Summary
Apresentamos uma tecnologia que utiliza o conjunto assistido pela capilaridade em uma plataforma microfluida para padronizar objetos microdimensionados suspensos em um líquido, como bactérias e coloides, em matrizes prescritas em um substrato de polidimetilsiloxano.
Abstract
A padronização controlada de microrganismos em arranjos espaciais definidos oferece possibilidades únicas para uma ampla gama de aplicações biológicas, incluindo estudos de fisiologia microbiana e interações. No nível mais simples, a padronização espacial precisa dos microrganismos permitiria imagens confiáveis e de longo prazo de um grande número de células individuais e transformaria a capacidade de estudar quantitativamente interações micróbios dependentes da distância. Mais exclusivamente, acoplamento preciso da padronização espacial e controle total sobre as condições ambientais, como oferecido pela tecnologia microfluida, forneceria uma plataforma poderosa e versátil para estudos unicelulares em ecologia microbiana.
Este artigo apresenta uma plataforma microfluidica para produzir padrões versáteis e definidos pelo usuário de microrganismos dentro de um canal microfluido, permitindo acesso óptico completo para monitoramento de longo prazo e de alto rendimento. Esta nova tecnologia microfluida é baseada na montagem de partículas assistidas pela capilaridade e explora as forças capilares decorrentes do movimento controlado de uma suspensão evaporando dentro de um canal microfluido para depositar objetos microsized individuais em uma matriz de armadilhas microfabricadas em um substrato polidimetilsiloxano (PDMS). Deposições sequenciais geram o layout espacial desejado de objetos únicos ou múltiplos de micro-tamanho, ditados unicamente pela geometria das armadilhas e pela sequência de enchimento.
A plataforma foi calibrada usando partículas coloidais de diferentes dimensões e materiais: provou ser uma ferramenta poderosa para gerar diversos padrões coloidais e realizar a funcionalidade superficial de partículas presas. Além disso, a plataforma foi testada em células microbianas, utilizando células Escherichia coli como bactéria modelo. Milhares de células individuais foram padronizadas na superfície, e seu crescimento foi monitorado ao longo do tempo. Nesta plataforma, o acoplamento da deposição unicelular e da tecnologia microfluidica permite tanto a padronização geométrica de microrganismos quanto o controle preciso das condições ambientais. Assim, abre uma janela para a fisiologia de micróbios únicos e a ecologia das interações micróbios-micróbios, como mostrado por experimentos preliminares.
Introduction
A padronização espacial de microrganismos únicos, particularmente dentro de arenas experimentais que permitem o controle total sobre as condições ambientais, como dispositivos microfluidos, é altamente desejável em uma ampla gama de contextos. Por exemplo, organizar microrganismos em matrizes regulares permitiria a imagem precisa de um grande número de células individuais e o estudo de seu crescimento, fisiologia, expressão genética em resposta a estímulos ambientais e suscetibilidade de medicamentos. Também permitiria estudar interações célula-células de particular interesse em pesquisa em comunicação celular (por exemplo, sensoriamento de quórum), alimentação cruzada (por exemplo, simbiose alga-bacteriana) ou antagonismo (por exemplo, alopatia), com controle total sobre a localização espacial das células em relação umas às outras. Estudos de fisiologia e evolução celular1, estudos de interação célula-célula2, triagem de diferenciação fenotípica3, monitoramento ambiental4 e triagem de medicamentos5 estão entre os campos que podem se beneficiar muito de uma tecnologia capaz de alcançar essa análise quantitativa unicelular.
Várias estratégias para isolar e manusear células únicas têm sido propostas nos últimos anos, desde armadilhas ópticas holográficas6 e métodos heterogêneos de funcionalização de superfície7,8,9,10 até quimiostats11 unicelulares e microfluidos de gotícula12. Esses métodos são tecnicamente muito exigentes ou afetam a fisiologia celular e não fornecem uma plataforma de alto rendimento para padronizar micróbios que podem ser estudados por longos períodos, garantindo resolução unicelular, acesso óptico completo e controle sobre as condições ambientais. O objetivo deste artigo é descrever uma plataforma para padronizar bactérias com precisão micrométrica em arranjos espaciais prescritos em uma superfície PDMS através de montagem assistida por capilaridade. Esta plataforma permite uma padronização espacial precisa e flexível dos micróbios e permite acesso óptico completo e controle sobre as condições ambientais, graças à sua natureza microfluidica.
