Summary
אנו מציגים פרוטוקול לקביעת כיראליות רב-תאית במבחנה, תוך שימוש בטכניקת המיקרו-פטרינג. בדיקה זו מאפשרת כימות אוטומטי של הטיות שמאל-ימין של סוגים שונים של תאים וניתן להשתמש בה למטרות סינון.
Abstract
כיראליות היא תכונה תאית פנימית, המתארת את האסימטריה במונחים של קיטוב לאורך ציר שמאל-ימין של התא. מכיוון שתכונה ייחודית זו מושכת תשומת לב גוברת בשל תפקידיה החשובים הן בהתפתחות והן במחלות, שיטת כימות סטנדרטית לאפיון כיראליות תאים תקדם את המחקר ואת היישומים הפוטנציאליים. בפרוטוקול זה אנו מתארים בדיקה של אפיון כיראליות רב-תאית המשתמשת במערכים מיקרו-פטרתיים של תאים. מיקרו-פטרנים סלולריים מיוצרים על שקופיות זכוכית מצופים טיטניום/זהב באמצעות הדפסה מיקרו-קונקרטית. לאחר זריעה על האיים המוגדרים באופן גיאומטרי (למשל, בצורת טבעת), המצופים בחלבון, התאים נודדים בכיוון ויוצרים יישור מוטה לכיוון הכיוון השעון או לכיוון נגד כיוון השעון, אותו ניתן לנתח ולכמת באופן אוטומטי על ידי תוכנית MATLAB שנכתבה בהתאמה אישית. כאן אנו מתארים בפירוט את הייצור של מצעים micropatterned, זריעת תאים, איסוף תמונות וניתוח נתונים ומציגים תוצאות מייצגות שהושגו באמצעות תאי NIH/3T3. פרוטוקול זה אומת בעבר במספר מחקרים שפורסמו והוא כלי יעיל ואמין לחקר כיראליות תאים במבחנה.
Introduction
אסימטריה שמאל-ימין (LR) של התא, הידועה גם בשם ידיים תאיות או כיראליות, מתארת את קוטביות התא בציר LR ומוכרת כתכונה ביופיזית בסיסית, שמורה, 1,2,3,4,5. כיראליות התא נצפתה הן in vivo והן in vitro במספר קשקשים. ממצאים קודמים חשפו מערבולת כיראלית של שלד אקטין ציטוסקלטון בתאים בודדים שנזרעו באיים עגולים6, נדידה ויישור מוטים של תאים בתוך גבולות מוגבלים 7,8,9,10,11, ולולאה א-סימטרית של צינור חום עוף 12.
ברמה הרב-תאית, כיראליות התאים יכולה להיקבע מתוך נדידה או יישור כיווניים, סיבוב תאי, דינמיקה של השלד הציטוסקטלי ומיקום אברוני התא 7,8,9,10,11,12,13. הקמנו בדיקה מבוססת מיקרו-פטרינגשל 14 כדי לאפיין ביעילות את ההטיה הכיראלית של תאים דביקים 7,8,9,10. כאשר המיקרו-פטרנים בצורת טבעת מגבילים באופן גיאומטרי את צבירי התאים, התאים מפגינים יחד נדידה כיוונית ויישור מוטה. תוכנית MATLAB פותחה כדי לזהות ולמדוד באופן אוטומטי את יישור התאים בתמונות של ניגודיות פאזה של הטבעת. כיוון יישור התאים המקומיים מכמת בזווית מוטה, בהתאם לסטייתו מהכיוון ההיקפי. לאחר ניתוח סטטיסטי, תבנית הטבעת של התאים מוגדרת כהטיות נגד כיוון השעון (CCW) או כהטיות בכיוון השעון (CW).
בדיקה זו שימשה לאפיון הכיראליות של פנוטיפים של תאים מרובים (טבלה 1), והאסימטריה LR של תאים נמצאה כ-7,11,15 ספציפיים לפנוטיפ. יתר על כן, הפרעה לדינמיקה ולמורפולוגיה של אקטין יכולה לגרום להיפוך של הטיה כיראלית 7,8, ועקה חמצונית יכולה לשנות גם את כיראליותהתאים 9. בגלל הפשטות של ההליך והחוסן של הגישה 7,8,9,10, בדיקת כיראליות דו-ממדית זו מספקת כלי יעיל ואמין לקביעה ולימוד כיראליות רב-תאית במבחנה.
מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את השימוש בשיטה זו כדי לאפיין את כיראליות התא. פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר מערכים תאיים עם דוגמאות באמצעות טכניקת הדפסה מיקרו-קונטקונטקטית ולבצע ניתוח כיראליות באופן אוטומטי באמצעות תוכנית MATLAB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור חותמות פולידימתילסילוקסן (PDMS)16
- ציירו מערך של טבעות בקנה מידה זעיר באמצעות תוכנת CAD, עם קוטר פנימי של 250 מיקרומטר וקוטר חיצוני של 450 מיקרומטר. התבנית המשמשת בפרוטוקול זה היא מערך של 10 x 10 עם מרחק של 850 מיקרומטר בין טבעות.
- הדפס מסכת שקיפות של התבנית ברזולוציה הרצויה באמצעות שירות הדפסת המסכות של חברת המיקרו-פבריקציה (ראה טבלת חומרים).
הערה: הממדים שסופקו של הטבעת הוכחו כעובדים עבור סוגי תאים רבים7. - ביצוע פוטוליתוגרפיה אולטרה סגולה (UV) באמצעות המסכה המכילה את התכונות הרצויות ליצירת תבנית פוטורסיסטית שלילית (כגון SU-8)8.
- כסו פרוסת סיליקון מצופה בפוטורסיסט על ידי מסכת השקיפות המיוצרת בשלבים 1.1-1.2.
- על יישור מגע UV, פולימריזציה של הפוטורסיסט תחת אזורים שקופים של המסכה על ידי אור UV.
הערה: לאחר שטיפה ופיתוח נוספים, התבנית הראשית עם התכונות הרצויות מיוצרת8. הפרטים התפעוליים תלויים בציוד הספציפי שבו נעשה שימוש.
- מכינים פרה-פולימרים אלסטומריים של PDMS על ידי ערבוב עם חומר הריפוי שלו ביחס של 10:1 ואז מטילים את התערובת על התבנית בצלחת פטרי.
- מניחים את המנה בתא ואקום למשך 30 דקות כדי להסיר בועות אוויר ב- PDMS ואופים בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפחות.
- לאחר ריפוי מלא של PDMS, חתכו את מערכי התבניות לבולים.
הערה: ניתן להעדיף חותמות עבות יותר (כ-1 ס"מ) בשל קלות הטיפול בשלבים המאוחרים יותר של הדפסת מיקרו-קונטיקט.
2. ציפוי שקופיות זכוכית
- נקו את מגלשות הזכוכית. משרים את המגלשות באמבט 100% אתנול, מתפזרים במשך 5 דקות ואז שוטפים במים.
- חזור על שלב זה תחילה עם אצטון, לאחר מכן עם איזופרופנול, ולאחר מכן ייבוש בזרם חנקן.
- השתמש בציוד אידוי של קרן אלקטרונים (E-beam) כדי לצפות שכבות טיטניום וזהב על מגלשות זכוכית.
הערה: עבור שכבת הטיטניום, העובי הרצוי הוא 15 Å (1 Å = 10-10 מ '). עבור שכבת הזהב, העובי הרצוי הוא 150 Å. ציפוי טיטניום תחילה ולאחר מכן זהב, שכן שכבת הטיטניום משמשת כדבק בין זהב למגלשת הזכוכית. - מניחים את המגלשות המנוקות בתא האידוי ומכניסים כור היתוך מזהב וטיטניום מתחת לתריסים.
- שאבו את התא כדי ליצור ואקום נמוך מ-10-5 Pa לפני התכת המתכות. מקד את קרן האלקטרונים על המתכת והתאים את ההספק כך שקצב ההפקדה יתאים לשליטה בעובי התצהיר.
- פתח את התריס כדי להתחיל את תצהיר המתכת. סגור את התריס כאשר מגיעים לעובי הרצוי.
- החלף כור היתוך בין אידוי רציף של שתי מתכות.
- המתן עד שכור ההיתוך יתקרר כנדרש על ידי הציוד, פתח את החדר והוציא את מגלשות הזכוכית המצופות בזהב.
- שאבו שוב את החדר לצורך תחזוקת ציוד.
