Summary
Vi præsenterer en protokol til bestemmelse af multicellulær chiralitet in vitro ved hjælp af mikromønsterteknikken. Dette assay giver mulighed for automatisk kvantificering af venstre-højre bias af forskellige typer celler og kan bruges til screeningsformål.
Abstract
Chiralitet er en iboende cellulær egenskab, som skildrer asymmetrien med hensyn til polarisering langs cellens venstre-højre akse. Da denne unikke egenskab tiltrækker stigende opmærksomhed på grund af sine vigtige roller i både udvikling og sygdom, ville en standardiseret kvantificeringsmetode til karakterisering af cellechiralitet fremme forskning og potentielle anvendelser. I denne protokol beskriver vi et multicellulært chiralitetskarakteriseringsassay, der bruger mikromønstrede arrays af celler. Cellulære mikromønstre fremstilles på titanium / guldbelagte glasrutschebaner via mikrokontaktudskrivning. Efter såning på de geometrisk definerede (f.eks. Ringformede), proteinbelagte øer, migrerer celler retningsbestemt og danner en forudindtaget justering mod enten uret eller mod uret retning, som automatisk kan analyseres og kvantificeres ved hjælp af et specialskrevet MATLAB-program. Her beskriver vi detaljeret fremstillingen af mikromønstrede substrater, cellesåning, billedindsamling og dataanalyse og viser repræsentative resultater opnået ved hjælp af NIH / 3T3-cellerne. Denne protokol er tidligere blevet valideret i flere offentliggjorte undersøgelser og er et effektivt og pålideligt værktøj til at studere cellechiralitet in vitro.
Introduction
Venstre-højre (LR) asymmetri af cellen, også kendt som cellulær handedness eller chiralitet, beskriver cellepolariteten i LR-aksen og anerkendes som en grundlæggende, bevaret, biofysisk egenskab 1,2,3,4,5. Cellechiralitet er blevet observeret både in vivo og in vitro på flere skalaer. Tidligere resultater afslørede chiral hvirvlen af actincytoskelet i enkeltceller podet på cirkulære øer6, forudindtaget migration og justering af celler inden for begrænsede grænser 7,8,9,10,11 og asymmetrisk looping af kyllingevarmerør12.
På det multicellulære niveau kan cellechiralitet bestemmes ud fra retningsbestemt migration eller justering, cellulær rotation, cytoskeletal dynamik og celleorganelpositionering 7,8,9,10,11,12,13. Vi har etableret et mikromønsterbaseret14 assay for effektivt at karakterisere den chirale bias af klæbende celler 7,8,9,10. Med de ringformede mikromønstre, der geometrisk begrænser celleklynger, udviser cellerne kollektivt retningsbestemt migration og forudindtaget justering. Et MATLAB-program blev udviklet til automatisk at registrere og måle cellejustering i fasekontrastbilleder af ringen. Retningen af lokal cellejustering kvantificeres med en forspændt vinkel afhængigt af dens afvigelse fra omkredsretningen. Efter statistisk analyse betegnes cellernes ringmønster enten som CCW-forstyrrelser (mod uret) eller med uret (CW) forstyrrelser.
Dette assay er blevet brugt til at karakterisere chiraliteten af flere cellefænotyper (tabel 1),og LR-asymmetrien af celler har vist sig at være fænotypespecifik 7,11,15. Desuden kan forstyrrelse af aktindynamik og morfologi resultere i en reversering af chiral bias 7,8, og oxidativ stress kan også ændre cellechiralitet9. På grund af procedurens enkelhed og robustheden af tilgangen 7,8,9,10 giver dette 2D-chiralitetsassay et effektivt og pålideligt værktøj til bestemmelse og undersøgelse af multicellulær chiralitet in vitro.
