Summary
Vi presenterar en teknik som använder kapillärassisterad montering i en mikrofluidisk plattform för att mönster mikrostora föremål upphängda i en vätska, såsom bakterier och kolloider, i föreskrivna matriser på ett polydimethylsiloxan substrat.
Abstract
Kontrollerad mönstra av mikroorganismer i definierade rumsliga arrangemang erbjuder unika möjligheter för ett brett spektrum av biologiska tillämpningar, inklusive studier av mikrobiell fysiologi och interaktioner. På den enklaste nivån skulle noggrann rumslig mönstra av mikroorganismer möjliggöra tillförlitlig, långsiktig avbildning av ett stort antal enskilda celler och omvandla förmågan att kvantitativt studera avståndsberoende mikrob-mikrobinteraktioner. Mer unikt är att koppling av noggrann rumslig mönstra och full kontroll över miljöförhållanden, som erbjuds av mikrofluidisk teknik, skulle ge en kraftfull och mångsidig plattform för encelliga studier i mikrobiell ekologi.
Detta dokument presenterar en mikrofluidisk plattform för att producera mångsidiga och användardefinierade mönster av mikroorganismer inom en mikrofluidisk kanal, vilket möjliggör fullständig optisk åtkomst för långsiktig övervakning med hög genomströmning. Denna nya mikrofluidiska teknik är baserad på kapillärassisterad partikelmontering och utnyttjar kapillärkrafterna som härrör från den kontrollerade rörelsen hos en avdunstningsfjädring inuti en mikrofluidisk kanal för att deponera enskilda mikrosiserade föremål i en rad fällor som mikrofabriceras på ett polydimethylsiloxan (PDMS) substrat. Sekventiella depositioner genererar önskad rumslig layout för enstaka eller flera typer av mikrostora objekt, dikterade enbart av fällornas geometri och fyllningssekvensen.
Plattformen har kalibrerats med hjälp av kolloidala partiklar av olika dimensioner och material: den har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att generera olika kolloidala mönster och utföra ytfunktionalisering av fångade partiklar. Dessutom testades plattformen på mikrobiella celler, med Escherichia coli-celler som modellbakteri. Tusentals enskilda celler mönstrades på ytan, och deras tillväxt övervakades över tiden. I denna plattform möjliggör kopplingen av encellsdeposition och mikrofluidisk teknik både geometrisk mönstra av mikroorganismer och exakt kontroll av miljöförhållanden. Det öppnar således ett fönster in i fysiologin hos enskilda mikrober och ekologin hos mikrobmikroberinteraktioner, vilket framgår av preliminära experiment.
Introduction
Rumslig mönstra av enskilda mikroorganismer, särskilt inom experimentella arenor som möjliggör full kontroll över miljöförhållanden, såsom mikrofluidiska anordningar, är mycket önskvärd i ett brett spektrum av sammanhang. Till exempel skulle arrangera mikroorganismer i regelbundna matriser möjliggöra korrekt avbildning av ett stort antal enskilda celler och studier av deras tillväxt, fysiologi, genuttryck som svar på miljöstimuli och läkemedelskänslighet. Det skulle också göra det möjligt att studera cellcellsinteraktioner av särskilt intresse för forskning om cellulär kommunikation (t.ex. kvorumavkänning), korsmatning (t.ex. alg-bakteriell symbios) eller antagonism (t.ex. allelopathy), med full kontroll över den rumsliga lokaliseringen av celler i förhållande till varandra. Cellfysiologi och evolutionsstudier1, cell-cellinteraktionsstudier2, fenotypisk differentieringsscreening3, miljöövervakning4 och läkemedelsscreening5 är några av de områden som kan dra stor nytta av en teknik som kan uppnå sådan kvantitativ encellsanalys.
Flera strategier för att isolera och hantera enskilda celler har föreslagits under de senaste åren, från holografiska optiska fällor6 och heterogena ytfunktionaliseringsmetoder7,8,9,10 till encelliga chemostats11 och droplet microfluidics12. Dessa metoder är antingen tekniskt mycket krävande eller påverkar cellfysiologi och misslyckas med att tillhandahålla en plattform med hög genomströmning för att mönstermikrober som kan studeras under långa perioder, vilket säkerställer encellsupplösning, fullständig optisk åtkomst och kontroll över miljöförhållanden. Målet med detta dokument är att beskriva en plattform för att mönster bakterier med mikrometrisk precision i föreskrivna rumsliga arrangemang på en PDMS-yta genom kapillärstödd montering. Denna plattform möjliggör exakt och flexibel rumslig mönskning av mikrober och möjliggör full optisk åtkomst och kontroll över miljöförhållanden, tack vare dess mikrofluidiska natur.