הערה: הפרטים התפעוליים עשויים להיות תלויים במאייד קרן E ספציפי. חשוב שיהיה בעל שיעור הפקדה מבוקר היטב ונמוך של טיטניום. שכבת טיטניום עבה מובילה לעתים קרובות לנראות לקויה, במיוחד להדמיה פלואורסצנטית של התאים. לאחר הציפוי, ניתן לאחסן את מגלשות הזכוכית המצופות טיטניום/זהב בתא ואקום יבש בטמפרטורת החדר למשך חודש לפחות.
3. הדפסה מיקרו-קונקרטית
- חתכו את החלקה המצופה טיטניום/זהב לחתיכות קטנות יותר, אם תרצו. צורה מרובעת של 12 מ"מ x 12 מ"מ מומלצת ליישום טיפוסי (איור 1B).
- השתמשו בחותך זכוכית כדי להחליק על פני השטח כדי להשאיר מסלול מעוות, ואז החזיקו את מגלשת הזכוכית משני הצדדים והתכופפו לעבר השקע כדי לפרוץ לרבעים קטנים. הימנע מלגעת במשטח המצופה בזהב.
הערה: כדי לקבוע באופן חזותי איזה צד של הזכוכית הוא המשטח המצופה במקרה של התהפכות מקרית, השווה את השתקפות האור משני הצדדים. המשטח המכוסה זהב יראה השתקפות בהירה יותר, ואילו הצד הלא מצופה יהיה בעל השתקפות עמומה יותר (משכבת הטיטניום בצד השני של הזכוכית). דרך חלופית היא להתבונן בשולי המגלשה, וניתן לקבוע את צד הציפוי ממשטח החיתוך האנכי. - נקו את המגלשות על ידי השריית 100% אתנול בצלחת פטרי עם צד הזהב למעלה על שייקר מסלול למשך 10 דקות לפחות. שאפו החוצה את האתנול, ואז ייבשו כל מגלשה על ידי נשיפה עם זרם חנקן.
- נקו את חותמות ה-PDMS עם מי סבון ולאחר מכן 100% אתנול. מייבשים את הבולים בגז חנקן.
- הכינו תמיסת 2 mM octadecanethiol (C18) על ידי המסת 5.74 מ"ג של אבקת C18 ב-10 מ"ל של 100% אתנול.
הערה: אטום ואחסן את תמיסת C18 בטמפרטורת החדר. דפוסים מודפסים עם C18 יוצרים מונו-שכבתי דביק המורכב בעצמו שעבורו הפיברונקטין והתאים יתחברו באופן מועדף. - השרו את חותמות ה-PDMS בתמיסת C18 כאשר המשטח המעוצב פונה כלפי מטה במשך 10 שניות ויבשו בעדינות בגז חנקן במשך 60 שניות.
הערה: בעת הייבוש, הניחו תחילה את הנחל הרחק מהבול (כ-1 מ') עד שרוב הנוזלים יתאדו ואז הזיזו את הנחל באיטיות קרוב יותר כדי לייבש את החותמת במלואה. זאת כדי למנוע תמיסת C18 להתפוצץ במקום להתייבש על הבול. - הניחו את הבול עם הפנים כלפי מטה על שקופיות הזהב במשך 60 שניות לפני ההסרה.
- כדי להבטיח הטבעה נכונה, הקש בעדינות על הפינצטה על הבולים כדי להעביר כראוי את התבניות. אל תדחפו חזק מדי למטה, ומשקל הפינצטה בדרך כלל מספיק.
הערה: בדיקה חזותית של הבול במהלך ההקשה תוודא כי החותמת ושקופית הזכוכית יצרו מגע אחיד. - הכינו תאי לחות.
- פיפטה 1 מ"ל של 70% אתנול לתוך מכסה צלחת פטרי הפוך והניח חתיכת פרפילם כדי לכסות את פני השטח (מכוסה עם הפנים כלפי מעלה).
- השתמשו בפינצטה כדי להרים, הניחו פרפילם כדי להבטיח שאין בועות אוויר והסירו עודפי אתנול במידת הצורך.
- הכן 2 mM HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3) פתרון: דילול 5 μL תמיסת מלאי ב 5 מ"ל של 100% אתנול.