Formålet med denne protokol er at demonstrere brugen af denne metode til at karakterisere cellechiralitet. Denne protokol beskriver, hvordan man fremstiller mønstrede cellulære arrays via mikrokontaktudskrivningsteknik og udfører chiralitetsanalyse på en automatiseret måde ved hjælp af MATLAB-programmet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af polydimethylsiloxan (PDMS) stempler16
- Tegn en række mikroskalaringe ved hjælp af CAD-software med en indvendig diameter på 250 μm og en ydre diameter på 450 μm. Mønsteret, der anvendes i denne protokol, er et 10 x 10 array med en afstand på 850 μm mellem ringe.
- Udskriv en gennemsigtighedsmaske af mønsteret i den ønskede opløsning ved hjælp af en mikrofabrikationsvirksomheds maskeudskrivningstjeneste (se Materialetabel).
BEMÆRK: De medfølgende dimensioner af ringen har vist sig at fungere for mange celletyper7. - Udfør ultraviolet (UV) fotolitografi ved hjælp af masken, der indeholder ønskede funktioner for at fremstille en negativ fotoresistform (såsom SU-8)8.
- Dæk en siliciumskive spin-coatet med photoresist med gennemsigtighedsmasken fremstillet i trin 1.1-1.2.
- På en UV-kontaktjustering polymeriseres photoresist under gennemsigtige områder af masken ved hjælp af UV-lys.
BEMÆRK: Efter yderligere vask og udvikling fremstilles masterformen med ønskede egenskaber8. Operationelle detaljer afhænger af det specifikke udstyr, der anvendes.
- Forbered PDMS-elastomeriske prepolymerer ved at blande med dets hærdningsmiddel i forholdet 10: 1 og derefter støbe blandingen på formen i en petriskål.
- Læg fadet i et vakuumkammer i 30 minutter for at fjerne luftbobler i PDMS og bages i en ovn ved 60 °C i mindst 2 timer.
- Efter fuldstændig hærdning af PDMS skal du skære mønsterarrays i frimærker.
BEMÆRK: Tykkere frimærker (ca. 1 cm) kan foretrækkes på grund af den lette håndtering ved de senere trin i mikrokontakttryk.
2. Belægning af glasrutschebaner
- Rengør glasrutsjebanerne. Sug diasene i blød i et 100% ethanolbad, sonikat i 5 minutter, og skyll derefter med vand.
- Gentag dette trin først med acetone, derefter med isopropanol, efterfulgt af tørring i en nitrogenstrøm.
- Brug et elektronstråle (E-beam) fordampningsudstyr til at belægge titanium- og guldlag på glasrutschebaner.
BEMÆRK: For titaniumlaget er den ønskede tykkelse 15 Å (1 Å = 10-10 m). For guldlaget er den ønskede tykkelse 150 Å. Coat titanium først og derefter guld, da titaniumlaget tjener som et klæbemiddel mellem guld og glasglasset. - Anbring de rensede dias i fordampningskammeret, og indsæt guld- og titaniumdigler under skodderne.
- Pump ned i kammeret for at skabe et vakuum lavere end 10-5 Pa før smeltning af metaller. Fokuser elektronstrålen på metallet, og juster effekten, så aflejringshastigheden er passende til styring af aflejringstykkelsen.
- Åbn lukkeren for at starte metalaflejringen. Luk lukkeren, når den ønskede tykkelse er nået.
- Skift digler mellem sekventiel fordampning af to metaller.
- Vent på, at diglerene køler af som krævet af udstyret, udluft kammeret, og tag de guldbelagte glasrutschebaner ud.
- Pump kammeret ned igen for vedligeholdelse af udstyr.
BEMÆRK: Driftsdetaljer kan afhænge af en specifik E-strålefordamper. Det er vigtigt at have en velkontrolleret, lav deponeringshastighed for titanium. Et tykt titaniumlag fører ofte til dårlig synlighed, især til fluorescensbilleddannelse af cellerne. Efter belægning kan de titanium/guldbelagte glasrutsjebaner opbevares i et tørt vakuumkammer ved stuetemperatur i mindst 1 måned.
