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Engineering

अनुक्रमिक केशिकाओं-सहायता प्राप्त असेंबली के माध्यम से सूक्ष्मजीवों और सूक्ष्म कणों का पैटर्निंग

Published: November 4, 2021 doi: 10.3791/63131
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, ETH Zurich, 2Department of Materials, ETH Zurich

Summary

हम एक ऐसी तकनीक पेश करते हैं जो एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म में केशिका-सहायता प्राप्त असेंबली का उपयोग करती है ताकि एक तरल पदार्थ में निलंबित सूक्ष्म आकार की वस्तुओं को पैटर्न किया जा सके, जैसे कि बैक्टीरिया और कोलाइड्स, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन सब्सट्रेट पर निर्धारित सरणियों में।

Abstract

परिभाषित स्थानिक व्यवस्थाओं में सूक्ष्मजीवों का नियंत्रित पैटर्निंग जैविक अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अद्वितीय संभावनाएं प्रदान करता है, जिसमें माइक्रोबियल फिजियोलॉजी और इंटरैक्शन का अध्ययन शामिल है। सबसे सरल स्तर पर, सूक्ष्मजीवों की सटीक स्थानिक पैटर्निंग बड़ी संख्या में व्यक्तिगत कोशिकाओं की विश्वसनीय, दीर्घकालिक इमेजिंग को सक्षम करेगी और दूरी-निर्भर माइक्रोब-माइक्रोब इंटरैक्शन का मात्रात्मक रूप से अध्ययन करने की क्षमता को बदल देगी। अधिक विशिष्ट रूप से, सटीक स्थानिक पैटर्निंग और पर्यावरणीय परिस्थितियों पर पूर्ण नियंत्रण का युग्मन, जैसा कि माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक द्वारा पेश किया गया है, माइक्रोबियल पारिस्थितिकी में एकल-सेल अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली और बहुमुखी मंच प्रदान करेगा।

यह पेपर एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के भीतर सूक्ष्मजीवों के बहुमुखी और उपयोगकर्ता-परिभाषित पैटर्न का उत्पादन करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म प्रस्तुत करता है, जिससे दीर्घकालिक, उच्च-थ्रूपुट निगरानी के लिए पूर्ण ऑप्टिकल पहुंच की अनुमति मिलती है। यह नई माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक केशिका-सहायता प्राप्त कण असेंबली पर आधारित है और एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के अंदर एक वाष्पीकरण निलंबन की नियंत्रित गति से उत्पन्न केशिका बलों का शोषण करती है ताकि व्यक्तिगत माइक्रोसाइज्ड वस्तुओं को एक पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) सब्सट्रेट पर माइक्रोफैब्रिकेटेड ट्रैप की एक सरणी में जमा किया जा सके। अनुक्रमिक निक्षेपण एकल या कई प्रकार की सूक्ष्म आकार की वस्तुओं का वांछित स्थानिक लेआउट उत्पन्न करते हैं, जो पूरी तरह से जाल की ज्यामिति और भरने के अनुक्रम द्वारा निर्धारित होते हैं।

प्लेटफ़ॉर्म को विभिन्न आयामों और सामग्रियों के कोलाइडल कणों का उपयोग करके कैलिब्रेट किया गया है: यह विविध कोलाइडल पैटर्न उत्पन्न करने और फंसे हुए कणों की सतह कार्यात्मकता करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित हुआ है। इसके अलावा, मंच का परीक्षण माइक्रोबियल कोशिकाओं पर किया गया था, एक मॉडल जीवाणु के रूप में एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाओं का उपयोग करके। हजारों व्यक्तिगत कोशिकाओं को सतह पर पैटर्न किया गया था, और समय के साथ उनके विकास की निगरानी की गई थी। इस मंच में, एकल-कोशिका जमाव और माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक का युग्मन सूक्ष्मजीवों के ज्यामितीय पैटर्निंग और पर्यावरणीय परिस्थितियों के सटीक नियंत्रण दोनों की अनुमति देता है। इस प्रकार यह एकल रोगाणुओं के शरीर विज्ञान और माइक्रोब-माइक्रोब इंटरैक्शन की पारिस्थितिकी में एक खिड़की खोलता है, जैसा कि प्रारंभिक प्रयोगों द्वारा दिखाया गया है।

Introduction

एकल सूक्ष्मजीवों का स्थानिक पैटर्निंग, विशेष रूप से प्रयोगात्मक क्षेत्रों के भीतर जो पर्यावरणीय स्थितियों पर पूर्ण नियंत्रण को सक्षम करता है, जैसे कि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण, संदर्भों की एक विस्तृत श्रृंखला में अत्यधिक वांछनीय है। उदाहरण के लिए, नियमित सरणियों में सूक्ष्मजीवों की व्यवस्था करने से बड़ी संख्या में व्यक्तिगत कोशिकाओं की सटीक इमेजिंग और पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में उनके विकास, शरीर विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति और दवा संवेदनशीलता के अध्ययन की अनुमति मिलेगी। यह सेलुलर संचार (जैसे, कोरम सेंसिंग), क्रॉस-फीडिंग (जैसे, अल्गल-बैक्टीरियल सहजीवन), या विरोध (जैसे, एलेलोपैथी) में अनुसंधान में विशेष रुचि के सेल-सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने की भी अनुमति देगा, जिसमें एक-दूसरे के सापेक्ष कोशिकाओं के स्थानिक स्थानीयकरण पर पूर्ण नियंत्रण होगा। सेल फिजियोलॉजी और विकास अध्ययन1, सेल-सेल इंटरैक्शन अध्ययन 2, फेनोटाइपिक भेदभाव स्क्रीनिंग 3, पर्यावरण निगरानी 4, और दवा स्क्रीनिंग 5 उन क्षेत्रों में से हैं जो इस तरह के मात्रात्मक एकल-सेल विश्लेषण को प्राप्त करने में सक्षम तकनीक से बहुत लाभ उठा सकते हैं।

एकल कोशिकाओं को अलग करने और संभालने के लिए कई रणनीतियों को हाल के वर्षों में प्रस्तावित किया गया है, होलोग्राफिक ऑप्टिकल ट्रैप 6 और विषम सतह कार्यात्मकता विधियों 7,8,9,10 से एकल-सेल केमोस्टैट्स 11 और ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक्स 12 तक। ये तरीके या तो तकनीकी रूप से बहुत मांग कर रहे हैं या सेल फिजियोलॉजी को प्रभावित करते हैं और पैटर्न रोगाणुओं के लिए एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफ़ॉर्म प्रदान करने में विफल रहते हैं जिनका लंबी अवधि में अध्ययन किया जा सकता है, एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन, पूर्ण ऑप्टिकल एक्सेस और पर्यावरणीय स्थितियों पर नियंत्रण सुनिश्चित करना। इस पेपर का लक्ष्य केशिका-सहायता प्राप्त असेंबली के माध्यम से पीडीएमएस सतह पर निर्धारित स्थानिक व्यवस्था में माइक्रोमेट्रिक परिशुद्धता के साथ बैक्टीरिया को पैटर्न करने के लिए एक मंच का वर्णन करना है। यह प्लेटफ़ॉर्म रोगाणुओं के सटीक और लचीले स्थानिक पैटर्निंग की अनुमति देता है और पर्यावरणीय परिस्थितियों पर पूर्ण ऑप्टिकल पहुंच और नियंत्रण को सक्षम बनाता है, इसकी माइक्रोफ्लुइडिक प्रकृति के लिए धन्यवाद।