Tekniken bakom denna plattform är en monteringsteknik som utvecklats under de senaste åren, kallad sCAPA13,14,15 (sekventiell kapillärstödd partikelmontering) som integrerades i en mikrofluidisk plattform16. Menisken hos en avdunstning flytande droppe, samtidigt som den avtar över ett mönstrat polydimethylsiloxan (PDMS) substrat inuti en mikrofluidisk kanal, utövar kapillärkrafter som fångar de enskilda kolloidala partiklarna upphängda i vätskan i mikrometriska brunnar mikrofabricerade på substratet (figur 1A). Suspenderade partiklar transporteras först till luft-vätskegränssnittet av konvektiva strömmar och placeras sedan i fällorna av kapillärhet. Kapillärkrafter som utövas av den rörliga menisken verkar i större skala jämfört med krafter involverade i partikelinteraktioner.
Monteringsmekanismen påverkas således inte av partiklarnas material, dimensioner och ytegenskaper. Parametrar som partikelkoncentration, meniskens hastighet, temperatur och ytspänningen i suspensionen är de enda parametrarna som påverkar mönstraringsprocessens utbyte. Läsaren kan hitta en detaljerad beskrivning av de ovan nämnda parametrarnas påverkan på mönseringsprocessen i 13,14,15. I den ursprungliga sCAPA-tekniken13,14,15 utfördes den kolloidala mönstraringsprocessen i ett öppet system och krävde ett piezoelektriskt stadium med hög precision för att driva fjädringen över mallen. Denna plattform utnyttjar en annan strategi och gör det möjligt att utföra mönstrar med standardutrustning som vanligtvis används i mikrofluidik i en kontrollerad miljö, vilket minimerar riskerna för att förorena proverna.
Denna mikrofluidiska plattform optimerades först på kolloidala partiklar för att skapa regelbundna matriser av inerta partiklar och sedan framgångsrikt appliceras på bakterier. Båda mikrofluidiska plattformarna beskrivs i detta dokument (figur 1B,C). De flesta förberedande stegen och den experimentella utrustning som beskrivs i protokollet är gemensamma för de två tillämpningarna (figur 2). Vi rapportera kolloidal mönstrar för att visa att tekniken kan användas för att utföra flera sekventiella depositioner på samma yta för att skapa komplexa, multimaterial mönster. I synnerhet deponerades en enda partikel per fälla för varje steg för att bilda kolloidala matriser med en specifik geometri och sammansättning, endast dikterad av fällornas geometri och fyllningssekvens. När det gäller bakteriell mönstrad beskrivs enskilda depositioner, vilket resulterar i att en bakterie deponeras per fälla. När cellerna är mönstrade på ytan spolas den mikrofluidiska kanalen med medium för att främja bakterietillväxt, det preliminära steget i en encellsstudie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Silikonmästare förberedelse
OBS: PDMS-mallarna med de mikrofabricerade fällorna som utgör mallen för kolloidal och mikrobiell mönstrad tillverkades enligt den metod som introducerades av Geissler m.fl. 17. Kiselmästaren förbereddes av konventionell litografi i ett renrum. Se följande steg för proceduren och materialförteckningen för utrustningen.
- Designa funktionerna med hjälp av CAD-programvara (Computer-Aided Design).
- Förbered kromglasmasken med ett lager av positiv fotoresist genom att exponera de designade funktionerna med en UV-direkt laserförfattare.
- Utveckla kromglasmasken med en spinnutvecklare med en utvecklare på 1:4 photoresist till vattenförhållande för 15 s.
- Sänk ner masken i kromets ets i 50 s.
- Plasmabehandla en 10 cm kiselskiva i 3 min vid 600 W.
- Ångdeponera ett lager hexamethyldisilizane och baka vid 110 °C för att förbättra vidhäftningen mot fotoresisten.
- Sätt in ett lager av photoresist på 4 500 × g i 2 min.
- Exponera funktionen för UV genom kromglasmasken med en maskjusterare i 2 s och utvecklas med en utvecklare som för masken.
- För att slutföra tillverkningen av kiselmästaren, etsa skivan via djup reaktiv jonutbyte, justera etsningstiden (<2 min) för att uppnå önskat djup (mätt med en profilometer).
2. Mikrokanal mögelberedning
- Designa kanalen med CAD-programvara och skiva den med en utsnittsprogramvara för att konvertera den utformade modellen till instruktioner för 3D-skrivaren och ställa in skivavståndet på 0,05 mm.
