Isolamento delle cellule endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo per esperimenti multi-omici a singola cellula

Summary

Presentiamo un metodo per isolare cellule e nuclei endoteliali dal lume delle arterie carotidi di topo esposte a condizioni di flusso stabili o disturbate per eseguire esperimenti omici a singola cellula.

Abstract

L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria delle regioni arteriose esposte a flussi sanguigni disturbati (d-flow). Il D-flow regola l'espressione dei geni nell'endotelio a livello trascrittomico ed epigenomico, con conseguente risposta proaterogena. Recentemente, sono stati eseguiti studi di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) e test a singola cellula per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (scATACseq) per determinare i cambiamenti di accessibilità trascrittomica e cromatina a una risoluzione a singola cellula utilizzando il modello di legatura parziale della carotide (PCL) del topo. Poiché le cellule endoteliali (ECs) rappresentano una frazione minore delle popolazioni cellulari totali nella parete arteriosa, è stato utilizzato un metodo di digestione luminale per ottenere preparati monocellulari arricchiti con EC. Per questo studio, i topi sono stati sottoposti a chirurgia PCL per indurre il flusso d nell'arteria carotide sinistra (LCA) mentre utilizzavano l'arteria carotide destra (RCA) come controllo. Le arterie carotidi sono state sezionate due giorni o due settimane dopo l'intervento chirurgico PCL. Il lume di ciascuna carotide è stato sottoposto alla digestione della collagenasi e sono state ottenute singole cellule arricchite con endotelio o singoli nuclei. Questi preparati monocellulari e mononuclei sono stati successivamente codificati a barre utilizzando una configurazione microfluidica 10x Genomics. Le singole cellule e i singoli nuclei con codice a barre sono stati quindi utilizzati per la preparazione dell'RNA, la generazione della libreria e il sequenziamento su un sequenziatore di DNA ad alto rendimento. Dopo l'elaborazione bioinformatica, i set di dati scRNAseq e scATACseq hanno identificato vari tipi di cellule dalla digestione luminale, costituite principalmente da EC . Erano presenti anche cellule muscolari lisce, fibroblasti e cellule immunitarie. Questo metodo di arricchimento CE ha aiutato a comprendere l'effetto del flusso sanguigno sull'endotelio, che avrebbe potuto essere difficile con il metodo di digestione totale delle arterie. Il metodo di preparazione a singola cellula arricchito con EC può essere utilizzato per eseguire studi omici a singola cellula in topi EC-knockout e transgenici in cui l'effetto del flusso sanguigno su questi geni non è stato studiato. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattata per isolare singole cellule arricchite di EC da espianti di arterie umane per eseguire studi meccanicistici simili.

Introduction

Questo laboratorio ha precedentemente dimostrato che l'induzione del d-flow porta a uno sviluppo rapido e robusto dell'aterosclerosi nei topi iperlipidemici ^1,2. Il nuovo modello murino di aterosclerosi indotta da d-flow è stato possibile utilizzando la chirurgia della legatura parziale della carotide (PCL) ³. La chirurgia PCL induce condizioni di flusso sanguigno basso e oscillatorio o d-flow nell'arteria carotide sinistra legata (LCA). Al contrario, l'arteria carotide destra controlaterale (RCA) continua ad affrontare un flusso laminare stabile (s-flow). In precedenza, per comprendere l'effetto del d-flow sulle cellule endoteliali, le arterie carotidi venivano sezionate dopo un intervento chirurgico di legatura parziale e lavate con un agente lisante a base di fenolo e guanidina isotiocianato (metodo di lavaggio del DNA / RNA luminale)^2,4, che forniva RNA o DNA "pooled bulk" arricchiti con endotelio. Questi aggregati di RNA o DNA bulk sono stati quindi elaborati per studi trascrittomici o studi epigenomici sul metiloma del DNA, rispettivamente ^4,5,6. Questi studi hanno contribuito a scoprire più geni sensibili al flusso e microRNA i cui ruoli nella biologia endoteliale e nell'aterosclerosi sono stati ampiamente studiati ^4,6,7.