הערה: ניתן לאטום ולאחסן את תמיסת EG3 המדולל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ויש לאחסן מלאי EG3 לא מדולל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. הטיפול ב-EG3 משמש כדי להפוך את אזור הזכוכית ללא C18 ללא דבק לתאים. - טיפות Micropipette 40 μL של EG3 עבור כל רבע זכוכית מחליקות על הפרפילם בתא הלחות, ומשאירות מספיק מקום בין טיפות כדי להסביר את המרווח של מגלשות הזהב.
- השתמשו בפינצטה כדי למקם שקופיות זהב מודפסות C18 עם הפנים כלפי מטה על הטיפות ולהבטיח שאין בועות מתחת לשקופיות. דחפו בעדינות את המגלשות זו לזו מבלי להרים אותן כדי למזער את האידוי.
הערה: מניחים קצה אחד של שקופיות הזכוכית כלפי מטה ליד הטיפה, ולאחר מכן מורידים באיטיות את הקצה השני של החלקת הזכוכית כלפי מטה. אם קיימת בועה, דחפו את מגלשת הזהב מבלי להרים אותה עד שהבועה כבר לא תהיה נוכחת. - אטמו את צלחת הפטרי בחוזקה עם פרפילם והשאירו אותה בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות לפחות.
הערה: אם רוצים דגירה נרחבת, אטמו פעמיים את צלחת הפטרי והשאירו אותה עד 24 שעות. - בארון בטיחות ביולוגית, מניחים שקופיות זהב עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי, משרים ושוטפים 3 פעמים ב-70% אתנול כדי להסיר EG3, ואז משאירים באתנול למשך 10 דקות לעיקור.
- שאפו את האתנול והחליפו אותו ב-PBS סטרילי.
- הכינו תא לחות נוסף כמתואר בשלב 3.9, עם PBS במקום אתנול.
הערה: בשל ההבדל במתח הפנים, קל יותר להוסיף תחילה 4-5 מ"ל של PBS כדי להניח parafilm ולהסיר בועות, ולאחר מכן לשאוף החוצה את עודף. - הכינו את תמיסת הפיברונקטין של 50 מיקרוגרם/מ"ל (חלבונים אחרים, אם תרצו) ב-PBS סטרילי ובטיפות מיקרופיפט 50 μL של תמיסת פיברונקטין לכל רבעון להחליק על הפרפילם, ולהשאיר רווח מסוים בין הטיפות.
הערה: ציפוי פיברונקטין מקל על היצמדות תאים למשטחים מעוצבים. - השתמשו בפינצטה של פרוסות כדי להניח שקופיות עם הפנים כלפי מטה על הטיפות ולוודא שאין בועות מתחת לשקופיות. דחפו בעדינות את המגלשות זו לזו מבלי להרים אותן.
הערה: פינצטה מזכוכית או פינצטה עם קצוות רחבים ישרים מומלצים לטיפול בשקופיות. - השאירו את צלחת הפטרי בארון הבטיחות הביולוגית למשך 30 דקות.
- לאחר 30 דקות, הניחו את מגלשות הזהב עם הפנים כלפי מעלה ב- PBS לאחר שטיפה במשך 3 פעמים.
הערה: ניתן לאחסן שקופיות בדוגמת פיברונקטין ב- PBS ב- 4 °C (75 °F) למשך כחודש.
4. זריעת תאים על גבי שקופיות מיקרו-פוטרניות
- חממו את המדיה של תרביות התאים וטריפסין באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: התיאור הבא של תת-תרבות הוא עבור תאי NIH/3T3. תנאי התרבית עשויים להשתנות בהתאם לסוגי התאים. - (אופציונלי) השרו שקופיות מעוצבות במדיה של תרבית בצלחת של 12 בארות, התחממו עד 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לפני טריפסיניזציה של תאים לחיבור טוב יותר של התאים.
- נסה את התאים, נטרל עם מדיה המכילה FBS, צנטריפוגה כלפי מטה ב- 100 x g למשך 3 דקות, ולאחר מכן החייאה על ידי ערבוב טוב עם מדיה טרייה.
הערה: ודא שהתאים מנותקים לחלוטין זה מזה. - ספרו את התאים, דיללו ל-200,000 תאים/מ"ל והוסיפו 0.5 מ"ל של תרחיף התאים לכל באר המכילה שקופית זהב אחת.