- Skriv ut kanalen med en 3D-skrivare i ~1 h.
- Tvätta och postcure formen i en dedikerad härdnings- och tvättmaskin.
- Lägg formen i en behållare fylld med ren isopropylalkohol (IPA) och virvla vätskan (tvätta i 20 min). Ta ut behållaren fylld med IPA ur maskinen.
- När den tvättade formen har avlägsnats från IPA-behållaren, lägg tillbaka den i tvätt- och härdningsmaskinen och postcure den i 15 min vid 35 °C.
OBS: Materialregistret rapporterar 3D-skrivaren och härdnings- och tvättmaskinen som används i mögelberedningsprotokollet. 3D-modellen skars upp med 3D-skrivarens egenutvecklade utsnittsprogram.
- Placera trycket i en UV-ugn i 12 timmar och placera det i en ugn vid 80 °C i 12 timmar.
OBS: Detta steg säkerställer att all polymer härdas och att all ocured polymer avlägsnas från trycket eftersom det skulle förhindra PDMS från härdning. - Silanisera formen genom ångdeposition av triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyl) silan.
- Placera 3D-formen i en vakuumavsickering tillsammans med 20 μL 100% koncentrerad Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorotyl) silan pipetted på en aluminiumfolie placerad nära formen.
- Skapa ett vakuum i avsickatorn för att generera ånga och lämna i 40 min.
- Ta bort formen från avsiccatorn och skölj den med ren etanol innan du häller PDMS på den.
3. Tillverkning av det mikrofluidiska chipet
- Förbered en PDMS-blandning genom att blanda elastomeren med dess tvärbindningsmedel (Table of Materials). Rör om blandningen kraftigt för att blanda de två komponenterna jämnt tills luftbubblor bildas och PDMS-blandningen ser ogenomskinlig ut.
OBS: Mängden cross-linker bör vara 10% i vikt av mängden elastomer. - Avgasa blandningen av elastomer och tvärbindningsmedel i en vakuumavsick för att avlägsna de fångade luftbubblorna. Överför blandningen i avsickatorn till behållaren som används för blandning (steg 3.1). Fortsätt avgasningsprocessen tills alla bubblor har tagits bort och blandningen ser genomskinlig ut igen.
Obs: Den tid som vanligtvis krävs för uttorkning är 30 min. - Häll 3 g av blandningen på kiselmästaren för att producera mallen, som kommer att fungera som "golvet" i det mikrofluidiska chipet.
OBS: Tjockleken på PDMS-skiktet kan justeras genom att ändra mängden blandning som hälls på kiselmästaren.- För att få en 400 μm tjock mall, häll 3 g PDMS på kiselmästaren, placera kiselmästaren på en spinnlack och snurra kappan vid 21 × g i 5 s och 54 × g i 10 s och sedan degas igen enligt beskrivningen i steg 3.2 för att avlägsna fångade luftbubblor.
- Häll 20 g av PDMS-blandningen på den 3D-utskrivna formen för att göra mikrokanal, som kommer att fungera som "taket" på det mikrofluidiska chipet, och avgasa det enligt beskrivningen i steg 3.2 i 30 min.
- Grädda både kiselskivan och den 3D-printade formen vid 70 °C i minst 2 timmar.
- Skala av PDMS-skiktet från den 3D-utskrivna formen, skär PDMS med ett blad runt mikrokanalerna och stansa hålen som kommer att fungera som inlopp och utlopp av den mikrofluidiska kanalen.
- Skala av PDMS från kiselhanteraren och skär PDMS-skiktet i mindre bitar med samma dimensioner av de mikrofluidiska kanalerna som kommer att bindas ovanpå mallarna.
- Gnugga försiktigt mallarna och mikrokanalerna med en 1% tvättmedelslösning (se materialtabellen) i 5 min och skölj sedan med avjoniserat vatten. Skölj sedan mallarna och mikrokanalerna med isopropanol och skölj dem med avjoniserat vatten. Torka mallarna och mikrokanalerna i rumstemperatur i 1 min med tryckluft vid 1 bar.
- Placera mallarna och mikrokanalerna i en plasmarengörare med ytorna som ska bindas uppåt. Slå på plasmarengöraren och plasma behandla mallarna och mikrokanalerna i 40 s. Ta ut dem från plasmarengöraren och bind omedelbart mikrokanalerna ovanpå mallarna genom att sätta dem i kontakt med varandra.
- Förvara de mikrofluidiska spånorna i en ugn vid 70 °C i fem dagar för att säkerställa PDMS hydrofobiska återhämtning och ha en avtagande kontaktvinkel inom det optimala intervallet, mellan 30 och 60°10,11.
