Summary
Presentiamo una tecnologia che utilizza l'assemblaggio assistito dalla capillarità in una piattaforma microfluidica per modellare oggetti di dimensioni micro sospesi in un liquido, come batteri e colloidi, in matrici prescritte su un substrato di polidimetilsilossano.
Abstract
La modellazione controllata dei microrganismi in disposizioni spaziali definite offre possibilità uniche per una vasta gamma di applicazioni biologiche, compresi studi di fisiologia microbica e interazioni. Al livello più semplice, un accurato pattern spaziale dei microrganismi consentirebbe l'imaging affidabile e a lungo termine di un gran numero di singole cellule e trasformerebbe la capacità di studiare quantitativamente le interazioni microbo-microbo dipendenti dalla distanza. Più unicamente, l'accoppiamento di modelli spaziali accurati e il pieno controllo sulle condizioni ambientali, come offerto dalla tecnologia microfluidica, fornirebbe una piattaforma potente e versatile per studi su singole cellule in ecologia microbica.
Questo documento presenta una piattaforma microfluidica per produrre modelli versatili e definiti dall'utente di microrganismi all'interno di un canale microfluidico, consentendo un accesso ottico completo per il monitoraggio a lungo termine e ad alta produttività. Questa nuova tecnologia microfluidica si basa sull'assemblaggio di particelle assistito dalla capillarità e sfrutta le forze capillari derivanti dal movimento controllato di una sospensione evaporante all'interno di un canale microfluidico per depositare singoli oggetti di dimensioni micrometriche in una serie di trappole microfabbricate su un substrato di polidimetilsilossano (PDMS). Le deposizioni sequenziali generano il layout spaziale desiderato di singoli o più tipi di oggetti di dimensioni micro, dettato esclusivamente dalla geometria delle trappole e dalla sequenza di riempimento.
La piattaforma è stata calibrata utilizzando particelle colloidali di diverse dimensioni e materiali: ha dimostrato di essere un potente strumento per generare diversi modelli colloidali ed eseguire la funzionalizzazione superficiale delle particelle intrappolate. Inoltre, la piattaforma è stata testata su cellule microbiche, utilizzando cellule di Escherichia coli come batterio modello. Migliaia di singole cellule sono state modellate sulla superficie e la loro crescita è stata monitorata nel tempo. In questa piattaforma, l'accoppiamento della deposizione monocellulare e della tecnologia microfluidica consente sia la modellazione geometrica dei microrganismi che il controllo preciso delle condizioni ambientali. Apre così una finestra sulla fisiologia dei singoli microbi e sull'ecologia delle interazioni microbo-microbo, come dimostrato da esperimenti preliminari.
Introduction
La modellazione spaziale di singoli microrganismi, in particolare all'interno di arene sperimentali che consentono il pieno controllo sulle condizioni ambientali, come i dispositivi microfluidici, è altamente auspicabile in una vasta gamma di contesti. Ad esempio, organizzare i microrganismi in array regolari consentirebbe l'imaging accurato di un gran numero di singole cellule e lo studio della loro crescita, fisiologia, espressione genica in risposta a stimoli ambientali e suscettibilità ai farmaci. Consentirebbe inoltre di studiare le interazioni cellula-cellula di particolare interesse nella ricerca sulla comunicazione cellulare (ad esempio, quorum sensing), cross-feeding (ad esempio, simbiosi algale-batterica) o antagonismo (ad esempio, allelopatia), con pieno controllo sulla localizzazione spaziale delle cellule l'una rispetto all'altra. Gli studi di fisiologia ed evoluzione cellulare1, gli studi di interazione cellula-cellula2, lo screening fenotipico della differenziazione3, il monitoraggio ambientale4 e lo screening farmacologico5 sono tra i campi che possono trarre grande beneficio da una tecnologia in grado di ottenere tale analisi quantitativa a singola cellula.
Negli ultimi anni sono state proposte diverse strategie per isolare e gestire singole cellule, dalle trappole ottiche olografiche6 e metodi di funzionalizzazione di superficie eterogenei7,8,9,10 ai chemiostati monocellulari11 e alla microfluidica delle goccioline12. Questi metodi sono tecnicamente molto impegnativi o influenzano la fisiologia cellulare e non riescono a fornire una piattaforma ad alto rendimento per modellare i microbi che possono essere studiati per lunghi periodi, garantendo la risoluzione a singola cellula, il pieno accesso ottico e il controllo sulle condizioni ambientali. L'obiettivo di questo documento è descrivere una piattaforma per modellare i batteri con precisione micrometrica in disposizioni spaziali prescritte su una superficie PDMS attraverso l'assemblaggio assistito dalla capillarità. Questa piattaforma consente una modellazione spaziale precisa e flessibile dei microbi e consente l'accesso ottico completo e il controllo delle condizioni ambientali, grazie alla sua natura microfluidica.
