Summary
我们提出了一种技术，该技术在微流体平台中使用毛细管辅助组装，将悬浮在液体中的微尺寸物体（例如细菌和胶体）图案化为聚二甲基硅氧烷衬底上的规定阵列。
Abstract
将微生物控制模式化为定义的空间排列，为广泛的生物学应用提供了独特的可能性，包括微生物生理学和相互作用的研究。在最简单的层面上，微生物的精确空间图案化将实现对大量单个细胞的可靠，长期成像，并改变定量研究距离依赖性微生物 - 微生物相互作用的能力。更独特的是，结合微流体技术提供的精确空间图案和对环境条件的完全控制，将为微生物生态学中的单细胞研究提供一个强大而通用的平台。
本文提出了一个微流体平台，用于在微流体通道内产生多功能和用户定义的微生物模式，从而允许完整的光学访问以进行长期，高通量的监测。这种新的微流体技术基于毛细管辅助颗粒组装，并利用微流体通道内蒸发悬浮液的受控运动产生的毛细管力，将单个微尺寸物体沉积在微细加工到聚二甲基硅氧烷（PDMS）底物上的一系列陷阱中。顺序沉积生成单个或多个类型的微型物体的所需空间布局，仅由陷阱的几何形状和填充顺序决定。
该平台已使用不同尺寸和材料的胶体颗粒进行校准：它已被证明是生成各种胶体图案并执行捕获颗粒表面功能化的强大工具。此外，该平台在微生物细胞上进行了测试，使用 大肠 杆菌细胞作为模型细菌。成千上万的单个细胞被图案化在表面上，并随着时间的推移监测它们的生长。在这个平台上，单细胞沉积和微流体技术的耦合允许微生物的几何图案化和环境条件的精确控制。因此，它为单个微生物的生理学和微生物 - 微生物相互作用的生态学打开了一扇窗，如初步实验所示。
Introduction
单个微生物的空间模式化，特别是在能够完全控制环境条件的实验领域，如微流体装置，在广泛的背景下是非常可取的。例如，将微生物排列成规则的阵列将允许对大量单个细胞进行精确成像，并研究它们的生长，生理学，响应环境刺激的基因表达和药物敏感性。它还允许研究对细胞通讯（例如，群体感应），交叉喂养（例如，藻类 - 细菌共生）或拮抗（例如，化感作用）特别感兴趣的细胞 - 细胞相互作用，并完全控制细胞相对于彼此的空间定位。细胞生理学和进化研究1，细胞 - 细胞相互作用研究2，表型分化筛选3，环境监测4和药物筛选5 是能够实现这种定量单细胞分析的技术可以极大地受益的领域。
近年来，从全息光学陷阱6和异质表面功能化方法7，8，9，10到单细胞化学抑制剂11和液滴微流体12，已经提出了几种分离和处理单细胞的策略。这些方法要么在技术上要求很高，要么会影响细胞生理学，并且无法提供高通量平台来对可以长期研究的微生物进行模式分析，从而确保单细胞分辨率，完全光学访问和对环境条件的控制。本文的目的是描述一个平台，通过毛细管辅助组装，以微米精度将细菌图案化到PDMS表面上规定的空间排列中。该平台允许对微生物进行精确而灵活的空间图案化，并由于其微流体特性而能够完全光学访问和控制环境条件。
该平台背后的技术是近年来开发的组装技术，名为sCAPA13，14，15（顺序毛细管辅助颗粒组装），被集成到微流体平台16中。蒸发液滴的半月板在微流体通道内的图案化聚二甲基硅氧烷（PDMS）底物上后退时，施加毛细管力，将悬浮在液体中的单个胶体颗粒捕获到基板上微细加工的微孔中（图1A）。悬浮颗粒首先通过对流输送到气液界面，然后通过毛细管进入陷阱。与粒子相互作用中涉及的力相比，移动半月板施加的毛细管力的作用范围更大。