इस प्लेटफ़ॉर्म के पीछे की तकनीक हाल के वर्षों में विकसित एक असेंबली तकनीक है, जिसका नाम SCAPA13,14,15 (अनुक्रमिक केशिका-सहायता प्राप्त कण असेंबली) है जिसे माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म 16 में एकीकृत किया गया था। एक वाष्पीकरण तरल बूंद का मेनिस्कस, जबकि एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के अंदर एक पैटर्न वाले पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) सब्सट्रेट पर कम हो रहा है, केशिका बलों को लागू करता है जो तरल में निलंबित व्यक्तिगत कोलाइडल कणों को माइक्रोमेट्रिक कुओं में फंसाते हैं जो सब्सट्रेट पर माइक्रोफैब्रिकेटेड माइक्रोफैब्रिकेटेड होते हैं (चित्रा 1 ए)। निलंबित कणों को पहले संवहनी धाराओं द्वारा हवा-तरल इंटरफ़ेस में ले जाया जाता है और फिर केशिकाओं द्वारा जाल में रखा जाता है। कण इंटरैक्शन में शामिल बलों की तुलना में चलती मेनिस्कस द्वारा लगाए गए केशिका बल बड़े पैमाने पर कार्य करते हैं।

इस प्रकार, असेंबली तंत्र कणों की सामग्री, आयामों और सतह गुणों से प्रभावित नहीं होता है। कण एकाग्रता, मेनिस्कस की गति, तापमान और निलंबन की सतह तनाव जैसे पैरामीटर एकमात्र पैरामीटर हैं जो पैटर्निंग प्रक्रिया की उपज को प्रभावित करते हैं। पाठक 13,14,15 में पैटर्निंग प्रक्रिया पर उपर्युक्त मापदंडों के प्रभाव का एक विस्तृत विवरण पा सकता है। मूल एससीएपीए प्रौद्योगिकी 13,14,15 में, कोलाइडल पैटर्निंग प्रक्रिया को एक खुली प्रणाली में किया गया था और टेम्पलेट में निलंबन को चलाने के लिए एक उच्च-परिशुद्धता पीजोइलेक्ट्रिक चरण की आवश्यकता थी। यह प्लेटफ़ॉर्म एक अलग रणनीति का शोषण करता है और पैटर्निंग को एक नियंत्रित वातावरण में आमतौर पर माइक्रोफ्लुइडिक्स में उपयोग किए जाने वाले मानक उपकरणों के साथ किए जाने की अनुमति देता है, इस प्रकार नमूनों को दूषित करने के जोखिम को कम करता है।

इस माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म को पहले कोलाइडल कणों पर अनुकूलित किया गया था ताकि अक्रिय कणों की नियमित सरणियां बनाई जा सकें और फिर सफलतापूर्वक बैक्टीरिया पर लागू किया जा सके। दोनों माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफार्मों को इस पेपर में वर्णित किया गया है (चित्रा 1 बी, सी)। प्रोटोकॉल में वर्णित अधिकांश प्रारंभिक चरण और प्रयोगात्मक उपकरण दो अनुप्रयोगों (चित्रा 2) के लिए आम हैं। हम कोलाइडल पैटर्निंग की रिपोर्ट करते हैं ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि तकनीक का उपयोग जटिल, मल्टीमटेरियल पैटर्न बनाने के लिए एक ही सतह पर कई अनुक्रमिक जमाव करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, एक विशिष्ट ज्यामिति और संरचना के साथ कोलाइडल सरणियों को बनाने के लिए प्रत्येक चरण के लिए एक एकल कण प्रति जाल जमा किया गया था, जो पूरी तरह से जाल की ज्यामिति और भरने के अनुक्रम द्वारा निर्धारित किया गया था। बैक्टीरियल पैटर्निंग के लिए, एकल जमाव का वर्णन किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रति जाल एक जीवाणु जमा होता है। एक बार जब कोशिकाओं को सतह पर पैटर्न किया जाता है, तो माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को बैक्टीरिया के विकास को बढ़ावा देने के लिए माध्यम के साथ फ्लश किया जाता है, जो किसी भी एकल-सेल अध्ययन का प्रारंभिक चरण है।

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Protocol

1. सिलिकॉन मास्टर तैयारी

नोट: PDMS टेम्पलेट्स microfabricated जाल है कि कोलाइडल और माइक्रोबियल patterning के लिए टेम्पलेट फार्म असर Geissler एट अल द्वारा शुरू की गई विधि के अनुसार गढ़े गए थे. १७ । सिलिकॉन मास्टर एक क्लीनरूम में पारंपरिक लिथोग्राफी द्वारा तैयार किया गया था। प्रक्रिया के लिए निम्न चरणों और उपकरण ों के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (CAD) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सुविधाओं को डिज़ाइन करें.
  2. एक यूवी प्रत्यक्ष लेजर लेखक के साथ डिजाइन की गई सुविधाओं को उजागर करके सकारात्मक फोटोरेसिस्ट की एक परत के साथ क्रोम-ग्लास मास्क तैयार करें।
    1. एक स्पिन डेवलपर के साथ क्रोम-ग्लास मास्क विकसित करें जो 15 सेकंड के लिए पानी के अनुपात में 1: 4 फोटोरेसिस्ट पर डेवलपर का उपयोग करता है।
    2. मास्क को क्रोमियम में विसर्जित करें और 50 सेकंड के लिए एचांट करें।
    3. प्लाज्मा-600 डब्ल्यू पर 3 मिनट के लिए एक 10 सेमी सिलिकॉन वेफर का इलाज करें।
    4. वाष्प-जमा hexamethyldisilizane की एक परत और 110 डिग्री सेल्सियस पर सेंकना photoresist की ओर आसंजन में सुधार करने के लिए.
    5. 2 मिनट के लिए 4,500 × जी पर फोटोरेसिस्ट की एक परत जमा करें।
    6. 2 s के लिए एक मुखौटा संरेखक के साथ क्रोम-ग्लास मास्क के माध्यम से यूवी के लिए सुविधा को बेनकाब करें और मास्क के लिए एक डेवलपर के साथ विकसित करें।
  3. सिलिकॉन मास्टर के निर्माण को पूरा करने के लिए, गहरी प्रतिक्रियाशील आयन विनिमय के माध्यम से वेफर को खोदना, वांछित गहराई (प्रोफाइलोमीटर के साथ मापा गया) प्राप्त करने के लिए नक़्क़ाशी समय (<2 मिनट) को समायोजित करना।