- יש לנער בעדינות את צלחת הבאר מספר פעמים לזריעת תאים אחידה ולאחסן אותה באינקובטור למשך 15 דקות כדי לאפשר חיבור לתא.
- לאחר 15 דקות, בדקו את חיבור התא תחת מיקרוסקופ. אפשר זמן נוסף, במידת הצורך.
הערה: התאים המחוברים יתפזרו על פני השטח עם פילופודיום גלוי או שיטוח ולא יזוזו מהמשטח כאשר לוחית הבאר תוטפח בעדינות או תזוז. - שאפו החוצה את המדיה המכילה תאים לא מחוברים מכל באר והוסיפו 1 מ"ל של מדיה תרבית. לטיפול תרופתי, יש להשלים ריאגנטים נוספים לתקשורת התרבות בשלב זה.
- תרבית את התאים באינקובטור במשך 24 שעות ובדוק את המפגש כדי לקבוע אם נוצרה כיראליות.
הערה: מפגש של מעל 75% מומלץ עבור רוב סוגי התאים, ומפגש יתר עשוי להשפיע על אפיון הכיראליות.
5. אוסף תמונות
- תקן את התאים במפגש.
- הסירו את מדיית התרבית מצלחת הבאר ושטפו פעם אחת עם PBS.
- מוסיפים תמיסת פרפורמלדהיד של 4%, דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ולאחר מכן שוטפים 3 פעמים עם PBS.
הערה: אם הקיבוע משנה באופן משמעותי את המורפולוגיה של התא, מומלץ לבצע הדמיה לפני הקיבוע
- השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם פונקציונליות מצלמה, צלם כל טבעת על השקופיות ברזולוציה גבוהה (עדשת אובייקט 10x מספיקה לניתוח).
6. אפיון כיראליות של תאים (איור 2)
- הורד קבצי קוד MATLAB לאפיון כיראליות מהקבצים המשלימים (קובץ משלים 1).
הערה: הקוד נבדק כדי לעבוד עם MATLAB_R2015b וגרסאות מתקדמות יותר הן במערכות Windows והן במערכות macOS. ארגז הכלים של הסטטיסטיקה המעגלית נדרש גם להפעלת הקבצים, אותם ניתן למצוא בהפניה17. - הוסף את תיקיית הקוד ותיקיות המשנה (עם ארגז כלים לסטטיסטיקה מעגלית בפנים) לנתיב MATLAB ופתח את הקובץ "ROI_selection.m". בשורה 4, שנה את הספריה לתיקיית הנתונים הרצויה (עבור משתמשי חלונות, החלף את "/" ל- "\" בשורות 4 ו- 5).
- שנה את גודל התמונה בשורה 14, כאשר שתי הדמויות הראשונות מייצגות את גודל העיגול הפנימי של הטבעת ואילו השתיים האחרות מייצגות את החיצוני.
הערה: ודא שהגדלים של כל התמונות בתיקיה שיש לנתח זהות. - לחץ על לחצן הפעלה כדי להפעיל את קוד MATLAB "ROI_selection.m" כדי לקבוע את אזור העניין (ROI) בתמונות של ניגודיות פאזה.
- גררו ידנית את ריבוע הבחירה כך שיתאים לטבעת, ולאחר מכן לחצו פעמיים על התמונה כדי לאשר את הבחירה.
- חזור על שלב זה עבור כל תמונה בתיקיה (התמונה הבאה תופיע באופן אוטומטי לאחר אישור בחירת ההחזר על ההשקעה של תמונה קודמת); קובץ ".mat" ייווצר כדי לאחסן את פרטי ההחזר על ההשקעה עבור כל תמונה.
