fibronectin-mønstrede lysbilder kan lagres i PBS ved 4 °C i omtrent en måned.
4. Såing celler på mikropatterned lysbilder
- Varm opp cellekulturmediene og trypsin i et 37 °C vannbad.
MERK: Følgende beskrivelse av subkultur er for NIH/3T3 celler. Kulturforholdene kan variere avhengig av celletyper. - (Valgfritt) Soak mønstret lysbilder i kulturmedier i en 12-brønns plate, varme opp til 37 °C i en inkubator før trypsinisering av celler for bedre cellevedlegg.
- Prøv cellene, nøytraliser med FBS-inneholdende medier, sentrifuger ned på 100 x g i 3 minutter, og deretter resuspend ved å blande godt med friske medier.
MERK: Pass på at cellene er helt dissosiert fra hverandre. - Tell cellene, fortynn til 200.000 celler / ml og tilsett 0,5 ml av celleopphenget til hver brønn som inneholder ett gullsklie.
- Rist forsiktig brønnplaten et par ganger for jevn cellesåing og oppbevar den i en inkubator i 15 minutter for å tillate cellefeste.
- Etter 15 min, kontroller cellevedlegget under et mikroskop. Tillat ekstra tid om nødvendig.
MERK: De vedlagte cellene vil spre seg ut på overflaten med synlig filopodium eller sammenslåing og vil ikke bevege seg fra overflaten når brønnplaten forsiktig bankes eller flyttes. - Aspirer ut mediet som inneholder uattrerte celler fra hver brønn og tilsett 1 ml kulturmedier. For narkotikabehandling, supplere ytterligere reagenser til kulturmedier på dette trinnet.
- Kultur cellene i inkubatoren i 24 timer og sjekk samløp for å avgjøre om chirality har dannet seg.
MERK: Over 75 % samløp anbefales for de fleste celletyper, og oversamtid kan påvirke kiralitetskarakteriseringen.
5. Bildesamling
- Fest cellene ved samløp.
- Fjern kulturmedier fra brønnplaten og skyll én gang med PBS.
- Tilsett 4% paraformaldehydoppløsning, inkuber ved romtemperatur i 15 min, skyll deretter 3 ganger med PBS.
MERK: Hvis fikseringen endrer cellemorfologien betydelig, anbefales avbildning før fiksering
- Bruk et fasekontrastmikroskop med kamerafunksjonalitet, bilde hver ring på lysbildene med høy oppløsning (10x objektlinse er tilstrekkelig for analyse).
6. Karakterisering av celle chiralitet (figur 2)
- Last ned MATLAB-kodefiler for chirality-karakterisering fra tilleggsfilene (Tilleggsfil 1).
MERK: Koden er testet for å fungere med MATLAB_R2015b og senere versjoner på både Windows- og macOS-systemer. Den sirkulære statistikkverktøykassen er også nødvendig for å kjøre filene, som du finner i referanse17. - Legg til kodemappen og undermappene (med sirkulær statistikkverktøykasse inni) i MATLAB-banen og åpne filen "ROI_selection.m". I linje 4 endrer du katalogen til ønsket datamappe (for vindusbrukere bytter du "/" til "\" i linje 4 og 5).
- Endre bildestørrelsen på linje 14, med de to første figurene som representerer ringens indre sirkelstørrelse, mens de to andre representerer den ytre.
MERK: Kontroller at størrelsen på alle bildene i en mappe som skal analyseres, er identiske. - Klikk på Kjør-knappen for å utføre MATLAB-koden "ROI_selection.m" for å bestemme interesseområdet (ROI) i fasekontrastbilder.
- Dra markeringsplassen manuelt slik at den passer til ringen, og dobbeltklikk deretter bildet for å bekrefte markeringen.
- Gjenta dette trinnet for hvert bilde i mappen (det neste bildet dukker automatisk opp etter å ha bekreftet avkastningen på et tidligere bilde); En ".mat"-fil genereres for å lagre AVKASTNINGEN-informasjonen for hvert bilde.