3. Udskrivning af mikrokontakt
- Skær den titanium/guldbelagte rutsjebane i mindre stykker, hvis det ønskes. En firkantet form på 12 mm x 12 mm anbefales til en typisk anvendelse (figur 1B).
- Brug en glasskærer til at glide hen over overfladen for at efterlade et bulet spor, hold derefter glasglideren i begge sider og bøj ved bulen for at bryde ind i små kvartaler. Undgå at røre overfladen belagt med guld.
BEMÆRK: For visuelt at bestemme, hvilken side af glasset der er den belagte overflade i tilfælde af utilsigtet at vælte, skal du sammenligne refleksionen af lys på begge sider. Den gulddækkede overflade viser en lysere refleksion, mens den ikke-belagte side vil have en lysere refleksion (fra titaniumlaget på den anden side af glasset). En alternativ måde er at observere kanterne på diaset, og belægningssiden kan bestemmes ud fra den lodrette skæreflade. - Rengør rutsjebanerne ved at lægge 100% ethanol i blød i en petriskål med guldsiden oppe på en orbital shaker i mindst 10 min. Aspirer ethanolen ud, tør derefter hvert dias ved at blæse med en nitrogenstrøm.
- Rengør PDMS-frimærkerne med sæbevand og derefter 100% ethanol. Tør frimærkerne med nitrogengas.
- Der fremstilles 2 mM octadecanethiol (C18) opløsning ved at opløse 5,74 mg C18-pulver i 10 ml 100 % ethanol.
BEMÆRK: Forsegl og opbevar C18-opløsning ved stuetemperatur. Udskrivningsmønstre med C18 skaber et klæbende selvmonteret monolag, som fibronectin og celler fortrinsvis vil fastgøre. - Blødgør PDMS-stemplerne i C18-opløsning med den mønstrede overflade nedad i 10 s og tør forsigtigt med nitrogengas i 60 s.
BEMÆRK: Når du tørrer, skal du først placere strømmen væk fra stemplet (ca. 1 m), indtil det meste væske er fordampet, og derefter langsomt flytte strømmen tættere på for at tørre stemplet helt. Dette er for at undgå, at C18-opløsningen blæses væk i stedet for at tørre på stemplet. - Læg frimærket med forsiden nedad på guldrutsjebanerne i 60 s, før det fjernes.
- For at sikre korrekt stempling skal du forsigtigt trykke pincetten på frimærkerne for at overføre mønstrene korrekt. Skub ikke for hårdt ned, og vægten af pincet er typisk tilstrækkelig.
BEMÆRK: Visuel inspektion af stemplet under trykning vil sikre, at stempel og glasrutschebane har fået kontakt ensartet. - Forbered fugtighedskamre.
- Pipette 1 ml 70% ethanol i et omvendt petriskålslåg og lægge et stykke parafilm for at dække overfladen (dækket med forsiden op).
- Brug pincet til at løfte, læg parafilm ned for at sikre, at der ikke er luftbobler, og fjern overskydende ethanol, hvis det er nødvendigt.
- 2 mM HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3)-opløsning fremstilles: Fortynd 5 μL stamopløsning i 5 ml 100 % ethanol.
BEMÆRK: Den fortyndede EG3-opløsning kan forsegles og opbevares ved 4 °C, og ufortyndet EG3-stam skal opbevares ved -20 °C. EG3-behandlingen bruges til at gøre glasområdet uden C18 ikke-klæbende på celler. - Mikropipette 40 μL dråber EG3 for hvert kvart glas glider på parafilmen i fugtighedskammeret, hvilket giver tilstrækkelig plads mellem dråber til at tage højde for afstanden mellem guldglider.
- Brug pincet til at placere C18-trykte gulddias med forsiden nedad på dråberne og sørg for, at der ikke er bobler under diasene. Skub forsigtigt gliderne sammen uden at løfte dem for at minimere fordampningen.