La tecnologia alla base di questa piattaforma è una tecnologia di assemblaggio sviluppata negli ultimi anni, denominata sCAPA13,14,15 (sequenziale capillarity-assisted particle assembly) che è stata integrata in una piattaforma microfluidica16. Il menisco di una goccia liquida evaporante, mentre si ritira su un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) modellato all'interno di un canale microfluidico, esercita forze capillari che intrappolano le singole particelle colloidali sospese nel liquido in pozzi micrometrici microfabbricati sul substrato (Figura 1A). Le particelle sospese vengono prima trasportate all'interfaccia aria-liquido da correnti convettive e quindi collocate nelle trappole per capillarità. Le forze capillari esercitate dal menisco in movimento agiscono su una scala più ampia rispetto alle forze coinvolte nelle interazioni particellarie.
Pertanto, il meccanismo di assemblaggio non è influenzato dal materiale, dalle dimensioni e dalle proprietà superficiali delle particelle. Parametri come la concentrazione delle particelle, la velocità del menisco, la temperatura e la tensione superficiale della sospensione sono gli unici parametri che influenzano la resa del processo di patterning. Il lettore può trovare una descrizione dettagliata dell'influenza dei suddetti parametri sul processo di patterning in13,14,15. Nella tecnologia sCAPA originale13,14,15, il processo di pattern colloidale veniva eseguito in un sistema aperto e richiedeva uno stadio piezoelettrico ad alta precisione per guidare la sospensione attraverso il modello. Questa piattaforma sfrutta una strategia diversa e consente di effettuare il patterning con apparecchiature standard generalmente utilizzate in microfluidica in ambiente controllato, riducendo così al minimo i rischi di contaminazione dei campioni.
Questa piattaforma microfluidica è stata inizialmente ottimizzata su particelle colloidali per creare matrici regolari di particelle inerti e poi applicata con successo ai batteri. Entrambe le piattaforme microfluidiche sono descritte in questo articolo (Figura 1B,C). La maggior parte delle fasi preparatorie e le apparecchiature sperimentali descritte nel protocollo sono comuni per le due applicazioni (Figura 2). Riportiamo modelli colloidali per dimostrare che la tecnica può essere utilizzata per eseguire più deposizioni sequenziali sulla stessa superficie per creare modelli complessi e multimateriali. In particolare, una singola particella è stata depositata per trappola per ogni passo per formare matrici colloidali con una geometria e una composizione specifiche, dettate esclusivamente dalla geometria e dalla sequenza di riempimento delle trappole. Per quanto riguarda il pattern batterico, vengono descritte singole deposizioni, con conseguente deposito di un batterio per trappola. Una volta che le cellule sono modellate sulla superficie, il canale microfluidico viene lavato con il mezzo per promuovere la crescita batterica, la fase preliminare di qualsiasi studio a singola cellula.
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Protocol
1. Preparazione del master del silicio
NOTA: I modelli PDMS con le trappole microfabbricate che formano il modello per il pattern colloidale e microbico sono stati fabbricati secondo il metodo introdotto da Geissler et al. 17. Il master in silicio è stato preparato con la litografia convenzionale in una camera bianca. Vedere i seguenti passaggi per la procedura e la tabella dei materiali per l'apparecchiatura.
- Progettare le funzionalità utilizzando il software CAD (Computer-Aided Design).
- Preparare la maschera in vetro cromato con uno strato di fotoresist positivo esponendo le caratteristiche progettate con una macchina laser diretta UV.
- Sviluppa la maschera in vetro cromato con uno sviluppatore di spin utilizzando uno sviluppatore con un rapporto fotoresist/acqua 1:4 per 15 s.
- Immergere la maschera in etchant al cromo per 50 s.
- Trattare al plasma un wafer di silicio da 10 cm per 3 minuti a 600 W.
- Depositare in vapore uno strato di esametildilisilizane e cuocere a 110 °C per migliorare l'adesione verso il fotoresiste.
- Depositare uno strato di fotoresist a 4.500 × g per 2 min.
- Esporre la funzione ai raggi UV attraverso la maschera in vetro cromato con un allineatore di maschere per 2 s e sviluppare con uno sviluppatore come per la maschera.
- Per completare la fabbricazione del master in silicio, incidere il wafer tramite scambio ionico reattivo profondo, regolando il tempo di incisione (<2 min) per ottenere la profondità desiderata (misurata con un profilometro).
2. Preparazione dello stampo a microcanali
- Progetta il canale con un software CAD e affettalo con un software di affettatura per convertire il modello progettato in istruzioni per la stampante 3D, impostando la distanza di taglio a 0,05 mm.
- Stampa il canale con una stampante 3D per ~ 1 ora.