Tuttavia, nonostante l'arricchimento endoteliale, questi studi di massa RNA / DNA non hanno potuto distinguere il ruolo specifico di ciascun tipo di cellula nella parete arteriosa nell'aterosclerosi indotta da d-flow. Sono stati eseguiti studi di isolamento a singola cellula arricchita di endotelio (sc) e di sequenziamento di scRNA e scATAC per superare questa limitazione⁸. Per questo, i topi C57Bl6 sono stati sottoposti alla chirurgia PCL per indurre il d-flow nella LCA mentre utilizzavano l'RCA esposto al flusso s come controllo. Due giorni o due settimane dopo l'intervento chirurgico PCL, i topi sono stati sacrificati e le carotidi sono state sezionate e ripulite. Il lume di entrambe le LCA e RCA è stato infuso con collagenasi e sono stati raccolti i digesti di collagenasi luminale contenenti EC come frazione significativa e altre cellule arteriose. La sospensione a singola cellula (scRNAseq) o la sospensione a nucleo singolo (scATACseq) sono state preparate e codificate a barre con identificatori univoci per ogni cellula o nucleo utilizzando una configurazione genomica 10x. Gli RNA sono stati sottoposti alla preparazione della libreria di cDNA e sequenziati.

I set di dati scRNAseq e scATACseq sono stati elaborati utilizzando il software Cell Ranger Single-Cell e ulteriormente analizzati dai pacchetti Seurat e Signac R ^9,10. Ad ogni cellula e nucleo è stato assegnato un tipo di cellula da queste analisi e raggruppato nel tipo di cellula in base ai geni marcatori e ai modelli di espressione genica unici. I risultati di scRNAseq e scATACseq hanno dimostrato che questi preparati unicellulari sono arricchiti con EC e contengono anche cellule muscolari lisce (SMC), fibroblasti e cellule immunitarie.

Ulteriori analisi hanno rivelato che la popolazione EC nella digestione luminale è altamente divergente e plastica (8 diversi cluster EC) e reattiva al flusso sanguigno. Ancora più importante, questi risultati hanno dimostrato che il d-flow riprogramma le EC da un fenotipo antinfiammatorio protetto dall'atero a fenotipi pro-aterogeni, tra cui la transizione pro-infiammatoria, endoteliale-mesenchimale, la transizione delle cellule staminali / progenitrici endoteliali e, più sorprendentemente, la transizione da cellule endoteliali a cellule immunitarie. Inoltre, i dati di scATACseq rivelano nuovi cambiamenti di accessibilità della cromatina dipendenti dal flusso e siti di legame del fattore di trascrizione in modo genomico, che costituiscono la base di diverse nuove ipotesi. La metodologia e il protocollo per la preparazione di singole cellule endoteliali per studi multi-omici a singola cellula dalle arterie carotidi di topo sono dettagliati di seguito.

Protocol

Tutte le procedure animali descritte di seguito sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Emory University. I topi C57BL / 6 non ipercolesterolemizzanti, abbinati all'età e al sesso sono stati utilizzati per mitigare la variazione dipendente dal sesso e compensare qualsiasi complicanza delle condizioni ipercolesterolemiche.

1. Chirurgia della legatura parziale della carotide (PCL)

NOTA: La legatura parziale dell'arteria carotide della LCA è stata effettuata come descritto in precedenza e dimostrato³.