4. Bakteriell mönstra
- En dag före experimentet, odla en population av Escherichia coli (stam MG1655 prpsM-GFP). Inokulera kulturen direkt från det frusna beståndet och odla över natten i 20 timmar i lysogent buljong (LB) medium i en shakerinkubator vid 37 °C. Tillsätt 50 μg/ml kanamycin för cellerna för att behålla prpsM-GFP-plasmiden.
- På experimentdagen ställer du in lådinkubatorn (figur 2A) till 37 °C flera timmar före experimentet för att ha en jämn och stabil temperatur innan experimentet påbörjas. Ställ in sprutpumpen och den uppvärmda glasplattan på mikroskopstadiet (figur 2B,C) och ställ in temperaturen vid samma temperatur som boxinkubatorn.
OBS: Kartonginkubatorn där hela systemet, inklusive mikroskopet (figur 2E), är innesluten säkerställer att en jämn och konstant temperatur upprätthålls under hela experimentet när kanalen spolas med medium. - Nittio minuter före experimentet, lägg det mikrofluidiska chipet i ett kärl fyllt med 100% etanol (EtOH) och spola kanalen med 100% EtOH i minst 10 min. Placera det mikrofluidiska chipet i en vakuumavsickering och degas i minst 30 minuter. Byt ut EtOH mot destillerat vatten och dammsug chipet i minst 30 minuter. Sätt det mikrofluidiska chipet i ugnen vid 70 °C i 10 minuter för att avlägsna eventuella spår av vätska kvar i kanalen.
OBS: Detta steg är nödvändigt för att förhindra bubbelbildning i kanalen när det spolas med odlingsmedium. Detta bubbelförebyggande protokoll anpassades från Wang et al.18. - Pipett 1 ml 3-(N-morpholino)propansulfonsyra (MOPS) medium (1x) i en centrifugflaska och tillsätt 10 μL 0,132 M kaliumfosfat (K2HPO4). Ta över natten kulturen ur inkubatorn 37 °C och alikvot 100 μL i centrifugflaskan och centrifugera kulturen vid 2 300 × g i 2 min. Rör försiktigt ut supernatanten ur centrifugflaskan och återutnyttja pelleten i 1 ml färskt MOPS-medium med 0,015 % v/v Tween 20 och 0,01 % v/v kaliumfosfat.
OBS: Den typiska koncentrationen av bakteriesuspensionen ligger i intervallet 0,015-0,15 vol%, vilket säkerställer bildandet av en förlängd och mobil ackumuleringszon och förhindrar ackumulering av partiklar på substratet. Att ersätta nattmediet med färskt medium minimerar riskerna med att släppa filmer av bakterier på mallen. Bristen på kolkälla i det färska mediet förhindrar att celler växer i suspensionen under mallmönster. En koncentration på 0,015% v/v Tween 20 i suspensionen är nödvändig för att kontaktvinkeln för den avtagande vätskan på PDMS-mallen ska falla inom det optimala intervallet, mellan 30 och 60°. - Ladda bakteriesuspensionen i en 1 ml-spruta och anslut sprutan till chipet genom mikrofluidrör.
- För att säkra anslutningen mellan sprutan och slangen, sätt direkt in en nål med en ytterdiameter på 0,6 mm i slangen. För att undvika att någon fjädring som finns kvar i inloppsområdet över kanalen sprids, spola friskt medium genom hålet som används som utlopp under mönskningsprocessen (figur 3A-III), snarare än hålet som används som inlopp.
- Montera sprutan på sprutpumpen och injicera suspensionen i det mikrofluidiska chipet genom inloppet som ligger vid kanalens uppströms del tills suspensionen täcker mallområdet med fällor.
OBS: Under vätskeinsprutningsprocessen kan luft komma ut genom ett utlopp som ligger i kanalens nedströms ände. - Ställ in sprutpumpen så att bakteriefjädringen (figur 3A-I) drar tillbaka bakteriesusen med en flödeshastighet på 0,07-0,2 μL/min, vilket i den beskrivna geometrin motsvarar en menisk avtagande hastighet på 80-100 μm/min.
- Övervaka mönstrarprocessen via mikroskopprogramvara.
OBS: Här användes en 10x förstoring för att övervaka den avtagande menisken på mallen, och en 20x förstoring användes för att övervaka nedfallet av enskilda bakterier i de mikrofabricerade fällorna.
- När mallen har mönstrats med celler (figur 3A-II), öka uttagets flöde för att snabbt tömma den mikrofluidiska kanalen och spola den med färsk LB som tidigare avgasades i minst 30 min och förvarnades vid 30 °C.