2. Microchannel मोल्ड तैयारी

  1. सीएडी सॉफ्टवेयर के साथ चैनल डिजाइन करें और इसे 3 डी प्रिंटर के लिए निर्देशों में डिज़ाइन किए गए मॉडल को परिवर्तित करने के लिए एक स्लाइसर सॉफ़्टवेयर के साथ स्लाइस करें, 0.05 मिमी पर स्लाइसिंग दूरी निर्धारित करें।
  2. ~ 1 ज के लिए एक 3 डी प्रिंटर के साथ चैनल मुद्रित करें।
  3. धोएं और एक समर्पित इलाज और वॉशिंग मशीन में मोल्ड postcure.
    1. शुद्ध आइसोप्रोपाइल अल्कोहल (आईपीए) से भरे कंटेनर में मोल्ड डालें और तरल (20 मिनट के लिए धोएं) भंवर करें। आईपीए से भरे कंटेनर को मशीन से बाहर निकालें।
    2. एक बार जब धोया मोल्ड आईपीए कंटेनर से हटा दिया जाता है, तो इसे धोने और इलाज मशीन में वापस रखें और इसे 35 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पोस्टक्योर करें।
      नोट: सामग्री की तालिका 3 डी प्रिंटर और इलाज और मोल्ड तैयारी प्रोटोकॉल में उपयोग की वाशिंग मशीन की रिपोर्ट करता है। 3 डी मॉडल को 3 डी प्रिंटर के मालिकाना स्लाइसर सॉफ्टवेयर के साथ कटा हुआ था।
  4. प्रिंट को 12 घंटे के लिए यूवी ओवन में रखें और इसे 12 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें।
    नोट: यह चरण सुनिश्चित करता है कि सभी बहुलक ठीक हो गए हैं और सभी असुरक्षित बहुलक को प्रिंट से हटा दिया गया है क्योंकि यह पीडीएमएस को इलाज से रोक देगा।
  5. Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane के वाष्प जमाव के माध्यम से मोल्ड Silanize.
    1. 100% केंद्रित Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane silane के 20 μL के साथ एक वैक्यूम desiccator में 3 डी मोल्ड जगह एक एल्यूमीनियम पन्नी मोल्ड के करीब रखा पर pipetted.
    2. वाष्प उत्पन्न करने के लिए desiccator में एक वैक्यूम बनाएँ और 40 मिनट के लिए छोड़ दें।
    3. desiccator से मोल्ड निकालें और उस पर PDMS डालने से पहले इसे शुद्ध इथेनॉल के साथ कुल्ला।

3. माइक्रोफ्लुइडिक चिप का निर्माण

  1. अपने क्रॉसलिंकिंग एजेंट (सामग्री की तालिका) के साथ इलास्टोमर को मिलाकर एक पीडीएमएस मिश्रण तैयार करें। दो घटकों को समान रूप से मिश्रण करने के लिए मिश्रण को जोरदार रूप से हिलाएं जब तक कि हवा के बुलबुले नहीं बनते हैं, और पीडीएमएस मिश्रण अपारदर्शी दिखता है।
    नोट: क्रॉस-लिंकर की मात्रा इलास्टोमर की मात्रा के वजन से 10% होनी चाहिए।
  2. फंसे हुए हवा के बुलबुले को हटाने के लिए एक वैक्यूम desiccator में elastomer और crosslinking एजेंट के मिश्रण degas. मिश्रण के लिए उपयोग किए जाने वाले कंटेनर में डेसिकेटर में मिश्रण को स्थानांतरित करें (चरण 3.1)। Degassing प्रक्रिया जारी रखें जब तक कि सभी बुलबुले हटा दिए गए हैं और मिश्रण फिर से पारदर्शी दिखता है।
    नोट: आमतौर पर desication के लिए आवश्यक समय 30 मिनट है।
  3. टेम्पलेट का उत्पादन करने के लिए सिलिकॉन मास्टर पर मिश्रण के 3 ग्राम डालें, जो माइक्रोफ्लुइडिक चिप के "फर्श" के रूप में काम करेगा।
    नोट: PDMS परत की मोटाई सिलिकॉन मास्टर पर डाले गए मिश्रण की मात्रा को बदलकर ट्यून किया जा सकता है।
    1. एक 400 μm मोटी टेम्पलेट प्राप्त करने के लिए, सिलिकॉन मास्टर पर PDMS के 3 ग्राम डालना, एक स्पिन कोटर पर सिलिकॉन मास्टर रखें, और 5 s के लिए 21 × g पर स्पिन कोट और 10 s के लिए 54 × g , और फिर फंसे हुए हवा के बुलबुले को हटाने के लिए चरण 3.2 में वर्णित के रूप में फिर से degas।
  4. माइक्रोचैनल बनाने के लिए 3 डी-मुद्रित मोल्ड पर पीडीएमएस मिश्रण के 20 ग्राम डालें, जो माइक्रोफ्लुइडिक चिप की "छत" के रूप में काम करेगा, और इसे 30 मिनट के लिए चरण 3.2 में वर्णित के रूप में degas।
  5. सिलिकॉन वेफर और 3 डी मुद्रित मोल्ड दोनों को कम से कम 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
  6. 3 डी मुद्रित मोल्ड से पीडीएमएस परत को छीलें, माइक्रोचैनल के चारों ओर एक ब्लेड के साथ पीडीएमएस को काटें, और उन छेदों को पंच करें जो माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के इनलेट और आउटलेट के रूप में काम करेंगे।
  7. सिलिकॉन मास्टर से पीडीएमएस को छील लें और माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के समान आयामों के साथ पीडीएमएस परत को छोटे टुकड़ों में काट लें जो टेम्पलेट्स के शीर्ष पर बंधे होंगे।
  8. धीरे से 5 मिनट के लिए एक 1% डिटर्जेंट समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके टेम्पलेट्स और माइक्रोचैनल को रगड़ें और फिर विआयनीकृत पानी से कुल्ला करें। इसके बाद, isopropanol के साथ टेम्पलेट्स और माइक्रोचैनल को कुल्ला करें और उन्हें विआयनीकृत पानी से कुल्ला करें। 1 बार पर संपीड़ित हवा के साथ 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर टेम्पलेट्स और माइक्रोचैनल को सुखाएं।
  9. सतहों के साथ एक प्लाज्मा क्लीनर में टेम्पलेट्स और माइक्रोचैनल रखें, जिनका सामना करना पड़ रहा है। प्लाज्मा क्लीनर को चालू करें, और प्लाज्मा 40 सेकंड के लिए टेम्पलेट्स और माइक्रोचैनल का इलाज करें। उन्हें प्लाज्मा क्लीनर से बाहर निकालें और तुरंत टेम्पलेट्स के शीर्ष पर माइक्रोचैनल को एक दूसरे के संपर्क में रखकर उन्हें बांधें।
  10. पीडीएमएस हाइड्रोफोबिक वसूली सुनिश्चित करने के लिए पांच दिनों के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स स्टोर करें और 30 और 60 डिग्री 10,11 के बीच इष्टतम सीमा के भीतर एक कम संपर्क कोण हो।