BEMÆRK: Placer den ene kant af glasset glider ned i nærheden af dråben, og sænk derefter langsomt den anden ende af glasslidningen ned. Hvis der er en boble til stede, skal du skubbe guldglideren uden at løfte den, indtil boblen ikke længere er til stede. - Forsegl petriskålen tæt med parafilm og lad den stå ved stuetemperatur i mindst 3 timer.
BEMÆRK: Hvis der ønskes omfattende inkubation, skal du dobbeltforsegl petriskålen og lade den stå i op til 24 timer. - I et biosikkerhedsskab skal du placere gulddias med forsiden op i en petriskål, suge og skylle 3 gange i 70% ethanol for at fjerne EG3 og derefter lade det stå i ethanol i 10 minutter til sterilisering.
- Aspirer ethanolen ud og erstat den med steril PBS.
- Forbered et andet fugtighedskammer som beskrevet i trin 3.9 med PBS i stedet for ethanol.
BEMÆRK: På grund af forskellen i overfladespænding er det lettere først at tilføje 4-5 ml PBS for at lægge parafilm ned og fjerne bobler og derefter aspirere det overskydende ud. - Forbered 50 μg / ml fibronectinopløsningen (andre proteiner, hvis det ønskes) i steril PBS og mikropipette 50 μL dråber fibronectinopløsning for hvert kvartal glider på parafilmen, hvilket efterlader noget mellemrum mellem dråber.
BEMÆRK: Fibronectinbelægning letter celleadhæsion til mønstrede overflader. - Brug wafer pincet til at placere dias med forsiden nedad på dråberne og sørg for, at der ikke er bobler under diasene. Skub forsigtigt gliderne sammen uden at løfte dem.
BEMÆRK: Glasglidepincet eller wafer pincet med lige brede spidser anbefales til håndtering af diasene. - Lad petriskålen ligge i biosikkerhedsskabet i 30 min.
- Efter 30 min skal du placere guldrutsjebanerne med forsiden mod op i PBS efter skylning i 3 gange.
BEMÆRK: Fibronectinmønstrede dias kan opbevares i PBS ved 4 °C i ca. en måned.
4. Såning af celler på mikromønstrede dias
- Varm cellekulturmedierne og trypsin op i et vandbad på 37 °C.
BEMÆRK: Følgende beskrivelse af subkultur er for NIH/3T3-celler. Dyrkningsbetingelserne kan variere afhængigt af celletyper. - (Valgfrit) Blødgør mønstrede dias i kulturmedier i en 12-brønds plade, varm op til 37 ° C i en inkubator før trypsinisering af celler for bedre cellefastgørelse.
- Prøv cellerne, neutraliser med FBS-holdige medier, centrifuger ned ved 100 x g i 3 minutter, og derefter resuspend ved at blande godt med friske medier.
BEMÆRK: Sørg for, at cellerne er helt adskilt fra hinanden. - Tæl cellerne, fortynd til 200.000 celler / ml og tilsæt 0,5 ml af cellesuspensionen til hver brønd, der indeholder et gulddias.
- Ryst forsigtigt brøndpladen et par gange for ensartet cellesåning og opbevar den i en inkubator i 15 minutter for at muliggøre cellefastgørelse.
- Efter 15 minutter skal du kontrollere cellefastgørelsen under et mikroskop. Tillad yderligere tid, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: De vedhæftede celler spredes ud på overfladen med synligt filopodium eller udfladning og bevæger sig ikke fra overfladen, når brøndpladen forsigtigt tappes eller flyttes. - Aspirer medierne, der indeholder ikke-fastgjorte celler fra hver brønd, og tilsæt 1 ml kulturmedier. Til lægemiddelbehandling skal du supplere yderligere reagenser til kulturmedier på dette trin.
- Kultur cellerne i inkubatoren i 24 timer og kontroller sammenløbet for at afgøre, om chiralitet er dannet.
BEMÆRK: Over 75% sammenløb anbefales til de fleste celletyper, og over-sammenløb kan påvirke chiralitetskarakteriseringen.