- Ställ in sprutpumpen på en flödeshastighet på 2 μL/min för att försiktigt spola kanalen. När kanalen har fyllts, öka flödet (15 μL/min) enligt de specifika experimentella behoven.
- Skaffa bilder av växande bakterier vid önskad förstoring och tidsintervall.
5. Kolloidal mönstra
- Pipett 900 μL av en 0,015 % v/v Tween 20 vattenlösning i en centrifugflaska och pipett 100 μL av den ursprungliga kolloidala suspensionen i den. Centrifugera suspensionen vid 13 500 × g i 1 min. Ta försiktigt bort supernatanten och byt ut den mot vattenlösningen Tween 20 (0,015% v/v). Upprepa denna process tre gånger för att säkerställa fullständig ersättning av leverantörens lösningsmedel från lagerupphängningen.
- Ladda den kolloidala suspensionen i en 1 ml-spruta och anslut sprutan till chipet genom mikrofluidrör. Injicera suspensionen i det mikrofluidiska chipet genom inloppet som ligger i den centrala delen, vid kanalens uppströms del, och tryck gradvis suspensionen tills mallen är täckt.
- Dra tillbaka den kolloidala suspensionen med en flödeshastighet på 0,07-0,2 μL/min, vilket motsvarar en menisk avtagande hastighet på 1-2 μm/min, och avbilda mönstrarprocessen via mikroskopprogramvara. Använd 10x förstoring för att övervaka den avtagande menisken på mallen och 20x förstoring för att observera nedfallet av enskilda partiklar i de mikrofabricerade fällorna. Öka flödet när menisken når slutet av mallen för att tömma kanalen snabbt.
OBS: Kolloidala matriser bestående av flera partiklar kan produceras genom att köra mönstraringsprocessen från steg 5.1 till 5.3 i serie. Kanalen är laddad med en ny kolloidal suspension vid varje iteration enligt önskade kolloidala matrisers sammansättning. Varje mönstrande steg lägger till en partikel till kolloidal matrisen och kan köras sekventiellt tills fällorna har fyllts med önskad partikelsekvens. Sammansättningen av de resulterande kolloidala matriserna ges endast av sekvensen av kolloidala suspensioner som används för att fylla fällorna (figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mikrofluidisk plattform som utnyttjar kapillärassisterad montering för att mönster kolloidala partiklar och bakterier till fällor som mikrofabricerats på en PDMS-mall utvecklades. Två olika kanalgeometrier har utformats för att optimera mönstraring av kolloider och bakterier genom den kapillärstödda enheten. Den första kanalgeometrin (figur 1B) består av tre 23 mm långa parallella sektioner utan fysisk barriär mellan dem. De två sektionerna på sidorna är 5 mm breda och 1 mm höga, medan den centrala delen är 7 mm bred och 500 μm hög. Denna design hjälper till att upprätthålla en väldefinierad rörlig droppe med en avtagande konvexformad menisk. Arbetsprincipen för denna plattform beskrivs i detalj av Pioli et al.11. Om experimentet kräver att sidokanalerna fylls, som vid bakterieodling, bildas vanligtvis luftfickor. Av denna anledning designade och testade vi en andra geometri som förenklar fyllningsprocessen när kanalen spolas med medium. I detta fall består plattformen (figur 1C) av en enda 20 mm lång, 3 mm bred och 500 μm hög rak kanal.
Temperaturen i den mikrofluidiska kanalen är en viktig parameter för att säkerställa en effektiv deponeringsprocess. Den skall hållas 15 °C ovanför daggpunkten för att undvika kondens på mallen. Den uppvärmda glasplattan under kanalen (figur 2D) säkerställer en enhetlig temperatur över mallen för att förhindra kondens under mönskningsprocessen i området nära vätskeluftgränssnittet, kännetecknat av en hög ångkoncentration i luften. Temperaturen på den uppvärmda glasplattan måste vara densamma som för boxinkubatorn för att undvika kondens på mallen.
Den raka kanalgeometrin utnyttjades för att mönster stationära faser celler (figur 4A) av en fluorescerande E. coli stam (MG1655 prpsM-GFP). Bakterier deponerades i 83% av de 5 000 analyserade fällorna. Cellerna placerades först i fällorna enligt det presenterade protokollet och odlades därefter i 4 h vid 37 °C i LB spolades vid 10 mm/min. Mönstrade bakterier återupptog tillväxten vid olika tidpunkter inom 1,5 timmar från när kanalen fylldes med färsk LB (figur 4B-I), med medianvärdet vid 44 min. När tillväxten har återupptagits börjar enstaka bakterieceller bilda enskilda kolonier, som expanderar (figur 4B-II) tills ett ytskikt bildas (3,5 h) och encellsupplösningen går förlorad (figur 4B-III).