因此，装配机制不受颗粒的材料、尺寸和表面特性的影响。颗粒浓度、弯月板速度、温度和悬浮液表面张力等参数是影响图案化过程产量的唯一参数。读者可以在13，14，15中找到上述参数对图案化过程影响的详细说明。在最初的sCAPA技术13，14，15中，胶体图案化过程在开放系统中进行，并且需要高精度压电级来驱动悬架穿过模板。该平台利用不同的策略，并允许在受控环境中使用通常用于微流体的标准设备进行图案化，从而最大限度地降低污染样品的风险。
这种微流体平台首先在胶体颗粒上进行优化，以创建常规的惰性颗粒阵列，然后成功应用于细菌。本文描述了这两种微流体平台（图1B，C）。方案中描述的大多数准备步骤和实验设备对于这两种应用都是通用的（图2）。我们报告了胶体图案化，以证明该技术可用于在同一表面上执行多个顺序沉积，以创建复杂的多材料图案。特别是，每个陷阱每个步骤沉积一个颗粒，以形成具有特定几何形状和组成的胶体阵列，完全由陷阱的几何形状和填充顺序决定。至于细菌模式，描述了单个沉积，导致每个陷阱沉积一个细菌。一旦细胞在表面上被图案化，微流体通道就会被培养基冲洗以促进细菌生长，这是任何单细胞研究的初步步骤。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 硅母站制备
注：带有构成胶体和微生物图案模板的微细结构疏水阀的PDMS模板是根据Geissler等人引入的方法制造的。17. 硅母模是在洁净室中通过常规光刻法制备的。有关步骤和设备 的材料表 ，请参阅以下步骤。
- 使用计算机辅助设计 （CAD） 软件设计功能。
- 使用紫外直接激光刻录机曝光设计的特征，用一层正向光刻胶准备铬玻璃掩模。
- 使用旋转显影剂以 1：4 光刻胶与水的比例开发 15 s 的显影剂，开发铬玻璃掩模。
- 将面膜浸入铬蚀刻剂中50秒。
- 等离子体处理10 cm硅晶圆，在600 W下3分钟。
- 气相沉积一层六甲基二硅氮烷，并在110°C下烘烤，以提高对光刻胶的附着力。
- 在4，500× g 下沉积一层光刻胶2分钟。
- 使用掩模对准器通过镀铬玻璃掩模将该特征暴露在UV下2秒，并与开发人员一起开发掩模。
- 为了完成硅母版的制造，通过深度反应离子交换蚀刻晶圆，调整蚀刻时间（<2分钟）以达到所需的深度（使用轮廓仪测量）。
2. 微通道模具制备
- 使用CAD软件设计通道，并使用切片器软件对其进行切片，以将设计的模型转换为3D打印机的说明，将切片距离设置为0.05 mm。
- 使用3D打印机打印通道约1小时。
- 在专用的固化和洗衣机中清洗和后固化霉菌。
- 将模具放入装有纯异丙醇（IPA）的容器中，涡旋液体（洗涤20分钟）。将装满IPA的容器从机器中取出。
- 一旦洗涤的模具从IPA容器中取出，将其放回洗涤和固化机中，并在35°C下后固化15分钟。
注： 材料表 报告了模具制备方案中使用的3D打印机以及固化和洗衣机。3D模型是用3D打印机的专有切片机软件切片的。
- 将打印件放入UV烤箱中12小时，然后将其置于80°C的烤箱中12小时。
注意：此步骤可确保所有聚合物都固化，并且所有未固化的聚合物都从打印件中移除，因为它会阻止PDMS固化。 - 通过三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷的气相沉积使模具硅烷化。
- 将3D模具与20μL100%浓缩三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷一起放入真空干燥器中，移液在靠近模具的铝箔上。