- Lavare e post-polimerizzare lo stampo in una macchina dedicata alla polimerizzazione e alla lavatrice.
- Mettere lo stampo in un contenitore pieno di alcool isopropilico puro (IPA) e vorticare il liquido (lavare per 20 minuti). Estrarre il contenitore pieno di IPA dalla macchina.
- Una volta rimosso lo stampo lavato dal contenitore IPA, rimetterlo nella lavatrice e indurire e post-polimerizzarlo per 15 minuti a 35 °C.
NOTA: La Tabella dei materiali riporta la stampante 3D e la polimerizzazione e la lavatrice utilizzate nel protocollo di preparazione dello stampo. Il modello 3D è stato affettato con il software di affettatura proprietario della stampante 3D.
- Posizionare la stampa in un forno UV per 12 ore e metterla in un forno a 80 °C per 12 ore.
NOTA: questo passaggio garantisce che tutto il polimero sia polimerizzato e che tutto il polimero non polimerizzato venga rimosso dalla stampa in quanto impedirebbe la polimerizzazione del PDMS. - Silanizzare lo stampo attraverso la deposizione di vapore di tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottil) silano.
- Posizionare lo stampo 3D in un essiccatore sottovuoto insieme a 20 μL di tricloro concentrato al 100% (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottile) silano pipettato su un foglio di alluminio posto vicino allo stampo.
- Creare un vuoto nell'essiccatore per generare vapore e lasciare per 40 minuti.
- Rimuovere lo stampo dall'essiccatore e risciacquarlo con etanolo puro prima di versare PDMS su di esso.
3. Fabbricazione del chip microfluidico
- Preparare una miscela PDMS mescolando l'elastomero con il suo agente reticolante (Tabella dei materiali). Mescolare vigorosamente la miscela per fondere i due componenti in modo uniforme fino a quando non si formano bolle d'aria e la miscela PDMS appare opaca.
NOTA: la quantità di reticolante deve essere pari al 10% in peso della quantità di elastomero. - Degassare la miscela di elastomero e agente reticolante in un essiccatore sottovuoto per rimuovere le bolle d'aria intrappolate. Trasferire la miscela nell'essiccatore nel contenitore utilizzato per la miscelazione (punto 3.1). Continuare il processo di degasaggio fino a quando tutte le bolle sono state rimosse e la miscela appare di nuovo trasparente.
NOTA: il tempo tipicamente richiesto per l'essiccazione è di 30 minuti. - Versare 3 g della miscela sul master di silicio per produrre il modello, che fungerà da "pavimento" del chip microfluidico.
NOTA: lo spessore dello strato PDMS può essere regolato modificando la quantità di miscela versata sul master in silicio.- Per ottenere un modello di 400 μm di spessore, versare 3 g di PDMS sul master di silicio, posizionare il master di silicio su uno spin coater e girare il rivestimento a 21 × g per 5 s e 54 × g per 10 s, quindi degasare di nuovo come descritto al passaggio 3.2 per rimuovere le bolle d'aria intrappolate.
- Versare 20 g della miscela PDMS sullo stampo stampato in 3D per creare il microcanale, che fungerà da "tetto" del chip microfluidico, e degasarlo come descritto nel passaggio 3.2 per 30 minuti.
- Cuocere sia il wafer di silicio che lo stampo stampato in 3D a 70 °C per almeno 2 ore.
- Staccare lo strato PDMS dallo stampo stampato in 3D, tagliare il PDMS con una lama attorno ai microcanali e perforare i fori che serviranno come ingresso e uscita del canale microfluidico.
- Staccare il PDMS dal master del silicio e tagliare lo strato PDMS in pezzi più piccoli con le stesse dimensioni dei canali microfluidici che saranno incollati sopra i modelli.
- Strofinare delicatamente le sagome e i microcanali utilizzando una soluzione detergente all'1% (vedere la Tabella dei materiali) per 5 minuti e poi risciacquare con acqua deionizzata. Quindi, risciacquare i modelli e i microcanali con isopropanolo e risciacquarli con acqua deionizzata. Asciugare le sagome e i microcanali a temperatura ambiente per 1 minuto con aria compressa a 1 bar.
- Posizionare le sagome e i microcanali in un pulitore al plasma con le superfici da incollare rivolte verso l'alto. Accendere il detergente al plasma e trattare al plasma i modelli e i microcanali per 40 s. Toglieteli dal detergente al plasma e incollate immediatamente i microcanali sopra i modelli mettendoli in contatto tra loro.
- Conservare i trucioli microfluidici in un forno a 70 °C per cinque giorni per garantire il recupero idrofobo PDMS e avere un angolo di contatto sfuggente all'interno dell'intervallo ottimale, tra 30 e 60 °10,11.