4. बैक्टीरियल पैटर्निंग

  1. प्रयोग से एक दिन पहले, Escherichia coli (तनाव MG1655 prpsM-GFP) की आबादी बढ़ जाती है। जमे हुए स्टॉक से सीधे संस्कृति को संक्रमित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर शेकर इनक्यूबेटर में लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) माध्यम में 20 घंटे के लिए रात भर बढ़ें। prpsM-GFP प्लास्मिड को बनाए रखने के लिए कोशिकाओं के लिए kanamycin के 50 μg / mL जोड़ें।
  2. प्रयोग के दिन, प्रयोग शुरू करने से पहले एक समान और स्थिर तापमान रखने के लिए प्रयोग से कई घंटे पहले बॉक्स इनक्यूबेटर (चित्रा 2 ए) को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। माइक्रोस्कोप चरण (चित्रा 2B, C) पर सिरिंज पंप और गर्म ग्लास प्लेट सेट करें, जो बॉक्स इनक्यूबेटर के समान तापमान पर तापमान सेट करता है।
    नोट: बॉक्स इनक्यूबेटर जिसमें माइक्रोस्कोप (चित्रा 2E) सहित पूरी प्रणाली संलग्न है, यह सुनिश्चित करता है कि चैनल को माध्यम के साथ फ्लश किए जाने पर पूरे प्रयोग के दौरान एक समान और स्थिर तापमान बनाए रखा जाता है।
  3. प्रयोग से नब्बे मिनट पहले, माइक्रोफ्लुइडिक चिप को 100% इथेनॉल (ईटीओएच) से भरे एक जहाज में रखें और कम से कम 10 मिनट के लिए 100% ईटीओएच के साथ चैनल को फ्लश करें। माइक्रोफ्लुइडिक चिप को कम से कम 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम डेसिकेटर और डेगास में रखें। आसुत पानी के साथ EtOH का आदान-प्रदान करें और कम से कम 30 मिनट के लिए चिप का वैक्यूम-ट्रीट करें। चैनल में छोड़े गए तरल के किसी भी निशान को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए ओवन में 70 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोफ्लुइडिक चिप डालें।
    नोट:: यह चरण संस्कृति माध्यम के साथ flushed जब चैनल में बुलबुला गठन को रोकने के लिए आवश्यक है। इस बुलबुला रोकथाम प्रोटोकॉल वांग एट al.18 से अनुकूलित किया गया था।
  4. पिपेट 3-(एन-मॉर्फोलिनो) प्रोपेनसल्फोनिक एसिड (एमओपीएस) माध्यम (1x) के 1 एमएल को एक सेंट्रीफ्यूज शीशी में और 0.132 एम पोटेशियम फॉस्फेट (K2HPO4) के 10 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से रातोंरात संस्कृति को बाहर निकालें और सेंट्रीफ्यूज शीशी में 100 μL को एलीकोट करें और 2 मिनट के लिए 2,300 × ग्राम पर संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें। धीरे सेंट्रीफ्यूज शीशियों से बाहर supernatant पिपेट, और 0.015% v / v के साथ ताजा MOPS माध्यम के 1 mL में गोली resuspend Tween 20 और पोटेशियम फॉस्फेट के 0.01% v / v के साथ।
    नोट: बैक्टीरियल निलंबन की विशिष्ट एकाग्रता 0.015-0.15 vol% की सीमा में है, जो एक विस्तारित और मोबाइल संचय क्षेत्र के गठन को सुनिश्चित करती है और सब्सट्रेट पर कणों के संचय को रोकती है। ताजा माध्यम के साथ रातभर माध्यम को बदलने से टेम्पलेट पर बैक्टीरिया की फिल्मों को जारी करने के जोखिम को कम किया जाता है। ताजा माध्यम में कार्बन स्रोत की कमी टेम्पलेट पैटर्निंग के दौरान निलंबन में कोशिकाओं को बढ़ने से रोकती है। निलंबन में Tween 20 के 0.015% v / v की एकाग्रता PDMS टेम्पलेट पर घटते तरल के संपर्क कोण के लिए 30 और 60 ° के बीच इष्टतम सीमा के भीतर गिरने के लिए आवश्यक है।
  5. एक 1 मिली सिरिंज में बैक्टीरियल निलंबन लोड करें और माइक्रोफ्लुइडिक टयूबिंग के माध्यम से चिप से सिरिंज को कनेक्ट करें।
    1. सिरिंज और टयूबिंग के बीच कनेक्शन को सुरक्षित करने के लिए, सीधे टयूबिंग में 0.6 मिमी के बाहरी व्यास के साथ एक सुई डालें। चैनल भर में इनलेट आस-पास के क्षेत्र में शेष किसी भी निलंबन को बिखरने से बचने के लिए, इनलेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले छेद के बजाय पैटर्निंग प्रक्रिया (चित्रा 3 ए-III) के दौरान एक आउटलेट के रूप में उपयोग किए जाने वाले छेद के माध्यम से ताजा माध्यम फ्लश करें।
    2. सिरिंज पंप पर सिरिंज माउंट और चैनल के अपस्ट्रीम भाग में स्थित इनलेट के माध्यम से माइक्रोफ्लुइडिक चिप में निलंबन इंजेक्ट करें जब तक कि निलंबन जाल के साथ टेम्पलेट क्षेत्र को कवर नहीं करता है।
      नोट: तरल इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान, हवा चैनल के डाउनस्ट्रीम छोर पर स्थित एक आउटलेट के माध्यम से बच सकती है।
    3. 0.07-0.2 μL / मिनट की प्रवाह दर पर बैक्टीरियल निलंबन (चित्रा 3A-I) को वापस लेने के लिए सिरिंज पंप सेट करें, जो वर्णित ज्यामिति में 80-100 μm / मिनट की मेनिस्कस घटती गति से मेल खाती है।
    4. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के माध्यम से पैटर्निंग प्रक्रिया की निगरानी करें।
      नोट: यहाँ, टेम्पलेट पर घटते मेनिस्कस की निगरानी के लिए एक 10x आवर्धन का उपयोग किया गया था, और माइक्रोफैब्रिकेटेड ट्रैप में व्यक्तिगत बैक्टीरिया के जमाव की निगरानी के लिए 20x आवर्धन का उपयोग किया गया था।
  6. एक बार जब टेम्पलेट को कोशिकाओं (चित्रा 3 ए-II) के साथ पैटर्न किया गया है, तो माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को जल्दी से खाली करने के लिए निकासी प्रवाह दर में वृद्धि करें और इसे ताजा एलबी के साथ फ्लश करें जो पहले कम से कम 30 मिनट के लिए degassed था और 30 डिग्री सेल्सियस पर prewarmed था।
  7. चैनल को धीरे से फ्लश करने के लिए 2 μL / मिनट की प्रवाह दर पर सिरिंज पंप सेट करें। एक बार जब चैनल भर जाता है, तो विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार प्रवाह दर (15 μL / मिनट) बढ़ाएं।
  8. वांछित आवर्धन और समय अंतराल पर बढ़ते बैक्टीरिया की छवियों को प्राप्त करें।