A tecnologia por trás dessa plataforma é uma tecnologia de montagem desenvolvida nos últimos anos, chamada sCAPA13,14,15 (conjunto de partículas assistidas por capilaridade sequencial) que foi integrada em uma plataforma microfluida16. O menisco de uma gotícula líquida evaporando, enquanto recua sobre um substrato de polidimimetilsiloxano padronizado (PDMS) dentro de um canal microfluido, exerce forças capilares que prendem as partículas coloidais individuais suspensas no líquido em poços micrométricos microfrágidos no substrato (Figura 1A). As partículas suspensas são primeiro transportadas para a interface ar-líquido por correntes convectivas e, em seguida, colocadas nas armadilhas por capilaridade. Forças capilares exercidas pelo ato de menisco em movimento em maior escala em comparação com as forças envolvidas nas interações de partículas.
Assim, o mecanismo de montagem não é influenciado pelo material, dimensões e propriedades superficiais das partículas. Parâmetros como concentração de partículas, velocidade do menisco, temperatura e tensão superficial da suspensão são os únicos parâmetros que influenciam o rendimento do processo de padronização. O leitor pode encontrar uma descrição detalhada da influência dos parâmetros acima mencionados no processo de padronização em 13,14,15. Na tecnologia sCAPA original13,14,15, o processo de padronização coloidal foi realizado em um sistema aberto e exigiu um estágio piezoelétrico de alta precisão para conduzir a suspensão através do modelo. Esta plataforma explora uma estratégia diferente e permite que a padronização seja realizada com equipamentos padrão geralmente utilizados em microfluidos em ambiente controlado, minimizando assim os riscos de contaminar as amostras.
Esta plataforma microfluida foi primeiramente otimizada em partículas coloidais para criar matrizes regulares de partículas inertes e, em seguida, aplicada com sucesso em bactérias. Ambas as plataformas microfluídicas estão descritas neste artigo (Figura 1B,C). A maioria das etapas preparatórias e os equipamentos experimentais descritos no protocolo são comuns para as duas aplicações (Figura 2). Relatamos padronização coloidal para demonstrar que a técnica pode ser usada para realizar múltiplas deposições sequenciais na mesma superfície para criar padrões complexos e multimateriais. Em particular, uma única partícula foi depositada por armadilha para cada passo para formar matrizes coloidais com uma geometria e composição específicas, ditadas unicamente pela geometria e sequência de enchimento das armadilhas. Quanto à padronização bacteriana, são descritos depoimentos únicos, resultando em uma bactéria sendo depositada por armadilha. Uma vez que as células são padronizadas na superfície, o canal microfluido é lavado com meio para promover o crescimento bacteriano, a etapa preliminar de qualquer estudo unicelular.
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Protocol
1. Preparação do mestre do silício
NOTA: Os modelos PDMS com as armadilhas microfráricas que formam o modelo de padronização coloidal e microbiana foram fabricados de acordo com o método introduzido por Geissler et al. 17 anos. O mestre de silício foi preparado por litografia convencional em uma sala de limpeza. Veja as etapas a seguir para o procedimento e a Tabela de Materiais para o equipamento.
- Projete os recursos usando o software CAD (Computer-Aided Design, design auxiliado por computador).
- Prepare a máscara de vidro cromado com uma camada de fotoresist positivo expondo as características projetadas com um laser uv escritor.
- Desenvolva a máscara de vidro cromado com um desenvolvedor de spin usando um desenvolvedor em 1:4 fotoresist para relação água para 15 s.
- Mergulhe a máscara em etchant de cromo por 50 s.
- Estedo de plasma um wafer de silício de 10 cm por 3 min a 600 W.
- Deposite uma camada de hexametiletiladisilizane e asse a 110 °C para melhorar a adesão ao fotoresist.
- Deposite uma camada de fotoresist a 4.500 × g por 2 min.
- Exponha o recurso ao UV através da máscara de vidro cromado com um alinhador de máscara para 2 s e desenvolva-se com um desenvolvedor quanto à máscara.
- Para completar a fabricação do mestre de silício, etch o wafer através de uma troca de íons reativas profundas, ajustando o tempo de gravação (<2 min) para alcançar a profundidade desejada (medido com um perfil.
2. Preparação do molde de microcanal
- Projete o canal com software CAD e corte-o com um software fatiador para converter o modelo projetado em instruções para a impressora 3D, definindo a distância de corte em 0,05 mm.
- Imprima o canal com uma impressora 3D por ~1 h.