4. Pattern batterico
- Un giorno prima dell'esperimento, crescere una popolazione di Escherichia coli (ceppo MG1655 prpsM-GFP). Inoculare la coltura direttamente dal brodo congelato e crescere durante la notte per 20 ore in brodo di lisogenia (LB) in un incubatore shaker a 37 °C. Aggiungere 50 μg/mL di kanamicina affinché le cellule mantengano il plasmide prpsM-GFP.
- Il giorno dell'esperimento, impostare l'incubatore a scatola (Figura 2A) a 37 °C diverse ore prima dell'esperimento per avere una temperatura uniforme e stabile prima di iniziare l'esperimento. Impostare la pompa della siringa e la lastra di vetro riscaldata sullo stadio del microscopio (Figura 2B,C), impostando la temperatura alla stessa temperatura dell'incubatore a scatola.
NOTA: L'incubatore a scatola in cui è racchiuso l'intero sistema, compreso il microscopio (Figura 2E), garantisce che venga mantenuta una temperatura uniforme e costante durante l'intero esperimento quando il canale viene lavato con il mezzo. - Novanta minuti prima dell'esperimento, metti il chip microfluidico in un recipiente pieno di etanolo al 100% (EtOH) e lava il canale con etOH al 100% per almeno 10 minuti. Posizionare il chip microfluidico in un essiccatore sottovuoto e degassare per almeno 30 minuti. Sostituire l'EtOH con acqua distillata e trattare sottovuoto il chip per almeno 30 minuti. Mettere il chip microfluidico nel forno a 70 °C per 10 minuti per rimuovere eventuali tracce di liquido lasciate nel canale.
NOTA: questo passaggio è necessario per evitare la formazione di bolle nel canale quando viene lavato con il terreno di coltura. Questo protocollo di prevenzione delle bolle è stato adattato da Wang et al.18. - Pipettare 1 mL di mezzo di acido 3-(N-morfolino)propanosolfonico (MOPS) (1x) in un flaconcino di centrifuga e aggiungere 10 μL di 0,132 M di fosfato di potassio (K2HPO4). Prelevare la coltura notturna dall'incubatore a 37 °C e aliquota 100 μL nel flaconcino della centrifuga e centrifugare la coltura a 2.300 × g per 2 minuti. Pipettare delicatamente il surnatante fuori dai flaconcini della centrifuga e risospesciare il pellet in 1 mL di terreno MOPS fresco con lo 0,015% v/v di Tween 20 e lo 0,01% v/v di fosfato di potassio.
NOTA: La concentrazione tipica della sospensione batterica è compresa tra 0,015-0,15 vol%, che assicura la formazione di una zona di accumulo estesa e mobile e impedisce l'accumulo di particelle sul substrato. La sostituzione del mezzo notturno con un mezzo fresco riduce al minimo i rischi di rilascio di film di batteri sul modello. La mancanza di fonte di carbonio nel mezzo fresco impedisce alle cellule di crescere nella sospensione durante la modellazione del modello. Una concentrazione dello 0,015% v/v di Tween 20 nella sospensione è necessaria affinché l'angolo di contatto del liquido sfuggente sul modello PDMS rientri nell'intervallo ottimale, tra 30 e 60°. - Caricare la sospensione batterica in una siringa da 1 mL e collegare la siringa al chip attraverso un tubo microfluidico.
- Per fissare il collegamento tra la siringa e il tubo, inserire direttamente un ago con un diametro esterno di 0,6 mm nel tubo. Per evitare di disperdere le sospensioni rimaste nelle vicinanze dell'ingresso attraverso il canale, lavare il mezzo fresco attraverso il foro utilizzato come uscita durante il processo di creazione della creazione (Figura 3A-III), anziché il foro utilizzato come ingresso.
- Montare la siringa sulla pompa della siringa e iniettare la sospensione nel chip microfluidico attraverso l'ingresso situato nella parte a monte del canale fino a quando la sospensione non copre la regione del modello con trappole.
NOTA: durante il processo di iniezione del liquido, l'aria può fuoriuscire attraverso un'uscita situata all'estremità a valle del canale. - Impostare la pompa della siringa per prelevare la sospensione batterica (Figura 3A-I) ad una portata di 0,07-0,2 μL/min, che nella geometria descritta corrisponde a una velocità di ritiro del menisco di 80-100 μm/min.
- Monitorare il processo di modellazione tramite il software del microscopio.
NOTA: Qui, è stato utilizzato un ingrandimento 10x per monitorare il menisco sfuggente sul modello e un ingrandimento 20x è stato utilizzato per monitorare la deposizione di singoli batteri nelle trappole microfabbricate.
- Una volta che il modello è stato modellato con celle (Figura 3A-II), aumentare la portata di prelievo per svuotare rapidamente il canale microfluidico e lavarlo con LB fresco che è stato precedentemente degassato per almeno 30 minuti e preriscaldato a 30 ° C.