- פתח את הקובץ "Analysis_batch.m" ושנה את ספריית התיקיה זהה לשלב 6.2. (עבור משתמשי החלונות, לשימוש בפעם הראשונה, החלף את "/" ל-"\" בשורות 5, 6, 124 ו-130)
- לחץ על כפתור הפעלה כדי לבצע את הקוד "Analysis_batch.m" כדי לקבוע את הכיראליות של תבניות טבעת סלולריות מרובות. ייווצר קובץ "datatoexcel.txt", המכיל נתונים סטטיסטיים מעגליים עבור כל טבעת, כמו גם את המספרים של טבעות בכיוון השעון, שאינן כיראליות ואנטי-כיוון השעון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רבע שעה לאחר זריעת תאי NIH/3T3, הידבקות התאים בתבנית הטבעת אושרה חזותית על ידי הדמיית ניגודיות פאזה. לאחר תרבית מאוחרת יותר של 24 שעות, התאים על התבניות התכנסו והתארכו עם יישורים א-סימטריים בעליל, מוטים לכיוון הכיוון השעון (איור 2). נדידה כיוונית של תאים מחוברים נרשמת על ידי הדמיה בהילוך מהיר, ניתן לכמת את תנועתיות התאים ואת המורפוגנזה באמצעות ניתוחים נוספים של הסרטון. כדי לבצע ניתוח כיראליות, תמונות של ניגודיות פאזה ברזולוציה גבוהה נלקחות לאחר הקיבוע (איור 2A-C) ומוזנות לתוכנית MATLAB. התוכנית מזהה מעברי צבע בעוצמה ומחשבת את כיווני יישור התא המתאימים בטבעת. לאחר מכן כיראליות התא נקבעת על סמך הסטטיסטיקה המעגלית של יישור התאים החורגת מהכיוון ההיקפי של הטבעות. לפיכך, ניתן להגדיר את התאים ככאלה עם כיוון השעון (CW), נגד כיוון השעון (CCW) או כלא-כיראליים (NC) (איור 2D). לאחר העיבוד, הניתוח הראה כי לרוב הטבעות יש הטיית CW דומיננטית, מה שמצביע על כך שלתאי 3T3 יש כיראליות CW חזקה. נתונים סטטיסטיים מעגליים שנוצרו מספקים גם מידע נוסף על זוויות מוטות לניתוחים נוספים במידת הצורך (איור 2E).
כיראליות התא תלויה בפנוטיפ שלה. בדיקת כיראליות הטבעת אומתה כמתאימה למספר סוגי תאים 7,8,9,10, כולל קווי תאים ותאים ראשוניים, כגון פיברובלסטים, מיובלסטים, תאי אנדותל ותאי גזע (טבלה 1). באופן מעניין, מכיוון שהכיראליות של התא מקורה בפונקציות של שלד אקטין ציטוסקלטון, שינויים בדינמיקה של אקטין עשויים להשפיע על ההטיה הכיראלית של התאים. עם תאי המיובלסט C2C12 של העכבר, מצאנו שעל ידי שיבוש פילמור אקטין עם טיפול של 50 ננומטר Latrunculin A, התאים הפגינו שינוי של הטיית הכיראליות של CCW ל-CW (איור 3A). בנוסף, תאי אנדותל של כלי דם טבוריים אנושיים (hUVECs) שטופלו בתרופה בעלת מולקולה קטנה, 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), כדי להפעיל את החלבון קינאז c הציגו העברה תלוית מינון של כיראליות התא מ-CW ל-CCW (איור 3B). ממצאים אלה מדגימים את התועלת של בדיקת הכיראליות של תבנית הטבעת שפותחה באופן ניסיוני, כמו גם את הרגישות של מבחן זה לשינויים בשלד הציטוסקטון.
איור 1. סכמטית של מיקרו-פטרציה תאית. (A) נוהל של מיקרו-פבריקציה והדפסה מיקרו-קונקרטית לצורך סידור תאים. תבנית פוטורסיסטית שלילית נוצרה על ידי הצלבה אולטרה סגולה (UV) של פוטוריסט באמצעות מסכה המכילה תכונות מיקרו-פטרנינג (1-2). פרפולימרים אלסטומריים אלסטומריים פולידימתילסילוקסן (PDMS) הושלכו על התבנית כדי ליצור בולים (3-4). לאחר מכן, מונו-שכבת הרכבה עצמית של דבק (SAM), אוקטה-דקנתיול (C18), היה מצופה על הבול והועבר על שקופיות זכוכית מצופות זהב באמצעות הדפסת