Detta proof-of-concept experiment visar att kapillär-assisterad montering i en mikrofluidisk kanal kan användas för att mönster en yta med tusentals livskraftiga en-bakterier celler. Elva replikat visar att mönstrade celler växte i 45,5% av fallen inom ett 7 h fönster. Fyra tester som utförts med tillsats av propidiumjodid (PI), en levande död fläck19, till den färska LB som spolats in i kanalen efter att nedfallet visat att icke-växande, mönstrade bakterier inte blev färgade. Eftersom PI binder till DNA men inte kan penetrera celler med ett intakt membran visar PI-färgningsexperimentet att varken mönskningsprocessen eller uttorknings- och rehydreringsprocesserna skadade cellernas membran.
Tre-avsnitt kanal geometri användes för att producera linjära kolloidal matriser med olika kompositioner genom att utföra sekventiell mönstraring av kolloidala partiklar. Figur 5 visar de olika kolloidala matriser som bildas genom sekventiell mönstra, inklusive dimers (figur 5A, B) och trimers (figur 5C), som innehåller två respektive tre sekventiellt fångade partiklar. Gröna och röda fluorescerande polystyrenpartiklar användes för att montera både dimers och trimers. Analyser som utförts över 55 000 fällor visar att grönröda (G-R) dimers (figur 5A, B) gjorda av partiklar med 2 μm och 1 μm i diameter bildades i 93% respektive 89% av analyserade fällor. Grön-röd-gröna (G-R-G) trimers (figur 5C) bildades i 52% av de 55 000 analyserade fällorna11. Dimers och trimers monterades genom att köra sekventiella depositioner, med kolloidala suspensioner rör sig i samma riktning över alla sekventiella depositioner (figur 3B). Som ett resultat är partiklar som fångas i varje deponeringssteg i direkt kontakt med de som fångats i det föregående.
Exakt positionering av partiklar kräver inte direkt kontakt mellan deponerade partiklar. Avståndet mellan mönstrade partiklar kan styras exakt genom att utföra två nedfall i motsatta riktningar, vilket fångar sådana partiklar i motsatta ändar av varje fälla (figur 5D). Avståndet mellan de fångade partiklarna kan justeras genom att designa fällor med önskad längd. En ytterligare möjlighet som erbjuds av plattformen är kemisk mönstra av ytan med mikrometrisk precision. Detta resultat kan uppnås genom att mönstra mallen med kemiskt funktionaliserade partiklar11.
Figur 1: Mikrofluidiska kanalers geometrier och mönstrarprocess. A) Schemat för en sidovysektion av den mikrofluidiska kanalen under mönstraring av kolloidala partiklar. Vätskefjädringen avdunstar inuti den mikrofluidiska kanalen, och konvektiva strömmar transporterar suspenderade partiklar mot luft-vätskegränssnittet. Partiklar ackumuleras därmed och bildar ackumuleringszonen. Sprutpumpen drar i vätskeupphängningen, vilket får den att dra sig tillbaka, och enskilda partiklar fastnar under vätskenedgången på mallen. Pilen representerar den riktning i vilken fjädringen rör sig. (B) Schematisk av den kanalgeometri som används för att mönstra kolloidala partiklar på PDMS-mallen. Kanalen är 23 mm lång och 17 mm bred och består av tre sektioner: en central som är 7 mm bred och två laterala som är 5 mm breda. Mallen finns på kanalens golv, inom den centrala delen. Tvärsnittet visar att den centrala delen av den mikrofluidiska kanalen, där vätskefjädringen är begränsad under hela mönskningsprocessen, är den grundaste delen av kanalen och är 500 μm hög, medan de två laterala sektionerna båda är 1 mm höga. C) Schematisk av den raka kanalgeometri som används för att mönstera bakterier. Den mikrofluidiska enheten består av en 20 mm lång, 3 mm bred och 500 μm hög rak kanal. Den rektangulära delen av denna mikrofluidiska enhet, som visas i tvärsnittet, förenklar kanalens fyllningsprocess med medium. SEM-bilden visar en liten del av PDMS-mallen med 2 μm långa, 1 μm breda och 500 nm djupa fällor mikrofabricerade på den. Skalstång = 2 μm. Förkortningar: PDMS = polydimethylsiloxan; SEM = scanningelektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Schematisk plattform för sekventiell kapillärassisterad montering i en mikrofluidisk kanal. A) Lådinkubator. Boxinkubatorn upprätthåller en jämn och konstant temperatur (här, 30 °C) inuti den mikrofluidiska kanalen. B) Spruta laddad med vätskefjädring. Sprutan styrs av en sprutpump (visas ej) och används för att styra vätskans rörelse under mönskningsprocessen. C) Uppvärmd glasplatta. Den uppvärmda glasplattan placeras under den mikrofluidiska kanalen och säkerställer en enhetlig temperatur (här, 30 °C) över mallen, vilket är avgörande för att undvika kondens i närheten av luft-vätskegränssnittet. D) Mikrofluidiskt chip laddat med en vätskefjädring. Det mikrofluidiska chipets golv bär fällorna där bakterier och kolloider blir mönstrade under mönstrar under mönstrarprocessen. E) Mikroskop. Den uppvärmda glasplattan och det mikrofluidiska chipet placeras på ett mikroskopstadium, vilket ger full optisk åtkomst under mönstraringsprocessen och alla följande steg. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Schematiska steg som är involverade i bakteriell och kolloidal mönstrad. Varje panel visar en inre vy av den mikrofluidiska kanalen och innehåller bara en liten del av PDMS-mallen. (A) Mönstra av bakterier genom kapillärassisterad sammansättning. (I) Bakteriesuspensionen avdunstar inuti den mikrofluidiska kanalen, vilket gör att konvektiva strömmar transporterar upphängda bakterier till luft-vätskegränssnittet och därmed bildar ackumuleringszonen. Under tiden dras fjädringen av sprutpumpen och dras tillbaka på mallen. Pilen representerar den riktning i vilken bakteriesuspensionen rör sig. Den avtagande fjädringen sveper över mallen och enskilda celler deponeras i de mikrofabricerade fällorna. (II) Deponerade bakterier utsätts för luft tills kanalen spolas med friskt medium. Deponeringsprocessen är över när vätskeupphängningen når slutet av mallen. (III) Den mikrofluidiska kanalen spolas med färskt medium (dvs. LB). Pilen representerar i vilken riktning det färska mediet spolas. B) Mönstrad kolloidala partiklar genom sekventiell kapillär assisterade montering. (I) Den kolloidala suspensionen avtar i mallen under avdunstning, och partiklar ackumuleras vid luft-vätskegränssnittet och bildar ackumuleringszonen. Enskilda partiklar deponeras i fällorna som mikrofabriceras på mallen. Pilen representerar den riktning i vilken den kolloidala suspensionen rör sig. (II) Deponeringsprocessen är avslutad när vätskeavstängningen når slutet av mallen. (III) En andra deposition skall köras i samma riktning som den första nedfallet för att placera en andra partikel i varje fälla i mallen. (IV) När den andra nedfallet är över mönstras mallen med dimers av en grön och en röd partikel. Förkortningar: PDMS = polydimethylsiloxan; LB = Lysogenybuljong. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: PDMS-mall mönstrad med E. coli -celler (stam MG1655 prpsM-GFP). A) SEM-bild av enskilda E. coli-celler som är fångade i 2 μm långa, 1 μm breda och 500 nm djupa fällor. Cellerna fångades efter en enda deposition. Skalstång = 2 μm. (B) Epifluorescensbilder av en liten del av PDMS-mallen (cirka 80 μm x 80 μm) med fångade celler av E. coli efter att den mikrofluidiska kanalen har fyllts med odlingsmedium (Lysogenybuljong) med en initial hastighet av 1,3 mm/min, som sedan ökas till 10 mm/min. Fångade celler växer och delar sig flera gånger i 4 h, så småningom sammanslagning med celler från närliggande fällor och täcker ytan. Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: PDMS = polydimethylsiloxan; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Kolloidala kluster monterade genom sekventiell kapillär kapillärassisterad partikelsammansättning i den mikrofluidiska plattformen (första kanalgeometrin). Epifluorescensmikroskopibild av (A) 15 dimers monterade av polystyrenpartiklar med 2 μm i diameter med två sekventiella nedfall. B) Dimers (n = 15) monterade av polystyrenpartiklar med 1 μm i diameter med två sekventiella nedfall. C) Trimers (n = 15) monterade av polystyrenpartiklar med en diameter på 1 μm med tre sekventiella nedfall. (D) Fällor (n = 15) med partiklar mönstrade vid extremiteterna i varje fälla genom att köra två sekventiella nedfall i motsatta riktningar. Avståndet mellan partiklar i en fälla är 2 μm. Skalningsstaplar = 4 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mikrofluidiska plattformen som beskrivs här gör det möjligt att mönstra mikrostora föremål, såsom kolloider och bakterier, i föreskrivna rumsliga arrangemang på ett PDMS-substrat. Den fulla kontrollen över miljöförhållanden som erbjuds av mikrofluidik och förmågan att mönstera celler med mikrometrisk precision som beviljas av sCAPA-teknik gör det till en mycket lovande plattform för framtida fysiologi- och ekologistudier.