- Impostare la pompa della siringa a una portata di 2 μL/min per lavare delicatamente il canale. Una volta riempito il canale, aumentare la portata (15 μL/min) in base alle specifiche esigenze sperimentali.
- Acquisire immagini di batteri in crescita all'ingrandimento desiderato e all'intervallo di tempo.
5. Pattern colloidale
- Pipettare 900 μL di una soluzione acquosa di Tween 20 allo 0,015% v/v in un flaconcino di centrifuga e pipettare 100 μL della sospensione colloidale originale in esso. Centrifugare la sospensione a 13.500 × g per 1 min. Rimuovere delicatamente il surnatante e sostituirlo con la soluzione acquosa di Tween 20 (0,015% v/v). Ripetere questo processo tre volte per garantire la sostituzione completa del solvente del fornitore dalla sospensione di magazzino.
- Caricare la sospensione colloidale in una siringa da 1 mL e collegare la siringa al chip tramite tubo microfluidico. Iniettare la sospensione nel chip microfluidico attraverso l'ingresso situato all'interno della sezione centrale, nella parte a monte del canale, e spingere gradualmente la sospensione fino a coprire il modello.
- Prelevare la sospensione colloidale ad una portata di 0,07-0,2 μL/min, che corrisponde a una velocità di ritiro del menisco di 1-2 μm/min, e visualizzare il processo di patterning tramite software al microscopio. Utilizzare l'ingrandimento 10x per monitorare il menisco sfuggente sul modello e l'ingrandimento 20x per osservare la deposizione di singole particelle nelle trappole microfabbricate. Aumentare la portata una volta che il menisco raggiunge la fine del modello per svuotare rapidamente il canale.
NOTA: matrici colloidali composte da diverse particelle possono essere prodotte eseguendo il processo di creazione di modelli dai passaggi 5.1 a 5.3 in serie. Il canale viene caricato con una nuova sospensione colloidale ad ogni iterazione in base alla composizione degli array colloidali desiderati. Ogni fase di creazione del modello aggiunge una particella all'array colloidale e può essere eseguita in sequenza fino a quando le trappole non sono state riempite con la sequenza di particelle desiderata. La composizione degli array colloidali risultanti è data esclusivamente dalla sequenza di sospensioni colloidali utilizzate per riempire le trappole (Figura 3B).
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Representative Results
È stata sviluppata una piattaforma microfluidica che sfrutta l'assemblaggio assistito dalla capillarità per modellare particelle colloidali e batteri in trappole microfabbricate su un modello PDMS. Due diverse geometrie di canale sono state progettate per ottimizzare il pattern di colloidi e batteri attraverso l'assemblaggio assistito dalla capillarità. La geometria del primo canale (Figura 1B) è costituita da tre sezioni parallele lunghe 23 mm senza barriere fisiche tra di loro. Le due sezioni sui lati sono larghe 5 mm e alte 1 mm, mentre la sezione centrale è larga 7 mm e alta 500 μm. Questo design aiuta a mantenere una goccia mobile ben definita con un menisco a forma convessa sfuggente. Il principio di funzionamento di questa piattaforma è descritto in dettaglio da Pioli et al.11. Se l'esperimento richiede il riempimento dei canali laterali, come nel caso della coltura dei batteri, di solito si formano sacche d'aria. Per questo motivo, abbiamo progettato e testato una seconda geometria che semplifica il processo di riempimento quando il canale viene lavato con il mezzo. In questo caso, la piattaforma (Figura 1C) è costituita da un singolo canale rettilineo lungo 20 mm, largo 3 mm e alto 500 μm.
La temperatura nel canale microfluidico è un parametro importante per garantire un processo di deposizione efficiente. Deve essere mantenuto a 15 °C sopra il punto di rugiada dell'acqua per evitare la condensa sul modello. La lastra di vetro riscaldata sotto il canale (Figura 2D) garantisce una temperatura uniforme attraverso la maschera per evitare la condensa durante il processo di patterning nella regione vicina all'interfaccia liquido-aria, caratterizzata da un'elevata concentrazione di vapore nell'aria. La temperatura della lastra di vetro riscaldata deve essere la stessa di quella dell'incubatore della scatola per evitare la condensa sul modello.
La geometria del canale rettilineo è stata sfruttata per modellare cellule stazionarie (Figura 4A) di un ceppo fluorescente di E. coli (MG1655 prpsM-GFP). I batteri sono stati depositati nell'83% delle 5.000 trappole analizzate. Le cellule sono state prima collocate nelle trappole secondo il protocollo presentato e successivamente coltivate per 4 ore a 37 °C in LB lavato a 10 mm/min. I batteri modellati hanno ripreso la crescita in momenti diversi entro 1,5 ore da quando il canale è stato riempito con LB fresco (Figura 4B-I), con la mediana a 44 minuti. Una volta ripresa la crescita, le singole cellule batteriche iniziano a formare singole colonie, che si espandono (Figura 4B-II) fino a formare uno strato superficiale (3,5 h) e la risoluzione di una singola cellula viene persa (Figura 4B-III).