מיקרו-קונטקונטקט (5-7), ולאחר מכן ציפוי של אתילן גליקול ללא דבק עם סיומת SAM, HS-(CH2)11-EG 3 (EG3) (8) ופיברונקטין (9). לאחר מכן נזרעו תאים כדי להיצמד לתבניות (10). (B) תמונות מדגימות את השלבים המרכזיים של מיקרו-פטריזציה של תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2. זרימת עבודה של ניתוחי הדמיה. (א) אוסף תמונות. רכוש תמונות של ניגודיות פאזה של כל טבעת. (B) הזנת נתונים לתוכנית MATLAB על-ידי הפעלת ספריית הגדרת הקבצים "ROI_Selection.m" וגודל התמונה. (C) בחר אזורי עניין (ROIs) על-ידי גרירת ריבוע הבחירה כך שיתאים לטבעת הסלולרית ולחיצה כפולה כדי לאשר. (D) לקבוע יישור תאים והטיות כיראליות על ידי הפעלת הקובץ "Analysis_Batch.m". (E) פלטים לדוגמה עם סיכום של מספרי טבעות מוטים וסטטיסטיקות מעגליות עבור כל טבעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3. תוצאות מייצגות של כיראליות של תאים תחת טיפול תרופתי. (A) תמונות ניגודיות פאזה ותוצאות אפיון כיראליות של תאי מיובלסט C2C12 של עכבר: קבוצות בקרה (משמאל) ו-50 ננומטר Latrunculin A מטופלות (מימין). גופן אדום מודגש מציין כיראליות דומיננטית ב- p < 0.05 על ידי מבחן דרגה. סרגלי קנה מידה: 100 μm. (B) תמונות ניגודיות פאזה ואפיון כיראליות תוצאות של תאי אנדותל כלי דם טבוריים אנושיים (hUVECs) על טבעות מיקרו-תבניות: קבוצות בקרה (משמאל) ו-30 ננומטר TPA מטופלות (מימין). גופן אדום מודגש מציין כיראליות דומיננטית ב- p < 0.05 על ידי מבחן דרגה. סרגלי קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| CW מוטה | CCW מוטה |
| · תאי NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) | · C2C12 (ATCC CRL-1772) |
| · תאי MC3T3-E1 (ATCC CRL-2593) | · תאי שריר השלד האנושי ( לונזה CC-2661) |
| · פיברובלסטים לבביים של חולדות | · קו פיברובלסט לסרטן העור האנושי (ATCC CRL-7762) |
| · פיברובלסטים ראשוניים בעור האדם (ATCC PCS-201-012) | · תאי אפיתל הכליה הכלביים של מאדין-דארבי (ATCC CCL-34) |
| · תאי גזע שמקורם בשומן אנושי | |
| · תאי גזע מזנכימליים אנושיים | |
| · תאי אנדותל וסקולריים טבוריים אנושיים (Lonza CC-2935) | |
| · תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האדם (מערכות תאים ACBRI-376) |
טבלה 1. הטיות כיראליות של סוגי תאים שונים המאופיינים על ידי בדיקת המיקרו-פטרנינג. CW: בכיוון השעון; CCW: נגד כיוון השעון.
קובץ משלים 1: קבצי קוד MATLAB לאפיון כיראליות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קבצי קידוד משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדיקת התבניות בצורת טבעת המתוארת כאן מספקת כלי קל לשימוש לאפיון כמותי של כיראליות רב-תאית, המסוגלת להפיק תוצאות אמינות ביותר וניתנות לחזרה. ייצור מהיר של מיקרו-סביבה מוגדרת זהה וניתוח בלתי מוטה מאפשר עיבוד אוטומטי בתפוקה גבוהה של דגימות בגודל גדול. פרוטוקול זה דן בייצור המיקרו-פטרנים הטבעתיים, בתבניות התאים ובניתוח אוטומטי של יישור התאים המוטה ותנועת הכיוון. שיטה זו תואמת לטכניקות הדמיה חיות לחקר תנועתיות התאים והמורפוגנזה הכיראלית, וניתן לשלב אותה באופן פוטנציאלי בתוכנות אחרות לזיהוי רעילות9 או ליישומי סינון תרופות.