- Åpne filen "Analysis_batch.m" og endre mappen for mappen på samme måte som trinn 6.2. (For vindusbrukere bytter du /for første gangs bruk til "\" i linje 5, 6, 124 og 130)
- Klikk på Kjør-knappen for å utføre koden "Analysis_batch.m" for å bestemme chiraliteten til flere mobilringmønstre. En "datatoexcel.txt" fil vil bli generert, som inneholder sirkulær statistikk for hver ring, samt antall urviseren, ikke-chiral og mot urviseren ringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Femten minutter etter sådd av NIH/3T3-celler ble celleadhesjon på ringmønsteret visuelt bekreftet ved fasekontrastavbildning. Etter påfølgende kultur på 24 timer ble celler på mønstrene konfluensielle og langstrakte med klart asymmetriske justeringer, partisk mot urviseren (figur 2). Retningsvandring av vedlagte celler registreres ved tidsforløpavbildning, cellemotilitet og morfogenese kan kvantifiseres med videre analyser av videoen. For å utføre chiralitetsanalyser tas høyoppløselige fasekontrastbilder etter fiksering (figur 2A-C) og mates inn i MATLAB-programmet. Programmet oppdager intensitetsgradienter og beregner tilsvarende cellejusteringsretninger på ringen. Deretter bestemmes celle chirality basert på den sirkulære statistikken over cellejustering som avviker fra ringenes omkretsretning. Cellene kan derfor betegnes som med klokken (faktisk vekt), mot klokken (CCW) eller ikke-chiral (NC) (figur 2D). Etter behandling viste analysen at flertallet av ringene har en dominerende CW-bias, noe som indikerer at 3T3 celler har en sterk CW-chiralitet. Sirkulær statistikk som genereres gir også tilleggsinformasjon om partiske vinkler for videre analyser ved behov (figur 2E).
Celle chirality avhenger av fenotypen. Ring chirality-analysen er verifisert for å være kompatibel med flere celletyper 7,8,9,10, inkludert både cellelinjer og primærceller, for eksempel fibroblaster, myoblast, endotelceller og stamceller (tabell 1). Interessant, fordi celle chirality stammer fra funksjonene til aktin cytoskeleton, kan endringer i aktindynamikk påvirke kjikvadral bias av celler. Med mus myoblast C2C12 celler, fant vi at ved å forstyrre aktinpolymerisering med 50 nM Latrunculin A-behandling, viste cellene en endring av CCW chiral bias i CW (figur 3A). I tillegg behandlet humane navlestrengsvaskulære endotelceller (hUVECs) med et lite molekylmedikament, 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), for å aktivere proteinkinase c viste et doseavhengig skifte av celle chiralitet fra CW til CCW (figur 3B). Disse funnene viser nytten av det utviklede ringmønsteret chirality assay eksperimentelt, samt følsomheten til denne analysen til endringer i cytoskeletonet.
Figur 1. Skjematisk for cellulær mikropattering. (A) Prosedyre for mikrofabrikasjon og mikrokontakttrykk for cellemønster. En negativ fotoresistform ble laget av ultrafiolett (UV) krysskobling av fotoresist via en maske som inneholder mikropatteringsfunksjoner (1-2). Polydimetylsiloksan (PDMS) elastomeriske prepolymerer ble kastet på formen for å lage frimerker (3-4). Deretter ble en selvmonteringsmonlayer (SAM), okta-decanethiol (C18), belagt på stempelet og overført til gullbelagte glasssklier via mikrokontakttrykk (5-7), etterfulgt av belegg av ikke-klebende etylenglykol-terminert SAM, HS-(CH2)11-EG 3 (EG3) (8) og fibronectin (9). Cellene ble deretter sådd for å feste seg til mønstrene (10). (B) Bilder demonstrerer de viktigste trinnene i cellemikropattering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Arbeidsflyt for bildeanalyser. (A) Bildesamling. Skaff deg fasekontrastbilder av hver ring. (B) Skriv inn data i MATLAB-programmet ved å kjøre "ROI_Selection.m" filinnstillingskatalog og bildestørrelse. (C) Velg områder av interesse (ROIer) ved å dra markeringsplassen for å passe til mobilringen og dobbeltklikk for å bekrefte. (D) Bestem cellejustering og chiral bias ved å kjøre filen "Analysis_Batch.m". (E) Eksempelutganger med et sammendrag av partiske ringetall og sirkulær statistikk for hver ring. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Representative resultater av chirality av celler under narkotika behandling. (A) Fasekontrastbilder og chiralitetskarakteriseringsresultater av mus myoblast C2C12 celler: Kontroll (venstre) og 50 nM Latrunculin A-behandlede grupper (høyre). Fet rød skrift indikerer dominerende chiralitet ved p < 0,05 etter rangeringstest. Skalastenger: 100 μm. (B) Fasekontrastbilder og chiralitetskarakteriseringsresultater av humane navlestrengsvaskulære endotelceller (hUVECer) på mikromønstrede ringer: Kontroll (venstre) og 30 nM TPA-behandlede grupper (høyre). Fet rød skrift indikerer dominerende chiralitet ved p < 0,05 etter rangeringstest. Skalastenger: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Faktisk vekt-partisk | Ccw partisk |
| · NIH/3T3 celler (ATCC CRL-1658) | · C2C12 (ATCC CRL-1772) |
| · MC3T3-E1-celler (ATCC CRL-2593) | · Humane skjelettmuskulaturceller (Lonza CC-2661) |
| · Rotte hjertefibroblaster | · En human hudkreft fibroblast linje (ATCC CRL-7762) |
| · Humane primære hudfibroblaster (ATCC PCS-201-012) | · Madin-Darby canine nyre epitelceller (ATCC CCL-34) |
| · Humane fettavledede stamceller | |
| · Humane mesenchymale stamceller | |
| · Humane navlestrengsvaskulære endotelceller (Lonza CC-2935) | |
| · Humane hjernemikrovaskulære endotelceller (cellesystemer ACBRI-376) |
Tabell 1. Chirale fordommer av forskjellige celletyper preget av mikropatterning analysen. Faktisk vekt: med klokken; CCW: mot klokken.