Questo esperimento proof-of-concept mostra che l'assemblaggio assistito da capillarità in un canale microfluidico può essere utilizzato per modellare una superficie con migliaia di cellule monobatteriche vitali. Undici repliche mostrano che le cellule modellate sono cresciute nel 45,5% dei casi entro una finestra di 7 ore. Quattro test condotti aggiungendo ioduro di propidio (PI), una macchia morta viva19, al LB fresco lavato nel canale dopo la deposizione hanno dimostrato che i batteri non in crescita e modellati non si sono macchiati. Poiché la PI si lega al DNA ma non può penetrare nelle cellule con una membrana intatta, l'esperimento di colorazione PI mostra che né il processo di patterning né i processi di essiccazione e reidratazione hanno danneggiato la membrana delle cellule.
La geometria del canale a tre sezioni è stata utilizzata per produrre matrici colloidali lineari con diverse composizioni eseguendo pattern sequenziali di particelle colloidali. La Figura 5 mostra le diverse matrici colloidali formate attraverso pattern sequenziali, inclusi dimeri (Figura 5A,B) e trimeri (Figura 5C), contenenti rispettivamente due e tre particelle intrappolate sequenzialmente. Le particelle di polistirene fluorescente verde e rosso sono state utilizzate per assemblare sia dimeri che trimeri. L'analisi condotta su 55.000 trappole mostra che i dimeri verde-rosso (G-R) (Figura 5A, B) costituiti da particelle con 2 μm e 1 μm di diametro si sono formati rispettivamente nel 93% e nell'89% delle trappole analizzate. I trimeri verde-rosso-verde (G-R-G) (Figura 5C) si sono formati nel 52% delle 55.000 trappole analizzate11. Dimeri e trimeri sono stati assemblati eseguendo deposizioni sequenziali, con le sospensioni colloidali che si muovevano nella stessa direzione attraverso tutte le deposizioni sequenziali (Figura 3B). Di conseguenza, le particelle intrappolate in ogni fase di deposizione sono in contatto diretto con quelle intrappolate nella precedente.
Il posizionamento preciso delle particelle non richiede il contatto diretto tra le particelle depositate. La distanza tra le particelle modellate può essere controllata con precisione eseguendo due deposizioni in direzioni opposte, intrappolando così tali particelle alle estremità opposte di ciascuna trappola (Figura 5D). La distanza tra le particelle intrappolate può essere regolata progettando trappole con la lunghezza desiderata. Un'ulteriore possibilità offerta dalla piattaforma è la modellazione chimica della superficie con precisione micrometrica. Questo risultato può essere ottenuto modellando il modello con particelle chimicamente funzionalizzate11.
Figura 1: Geometrie dei canali microfluidici e processo di patterning. (A) Schema di una sezione laterale del canale microfluidico durante la modellazione di particelle colloidali. La sospensione liquida evapora all'interno del canale microfluidico e le correnti convettive trasportano le particelle sospese verso l'interfaccia aria-liquido. Le particelle vengono così accumulate e formano la zona di accumulo. La pompa a siringa tira la sospensione liquida, spingendola a ritirarsi e le singole particelle rimangono intrappolate durante la recessione liquida sul modello. La freccia rappresenta la direzione in cui si muove la sospensione. (B) Schema della geometria del canale utilizzata per modellare le particelle colloidali sul modello PDMS. Il canale è lungo 23 mm e largo 17 mm ed è composto da tre sezioni: una centrale larga 7 mm e due laterali larghe 5 mm. Il modello si trova sul pavimento del canale, all'interno della sezione centrale. La sezione trasversale mostra che la sezione centrale del canale microfluidico, dove la sospensione liquida è confinata durante tutto il processo di patterning, è la parte più bassa del canale ed è alta 500 μm, mentre le due sezioni laterali sono entrambe alte 1 mm. (C) Schema della geometria del canale rettilineo utilizzata per modellare i batteri. Il dispositivo microfluidico è costituito da un canale dritto lungo 20 mm, largo 3 mm e alto 500 μm. La sezione rettangolare di questo dispositivo microfluidico, mostrata nella sezione trasversale, semplifica il processo di riempimento del canale con il mezzo. L'immagine SEM mostra una piccola porzione del modello PDMS con trappole microfabbricate da 2 μm di lunghezza, 1 μm di larghezza e 500 nm di profondità. Barra della scala = 2 μm. Abbreviazioni: PDMS = polidimetilsilossano; SEM = microscopia elettronica a scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema della piattaforma per l'assemblaggio sequenziale assistito da capillarità in un canale microfluidico. (A) Incubatore di scatole. L'incubatore a scatola mantiene una temperatura uniforme e costante (qui, 30 °C) all'interno del canale microfluidico. (B) Siringa caricata con sospensione liquida. La siringa è controllata da una pompa a siringa (non mostrata) e viene utilizzata per controllare il movimento del liquido durante il processo di patterning. (C) Lastra di vetro riscaldata. La lastra di vetro riscaldata è posizionata sotto il canale microfluidico e garantisce una temperatura uniforme (qui, 30 ° C) attraverso la matrice, che è fondamentale per evitare la condensa in prossimità dell'interfaccia aria-liquido. (D) Chip microfluidico caricato con una sospensione liquida. Il pavimento del chip microfluidico porta le trappole in cui batteri e colloidi vengono modellati durante il processo di modellazione. (E) Microscopio. La lastra di vetro riscaldata e il chip microfluidico sono posizionati su uno stadio di microscopio, garantendo un accesso ottico completo durante il processo di modellazione e tutte le fasi successive. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Schema delle fasi coinvolte nel pattern batterico e colloidale. Ogni pannello mostra una vista interna del canale microfluidico e include solo una piccola parte del modello PDMS. (A) Patterning dei batteri attraverso l'assemblaggio assistito dalla capillarità. (I) La sospensione batterica evapora all'interno del canale microfluidico, causando correnti convettive per trasportare i batteri sospesi all'interfaccia aria-liquido, formando così la zona di accumulo. Nel frattempo, la sospensione viene tirata dalla pompa della siringa e si ritira sul modello. La freccia rappresenta la direzione in cui si muove la sospensione batterica. La sospensione sfuggente attraversa il modello e le singole cellule vengono depositate nelle trappole microfabbricate. (II) I batteri depositati sono esposti all'aria fino a quando il canale non viene lavato con mezzo fresco. Il processo di deposizione è terminato quando la sospensione liquida raggiunge la fine del modello. (III) Il canale microfluidico viene lavato con mezzo fresco (cioè LB). La freccia rappresenta la direzione in cui viene lavato il mezzo fresco. (B) Patterning di particelle colloidali attraverso assemblaggio sequenziale assistito da capillarità. (I) La sospensione colloidale si ritira sulla sagoma durante l'evaporazione e le particelle si accumulano all'interfaccia aria-liquido, formando la zona di accumulo. Le singole particelle vengono depositate nelle trappole microfabbricate sul modello. La freccia rappresenta la direzione in cui si muove la sospensione colloidale. (II) Il processo di deposizione è completo quando la sospensione liquida raggiunge la fine del modello. (III) Una seconda deposizione viene eseguita nella stessa direzione della prima deposizione per posizionare una seconda particella in ogni trappola sul modello. (IV) Una volta terminata la seconda deposizione, il modello viene modellato con dimeri di una particella verde e una rossa. Abbreviazioni: PDMS = polidimetilsilossano; LB = brodo di lisogenesi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Modello PDMS modellato con cellule E. coli (ceppo MG1655 prpsM-GFP). (A) Immagine SEM di singole cellule di E. coli intrappolate in trappole lunghe 2 μm, larghe 1 μm e profonde 500 nm. Le cellule sono rimaste intrappolate dopo una singola deposizione. Barra di scala = 2 μm. (B) Immagini di epifluorescenza di una piccola porzione del modello PDMS (circa 80 μm x 80 μm) con cellule intrappolate di E. coli dopo che il canale microfluidico è stato riempito con terreno di coltura (brodo di lisogenesi) ad una velocità iniziale di 1,3 mm / min, che viene poi aumentata a 10 mm / min. Le cellule intrappolate crescono e si dividono più volte per 4 ore, fondendosi infine con le cellule delle trappole vicine e coprendo la superficie. Barre della scala = 10 μm. Abbreviazioni: PDMS = polidimetilsilossano; GFP = proteina fluorescente verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Ammassi colloidali assemblati attraverso l'assemblaggio sequenziale di particelle assistito dalla capillarità nella piattaforma microfluidica (geometria del primo canale). Immagine al microscopio a epifluorescenza di (A) 15 dimeri assemblati da particelle di polistirene con 2 μm di diametro con due deposizioni sequenziali. (B) Dimeri (n = 15) assemblati da particelle di polistirene con 1 μm di diametro con due deposizioni sequenziali. (C) Trimeri (n = 15) assemblati da particelle di polistirene con 1 μm di diametro con tre deposizioni sequenziali. (D) Trappole (n = 15) con particelle modellate alle estremità di ciascuna trappola eseguendo due deposizioni sequenziali in direzioni opposte. La distanza tra le particelle in una trappola è di 2 μm. Barre di scala = 4 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La piattaforma microfluidica qui descritta consente la modellazione di oggetti di dimensioni micro, come colloidi e batteri, in disposizioni spaziali prescritte su un substrato PDMS. Il pieno controllo sulle condizioni ambientali offerto dalla microfluidica e la capacità di modellare le cellule con precisione micrometrica garantita dalla tecnologia sCAPA lo rendono una piattaforma molto promettente per futuri studi di fisiologia ed ecologia.