- Lave e poste o molde em uma máquina de cura e lavagem dedicada.
- Coloque o molde em um recipiente cheio de álcool isopropílico puro (IPA) e vórtice do líquido (lave por 20 minutos). Tire o recipiente cheio de IPA da máquina.
- Uma vez que o molde lavado seja removido do recipiente IPA, coloque-o de volta na máquina de lavar e curar e colocá-lo por 15 min a 35 °C.
NOTA: A Tabela de Materiais informa a impressora 3D e a máquina de cura e lavagem utilizada no protocolo de preparação do molde. O modelo 3D foi fatiado com o software cortador proprietário da impressora 3D.
- Coloque a impressão em forno UV por 12 h e coloque-a em forno a 80 °C por 12 h.
NOTA: Esta etapa garante que todo o polímero esteja curado e que todo o polímero não curado seja removido da impressão, pois impediria a cura do PDMS. - Silanize o molde através da deposição de vapor de Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano.
- Coloque o molde 3D em um dessecador a vácuo junto com 20 μL de Trichloro 100% concentrado (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) tubulação de silano em uma folha de alumínio colocada perto do molde.
- Crie um vácuo no desiccator para gerar vapor e deixe por 40 minutos.
- Retire o molde do desiccador e enxágue-o com etanol puro antes de derramar PDMS sobre ele.
3. Fabricação do chip microfluido
- Prepare uma mistura de PDMS misturando o elastômero com seu agente de crosslinking (Tabela de Materiais). Mexa a mistura vigorosamente para misturar os dois componentes uniformemente até que as bolhas de ar sejam formadas, e a mistura PDMS parece opaca.
NOTA: A quantidade de cross-linker deve ser de 10% em peso da quantidade de elastômero. - Desgas a mistura de elastômero e agente de crosslinking em um dessecador de vácuo para remover as bolhas de ar presas. Transfira a mistura no desiccador para o recipiente utilizado para a mistura (etapa 3.1). Continue o processo de desgaseamento até que todas as bolhas tenham sido removidas e a mistura pareça transparente novamente.
NOTA: O tempo normalmente necessário para a profecimento é de 30 minutos. - Despeje 3 g da mistura no mestre do silício para produzir o modelo, que servirá como o "piso" do chip microfluido.
NOTA: A espessura da camada PDMS pode ser ajustada alterando a quantidade de mistura derramada no mestre do silício.- Para obter um modelo de 400 μm de espessura, despeje 3 g de PDMS no mestre do silício, coloque o mestre de silício em um reveste de spin e gire em 21 × g para 5 s e 54 × g por 10 s, e depois degas novamente como descrito na etapa 3.2 para remover bolhas de ar presas.
- Despeje 20 g da mistura PDMS no molde impresso em 3D para fazer o microcanal, que servirá como o "teto" do chip microfluido, e desgas-lo como descrito na etapa 3.2 por 30 min.
- Asse tanto o wafer de silício quanto o molde impresso em 3D a 70 °C por pelo menos 2 h.
- Retire a camada PDMS do molde impresso em 3D, corte o PDMS com uma lâmina ao redor dos microcanais e faça os orifícios que servirão de entrada e saída do canal microfluido.
- Retire o PDMS do mestre do silício e corte a camada PDMS em pedaços menores com as mesmas dimensões dos canais microfluidos que serão ligados em cima dos modelos.
- Esfregue suavemente os modelos e microcanais usando uma solução de detergente de 1% (veja a Tabela de Materiais) por 5 minutos e depois enxágue com água desionizada. Em seguida, enxágüe os modelos e microcanais com isopropanol e enxágue-os com água deionizada. Seque os modelos e microcanais à temperatura ambiente por 1 minuto com ar comprimido em 1 bar.
- Coloque os modelos e os microcanais em um limpador de plasma com as superfícies a serem ligadas de frente para cima. Ligue o limpador de plasma, e o plasma trate os modelos e os microcanais por 40 s. Retire-os do limpador de plasma e ligue imediatamente os microcanais em cima dos modelos, colocando-os em contato uns com os outros.
- Armazene os chips microfluidos em um forno a 70 °C durante cinco dias para garantir a recuperação hidrofóbica do PDMS e tenha um ângulo de contato recuando dentro da faixa ideal, entre 30 e 60°10,11.