5. कोलाइडल पैटर्निंग

  1. पिपेट 900 μL एक 0.015% v / v Tween 20 जलीय समाधान के एक सेंट्रीफ्यूज शीशी में और पिपेट 100 μL मूल कोलाइडल निलंबन में यह में. 1 मिनट के लिए 13,500 × ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। धीरे supernatant निकालें और इसे जलीय Tween 20 (0.015% v / v) समाधान के साथ बदलें। स्टॉक निलंबन से आपूर्तिकर्ता के विलायक का पूर्ण प्रतिस्थापन सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
  2. कोलाइडल निलंबन को 1 एमएल सिरिंज में लोड करें और माइक्रोफ्लुइडिक ट्यूबिंग के माध्यम से सीरिंज को चिप से कनेक्ट करें। चैनल के अपस्ट्रीम भाग में केंद्रीय अनुभाग के भीतर स्थित इनलेट के माध्यम से माइक्रोफ्लुइडिक चिप में निलंबन को इंजेक्ट करें, और धीरे-धीरे टेम्पलेट को कवर किए जाने तक निलंबन को धक्का दें।
  3. 0.07-0.2 μL / मिनट की प्रवाह दर पर कोलाइडल निलंबन को वापस लें, जो 1-2 μm / मिनट की मेनिस्कस घटती गति से मेल खाती है, और माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर के माध्यम से पैटर्निंग प्रक्रिया की छवि बनाती है। टेम्पलेट पर घटते हुए मेनिस्कस की निगरानी करने के लिए 10x आवर्धन का उपयोग करें और माइक्रोफैब्रिकेटेड जाल में व्यक्तिगत कणों के जमाव का निरीक्षण करने के लिए 20x आवर्धन। एक बार जब मेनिस्कस चैनल को जल्दी से खाली करने के लिए टेम्पलेट के अंत तक पहुंच जाता है तो प्रवाह दर बढ़ाएं।
    नोट: कई कणों से बने कोलाइडल सरणियों को श्रृंखला में चरण 5.1 से 5.3 तक पैटर्निंग प्रक्रिया चलाकर उत्पादित किया जा सकता है। चैनल वांछित कोलाइडल सरणियों की संरचना के अनुसार प्रत्येक पुनरावृत्ति पर एक नए कोलाइडल निलंबन के साथ लोड किया गया है। प्रत्येक पैटर्निंग चरण कोलाइडल सरणी में एक कण जोड़ता है और क्रमिक रूप से चलाया जा सकता है जब तक कि जाल वांछित कणों के अनुक्रम से भर नहीं जाते हैं। परिणामी कोलाइडल सरणियों की संरचना पूरी तरह से जाल को भरने के लिए उपयोग किए जाने वाले कोलाइडल निलंबन के अनुक्रम द्वारा दी जाती है (चित्रा 3 बी)।

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Representative Results

एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म जो एक पीडीएमएस टेम्पलेट पर माइक्रोफैब्रिकेटेड ट्रैप में कोलाइडल कणों और बैक्टीरिया को पैटर्न करने के लिए केशिका-सहायता प्राप्त असेंबली का शोषण करता है, विकसित किया गया था। दो अलग-अलग चैनल ज्यामिति को केशिकाओं-सहायता प्राप्त असेंबली के माध्यम से कोलाइड और बैक्टीरिया के पैटर्निंग को अनुकूलित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। पहले चैनल ज्यामिति (चित्रा 1 बी) में तीन 23 मिमी लंबे समानांतर खंड होते हैं जिनके बीच कोई भौतिक बाधा नहीं होती है। पक्षों पर दो खंड 5 मिमी चौड़े और 1 मिमी ऊंचे हैं, जबकि केंद्रीय खंड 7 मिमी चौड़ा और 500 μm ऊंचा है। यह डिजाइन एक कम उत्तल के आकार के मेनिस्कस के साथ एक अच्छी तरह से परिभाषित चलती बूंद को बनाए रखने में मदद करता है। इस मंच के कार्य सिद्धांत Pioli et al.11 द्वारा विस्तार से वर्णित है। यदि प्रयोग को पार्श्व चैनलों को भरने की आवश्यकता होती है, जैसा कि बैक्टीरिया के पालन के मामले में होता है, तो आमतौर पर हवा की जेब का गठन किया जाता है। इस कारण से, हमने एक दूसरी ज्यामिति को डिजाइन और परीक्षण किया जो चैनल को माध्यम के साथ फ्लश करने पर भरने की प्रक्रिया को सरल बनाता है। इस मामले में, प्लेटफ़ॉर्म (चित्रा 1 C) में एक एकल 20 मिमी लंबा, 3 मिमी चौड़ा और 500 μm उच्च सीधा चैनल होता है।

माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में तापमान एक कुशल जमाव प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। इसे टेम्पलेट पर संघनन से बचने के लिए पानी के ओस बिंदु के ऊपर 15 डिग्री सेल्सियस बनाए रखा जाना चाहिए। चैनल के नीचे गर्म कांच की प्लेट (चित्रा 2 डी) तरल-हवा इंटरफ़ेस के करीब क्षेत्र में पैटर्निंग प्रक्रिया के दौरान संक्षेपण को रोकने के लिए टेम्पलेट में एक समान तापमान सुनिश्चित करती है, जो हवा में एक उच्च वाष्प एकाग्रता की विशेषता है। टेम्पलेट पर संघनन से बचने के लिए गर्म ग्लास प्लेट का तापमान बॉक्स इनक्यूबेटर के समान होना चाहिए।

सीधे चैनल ज्यामिति को एक फ्लोरोसेंट ई कोलाई स्ट्रेन (MG1655 prpsM-GFP) के स्थिर-चरणबद्ध कोशिकाओं (चित्रा 4A) को पैटर्न करने के लिए शोषण किया गया था। बैक्टीरिया को 5,000 विश्लेषण जालों में से 83% में जमा किया गया था। कोशिकाओं को पहले प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार जाल में रखा गया था और बाद में एलबी में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए उगाया गया था, जिसे 10 मिमी / मिनट पर फ्लश किया गया था। पैटर्न वाले बैक्टीरिया ने 1.5 घंटे के भीतर अलग-अलग समय पर विकास को फिर से शुरू किया, जब चैनल को ताजा एलबी (चित्रा 4 बी-I) से भरा गया था, जिसमें 44 मिनट में औसत था। एक बार विकास फिर से शुरू होने के बाद, एकल जीवाणु कोशिकाएं अलग-अलग कॉलोनियों का निर्माण करना शुरू कर देती हैं, जो तब तक विस्तारित होती हैं (चित्रा 4 बी-II) जब तक कि एक सतह परत नहीं बनती है (3.5 ज) और एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन खो जाता है (चित्रा 4 बी-III)।

इस प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट प्रयोग से पता चलता है कि माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में केशिका-सहायता प्राप्त असेंबली का उपयोग हजारों व्यवहार्य एकल-बैक्टीरिया कोशिकाओं के साथ एक सतह को पैटर्न करने के लिए किया जा सकता है। ग्यारह प्रतिकृतियों से पता चलता है कि पैटर्न वाली कोशिकाएं 7 घंटे की खिड़की के भीतर 45.5% मामलों में बढ़ीं। प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई), एक जीवित-मृत दाग 19 को जोड़ने वाले चार परीक्षणों ने ताजा एलबी को जमाव के बाद चैनल में फ्लश किया, यह साबित करने के बाद कि गैर-बढ़ते, पैटर्न वाले बैक्टीरिया दाग नहीं गए थे। जैसा कि पीआई डीएनए से बांधता है लेकिन एक बरकरार झिल्ली के साथ कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकता है, पीआई स्टेनिंग प्रयोग से पता चलता है कि न तो पैटर्निंग प्रक्रिया और न ही निर्जलीकरण और पुनर्जलीकरण प्रक्रियाओं ने कोशिकाओं की झिल्ली को नुकसान पहुंचाया।