1. Anestetizzare il topo mediante inalazione di isoflurano (5% di isofluorano in ossigeno per induzione e 1,5% dopo quello di mantenimento) durante tutta la procedura utilizzando un vaporizzatore anestetico. Posizionare il topo supino su un tampone isotermico Deltaphase per prevenire la perdita di calore corporeo durante l'intervento chirurgico.
2. Applicare un unguento oculare per prevenire la cheratite da esposizione e confermare la profondità dell'anestesia dall'assenza di risposta al pizzico della punta.
3. Iniettare buprenorfina 0,05 mg/kg per via sottocutanea per gestire preventivamente il dolore. Disinfettare l'area epilata applicando e pulendo con soluzione di betadine e isopropanolo tre volte. Assicurarsi che il betadine sia l'ultimo passo per sterilizzare l'area chirurgica, partendo dal centro e finendo ai lati.
4. Utilizzando tecniche asettiche, praticare un'incisione ventrale della linea mediana (~ 1 cm) nella regione del collo ed esporre il punto di diramazione LCA mediante dissezione smussata.
5. Ligare la carotide interna sinistra, la carotide esterna e le arterie occipitali con sutura di seta 6-0; lasciare intatta l'arteria tiroidea superiore.
6. Approssimare la pelle e chiudere l'incisione con colla tissutale e/o punti di sutura.
7. Trasferire il mouse in una gabbia di recupero preriscaldata (mantenuta a 37 °C) e posizionarlo su un asciugamano pulito per un massimo di 1 ora per evitare l'ipotermia post-operatoria.
   NOTA: Nella nostra esperienza, una singola dose preventiva di buprenorfina (0,05 mg / kg) è di solito sufficiente per la gestione del dolore post-operatorio. Una dose ripetuta di buprenorfina può essere somministrata se l'animale è in difficoltà dopo le prime 24 ore. Se eseguita correttamente, non vi è mortalità associata a questa procedura e lo stress postoperatorio per il topo è minimo. I topi vengono riportati nelle rispettive gabbie e monitorati quotidianamente dopo l'intervento chirurgico.
8. Preparare l'impostazione della perfusione.
   1. Utilizzare lo 0,9% di NaCl (soluzione salina normale) contenente 10 U/mL di eparina in una sacca per flebo. Aggancia la sacca IV a 244-274 cm (8-9 piedi) da terra o circa 122-152 cm (4-5 piedi) più in alto della tavola di dissezione. Attaccare l'ago a farfalla all'estremità della linea salina e lavare eventuali bolle d'aria dalla linea IV.

2. Isolamento delle arterie carotidi dopo il sacrificio

1. Sacrificare i topi per inalazione di CO₂ seguendo il protocollo istituzionale IACUC.
2. Spruzzare etanolo al 70% sulla pelle del topo e posizionarlo in posizione supina sul pannello di dissezione contenente asciugamani di carta adsorbenti. Fissare le zampe del mouse agli asciugamani adsorbenti sulla scheda di dissezione usando nastro adesivo o un ago da 21 G.
3. Usando un paio di forbici sterili, rimuovere la pelle del topo partendo dall'addome e fino alla parte superiore del torace.
4. Utilizzare un paio di forbici per aprire la parete addominale sotto la gabbia toracica mediante dissezione smussata.
5. Usando le forbici, praticare con attenzione un'incisione lungo la lunghezza del diaframma e continuare attraverso le costole su entrambi i lati del torace fino a quando lo sterno può essere sollevato. Sollevare delicatamente lo sterno con un paio di pinze; Successivamente, rimuovere la gabbia toracica per esporre il cuore.
6. Rimuovere con attenzione il timo e qualsiasi tessuto connettivo sopra il cuore per visualizzare i vasi principali.
7. Recidere la vena cava con le forbici per consentire al sangue di uscire dalla circolazione chiusa.
8. Inserire un ago a farfalla da 21 G collegato alla linea IV attraverso l'apice del cuore nel ventricolo sinistro e consentire la perfusione retrograda per 2-3 minuti con soluzione salina normale a temperatura ambiente. Assicurarsi che venga mantenuta una portata costante di soluzione salina normale mantenendo il sacchetto salino all'altezza di 8-9 piedi da terra.
   NOTA: I polmoni e il fegato diventano pallidi, indicando una perfusione ottimale. Per ogni mouse vengono utilizzati circa 20 ml di buffer di perfusione.
9. Rimuovere la pelle dalla regione del collo e rimuovere tutto il grasso, i muscoli e i tessuti connettivi per esporre le arterie carotidi (Figura 1A).
   NOTA: Il resto della procedura viene eseguito al microscopio da dissezione.
10. Regolare il campo visivo per individuare i siti di legatura. Utilizzando le forbici da microdissezione da 10 mm, praticare una piccola incisione sotto il sito di legatura nell'LCA per consentire la perfusione.
11. Perfondere di nuovo per un ulteriore 1 minuto attraverso il ventricolo sinistro e assicurarsi che l'LCA sia ben perfuso e privo di tracce visibili di sangue.
12. Utilizzare una pinza a punta fine e piccole forbici a molla per rimuovere con cura i tessuti peri-avventiziali che circondano le carotidi mentre la carotide è attaccata al corpo.
    NOTA: Prestare estrema attenzione a non spremere o allungare le arterie carotidi durante questa fase di pulizia, in quanto ciò può aumentare il numero di cellule non vitali. Se eseguita correttamente, la vitalità cellulare nella sospensione cellulare finale è solitamente >93%.