4. Padronização bacteriana
- Um dia antes do experimento, cresce uma população de Escherichia coli (cepa MG1655 prpsM-GFP). Inocular a cultura diretamente do estoque congelado e crescer durante a noite por 20 h em caldo de lysogeny (LB) médio em uma incubadora shaker a 37 °C. Adicione 50 μg/mL de kanamicina para que as células mantenham o plasmídeo prpsM-GFP.
- No dia do experimento, coloque a incubadora da caixa (Figura 2A) a 37 °C várias horas antes do experimento para ter uma temperatura uniforme e estável antes de iniciar o experimento. Configure a bomba de seringa e a placa de vidro aquecida no estágio do microscópio (Figura 2B,C), definindo a temperatura na mesma temperatura da incubadora da caixa.
NOTA: A incubadora da caixa em que todo o sistema, incluindo o microscópio (Figura 2E), é fechado garante que uma temperatura uniforme e constante seja mantida durante todo o experimento quando o canal estiver lavado com meio. - Noventa minutos antes do experimento, coloque o chip microfluido em um navio cheio de 100% de etanol (EtOH) e lave o canal com 100% de EtOH por pelo menos 10 minutos. Coloque o chip microfluido em um desiccador a vácuo e degas por pelo menos 30 minutos. Troque o EtOH com água destilada e trate o chip por pelo menos 30 minutos. Coloque o chip microfluido no forno a 70 °C por 10 minutos para remover quaisquer vestígios de líquido deixados no canal.
NOTA: Esta etapa é necessária para evitar a formação de bolhas no canal quando lavada com meio de cultura. Este protocolo de prevenção de bolhas foi adaptado de Wang et al.18. - Pipeta 1 mL de 3-(N-morpholino)ácido propanesulfônico (MOPS) médio (1x) em um frasco de centrífuga e adicionar 10 μL de fosfato de potássio de 0,132 M (K2HPO4). Tire a cultura da noite para o dia da incubadora de 37 °C e aliquot 100 μL no frasco de centrífugas e centrífuga a cultura a 2.300 × g por 2 min. Pipeta suavemente o supernatante dos frascos de centrífugas, e resuspenque a pelota em 1 mL de mops fresco médio com 0,015% v/v de Tween 20 e 0,01% v/v de fosfato de potássio.
NOTA: A concentração típica da suspensão bacteriana está na faixa de 0,015-0,15 vol%, o que garante a formação de uma zona de acumulação estendida e móvel e impede o acúmulo de partículas no substrato. Substituir o meio noturno por meio fresco minimiza os riscos de lançar filmes de bactérias no modelo. A falta de fonte de carbono no meio fresco impede que as células cresçam na suspensão durante a padronização do modelo. É necessária uma concentração de 0,015% v/v de Tween 20 na suspensão para que o ângulo de contato do líquido recuado no modelo PDMS fique dentro da faixa ideal, entre 30 e 60°. - Carregue a suspensão bacteriana em uma seringa de 1 mL e conecte a seringa ao chip através de tubos microfluidos.
- Para fixar a conexão entre a seringa e a tubulação, insira diretamente uma agulha com um diâmetro externo de 0,6 mm na tubulação. Para evitar dispersar qualquer suspensão remanescente nas proximidades do canal, lave o meio fresco através do orifício usado como saída durante o processo de padronização (Figura 3A-III), em vez do orifício usado como entrada.
- Monte a seringa na bomba de seringa e injete a suspensão no chip microfluido através da entrada localizada na parte upstream do canal até que a suspensão cubra a região do modelo com armadilhas.
NOTA: Durante o processo de injeção de líquido, o ar pode escapar através de uma tomada localizada na extremidade a jusante do canal. - Defina a bomba de seringa para retirar a suspensão bacteriana (Figura 3A-I) a uma taxa de fluxo de 0,07-0,2 μL/min, que na geometria descrita corresponde a uma velocidade de recuo do menisco de 80-100 μm/min.
- Monitore o processo de padronização através de software de microscópio.
NOTA: Aqui, uma ampliação de 10x foi usada para monitorar o menisco recuando no modelo, e uma ampliação de 20x foi usada para monitorar a deposição de bactérias individuais nas armadilhas microfrágidas.
- Uma vez que o modelo tenha sido padronizado com células (Figura 3A-II), aumente a taxa de fluxo de retirada para esvaziar rapidamente o canal microfluido e lavá-lo com LB fresco que foi anteriormente desgassed por pelo menos 30 min e pré-equipado a 30 °C.
- Coloque a bomba de seringa a uma vazão de 2 μL/min para lavar suavemente o canal. Uma vez preenchido o canal, aumente a taxa de fluxo (15 μL/min) de acordo com as necessidades experimentais específicas.