יש כמה טיפים נוספים שכדאי לשתף. ראשית, בשלב ההדפסה הזעירה, יש ליצור את החותמת בצד הזהב של הזכוכית (ייתכן שיהיה קשה להבחין בה לאחר חיתוך המצע לחתיכות), ויש להימנע מהדפסה כפולה. שנית, עבור התאים הזקוקים לחלבונים אחרים לצורך התקשרות נכונה, ניתן להשתמש בחלבונים המועדפים בשלב 3.17. שלישית, עבור תרבית תאים, צפיפות התאים לא צריכה להיות גבוהה מדי, ואין לגדל את התאים במפגש יתר על המידה על התבניות. אחרת, תאים עלולים לפרוץ את הגבול הפנימי ולמלא את הטבעת למעגל מוצק. רביעית, אם תבניות התא שבורות או לא שלמות לאחר הזריעה, ייתכן שהן נובעות מהעברה לא שלמה של תבנית C18 במהלך הדפסת מגע (שלבים 3.7-3.8). יש לבחון את חותמות ה- PDMS לאיתור פגמים. הפעלת כוח מעט גבוה יותר בעת הטבעה על שקופיות יכולה גם היא להיות מועילה. לבסוף, אם התאים מתחברים לכל פני השטח של החלקת הזכוכית ללא תבניות נראות לעין, הכוח המופעל בשלב 3.8 עשוי להיות גבוה מדי, וכתוצאה מכך כל המשטח יוטבע ב-C18. ייתכן גם כי השקופיות פגומות או מאוחסנות ב- PBS במשך זמן רב מדי. יש להשתמש בדפוסים של חד-שכבתיים להרכבה עצמית (כלומר, C18 ו- EG3) תוך חודש לאחר ההדפסה.
למרות שהבדיקה המוצעת מספקת כלי נוח לאפיון כיראליות חזק, ישנן כמה מגבלות. ראשית, בדיקת התבניות תואמת רק לתאים הדבקים. ניתן לנתח את הכיראליות של תאים שאינם דבקים, כגון תאי גידול במחזור הדם, אדיפוציטים או תאים שאינם יונקים, באמצעות שיטת הדו-שכבתית התלת-ממדית של Matrigel18,19. שנית, עבור סוגי תאים בעלי צורת ריצוף טבעית ואינם מראים התארכות משמעותית, דיוק הניתוח עשוי לרדת. עם זאת, ניתן לאפיין את הכיראליות של סוגי תאים אלה על ידי ביצוע הדמיה חיה ומעקב אחר הטיית הנדידה7. לבסוף, בדיקת המיקרו-פטרינג היא שיטת ניתוח נקודות קצה, שאינה מיועדת לתרבית תאים ארוכת טווח. ניסויים כמו טיפול תרופתי לא יעלו על 72 שעות לאחר זריעה על דפוסים. עבור יישומים הדורשים זמן טיפול ממושך, שקול להקדים תאים לפני הזריעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (OD /NICHD DP2HD083961 ו- NHBLI R01HL148104). ליאו ק. וואן הוא חוקר פיו במדעים ביו-רפואיים (PEW 00026185), הנתמך על ידי נאמנויות הצדקה של פיו. האוקאנג ג'אנג נתמך על ידי מלגת קדם-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (20PRE35210243).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 proof ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX microscope system | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Electron beam evaporator | Temscal | BJD-1800 | Gold-titanum film coating |
| Fetal bovine serum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Glass microscope slides | VWR | 10024-048 | |
| Glass tweezers | Exelta | 390BSAPI | |
| Gold evaporation pellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI contact aligner | OAI | 200 | UV photolithography |
| Octadecanethiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Research product international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxane Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silicon Wafer | University Wafer | ID#809 | |
| Sodium pyruvate | Thermo fisher scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 photoresist | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titanium evaporation pellets | International Advanced Materials | TI14 | |
| Transparency mask (with feature) | Outputicity.com | N/A | Mask printing service |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
References
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413 (2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. Cell chirality in cardiovascular development and disease. APL Bioengineering. 4 (3), (2020).
- Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413 (2016).
- Utsunomiya, S., et al. Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis. Symmetry. 11 (4), 505 (2019).
- Tamada, A. Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry. Symmetry. 11 (1), 102 (2019).
- Tee, Y. H., et al. Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton. Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).
- Wan, L. Q., et al. Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).
- Fan, J., et al. Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability. Science Advances. 4 (10), 2111 (2018).
- Singh, A. V., et al. Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress. ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).
- Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).
- Chen, T. H., et al. Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics. Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).
- Ray, P., et al. Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).
- Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. Cell organelle-based analysis of cell chirality. Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Liu, W., et al. Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias. ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).
- Wan, L. Q., et al. Geometric control of human stem cell morphology and differentiation. Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).
- Circular Statistics Toolbox. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics (2021).
- Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).
- Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation. Stem Cells International. 2018, 1848605 (2018).