तीन-खंड चैनल ज्यामिति का उपयोग कोलाइडल कणों के अनुक्रमिक पैटर्निंग का प्रदर्शन करके विभिन्न रचनाओं के साथ रैखिक कोलाइडल सरणियों का उत्पादन करने के लिए किया गया था। चित्रा 5 अनुक्रमिक पैटर्निंग के माध्यम से गठित विभिन्न कोलाइडल सरणियों को दर्शाता है, जिसमें डिमर (चित्रा 5 ए, बी) और ट्रिमर (चित्रा 5 सी) शामिल हैं, जिनमें क्रमशः दो और तीन अनुक्रमिक रूप से फंसे हुए कण शामिल हैं। हरे और लाल फ्लोरोसेंट पॉलीस्टीरीन कणों का उपयोग डिमर और ट्रिमर दोनों को इकट्ठा करने के लिए किया गया था। 55,000 से अधिक जालों पर किए गए विश्लेषण से पता चलता है कि हरे-लाल (जी-आर) डिमर (चित्रा 5 ए, बी) व्यास में 2 μm और 1 μm के साथ कणों द्वारा बनाए गए थे, क्रमशः 93% और 89% विश्लेषण जाल में बनाए गए थे। हरे-लाल-हरे (जी-आर-जी) ट्रिमर (चित्रा 5 सी) का गठन 55,000 विश्लेषण किए गए ट्रैप 11 के 52% में किया गया था। डिमर और ट्रिमर को अनुक्रमिक निक्षेपण चलाकर इकट्ठा किया गया था, कोलाइडल निलंबन सभी अनुक्रमिक जमावों (चित्रा 3 बी) में एक ही दिशा में आगे बढ़ रहे थे। नतीजतन, प्रत्येक निक्षेपण चरण में फंसे कण पिछले एक में फंसे लोगों के साथ सीधे संपर्क में हैं।

कणों की सटीक स्थिति को जमा कणों के बीच सीधे संपर्क की आवश्यकता नहीं होती है। पैटर्न वाले कणों के बीच की दूरी को विपरीत दिशाओं में दो निक्षेपण करके ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है, इस प्रकार प्रत्येक जाल के विपरीत सिरों पर ऐसे कणों को फँसाया जा सकता है (चित्रा 5 डी)। फंसे हुए कणों के बीच की दूरी को वांछित लंबाई के साथ जाल डिजाइन करके ट्यून किया जा सकता है। प्लेटफ़ॉर्म द्वारा पेश की जाने वाली एक अतिरिक्त संभावना माइक्रोमेट्रिक परिशुद्धता के साथ सतह की रासायनिक पैटर्निंग है। यह परिणाम रासायनिक रूप से कार्यात्मक कणों 11 के साथ टेम्पलेट को पैटर्न करके प्राप्त किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों की ज्यामिति और पैटर्निंग प्रक्रिया। (ए) कोलाइडल कणों के पैटर्निंग के दौरान माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के साइड-व्यू सेक्शन की योजनाबद्ध। तरल निलंबन माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के अंदर वाष्पित हो जाता है, और संवहनी धाराएं हवा-तरल इंटरफ़ेस की ओर निलंबित कणों का परिवहन करती हैं। इस प्रकार कण संचित होते हैं और संचय क्षेत्र बनाते हैं। सिरिंज पंप तरल निलंबन को खींचता है, जिससे यह कम हो जाता है, और व्यक्तिगत कण टेम्पलेट पर तरल मंदी के दौरान फंस जाते हैं। तीर उस दिशा का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें निलंबन चल रहा है। (बी) पीडीएमएस टेम्पलेट पर कोलाइडल कणों को पैटर्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली चैनल ज्यामिति की योजनाबद्ध। चैनल 23 मिमी लंबा और 17 मिमी चौड़ा है और इसमें तीन खंड शामिल हैं: एक केंद्रीय जो 7 मिमी चौड़ा है और दो पार्श्व वाले हैं जो 5 मिमी चौड़े हैं। टेम्पलेट चैनल के फर्श पर है, केंद्रीय अनुभाग के भीतर। क्रॉस-सेक्शन से पता चलता है कि माइक्रोफ्लुइडिक चैनल का केंद्रीय खंड, जहां तरल निलंबन पैटर्निंग प्रक्रिया के दौरान सीमित है, चैनल का सबसे उथला हिस्सा है और 500 μm ऊंचा है, जबकि दो पार्श्व खंड दोनों 1 मिमी उच्च हैं। (c) बैक्टीरिया को पैटर्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली सीधे चैनल ज्यामिति की योजनाबद्ध। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में 20 मिमी लंबा, 3 मिमी चौड़ा और 500 μm-उच्च सीधा चैनल होता है। इस माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का आयताकार खंड, क्रॉस-सेक्शन में दिखाया गया है, माध्यम के साथ चैनल की भरने की प्रक्रिया को सरल बनाता है। SEM छवि PDMS टेम्पलेट का एक छोटा सा हिस्सा दिखाती है जिसमें 2 μm-long, 1 μm-wide, और 500 nm-deep traps microfabricated होते हैं। स्केल बार = 2 μm. संक्षेप: PDMS = polydimethylsiloxane; SEM = स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में अनुक्रमिक केशिका-सहायता प्राप्त असेंबली के लिए प्लेटफ़ॉर्म की योजनाबद्ध। (ए) बॉक्स इनक्यूबेटर। बॉक्स इनक्यूबेटर माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के अंदर एक समान और स्थिर तापमान (यहां, 30 डिग्री सेल्सियस) बनाए रखता है। (बी) तरल निलंबन के साथ भरी हुई सिरिंज। सिरिंज को एक सिरिंज पंप द्वारा नियंत्रित किया जाता है (नहीं दिखाया गया है) और पैटर्निंग प्रक्रिया के दौरान तरल की गति को नियंत्रित करने के लिए उपयोग किया जाता है। (c) गर्म कांच की प्लेट। गर्म कांच की प्लेट को माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के नीचे रखा जाता है और टेम्पलेट में एक समान तापमान (यहां, 30 डिग्री सेल्सियस) सुनिश्चित करता है, जो हवा-तरल इंटरफ़ेस के आसपास के क्षेत्र में संक्षेपण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। (डी) माइक्रोफ्लुइडिक चिप एक तरल निलंबन के साथ भरी हुई है। माइक्रोफ्लुइडिक चिप का फर्श उन जालों को सहन करता है जिसमें पैटर्निंग प्रक्रिया के दौरान बैक्टीरिया और कोलाइड्स पैटर्न हो जाते हैं। (ई) माइक्रोस्कोप। गर्म ग्लास प्लेट और माइक्रोफ्लुइडिक चिप को एक माइक्रोस्कोप चरण पर रखा जाता है, जो पैटर्निंग प्रक्रिया और निम्नलिखित सभी चरणों के दौरान पूर्ण ऑप्टिकल एक्सेस प्रदान करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: जीवाणु और कोलाइडल पैटर्निंग में शामिल चरणों की योजनाबद्ध। प्रत्येक पैनल माइक्रोफ्लुइडिक चैनल का एक आंतरिक दृश्य दिखाता है और इसमें केवल पीडीएमएस टेम्पलेट का एक छोटा सा हिस्सा शामिल है। (ए) केशिकाओं की सहायता से असेंबली के माध्यम से बैक्टीरिया का पैटर्निंग। (I) जीवाणु निलंबन माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के अंदर वाष्पित हो जाता है, जिससे संवहनी धाराएं निलंबित बैक्टीरिया को हवा-तरल इंटरफ़ेस में ले जाती हैं, इस प्रकार संचय क्षेत्र का निर्माण करती हैं। इस बीच, निलंबन सिरिंज पंप द्वारा खींचा जाता है और टेम्पलेट पर पीछे हट जाता है। तीर उस दिशा का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें जीवाणु निलंबन चल रहा है। कम निलंबन टेम्पलेट भर में स्वीप करता है, और व्यक्तिगत कोशिकाएं माइक्रोफैब्रिकेटेड जाल में जमा हो जाती हैं। (II) जमा बैक्टीरिया हवा के संपर्क में आते हैं जब तक कि चैनल को ताजा माध्यम के साथ फ्लश नहीं किया जाता है। जब तरल निलंबन टेम्पलेट के अंत तक पहुंचता है तो निक्षेपण प्रक्रिया समाप्त हो जाती है। (III) माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को ताजा माध्यम (यानी, एलबी) के साथ फ्लश किया जाता है। तीर उस दिशा का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें ताजा माध्यम फ्लश किया जाता है। (बी) अनुक्रमिक केशिकाओं-सहायता प्राप्त असेंबली के माध्यम से कोलाइडल कणों का पैटर्निंग। (I) कोलाइडल निलंबन वाष्पीकरण के दौरान टेम्पलेट पर कम हो जाता है, और कण वायु-तरल इंटरफ़ेस पर जमा होते हैं, जिससे संचय क्षेत्र बनता है। अलग-अलग कणों को टेम्पलेट पर माइक्रोफैब्रिकेटेड ट्रैप में जमा किया जाता है। तीर उस दिशा का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें कोलाइडल निलंबन चल रहा है। (II) जमाव प्रक्रिया तब पूरी हो जाती है जब तरल निलंबन टेम्पलेट के अंत तक पहुंच जाता है। (III) टेम्पलेट पर प्रत्येक जाल में एक दूसरे कण को रखने के लिए पहले निक्षेपण के समान ही एक दूसरा निक्षेपण चलाया जाता है। (IV) एक बार दूसरा निक्षेपण समाप्त हो जाने के बाद, टेम्पलेट को एक हरे और एक लाल कण के डिमर के साथ पैटर्न किया जाता है। संक्षेप: PDMS = polydimethylsiloxane; एलबी = लाइसोजेनी शोरबा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पीडीएमएस टेम्पलेट ई कोलाई (तनाव MG1655 prpsM-GFP) कोशिकाओं के साथ पैटर्न। (ए) 2 μm-long, 1 μm-wide, और 500 nm-deep traps में फंसे व्यक्तिगत E. coli कोशिकाओं की SEM छवि। कोशिकाओं को एक एकल जमाव के बाद फंस गए थे। स्केल बार = 2 μm. (B) PDMS टेम्पलेट (लगभग 80 μm x 80 μm) के एक छोटे से हिस्से की एपिफ्लोरेसेंस छवियां ई कोलाई की फंसी हुई कोशिकाओं के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के बाद 1.3 मिमी / मिनट की प्रारंभिक गति से संस्कृति माध्यम (लाइसोजेनी शोरबा) से भरा होता है, जिसे तब 10 मिमी / मिनट तक बढ़ा दिया जाता है। फंसी हुई कोशिकाएं 4 घंटे के लिए कई बार बढ़ती हैं और विभाजित होती हैं, अंततः पड़ोसी जाल से कोशिकाओं के साथ विलय हो जाती हैं और सतह को कवर करती हैं। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षेप: PDMS = polydimethylsiloxane; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: कोलाइडल क्लस्टर माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म (पहले चैनल ज्यामिति) में अनुक्रमिक केशिका-सहायता प्राप्त कण असेंबली के माध्यम से इकट्ठे हुए। (ए) की एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवि 15 डिमर दो अनुक्रमिक निक्षेपणों के साथ व्यास में 2 μm के साथ पॉलीस्टीरीन कणों से इकट्ठे हुए। (बी) डिमर (एन = 15) दो अनुक्रमिक निक्षेपणों के साथ व्यास में 1 μm के साथ polystyrene कणों से इकट्ठे हुए। (C) ट्रिमर (n = 15) पॉलीस्टीरीन कणों से तीन अनुक्रमिक निक्षेपणों के साथ व्यास में 1 μm के साथ इकट्ठे होते हैं। (D) जाल (n = 15) विपरीत दिशाओं में दो अनुक्रमिक निक्षेपणों को चलाकर प्रत्येक जाल के छोरों पर पैटर्न वाले कणों के साथ। एक जाल में कणों के बीच की दूरी 2 μm है। स्केल बार = 4 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म सूक्ष्म आकार की वस्तुओं, जैसे कोलाइड्स और बैक्टीरिया के पैटर्निंग को पीडीएमएस सब्सट्रेट पर निर्धारित स्थानिक व्यवस्था में अनुमति देता है। माइक्रोफ्लुइडिक्स द्वारा पेश की गई पर्यावरणीय स्थितियों पर पूर्ण नियंत्रण और एससीएपीए तकनीक द्वारा दी गई माइक्रोमेट्रिक परिशुद्धता के साथ कोशिकाओं को पैटर्न करने की क्षमता इसे भविष्य के शरीर विज्ञान और पारिस्थितिकी अध्ययन के लिए एक बहुत ही आशाजनक मंच बनाती है।