- Adquira imagens de bactérias em crescimento na ampliação desejada e intervalo de tempo.
5. Padronização coloidal
- Pipeta 900 μL de uma solução aquosa v/v 20 de 0,015% v/v Tween 20 em um frasco de centrífugas e pipeta 100 μL da suspensão coloidal original nele. Centrifugar a suspensão a 13.500 × g por 1 min. Remova suavemente o supernatante e substitua-o pela solução aquosa Tween 20 (0,015% v/v). Repita este processo três vezes para garantir a substituição completa do solvente do fornecedor da suspensão do estoque.
- Carregue a suspensão coloidal em uma seringa de 1 mL e conecte a seringa ao chip através de tubos microfluidos. Injete a suspensão no chip microfluido através da entrada localizada dentro da seção central, na parte upstream do canal, e empurre gradualmente a suspensão até que o modelo esteja coberto.
- Retire a suspensão coloidal a uma taxa de fluxo de 0,07-0,2 μL/min, o que corresponde a uma velocidade de recuo do menisco de 1-2 μm/min, e imagem do processo de padronização via software de microscópio. Use a ampliação de 10x para monitorar o menisco recuando no modelo e a ampliação de 20x para observar a deposição de partículas individuais nas armadilhas microfrágicadas. Aumente a taxa de fluxo assim que o menisco chegar ao final do modelo para esvaziar o canal rapidamente.
NOTA: Matrizes coloidais compostas de várias partículas podem ser produzidas executando o processo de padronização das etapas 5.1 a 5.3 em série. O canal é carregado com uma nova suspensão coloidal em cada iteração de acordo com a composição das matrizes coloidais desejadas. Cada passo de padronização adiciona uma partícula à matriz coloidal e pode ser executada sequencialmente até que as armadilhas tenham sido preenchidas com a sequência das partículas desejadas. A composição das matrizes coloidais resultantes é dada unicamente pela sequência de suspensões coloidais usadas para preencher as armadilhas (Figura 3B).
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Representative Results
Uma plataforma microfluida que explora o conjunto assistido pela capilaridade para padronizar partículas coloidais e bactérias em armadilhas microfíbridas em um modelo PDMS foi desenvolvida. Duas geometrias de canais diferentes foram projetadas para otimizar a padronização de coloides e bactérias através do conjunto assistido pela capilaridade. A geometria do primeiro canal (Figura 1B) consiste em três seções paralelas de 23 mm de comprimento sem barreira física entre eles. As duas seções nas laterais têm 5 mm de largura e 1 mm de altura, enquanto a seção central tem 7 mm de largura e 500 μm de altura. Este design ajuda a manter uma gotícula móvel bem definida com um menisco em forma de convexo recuando. O princípio de trabalho desta plataforma é descrito em detalhes por Pioli et al.11. Se o experimento requer o preenchimento dos canais laterais, como no caso da cultura de bactérias, os bolsões de ar geralmente são formados. Por essa razão, projetamos e testamos uma segunda geometria que simplifica o processo de enchimento quando o canal é lavado com meio. Neste caso, a plataforma (Figura 1C) consiste em um único canal reto de 20 mm de comprimento, 3 mm de largura e 500 μm de altura.
A temperatura no canal microfluido é um parâmetro importante para garantir um processo eficiente de deposição. Deve ser mantido 15 °C acima do ponto de orvalho da água para evitar condensação no modelo. A placa de vidro aquecida sob o canal (Figura 2D) garante uma temperatura uniforme em todo o modelo para evitar a condensação durante o processo de padronização na região próxima à interface líquido-ar, caracterizada por uma alta concentração de vapor no ar. A temperatura da placa de vidro aquecida deve ser a mesma da incubadora da caixa para evitar a condensação no modelo.
A geometria do canal reto foi explorada para padronizar células estacionárias (Figura 4A) de uma cepa E. coli fluorescente (MG1655 prpsM-GFP). As bactérias foram depositadas em 83% das 5.000 armadilhas analisadas. As células foram colocadas pela primeira vez nas armadilhas de acordo com o protocolo apresentado e posteriormente cultivadas por 4h a 37 °C em LB lavadas a 10 mm/min. As bactérias padronizadas retomaram o crescimento em diferentes horários dentro de 1,5 h a partir de quando o canal foi preenchido com LB fresco (Figura 4B-I), com a mediana em 44 min. Uma vez que o crescimento é retomado, células bacterianas únicas começam a formar colônias individuais, que se expandem (Figura 4B-II) até que uma camada de superfície seja formada (3,5 h) e a resolução unicelular seja perdida (Figura 4B-III).