Negli esperimenti presentati in questo lavoro, il master in silicio è stato realizzato utilizzando il fotoresist riportato nella Tabella dei Materiali. Tuttavia, potrebbe essere utilizzato qualsiasi fotoresist adatto a produrre caratteristiche nella gamma di dimensioni descritte e utilizzabile con lo stampaggio PDMS. Lo stesso vale per la resina di stampa 3D utilizzata per preparare lo stampo a microcanali. Potrebbe essere utilizzata qualsiasi resina in grado di produrre caratteristiche della dimensione descritta e compatibile con lo stampaggio PDMS.
In questo protocollo, la conservazione dei chip microfluidici a 70 °C per 5 giorni ottimizza l'idrofilia superficiale (angolo di contatto che cade tra 30 e 60°) quando Tween 20 viene aggiunto alla sospensione batterica o colloidale. Questa procedura garantisce la migliore riproducibilità per l'angolo di contatto sfuggente in queste condizioni sperimentali; tuttavia, anche altri tempi e temperature di conservazione possono funzionare.
Sono state presentate due applicazioni di questa tecnica microfluidica: 1) pattern batterico che coinvolge singole deposizioni di cellule batteriche nelle trappole sul substrato PDMS e 2) pattern colloidale che coinvolge deposizioni sequenziali di colloidi, ottenendo matrici colloidali di diverse composizioni. Questa piattaforma è stata completamente ottimizzata per garantire alte rese di deposizione batterica, con migliaia di cellule modellate sul modello PDMS. La combinazione di assemblaggio assistito da capillarità e microfluidica garantisce una risoluzione unicellulare e un flusso stabile di nutrienti per diverse ore, con accesso ottico completo durante tutto il processo. Le cellule modellate sono in grado di riprendere la crescita una volta che il canale microfluidico viene lavato con mezzo fresco, anche se la vitalità delle cellule modellate deve ancora essere ottimizzata.
Attualmente, il principale limite di questa tecnica è la mancanza di crescita di cellule modellate nel 54,5% degli esperimenti all'interno di una finestra di 7 ore. Questo aspetto può essere correlato alle specifiche specie batteriche e deve essere ulteriormente studiato per determinare la causa principale dello stress che impedisce alle cellule di ricrescere. L'esposizione all'aria e la forza esercitata dal menisco durante il processo di patterning possono essere tra i principali contributori allo stress batterico. Diverse possibili soluzioni possono essere implementate per ridurre tali fonti di stress, incluso l'uso di trappole più profonde per ridurre la forza applicata sulle cellule dal menisco durante il processo di patterning. Un'ulteriore opzione per ridurre lo stress associato all'esposizione all'aria sarebbe quella di diminuire la temperatura della lastra di vetro riscaldata. Una temperatura di 30 °C garantisce una velocità di evaporazione sufficiente della sospensione liquida durante il processo di patterning e ridurrebbe il calore a cui i batteri sono esposti dopo che sono stati modellati sul modello prima che il fluido venga lavato.
Una volta completamente ottimizzata, prevediamo che questa piattaforma sarà utilizzata in una varietà di studi biologici che coinvolgono l'analisi quantitativa di singole cellule. La natura ad alto rendimento della tecnica consente la modellazione di migliaia di cellule, fornendo grandi statistiche all'interno della stessa arena sperimentale. L'accesso ottico completo consente di tracciare il comportamento, la crescita e le attività molecolari di un gran numero di singoli microrganismi nel tempo, fornendo così importanti vantaggi nello studio dell'eterogeneità fenotipica in condizioni ambientali omogenee. La natura microfluidica di questa piattaforma garantisce la piena controllabilità delle condizioni ambientali come la composizione dei fluidi, la portata e la temperatura, solo per citarne alcuni.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il sostegno della sovvenzione SNSF PRIMA 179834 (a E.S.), una sovvenzione di ricerca ETH ETH-15 17-1 (R. S.) e un Gordon and Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (sovvenzione GBMF9197) (R. S.). Gli autori ringraziano il Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (Università di Granada, Spagna) per l'imaging SEM dei batteri e per le discussioni approfondite. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Jen Nguyen (Università della British Columbia, Canada), la Dott.ssa Laura Alvarez (ETH zurigo, Svizzera), Cameron Boggon (ETH Zurigo, Svizzera) e il Dott. Fabio Grillo per le discussioni approfondite.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
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