3. Isolamento unicellulare arricchito di cellule endoteliali da carotidi di topi

NOTA: I reagenti descritti di seguito possono essere preparati in anticipo e conservati a 4 °C fino all'uso: tamponi di lisi a nuclei singoli 1x e 0,1x con i reagenti elencati nella tabella 1; tampone di lavaggio a nuclei singoli con i reagenti elencati nella tabella 1; ricetta Nuclei Buffer a nucleo singolo con i reagenti elencati nella Tabella 1. Le scorte di lavoro di questi tamponi devono essere preparate seguendo il protocollo del fabbricante. Composizione tampone digestivo: collagenasi di tipo II 600 U/mL e DNasi I 60 U/mL in soluzione salina tamponata fosfato contenente fosfato (PBS) contenente siero bovino fetale (FBS).

1. Mentre le carotidi sono ancora attaccate, lavare l'esterno delle arterie carotidi con una normale soluzione salina per eliminare eventuali tracce di sangue.
2. Utilizzando una siringa da insulina dotata di un ago da 29 G, iniettare ~ 50 μL del tampone digestivo nel lume dell'estremità distale dell'arteria carotide sinistra. Quando il tampone di digestione inizia a riempire l'arteria carotide, bloccare l'estremità prossimale della carotide con una micro-clip (Figura 1B). Introdurre ulteriori 15-20 μL di tampone digestivo nel lume e tagliare l'estremità distale per evitare il rilascio del tampone di digestione.
3. Espiare con cautela le arterie carotidi dal topo (Figura 1B,C) e metterle in piatti da 35 mm contenenti una soluzione salina calda (a 37 °C) tamponata con Hepes.
   NOTA: assicurarsi che entrambi i morsetti siano posizionati saldamente. Se il morsetto si allenta, la soluzione di digestione può fuoriuscire dal lume e influenzare il conteggio delle cellule ottenuto. Se ciò accade, aggiungere un'ulteriore soluzione enzimatica usando una siringa da insulina dotata di un ago da 29 G dall'estremità aperta della carotide e fissare nuovamente il morsetto (Figura 1D). Se la soluzione tampone enzimatica perde di nuovo, è probabile che la carotide venga recisa durante il processo di espianto. In questo caso, scartare la carotide ed escludere il campione dallo studio. La manipolazione approssimativa ripetuta della carotide diminuirà la vitalità cellulare e la qualità della preparazione a singola cellula. Fare attenzione a identificare ed etichettare correttamente le arterie carotidi sinistra e destra.
4. Incubare le carotidi espiantate per 45 minuti a 37 °C con oscillazione intermittente.