Tilleggsfil 1: MATLAB-kodefiler for chirality-karakterisering. Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra kodefiler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ringformede mønsteranalysen som er beskrevet her, gir et brukervennlig verktøy for kvantitativ karakterisering av multicellulær chiralitet, som er i stand til å produsere svært pålitelige og repeterbare resultater. Rask generering av identiske definerte mikromiljø og objektiv analyse muliggjør automatisert behandling av høy gjennomstrømning av store prøver. Denne protokollen diskuterer fabrikasjonen av ringmikropatternene, cellemønsteret og automatisk analyse av den partiske cellejusteringen og retningsbevegelsen. Denne metoden er kompatibel med levende avbildningsteknikker for å studere cellemotilitet og kiral morfogenese og kan potensielt integreres i andre planformer for toksisitetsdeteksjon9 eller narkotikascreeningsapplikasjoner.
Det er noen flere tips å dele. Først, i mikrokontaktutskriftstrinnet, må stempelet gjøres på gullsiden av glasset (det kan være vanskelig å skille etter at substratet er kuttet i stykker), og dobbelttrykk bør unngås. For det andre, for cellene som krever andre proteiner for riktig vedlegg, kan de foretrukne proteinene brukes i trinn 3.17. For det tredje, for cellekultur, bør celletettheten ikke være for høy, og cellene bør ikke dyrkes overkonfluens på mønstrene. Ellers kan celler bryte den indre grensen og fylle ringen i en solid sirkel. For det fjerde, hvis cellemønstrene er brutt eller ufullstendige etter sådd, kan det skyldes en ufullstendig overføring av mønster av C18 under kontaktutskrift (trinn 3.7-3.8). PDMS-stemplene bør undersøkes for feil. Det kan også være nyttig å bruke litt høyere kraft når du stempler på lysbilder. Til slutt, hvis cellene festes til hele overflaten av glasssklie uten synlige mønstre, kan kraften som påføres i trinn 3.8 være for høy, noe som resulterer i at hele overflaten blir stemplet med C18. Det er også mulig at lysbildene er defekte eller har vært lagret i PBS for lenge. Mønstre av selvmontering monolayers (dvs. C18 og EG3) bør brukes innen en måned etter utskrift.
Selv om den foreslåtte analysen gir et praktisk verktøy for robust chirality karakterisering, er det noen begrensninger. For det første er mønsteranalysen bare kompatibel med tilhengerceller. Kiraliteten til ikke-tilhengerceller, som sirkulerende tumorceller, adipocytter eller ikke-pattedyrceller, kan muligens analyseres ved hjelp av 3D Matrigel bilayer-metoden18,19. For det andre, for celletyper som har en naturlig brosteinsform og ikke viser betydelig forlengelse, kan analysenøyaktigheten reduseres. Imidlertid kan chiraliteten til disse celletypene karakteriseres ved å utføre levende avbildning og spore migrasjonsbias7. Til slutt er mikropatterningsanalysen en endepunktanalysemetode, ikke beregnet på langsiktig cellekultur. Eksperimenter som legemiddelbehandling bør ikke overstige 72 timer etter sådd på mønstre. For applikasjoner som krever lengre behandlingstid, bør du vurdere forbehandling av celler før såing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health (OD/NICHD DP2HD083961 og NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan er en Pew Scholar i biomedisinsk vitenskap (PEW 00026185), støttet av Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang støttes av American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021).
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