5. Billedsamling
- Fastgør cellerne ved sammenløb.
- Fjern kulturmedier fra brøndpladen og skyl en gang med PBS.
- Tilsæt 4% paraformaldehydopløsning, inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter, og skyl derefter 3 gange med PBS.
BEMÆRK: Hvis fikseringen ændrer cellemorfologien væsentligt, anbefales billeddannelse før fiksering
- Brug et fasekontrastmikroskop med kamerafunktionalitet, aftryk hver ring på diasene i høj opløsning (10x objektobjektiv er tilstrækkeligt til analyse).
6. Cellechiralitetskarakterisering (figur 2)
- Download MATLAB-kodefiler til chiralitetskarakterisering fra de supplerende filer (supplerende fil 1).
BEMÆRK: Koden er testet til at fungere med MATLAB_R2015b og nyere versioner på både Windows- og macOS-systemer. Værktøjskassen til cirkulær statistik er også nødvendig for at køre filerne, som findes i reference17. - Føj kodemappen og undermapperne (med værktøjskassen til cirkulær statistik indeni) til MATLAB-stien, og åbn filen "ROI_selection.m". I linje 4 skal du ændre mappen til den ønskede datamappe (For vinduesbrugere skal du skifte "/" til "\" i linjerne 4 og 5).
- Skift billedstørrelsen i linje 14, hvor de to første figurer repræsenterer ringens indre cirkelstørrelse, mens de to andre repræsenterer den ydre.
BEMÆRK: Sørg for, at størrelserne på alle billeder i en mappe, der skal analyseres, er identiske. - Klik på knappen Kør for at udføre MATLAB-koden "ROI_selection.m" for at bestemme interesseområdet (ROI) i fasekontrastbilleder.
- Træk markeringsfirkanten manuelt, så den passer til ringen, og dobbeltklik derefter på billedet for at bekræfte det valgte.
- Gentag dette trin for hvert billede i mappen (det næste billede vises automatisk efter bekræftelse af ROI-valget af et tidligere billede); der genereres en ".mat"-fil for at gemme ROI-oplysningerne for hvert billede.
- Åbn filen "Analysis_batch.m", og skift mappen i mappen samme som trin 6.2. (For vinduesbrugere skal du for første gang skifte "/" til "\" i linjerne 5, 6, 124 og 130)
- Klik på knappen Kør for at udføre koden "Analysis_batch.m" for at bestemme chiraliteten af flere cellulære ringmønstre. En "datatoexcel.txt" -fil genereres, der indeholder cirkulær statistik for hver ring samt antallet af ringe med uret, ikke-chiral og mod uret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Femten minutter efter såningen af NIH / 3T3-celler blev celleadhæsion på ringmønsteret visuelt bekræftet ved fasekontrastbilleddannelse. Efter efterfølgende dyrkning på 24 timer blev cellerne på mønstrene sammenflydende og aflange med klart asymmetriske justeringer, forspændt mod urets retning (figur 2). Retningsbestemt migration af vedhæftede celler registreres ved time-lapse-billeddannelse, cellemotilitet og morfogenese kan kvantificeres med yderligere analyser af videoen. For at udføre chiralitetsanalyse tages fasekontrastbilleder i høj opløsning efter fiksering (figur 2A-C) og føres ind i MATLAB-programmet. Programmet registrerer intensitetsgradienter og beregner tilsvarende cellejusteringsretninger på ringen. Derefter bestemmes cellechiralitet baseret på den cirkulære statistik over cellejustering, der afviger fra ringenes omkredsretning. Cellerne kan derfor betegnes som med uret (CW), mod uret (CCW) eller ikke-chirale (NC) (figur 2D). Efter behandling viste analysen, at størstedelen af ringene har en dominerende CW-bias, hvilket indikerer, at 3T3-celler har en stærk CW-chiralitet. Den genererede cirkulære statistik giver også yderligere oplysninger om forudindtagede vinkler til yderligere analyser, hvis det er nødvendigt (figur 2E).