4. Lavaggio delle arterie carotidi

1. Dopo aver completato la digestione enzimatica luminale, rimuovere l'arteria carotide insieme ai morsetti dal piatto da 35 mm. Rimuovere con attenzione ogni morsetto, facendo attenzione che il tampone di digestione non perda.
2. Tenere delicatamente un'estremità dell'arteria carotide con una pinza fine sopra un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Inserire un ago da 29 G dotato di una siringa da insulina contenente 100 μL di tampone digestivo caldo (37 °C) nel lume con l'altra mano (Figura 1D).
3. Lavare rapidamente il lume della carotide nel tubo della microcentrifuga. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 0,3 mL di FBS nel tubo da 1,5 mL. Posizionare il tubo sul ghiaccio.
   NOTA: Il lavaggio contiene le cellule della digestione enzimatica luminale. L'aggiunta di FBS e la riduzione della temperatura arrestano il processo di digestione enzimatica. Se il numero di cellule nella preparazione è elevato e contiene detriti o tessuto adiposo, l'uso di un filtro cellulare da 50 o 70 μm è altamente raccomandato per filtrare i detriti di tessuti indesiderati. Per aumentare la conta delle singole cellule, si raccomanda il lavaggio di più carotidi. Qui, per ottenere almeno 5.000 cellule, 10-12 carotidi sono state lavate e raggruppate come un unico campione.
4. Centrifugare le celle a 500 × g per 5 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga dotata di rotore ad angolo fisso (vedere la tabella dei materiali).
5. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un tampone di digestione contenente il reagente di dissociazione cellulare (vedere la tabella dei materiali) per 5 minuti a 37 °C per separare tutte le cellule in singole cellule.
   NOTA: Se il numero di celle nella preparazione è basso, aumentare la velocità della centrifuga fino a 2.000-3.000 × g per far girare le celle. Inoltre, l'utilizzo di provette da centrifuga da 0,5 ml facilita una migliore visualizzazione del pellet cellulare sul fondo del tubo.
6. Bloccare la reazione enzimatica aggiungendo 0,15 mL di FBS nel tubo da 0,5 mL.
7. Centrifugare la sospensione monocella a 500 × g per 5 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga dotata di rotore ad angolo fisso, come al punto 4.4.
8. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μL di soluzione di albumina sierica bovina (BSA) ghiacciata all'1% in PBS in una provetta da microcentrifuga da 0,2 ml.
   NOTA: L'utilizzo di provette da centrifuga da 0,2 ml migliora la visualizzazione del pellet monocellulare sul fondo del tubo.

5. Analisi monocellulari e mononucleosi

1. Risospendere e inviare la preparazione a singola cellula per scRNAseq.
   1. Risospendere il pellet unicellulare con 100 μL di BSA ghiacciato all'1% in PBS in una provetta da 0,2 ml.
   2. Dopo aver risospeso le celle per l'incapsulamento a cella singola, procedere immediatamente per l'incapsulamento a cella singola e il codice a barre utilizzando un sistema di partizionamento e codifica a barre a cella singola basato sulla microfluidica (vedere la tabella dei materiali).
   3. Prima di sottoporre i campioni al nucleo di genomica, contare e ispezionare i preparati monocellulari; garantire l'assenza di aggregati cellulari.
      NOTA: L'aggregazione di singole celle può essere ulteriormente minimizzata aumentando la quantità di BSA fino al 2%.
2. Risospendere e inviare la preparazione a cella singola per scATACseq.
   1. Risospendere il pellet cellulare in 100 μL di 0,04% BSA in 1x PBS ghiacciato e centrifugare la sospensione monocellulare a 500 × g a 4 °C.
   2. Lisare la sospensione monocellulare con tampone di lisi 0,1x ghiacciato (Tabella 1) e incubare per 5 minuti su ghiaccio.
   3. Mescolare il lisato 10 volte con una pipetta P-20 e incubare per altri 10 minuti.
   4. Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio refrigerato (Tabella 1) alle celle lisate e mescolare 5 volte utilizzando una pipetta.
      NOTA: Utilizzare un filtro cellulare da 70 μm per filtrare eventuali detriti dalla sospensione cellulare e trasferirli in un tubo da 2 ml.
   5. Centrifugare il lisato a 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere i nuclei-pellet nel tampone nuclei diluiti (150 μL) (vedere la tabella dei materiali e la tabella 1). Contare e ispezionare i preparati a nucleo singolo utilizzando un emocitometro¹¹.
   6. Inviare il campione di nuclei singoli al nucleo genomico per la trasposizione di nuclei singoli, il partizionamento dei nuclei, la preparazione della libreria e il sequenziamento.
      NOTA: Se il numero iniziale di cellule è basso, è comune osservare detriti lungo i nuclei. Pertanto, si consiglia di iniziare con un numero di celle elevato.