Este experimento de prova de conceito mostra que a montagem assistida pela capilaridade em um canal microfluido pode ser usada para padronizar uma superfície com milhares de células de bactérias únicas viáveis. Onze réplicas mostram que as células padronizadas cresceram em 45,5% dos casos dentro de uma janela de 7h. Quatro testes realizados adicionando iodeto de propídio (PI), uma mancha morta ao vivo19, ao LB fresco lavado no canal após o depoimento provaram que bactérias não-crescentes e padronizadas não foram manchadas. Como a PI se liga ao DNA, mas não consegue penetrar células com uma membrana intacta, o experimento de coloração da PI mostra que nem o processo de padronização nem os processos de dessecação e reidratação danificaram a membrana das células.
A geometria do canal de três seções foi usada para produzir matrizes lineares coloidais com diferentes composições, realizando padronização sequencial de partículas coloidais. A Figura 5 mostra as diferentes matrizes coloidais formadas através de padronização sequencial, incluindo dimers (Figura 5A,B) e aparadores (Figura 5C), contendo duas e três partículas sequencialmente presas, respectivamente. Partículas de poliestireno fluorescente verde e vermelho foram usadas para montar tanto os centavos quanto os aparadores. Análises realizadas em mais de 55.000 armadilhas mostram que os dimers verde-vermelho (G-R) (Figura 5A,B) feitos por partículas com 2 μm e 1 μm de diâmetro foram formados em 93% e 89% das armadilhas analisadas, respectivamente. Os aparadores verde-vermelho-verde (G-R-G) (Figura 5C) foram formados em 52% das 55.000 armadilhas analisadas11. Dimers e aparadores foram montados executando depoimentos sequenciais, com as suspensões coloidais movendo-se na mesma direção em todos os depoimentos sequenciais (Figura 3B). Como resultado, as partículas presas em cada etapa de deposição estão em contato direto com as presas na anterior.
O posicionamento preciso das partículas não requer contato direto entre partículas depositadas. A distância entre partículas padronizadas pode ser precisamente controlada realizando duas deposições em direções opostas, prendendo tais partículas nas extremidades opostas de cada armadilha (Figura 5D). A distância entre as partículas presas pode ser ajustada projetando armadilhas com o comprimento desejado. Uma possibilidade adicional oferecida pela plataforma é a padronização química da superfície com precisão micrométrica. Este resultado pode ser alcançado com a padronização do modelo com partículas quimicamente funcionalizadas11.
Figura 1: Geometrias e padronagem dos canais microfluidos. (A) Esquema de uma seção de visão lateral do canal microfluido durante a padronização de partículas coloidais. A suspensão líquida evapora dentro do canal microfluido, e as correntes convectivas transportam partículas suspensas em direção à interface ar-líquido. As partículas são assim acumuladas e formam a zona de acumulação. A bomba de seringa puxa a suspensão líquida, levando-a a recuar, e partículas individuais ficam presas durante a recessão líquida no modelo. A seta representa a direção em que a suspensão está se movendo. (B) Esquema da geometria do canal usada para padronizar partículas coloidais no modelo PDMS. O canal tem 23 mm de comprimento e 17 mm de largura e consiste em três seções: uma central de 7 mm de largura e duas laterais de 5 mm de largura. O modelo está no piso do canal, dentro da seção central. A seção transversal mostra que a seção central do canal microfluido, onde a suspensão líquida está confinada durante todo o processo de padronização, é a parte mais rasa do canal e tem 500 μm de altura, enquanto as duas seções laterais têm 1 mm de altura. (C) Esquema da geometria do canal reto usada para padronizar bactérias. O dispositivo microfluido consiste em um canal reto de 20 mm de comprimento, 3 mm de largura e 500 μm de altura. A seção retangular deste dispositivo microfluido, mostrada na seção transversal, simplifica o processo de enchimento do canal com meio. A imagem SEM mostra uma pequena porção do modelo PDMS com armadilhas de 2 μm de comprimento, 1 μm de largura e 500 nm de profundidade microfíbridas nele. Barra de escala = 2 μm. Abreviaturas: PDMS = polidimimetilsiloxano; SEM = microscopia eletrônica de varredura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema da plataforma para montagem sequencial assistida por capilaridade em um canal microfluido. (A) Incubadora de caixas. A incubadora da caixa mantém uma temperatura uniforme e constante (aqui, 30 °C) dentro do canal microfluido. (B) Seringa carregada com suspensão líquida. A seringa é controlada por uma bomba de seringa (não mostrada) e é usada para controlar o movimento do líquido durante o processo de padronização. (C) Placa de vidro aquecida. A placa de vidro aquecida é colocada sob o canal microfluido e garante uma temperatura uniforme (aqui, 30 °C) através do modelo, o que é fundamental para evitar a condensação nas proximidades da interface ar-líquido. (D) Chip microfluido carregado com suspensão líquida. O piso do chip microfluido carrega as armadilhas nas quais bactérias e coloides são padronizados durante o processo de padronização. (E) Microscópio. A placa de vidro aquecida e o chip microfluido são colocados em um estágio de microscópio, concedendo acesso óptico total durante o processo de padronização e todas as etapas a seguir. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esquema das etapas envolvidas na padronização bacteriana e coloidal. Cada painel mostra uma visão interna do canal microfluido e inclui apenas uma pequena parte do modelo PDMS. (A) Padronização de bactérias através de montagem assistida por capilaridade. (I) A suspensão bacteriana evapora dentro do canal microfluido, causando correntes convectivas para transportar bactérias suspensas para a interface ar-líquido, formando assim a zona de acumulação. Enquanto isso, a suspensão é puxada pela bomba de seringa e recua no modelo. A seta representa a direção em que a suspensão bacteriana está se movendo. A suspensão de recuo varre o modelo, e células individuais são depositadas nas armadilhas microfrágidas. (II) Bactérias depositadas são expostas ao ar até que o canal seja lavado com meio fresco. O processo de deposição termina quando a suspensão líquida chega ao final do modelo. (III) O canal microfluido é lavado com meio fresco (ou seja, LB). A seta representa a direção em que o meio fresco é lavado. (B) Padronização de partículas coloidais através de montagem sequencial assistida pela capilaridade. (I) A suspensão coloidal recua no modelo enquanto evapora, e as partículas se acumulam na interface ar-líquido, formando a zona de acumulação. Partículas individuais são depositadas nas armadilhas microfíbridas no modelo. A seta representa a direção em que a suspensão coloidal está se movendo. (II) O processo de deposição é concluído quando a suspensão líquida atinge o final do modelo. (III) Um segundo depoimento é executado na mesma direção que o primeiro depoimento para colocar uma segunda partícula em cada armadilha no modelo. (IV) Uma vez que o segundo depoimento é feito, o modelo é padronizado com dimers de uma partícula verde e uma vermelha. Abreviaturas: PDMS = polidimimetilsiloxano; LB = Caldo de lysogeny. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Modelo PDMS padronizado com células E. coli (cepa MG1655 prpsM-GFP). (A) Imagem SEM de células individuais de E. coli presas em armadilhas de 2 μm de comprimento, 1 μm de largura e 500 nm de profundidade. As células ficaram presas após um único depoimento. Barra de escala = 2 μm. (B) Imagens de epifluorescência de uma pequena porção do modelo PDMS (aproximadamente 80 μm x 80 μm) com células presas de E. coli após o canal microfluidic é preenchido com meio de cultura (caldo de lysogeny) a uma velocidade inicial de 1,3 mm/min, que é então aumentado para 10 mm/min. As células presas crescem e se dividem várias vezes por 4h, eventualmente se fundindo com células de armadilhas vizinhas e cobrindo a superfície. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: PDMS = polidimimetilsiloxano; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Aglomerados coloidais montados através do conjunto de partículas assistidas pela capilaridade sequencial na plataforma microfluida (geometria do primeiro canal). Imagem de microscopia de epifluorescência de (A) 15 centavos montados a partir de partículas de poliestireno com 2 μm de diâmetro com duas deposições sequenciais. (B) Dimers (n = 15) montados a partir de partículas de poliestireno com 1 μm de diâmetro com duas deposições sequenciais. (C) Aparadores (n = 15) montados a partir de partículas de poliestireno com 1 μm de diâmetro com três deposições sequenciais. (D) Armadilhas (n = 15) com partículas padronizadas nas extremidades de cada armadilha, executando dois depoimentos sequenciais em direções opostas. A distância entre partículas em uma armadilha é de 2 μm. Barras de escala = 4 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A plataforma microfluida descrita aqui permite a padronização de objetos micro-tamanhos, como coloides e bactérias, em arranjos espaciais prescritos em um substrato PDMS. O controle total sobre as condições ambientais oferecidos pelos microfluidos e a capacidade de padronizar células com precisão micrométrica concedida pela tecnologia sCAPA torna-a uma plataforma muito promissora para futuros estudos de fisiologia e ecologia.