Cellechiralitet afhænger af dens fænotype. Ringchiralitetsassayet er blevet verificeret at være kompatibelt med flere celletyper 7,8,9,10, herunder både cellelinjer og primære celler, såsom fibroblaster, myoblast, endotelceller og stamceller (tabel 1). Interessant nok, fordi cellechiralitet stammer fra funktionaliteterne i actincytoskelet, kan ændringer i actindynamikken påvirke cellernes chirale bias. Med muse myoblast C2C12 celler fandt vi, at ved at forstyrre actinpolymerisation med 50 nM Latrunculin A-behandling udviste cellerne en ændring af CCW chiral bias i CW (figur 3A). Derudover viste humane navlestrengsvaskulære endotelceller (hUVECs) behandlet med et lille molekylelægemiddel, 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), for at aktivere proteinkinase c, et dosisafhængigt skift af cellechiralitet fra CW til CCW (figur 3B). Disse resultater viser nytten af det udviklede ringmønster chiralitetsassay eksperimentelt såvel som følsomheden af dette assay over for ændringer i cytoskelettet.
Figur 1. Skematisk af cellulær mikromønster. (A) Procedure for mikrofabrikation og mikrokontaktudskrivning til cellemønster. En negativ photoresist-form blev fremstillet ved ultraviolet (UV) tværbinding af photoresist via en maske indeholdende mikromønsterfunktioner (1-2). Polydimethylsiloxan (PDMS) elastomeriske prepolymerer blev støbt på formen for at skabe frimærker (3-4). Derefter blev et selvmonteringsmonolag (SAM), octa-decanethiol (C18), belagt på stemplet og overført til guldbelagte glasrutschebaner via mikrokontaktudskrivning (5-7) efterfulgt af belægning af ikke-klæbende ethylenglycol-afsluttet SAM, HS-(CH2)11-EG 3 (EG3) (8) og fibronectin (9). Celler blev derefter podet for at fastgøre sig til mønstrene (10). (B) Fotos viser de vigtigste trin i cellemikromønsteret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Arbejdsgang af billedanalyser. (A) Billedsamling. Få fasekontrastbilleder af hver ring. (B) Indtast data i MATLAB-programmet ved at køre "ROI_Selection.m" filindstillingsmappe og billedstørrelse. (C) Vælg områder af interesse (ROI'er) ved at trække i markeringsfirkanten, så den passer til mobilringen, og dobbeltklik for at bekræfte. (D) Bestem cellejustering og chirale forstyrrelser ved at køre filen "Analysis_Batch.m". (E) Eksempel på output med et resumé af forudindtagede ringnumre og cirkulær statistik for hver ring. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Repræsentative resultater af chiraliteten af celler under lægemiddelbehandling. (A) Fasekontrastbilleder og chiralitetskarakteriseringsresultater af musehypyoblast C2C12-celler: Kontrol (venstre) og 50 nM Latrunculin A-behandlede grupper (højre). Fed rød skrifttype angiver dominerende chiralitet ved p < 0,05 efter rangtest. Skalastænger: 100 μm. (B) Fasekontrastbilleder og chiralitetskarakteriseringsresultater af humane navlestrengsvaskulære endotelceller (hUVEAN'er) på mikromønstrede ringe: Kontrol (venstre) og 30 nM TPA-behandlede grupper (højre). Fed rød skrifttype angiver dominerende chiralitet ved p < 0,05 efter rangtest. Skalabjælker: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| CW forudindtaget | CCW forudindtaget |
| · NIH/3T3-celler (ATCC CRL-1658) | · C2C12 (ATCC CRL-1772) |
| · MC3T3-E1-celler (ATCC CRL-2593) | · Humane skeletmuskelceller (Lonza CC-2661) |
| · Rotte hjertefibroblaster | · En human hudkræft fibroblast linje (ATCC CRL-7762) |
| · Humane primære hudfibroblaster (ATCC PCS-201-012) | · Madin-Darby nyreepitelceller hos hunde (ATCC CCL-34) |
| · Humane fedtafledte stamceller | |
| · Humane mesenkymale stamceller | |
| · Humane navlestrengsvaskulære endotelceller (Lonza CC-2935) | |
| · Humane hjernemikrovaskulære endotelceller (Cellesystemer ACBRI-376) |
Tabel 1. Chirale forstyrrelser af forskellige celletyper karakteriseret ved mikromønsterassayet. CW: med uret; CCW: mod uret.