Representative Results

Sono stati eseguiti interventi chirurgici di legatura parziale della carotide su 44 topi e l'inizio del flusso d nella LCA è stato convalidato eseguendo l'ecografia un giorno dopo l'intervento chirurgico di legatura parziale. La chirurgia di legatura parziale di successo provoca una riduzione della velocità del flusso sanguigno e inverte il flusso sanguigno (flusso disturbato) nella LCA³. Le arterie carotidi sono state sezionate a due giorni o due settimane dopo la legatura. Il lume di ciascuna carotide è stato sottoposto alla digestione della collagenasi e sono state preparate sospensioni di singole cellule o nuclei singoli arricchite con endotelio. Le sospensioni a cella singola sono state raggruppate da 10 RCA e LCA per aumentare la resa cellulare. Le cellule/nuclei preparati sono stati successivamente codificati a barre e sequenziati. Per lo studio sc-RNAseq, il numero di singole cellule ottenute era ~ 9.700. La distribuzione delle cellule da 4 campioni è mostrata nella Tabella 2.

Allo stesso modo, per lo studio scATACseq, singole cellule sono state isolate da 12 RCA e LCA preparate, sottoposte a trattamento con trasposasi, codificate a barre e sequenziate. Il sequenziamento è stato eseguito per 18.324 nuclei singoli, che sono stati raggruppati da 1.291 (RCA a 2 giorni [2D-R]), 5.351 (LCA a 2 giorni [2D-L]), 5.826 (RCA a 2 settimane [2W-R]) e 5.856 (LCA a 2 settimane [2W-L]) (Tabella 2). Le preparazioni rappresentative di singole cellule e nuclei singoli visualizzate mediante microscopia a campo chiaro e microscopia a contrasto di fase sono mostrate nella Figura 2A,B. L'efficienza della preparazione di singoli nuclei da sospensione monocellulare è mostrata nella Figura 2C.

I nuclei (~7.000 ciascuno) da campioni 2D (RCA e LCA) e 2W (RCA e LCA) sono stati incubati con una miscela di trasposizione (enzima trasposasi Tn5 e tampone) vedi tabella dei materiali) per 60 minuti a 37 °C seguendo il protocollo del produttore. Sulla base della raccomandazione del produttore, una delicata condizione di detergente ha contribuito a mantenere intatti i nuclei durante l'etichettatura. Un master mix, costituito da un reagente per codici a barre, un agente riducente B e un enzima per codici a barre, è stato quindi caricato su una piattaforma di incapsulamento di cellule / nuclei microfluidici per preparare emulsioni di gel a nucleo singolo con codice a barre secondo le istruzioni del produttore.

Dopo il sequenziamento, la suite Cell Ranger Single-Cell Software è stata utilizzata per il demultiplexing, l'allineamento dell'elaborazione dei codici a barre e il clustering iniziale dei profili scATACseq e scRNaseq grezzi. Per lo studio scRNAseq, la distribuzione dei geni per cellula, l'identificatore molecolare univoco (UMI) per cellula, le letture mitocondriali per cellula e le informazioni sulla saturazione del sequenziamento sono mostrate nella Figura 3A-C. Allo stesso modo, per lo studio scATACseq, le metriche di controllo della qualità che mostrano la distribuzione delle dimensioni dell'inserto (schema di banding del nucleosoma) e il punteggio di arricchimento TSS normalizzato sono mostrate nella Figura 3D-F. Inoltre, la percentuale di letture di frammenti nei picchi, i frammenti della regione di picco, il punteggio di arricchimento TSS, il rapporto di letture nei siti genomici della lista nera e il rapporto di segnale nucleosomico sono mostrati nella Figura 3G-K.

L'arricchimento endoteliale è stato quantificato confrontando questo metodo con quello della digestione enzimatica dell'intera arteria carotide¹². La conta delle cellule endoteliali dalla digestione completa dell'arteria carotide era del 3-5% delle cellule totali ottenute, mentre questo metodo ha permesso l'arricchimento delle cellule endoteliali al >50% ⁸. Allo stesso modo, un altro studio a singola cellula che ha utilizzato l'intera aorta del topo ha mostrato che la frazione endoteliale era <7% della conta totale delle cellule. Per un'analisi approfondita di RNAseq a singola cellula e ATACseq a singola cellula, i lettori sono pregati di fare riferimento a ⁸.