इस काम में प्रस्तुत प्रयोगों में, सिलिकॉन मास्टर को सामग्री की तालिका में रिपोर्ट किए गए फोटोरेसिस्ट का उपयोग करके महसूस किया गया था। हालांकि, पीडीएमएस मोल्डिंग के साथ वर्णित और उपयोग करने योग्य आकार सीमा में सुविधाओं का उत्पादन करने के लिए उपयुक्त किसी भी फोटोरेसिस्ट का उपयोग किया जा सकता है। वही माइक्रोचैनल मोल्ड तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले 3 डी प्रिंटिंग राल पर लागू होता है। वर्णित आयाम की विशेषताओं का उत्पादन करने में सक्षम और पीडीएमएस मोल्डिंग के साथ संगत किसी भी राल का उपयोग किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, 5 दिनों के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स को संग्रहीत करने से सतह हाइड्रोफिलिसिटी (30 और 60 डिग्री के बीच गिरने वाले संपर्क कोण) का अनुकूलन होता है जब ट्वीन 20 को बैक्टीरियल या कोलाइडल निलंबन में जोड़ा जाता है। यह प्रक्रिया इन प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत घटते संपर्क कोण के लिए सबसे अच्छी पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करती है; हालांकि, अन्य भंडारण समय और तापमान के रूप में अच्छी तरह से काम कर सकते हैं.