Supplerende fil 1: MATLAB-kodefiler til chiralitetskarakterisering. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodningsfiler. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det ringformede mønsterassay, der er beskrevet her, giver et brugervenligt værktøj til kvantitativ karakterisering af multicellulær chiralitet, der er i stand til at producere meget pålidelige og repeterbare resultater. Hurtig generering af identiske definerede mikromiljøer og upartisk analyse muliggør automatiseret behandling med høj kapacitet af store størrelser af prøver. Denne protokol diskuterer fremstillingen af ringmikromønstrene, cellemønster og automatisk analyse af den forudindtagede cellejustering og retningsbevægelse. Denne metode er kompatibel med live-imaging teknikker til undersøgelse af cellemotilitet og chiral morfogenese og kan potentielt integreres i andre planformer for toksicitetsdetektion9 eller lægemiddelscreeningsapplikationer.
Der er et par ekstra tip at dele. For det første skal stemplet i mikrokontaktudskrivningstrinnet laves på glasets guldside (det kan være svært at skelne, efter at substratet er skåret i stykker), og dobbelttryk bør undgås. For det andet kan de foretrukne proteiner anvendes i trin 3.17 for de celler, der kræver andre proteiner til korrekt fastgørelse. For det tredje bør celletætheden for cellekultur ikke være for høj, og cellerne bør ikke dyrkes over-sammenløb på mønstrene. Ellers kan celler bryde den indre grænse og fylde ringen i en solid cirkel. For det fjerde, hvis cellemønstre er brudt eller ufuldstændige efter såning, kan det skyldes en ufuldstændig overførsel af C18-mønster under kontaktudskrivning (trin 3.7-3.8). PDMS-frimærkerne bør undersøges for fejl. Det kan også være nyttigt at anvende lidt højere kraft, når du stempler på dias. Endelig, hvis celler fastgøres til hele overfladen af glasglideren uden synlige mønstre, kan den kraft, der påføres i trin 3.8, være for høj, hvilket resulterer i, at hele overfladen stemples med C18. Det er også muligt, at diasene er defekte eller har været opbevaret i PBS for længe. Mønstre af monolag til selvmontering (dvs. C18 og EG3) skal anvendes inden for en måned efter udskrivning.
Selvom det foreslåede assay giver et praktisk værktøj til robust chiralitetskarakterisering, er der nogle begrænsninger. For det første er mønsteranalysen kun kompatibel med klæbende celler. Chiraliteten af ikke-klæbende celler, såsom cirkulerende tumorceller, adipocytter eller ikke-pattedyrceller, kan muligvis analyseres ved hjælp af 3D Matrigel-dobbeltlagsmetoden18,19. For det andet kan analysens nøjagtighed reduceres for celletyper, der har en naturlig brostensform og ikke viser signifikant forlængelse. Imidlertid kan chiraliteten af disse celletyper karakteriseres ved at udføre levende billeddannelse og spore migrationsbias7. Endelig er mikromønsterassayet en endpointanalysemetode, der ikke er beregnet til langsigtet cellekultur. Forsøg såsom lægemiddelbehandling bør ikke overstige 72 timer efter såning på mønstre. For applikationer, der kræver forlænget behandlingstid, skal du overveje at forbehandle celler inden såning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (OD / NICHD DP2HD083961 og NHBLI R01HL148104). Leo Q. Wan er en Pew Scholar i Biomedicinsk Videnskab (PEW 00026185), støttet af Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang støttes af American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021).
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