Figura 1: Isolamento delle arterie carotidi per la preparazione di singole cellule. (A) Vista anatomica delle arterie carotidi nei topi. Le frecce rosse e l'inserto mostrano l'arteria carotide sinistra isolata dopo la pulizia del grasso periavventiziale. Per uno schema dell'anatomia e delle legature carotidee, fare riferimento alla Figura 1 in Nam et al³ (B) L'immagine mostra la posizione delle micro-clip dopo aver riempito l'arteria carotide con il tampone di digestione. (C) Arteria carotide espiantata contenente tampone digestivo. Scala: distanza tra le linee nere = 1 mm. (D) Un ago da 29 G nel lume dell'arteria carotide del topo. Questo passaggio aiuta a ricostituire l'arteria carotide con tampone digestivo, se necessario. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Preparazione di nuclei singoli e monocellulari dalla digestione enzimatica luminale dell'arteria carotide di topo. (A) Preparazioni rappresentative di singole cellule e nuclei singoli. Barre di scala = 0,25 mm (B) Contrasto di fase rappresentativo e immagini Gel-Red di preparazioni a singolo nucleo. Barre di scala = 0,25 mm. (C) L'efficienza della preparazione dei singoli nuclei nella colonna di sinistra mostra il numero di singole celle all'inizio, mentre la colonna di destra mostra il numero di singoli nuclei dopo l'elaborazione con il buffer di isolamento dei nuclei in diversi passaggi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Metriche QC standard per lo studio scRNAseq e scATACseq. I grafici di violino mostrano (A) la distribuzione dei geni per cellula (nFeature RNA), (B) UMI per cellula (nCount_RNA), (C) letture mitocondriali per cellula (percentuale mt) per i dati scRNAseq. (D ed E) mostrano il pattern di banding dei nucleosomi per lo studio scATACseq. L'istogramma delle dimensioni dei frammenti di DNA mostra un forte schema di bande nucleosomiche corrispondente alla lunghezza del DNA avvolto attorno a un singolo nucleosoma. (F) Punteggio di arricchimento TSS normalizzato in ciascuna posizione rispetto al TSS. I grafici a dispersione/violino mostrano (G) letture percentuali di frammenti nei picchi, una misura della profondità di sequenziamento, (H) frammenti della regione del picco che mostrano il numero di frammenti che si sovrappongono ai picchi, (I) punteggio di arricchimento TSS, un rapporto tra la distribuzione aggregata delle letture centrate sui TSS e quella che fiancheggia il corrispondente TSS, (J) rapporto della lista nera, un rapporto di letture nei siti genomici della lista nera, e (K) segnale nucleosomiale, un rapporto tra frammenti mononucleosomiali e privi di nucleosomi. Abbreviazioni: scRNAseq = sequenziamento dell'RNA a singola cellula; scATACseq = Saggio a cellula singola per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi; QC = controllo qualità; UMI = identificatore molecolare univoco; TSS = sito di inizio della trascrizione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Composizione dei tamponi di lisi e lavaggio a singolo nucleo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Conteggio di singole cellule e nuclei singoli dalla digestione luminale dell'arteria carotide del topo. La tabella mostra anche le letture medie / cellula e il numero di geni / cellula per i dati scRNAseq. Per i dati scATACseq, i frammenti medi / cella e le letture totali ottenute per campione sono mostrati⁸. Abbreviazioni: scRNAseq = sequenziamento dell'RNA a singola cellula; scATACseq = Saggio a cellula singola per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi; 2D = 2 giorni; 2W = 2 settimane; R/RCA = arteria carotide destra; L/LCA = arteria carotide sinistra. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per isolare i preparati unicellulari dalle arterie carotidi del topo. L'influenza del d-flow sulle cellule endoteliali può essere accuratamente studiata se la chirurgia PCL viene eseguita correttamente. È fondamentale identificare correttamente i rami della carotide comune, come la carotide esterna, la carotide interna, l'arteria occipitale e l'arteria tiroidea superiore. La convalida dei modelli di flusso mediante ecografia convalida ulteriormente l'insorgenza di condizioni di flusso d. Sebbene la chirurgia PCL possa essere eseguita sui topi indipendentemente dalla loro età, l'età preferita è di 10 ± 2 settimane. I topi più anziani e i topi con background ipercolesterolemico tendono generalmente ad avere più grasso periadventiziale e pelle più rigida.