Nos experimentos apresentados neste trabalho, o mestre de silício foi realizado utilizando-se o fotoresistista relatado na Tabela de Materiais. No entanto, qualquer fotoresistista adequado para produzir características na faixa de tamanho descrita e utilizável com moldagem PDMS poderia ser usado. O mesmo se aplica à resina de impressão 3D usada para preparar o molde do microcanal. Qualquer resina capaz de produzir características da dimensão descrita e compatível com a moldagem PDMS poderia ser usada.
Neste protocolo, armazenar os chips microfluidos a 70 °C por 5 dias otimiza a hidrofilialidade superficial (ângulo de contato caindo entre 30 e 60°) quando tween 20 é adicionado à suspensão bacteriana ou coloidal. Este procedimento garante a melhor reprodutibilidade para o ângulo de contato de recuo nessas condições experimentais; no entanto, outros tempos de armazenamento e temperaturas podem funcionar também.
Duas aplicações desta técnica microfluida foram apresentadas: 1) padronização bacteriana envolvendo deposições individuais de células bacterianas nas armadilhas do substrato PDMS, e 2) padronização coloidal envolvendo deposições sequenciais de coloides, obtenção de matrizes coloidais de diferentes composições. Esta plataforma foi totalmente otimizada para garantir altos rendimentos de deposição bacteriana, com milhares de células padronizadas no modelo PDMS. A combinação de montagem assistida pela capilaridade e microfluidos garante resolução unicelular e fluxo estável de nutrientes por várias horas, com acesso óptico total durante todo o processo. As células padronizadas são capazes de retomar o crescimento uma vez que o canal microfluido é lavado com meio fresco, embora a viabilidade das células padronizadas ainda precise ser otimizada.
Atualmente, a maior limitação dessa técnica é a falta de crescimento de células padronizadas em 54,5% dos experimentos dentro de uma janela de 7h. Esse aspecto pode estar relacionado com as espécies bacterianas específicas e precisa ser investigado para determinar a causa raiz do estresse que impede que as células se reculam. A exposição ao ar e a força exercida pelo menisco durante o processo de padronização podem estar entre os principais contribuintes para o estresse bacteriano. Várias soluções possíveis podem ser implementadas para reduzir tais fontes de estresse, incluindo o uso de armadilhas mais profundas para reduzir a força aplicada nas células pelo menisco durante o processo de padronização. Uma opção adicional para reduzir o estresse associado à exposição ao ar seria diminuir a temperatura da placa de vidro aquecida. Uma temperatura de 30 °C garante uma taxa de evaporação suficiente da suspensão líquida durante o processo de padronização e reduziria o calor a que as bactérias são expostas depois de padronizadas no modelo antes que o meio seja lavado.
Uma vez totalmente otimizada, prevemos que essa plataforma será usada em uma variedade de estudos biológicos envolvendo análise quantitativa unicelular. A natureza de alto rendimento da técnica permite a padronização de milhares de células, fornecendo grandes estatísticas dentro da mesma arena experimental. O acesso óptico completo permite o acompanhamento do comportamento, crescimento e atividades moleculares de um grande número de microrganismos únicos ao longo do tempo, proporcionando grandes vantagens no estudo da heterogeneidade fenotípica em condições ambientais homogêneas. A natureza microfluida desta plataforma garante total controlabilidade sobre condições ambientais, como composição de mídia, vazão e temperatura, apenas para citar alguns.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio da bolsa SNSF PRIMA 179834 (à E.S.), uma Bolsa de Pesquisa ETH ETH-15 17-1 (R. S.), e um Prêmio de Investigação da Fundação Gordon e Betty Moore sobre Simbiose Microbiana Aquática (grant GBMF9197) (R. S.). Os autores agradecem ao Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (Universidade de Granada, Espanha) pela imagem sem de bactérias e pelas discussões perspicazes. Os autores agradecem ao Dr. Jen Nguyen (Universidade da Colúmbia Britânica, Canadá), Dr. Laura Alvarez (ETH Zurique, Suíça), Cameron Boggon (ETH Zürich, Suíça) e Dr. Fabio Grillo pelas discussões perspicazes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