I experimenten som presenterades i detta arbete realiserades kiselmästaren med hjälp av den fotoresist som rapporterades i materialregistret. Alla fotoresister som är lämpliga för att producera funktioner i storleksintervallet som beskrivs och kan användas med PDMS-gjutning kan dock användas. Detsamma gäller 3D-utskriftshartset som används för att förbereda mikrokanalformen. Alla hartser som kan producera egenskaper hos den beskrivna dimensionen och som är kompatibla med PDMS-gjutning kan användas.
I detta protokoll optimerar lagring av mikrofluidiska spånor vid 70 °C i 5 dagar ytans hydrofilicitet (kontaktvinkel som faller mellan 30 och 60°) när interpolering 20 tillsätts till bakteriell eller kolloidal suspension. Denna procedur säkerställer bästa reproducerbarhet för den avtagande kontaktvinkeln under dessa experimentella förhållanden. Andra lagringstider och temperaturer kan dock också fungera.
Två tillämpningar av denna microfluidic teknik har presenterats: 1) bakteriella mönstrar som omfattar enskilda nedfall av bakteriella celler i fällorna på PDMS substrat och 2) kolloidal mönstra som omfattar sekventiell depositioner av kolloider, erhålla kolloidal matriser av olika kompositioner. Denna plattform har optimerats helt för att säkerställa höga utbyten av bakteriell deponering, med tusentals celler mönstrade på PDMS-mallen. Kombinationen av kapillärassisterad montering och mikrofluidik säkerställer encellsupplösning och stabilt flöde av näringsämnen i flera timmar, med full optisk åtkomst under hela processen. De mönstrade cellerna kan återuppta tillväxten när den mikrofluidiska kanalen spolas med färskt medium, även om livskraften hos de mönstrade cellerna fortfarande måste optimeras.
För närvarande är den största begränsningen av denna teknik bristen på tillväxt av mönstrade celler i 54,5% av experimenten inom ett 7 h fönster. Denna aspekt kan vara relaterad till de specifika bakteriearterna och måste undersökas ytterligare för att fastställa grundorsaken till stressen som förhindrar att celler växer tillbaka. Luftexponering och den kraft som menisken utövar under mönstrarprocessen kan vara bland de största bidragsgivarna till bakteriell stress. Flera möjliga lösningar kan implementeras för att minska sådana källor till stress, inklusive användningen av djupare fällor för att minska den kraft som menisken applicerar på celler under mönstraringsprocessen. Ett ytterligare alternativ för att minska stressen i samband med luftexponering skulle vara att minska temperaturen på den uppvärmda glasplattan. En temperatur på 30 °C säkerställer en tillräcklig avdunstningshastighet för vätskeupphängningen under mönstraringsprocessen och skulle minska värmen som bakterierna utsätts för efter att de har mönstrats på mallen innan mediet spolas.
När vi är helt optimerade föreställer vi oss att denna plattform kommer att användas i en mängd olika biologiska studier som involverar kvantitativ encellsanalys. Teknikens höga genomströmningskaraktär möjliggör mönstraring av tusentals celler, vilket ger stor statistik inom samma experimentella arena. Full optisk åtkomst gör det möjligt att spåra beteende, tillväxt och molekylära aktiviteter hos ett stort antal enskilda mikroorganismer över tid, vilket ger stora fördelar i studien av fenotypisk heterogenitet under homogena miljöförhållanden. Plattformens mikrofluidiska karaktär säkerställer full kontroll över miljöförhållanden som mediesammansättning, flödeshastighet och temperatur, bara för att nämna några.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna bekräftar stöd från SNSF PRIMA grant 179834 (till E.S.), ett ETH Research Grant ETH-15 17-1 (R. S.), och en Gordon och Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (grant GBMF9197) (R. S.). Författarna tackar Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (University of Granada, Spanien) för SEM-avbildningen av bakterier och för de insiktsfulla diskussionerna. Författarna tackar Dr. Jen Nguyen (University of British Columbia, Kanada), Dr. Laura Alvarez (ETH Zürich, Schweiz), Cameron Boggon (ETH Zürich, Schweiz) och Dr. Fabio Grillo för de insiktsfulla diskussionerna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