इस माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक के दो अनुप्रयोगों को प्रस्तुत किया गया है: 1) पीडीएमएस सब्सट्रेट पर जाल में बैक्टीरिया कोशिकाओं के व्यक्तिगत जमाव को शामिल करने वाले बैक्टीरियल पैटर्निंग, और 2) कोलाइडल पैटर्निंग जिसमें कोलाइड्स के अनुक्रमिक जमाव शामिल हैं, विभिन्न रचनाओं के कोलाइडल सरणियों को प्राप्त करते हैं। इस प्लेटफ़ॉर्म को पूरी तरह से बैक्टीरिया के जमाव की उच्च पैदावार सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें पीडीएमएस टेम्पलेट पर हजारों कोशिकाएं पैटर्न की गई हैं। केशिका-सहायता प्राप्त असेंबली और माइक्रोफ्लुइडिक्स का संयोजन एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन और कई घंटों के लिए पोषक तत्वों के स्थिर प्रवाह को सुनिश्चित करता है, जिसमें पूरी प्रक्रिया में पूर्ण ऑप्टिकल पहुंच होती है। एक बार माइक्रोफ्लुइडिक चैनल को ताजा माध्यम के साथ फ्लश करने के बाद पैटर्न वाली कोशिकाएं विकास को फिर से शुरू करने में सक्षम होती हैं, हालांकि पैटर्न वाली कोशिकाओं की व्यवहार्यता को अभी भी अनुकूलित करने की आवश्यकता है।

वर्तमान में, इस तकनीक की प्रमुख सीमा 7 घंटे की खिड़की के भीतर 54.5% प्रयोगों में पैटर्न वाली कोशिकाओं के विकास की कमी है। यह पहलू विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों से संबंधित हो सकता है और तनाव के मूल कारण को निर्धारित करने के लिए आगे की जांच करने की आवश्यकता है जो कोशिकाओं को फिर से बढ़ने से रोकता है। हवा के संपर्क और पैटर्निंग प्रक्रिया के दौरान मेनिस्कस द्वारा लगाया गया बल जीवाणु तनाव के प्रमुख योगदानकर्ताओं में से एक हो सकता है। तनाव के ऐसे स्रोतों को कम करने के लिए कई संभावित समाधानों को लागू किया जा सकता है, जिसमें पैटर्निंग प्रक्रिया के दौरान मेनिस्कस द्वारा कोशिकाओं पर लागू बल को कम करने के लिए गहरे जाल का उपयोग शामिल है। हवा के संपर्क से जुड़े तनाव को कम करने के लिए एक अतिरिक्त विकल्प गर्म ग्लास प्लेट के तापमान को कम करना होगा। 30 डिग्री सेल्सियस का तापमान पैटर्निंग प्रक्रिया के दौरान तरल निलंबन की पर्याप्त वाष्पीकरण दर सुनिश्चित करता है और माध्यम को फ्लश करने से पहले टेम्पलेट पर पैटर्न करने के बाद गर्मी बैक्टीरिया को कम कर देगा।

एक बार पूरी तरह से अनुकूलित होने के बाद, हम कल्पना करते हैं कि इस मंच का उपयोग विभिन्न प्रकार के जैविक अध्ययनों में किया जाएगा जिसमें मात्रात्मक एकल-कोशिका विश्लेषण शामिल होगा। तकनीक की उच्च-थ्रूपुट प्रकृति हजारों कोशिकाओं के पैटर्निंग की अनुमति देती है, जो एक ही प्रयोगात्मक क्षेत्र के भीतर बड़े आंकड़े प्रदान करती है। पूर्ण ऑप्टिकल एक्सेस समय के साथ बड़ी संख्या में एकल सूक्ष्मजीवों के व्यवहार, विकास और आणविक गतिविधियों को ट्रैक करने में सक्षम बनाता है, इस प्रकार सजातीय पर्यावरणीय परिस्थितियों के तहत फेनोटाइपिक विषमता के अध्ययन में प्रमुख लाभ प्रदान करता है। इस प्लेटफ़ॉर्म की माइक्रोफ्लुइडिक प्रकृति पर्यावरणीय परिस्थितियों जैसे मीडिया संरचना, प्रवाह दर और तापमान पर पूर्ण नियंत्रण सुनिश्चित करती है, बस कुछ नाम देने के लिए।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखक SNSF PRIMA अनुदान 179834 (ई.एस.), एक ETH अनुसंधान अनुदान ETH-15 17-1 (R. S.), और एक गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन अन्वेषक पुरस्कार जलीय माइक्रोबियल सिम्बायोसिस (अनुदान GBMF9197) (आर.एस.) पर एक गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन अन्वेषक पुरस्कार से समर्थन स्वीकार करते हैं। लेखकों ने बैक्टीरिया के SEM इमेजिंग के लिए और व्यावहारिक चर्चाओं के लिए डॉ मिगुएल एंजेल फर्नांडीज-रोड्रिग्ज (ग्रेनाडा, स्पेन विश्वविद्यालय) को धन्यवाद दिया। लेखकों ने डॉ जेन गुयेन (ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय, कनाडा), डॉ लौरा अल्वारेज़ (ईटीएच ज़ुरिच, स्विट्जरलैंड), कैमरून बोगन (ईटीएच ज़्यूरिच, स्विट्जरलैंड) और डॉ फैबियो ग्रिलो को व्यावहारिक चर्चाओं के लिए धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcatel AMS 200SE I-Speeder Alcatel Micro Machining System deep reactive ion exchange system
Alconox detergent
AZ400K developer MicroChemicals AZ400K
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) BD 300912 used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel
Box Incubator Life Imaging Services used to ensure a uniform and constant temperature in the channel
Centrifuge Eppendorf 5424R used to replace the overnight media with fresh minimal media
Centrifuge vial Eppendorf 30120086 1.5 mL
CETONI Base 120 CETONI GmbH syringe pump
Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) microParticles GmbH PS-FluoRed-Fi267
Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) microParticles GmbH PS-FluoGreen-Fi182
Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) microParticles GmbH PS-FluoGreen-Fi183
Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) microParticles GmbH PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M PVA TePla used to plasma treat a 10 cm silicon wafer
H401-T-CONTROLLER Okolab controller of the heated glass plate
H601-NIKON-TS2R-GLASS Okolab heated glass plate
Heidelberg DWL 2000 Heidelberg Instruments UV direct laser writer
Insulin syringes, U 100, with luer Codan Medical ApS CODA621640 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process
Klayout Opensource used to design the features on the silicon master
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific 244610 Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel
Masterflex transfer tubing Masterflex HV-06419-05 0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x) Teknova M2101 diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium
Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments microscope
openSCAD Opensource used to design the mold
OPTIspin SB20 ATM group 51-0002-01-00 spin developer
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1 used to plasma treat the template and microchannel to bond them
Positive photoresist AZ1505 MicroChemicals AZ1505
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786 added to MOPS 1x
Prusa curing and Washing machine CW1S Prusa used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold
Prusa Resin - Tough Prusa Research a.s. UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing
Prusa SL1 3d printer Prusa used to print the mold
Scale VWR-CH 611-2605 used to weight PDMS mixture
Silicon wafer (10 cm) Silicon Materials Inc. N/Phos <100> 1-10 Ω cm
Süss MA6 Mask aligner SUSS MicroTec Group used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate
Sylgard 184 Dow Corning silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01 Technic chromium etchant
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma Aldrich 448931 used to silianize the 3D printed mold
TWEEN 20 Sigma Aldrich P1379 used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process
Veeco Dektak 6 M Veeco profilometer
VTC-100 Vacuum Spin Coater MTI corporation vacuum spin coater

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References

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इंजीनियरिंग अंक 177
अनुक्रमिक केशिकाओं-सहायता प्राप्त असेंबली के माध्यम से सूक्ष्मजीवों और सूक्ष्म कणों का पैटर्निंग
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Pioli, R., Stocker, R., Isa, L.,… More

Pioli, R., Stocker, R., Isa, L., Secchi, E. Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (177), e63131, doi:10.3791/63131 (2021).

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