È essenziale sezionare attentamente i preparati unicellulari arricchiti con endotelio dell'arteria carotide liberi dal tessuto circostante e dal grasso periavventiziale. Il lume delle carotidi deve essere perfuso accuratamente per evitare di contaminare le cellule del sangue nei preparati unicellulari. L'identificazione e l'etichettatura improprie dei tessuti possono comportare un'elevata deviazione standard. Per questo protocollo sono necessarie un'attenta pianificazione e gestione del tempo. Un chirurgo e un operatore esperto possono impiegare 15-20 minuti per eseguire un intervento chirurgico PCL. Il sacrificio, l'isolamento carotidea e la digestione enzimatica luminale da ciascun topo richiederebbero altri 35-40 minuti. Il tempo di elaborazione pratico dal lavaggio delle cellule endoteliali alla preparazione di singole cellule / nuclei singoli è di ulteriori 2 ore. La pianificazione meticolosa e il lavoro di squadra sono altamente raccomandati.

Come con qualsiasi protocollo sperimentale, alcuni svantaggi e limitazioni dovrebbero essere considerati. L'attuale protocollo non incorpora misure per evitare l'attivazione artefice della risposta precoce immediata durante la dissociazione del tessuto luminale. È stato riportato in letteratura che la digestione enzimatica può portare a eventi di segnalazione dello stress, come infiammazione e apoptosi. Questo può essere affrontato incorporando gruppi di controllo appropriati nel disegno sperimentale. Inoltre, i metodi di laboratorio umidi che possono ridurre al minimo l'attivazione artefattuale della risposta immediata durante la digestione enzimatica, come le proteasi attive a freddo, dovrebbero essere considerati^13,14.

Questo protocollo può essere utilizzato per qualsiasi ceppo di topo indipendentemente dal suo background genetico. Tuttavia, i preparati arricchiti endotelialmente possono rispondere meglio alle domande di ricerca relative ai cambiamenti nell'endotelio e sono quindi adatti per knockout EC-specifici e topi transgenici EC-specifici. Questo metodo di isolamento a singola cellula può essere adattato per eseguire studi multi-omici a singola cellula e altri saggi basati sulla citometria a flusso come la citometria a flusso di imaging. L'approccio della digestione luminale potrebbe essere utilizzato per aorte di topo appena ottenute, arterie di grandi animali (conigli e maiali), nonché per espianti vascolari umani appena ottenuti. Collettivamente, questo metodo ci permetterebbe di comprendere appieno il ruolo preciso del flusso sanguigno sulla funzione endoteliale e sulla riprogrammazione a una risoluzione a singola cellula.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)	Corning	21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile	Fablab	FL4022
50 mL SuperClear Centrifuge Tubes	Labcon	3191-335-028
6-0 Silk Suture Sterile	Covidien	s-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged	Thermo Fisher Scientic	08-771-2
Accutase solution,sterile-filtered	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	or equivalent
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)	10x Genomics	2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)	10x Genomics	2000123/ 2000138
Bovine Serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-500G
Buprenorphine	Med-Vet International	RXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1	10X Genomics	1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1	10X Genomics	1000175
Collagenase II	MP Biomedicals	2100502.5
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5005
Dnase1	New England Biolabs Inc	M0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)	Eppendorf	22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium Select	R&D systems	S11550
Fixed Angle Rotor	Eppendorf	FA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered saline	Millipore Sigma	51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)	BD	305932
Isoflurane	Patterson vet	789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec	130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter International Inc	2B1323
Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	PN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientic	70011-044
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co	RS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5480	or similar
Tissue Mend II	Webster Veteinanry	07-856-7946
Type II Collagenase	MP biomedicals	2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ files	NCBI	www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.0	10X Genomics	https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
Cicero	Pliner et al., 2018	https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1	Hadley Wickham	https://cran.r-project.org
Harmony	Korsunsky et al., 2019	https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJ	Schneider et al., 2012	https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0	Qiu et al., 2017	https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2	R Foundation	https://www.r-project.org
Seurat 3.1.3	Stuart et al., 2019	https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5	Stuart et al., 2019	https://github.com/timoast/signac