- 在干燥器中产生真空以产生蒸汽并离开40分钟。
- 从干燥器中取出模具，用纯乙醇冲洗，然后倒入PDMS。
3. 微流控芯片的制造
- 通过将弹性体与其交联剂混合来制备PDMS混合物（材料表）。用力搅拌混合物以均匀地混合两种组分，直到形成气泡，并且PDMS混合物看起来不透明。
注：交联剂的用量应为弹性体用量的10重量%。 - 在真空干燥器中对弹性体和交联剂的混合物进行脱气，以除去被困的气泡。将干燥器中的混合物转移到用于混合的容器中（步骤3.1）。继续脱气过程，直到所有气泡都被除去，混合物看起来再次透明。
注意：干燥通常需要30分钟。 - 将3g混合物倒在硅母头上以产生模板，该模板将用作微流控芯片的"地板"。
注意：PDMS层的厚度可以通过改变倒在硅母板上的混合物量来调整。- 要获得400μm厚的模板，将3gPDMS倒在硅母板上，将硅母模放在旋转涂层机上，并以21× g 旋转涂层5 s和54 × g 旋转10 s，然后按照步骤3.2中所述再次脱气以除去捕获的气泡。
- 将20gPDMS混合物倒在3D打印模具上以制作微通道，该微通道将用作微流控芯片的"屋顶"，并按照步骤3.2中所述将其脱气30分钟。
- 将硅晶圆和3D打印模具在70°C下烘烤至少2小时。
- 将PDMS层从3D打印模具上剥离，用刀片在微通道周围切割PDMS，然后打孔，作为微流体通道的入口和出口。
- 将PDMS从硅母板上剥离出来，并将PDMS层切割成更小的碎片，这些碎片具有相同尺寸的微流体通道，这些微流体通道将粘合在模板的顶部。
- 使用1%洗涤剂溶液（见 材料表）轻轻擦拭模板和微孔5分钟，然后用去离子水冲洗。接下来，用异丙醇冲洗模板和微通道，并用去离子水冲洗。将模板和微通道在室温下用1 bar的压缩空气干燥1分钟。
- 将模板和微通道放入等离子清洗机中，使要粘合的表面朝上。打开等离子清洗机，等离子体处理模板和微通道40秒。将它们从等离子清洗机中取出，并通过使它们彼此接触，立即将微通道粘合在模板顶部。
- 将微流控芯片在70°C的烘箱中储存五天，以确保PDMS疏水回收，并在30至60°10，11之间的最佳范围内具有后退的接触角。
4. 细菌图案化
- 在实验前一天，生长一种群 大肠杆菌 （菌株MG1655 prpsM-GFP）。直接从冷冻的培养物中接种培养物，并在37°C的振荡器培养箱中的溶菌汤（LB）培养基中生长20小时。 为细胞加入50μg/ mL卡那霉素以保留prpsM-GFP质粒。
- 在实验当天，在实验开始前几个小时将箱式培养箱（图2A）设置为37°C，以具有均匀稳定的温度。在显微镜载物台上设置注射器泵和加热的玻璃板（图2B，C），将温度设置为与箱式培养箱相同的温度。
注：封闭整个系统（包括显微镜）的箱式培养箱（图2E）确保在通道与培养基冲洗时，在整个实验过程中保持均匀恒定的温度。 - 在实验前90分钟，将微流控芯片放入充满100%乙醇（EtOH）的容器中，并用100%EtOH冲洗通道至少10分钟。将微流控芯片置于真空干燥器中并脱气至少30分钟。将EtOH与蒸馏水交换，并对芯片进行至少30分钟的真空处理。将微流控芯片置于70°C的烘箱中10分钟，以除去通道中残留的任何液体痕迹。
注意：此步骤对于防止用培养基冲洗时通道中形成气泡是必要的。该气泡预防方案改编自Wang等人18。 - 将1mL 3-（N-吗啉基）丙烷磺酸（MOPS）培养基（1x）移液到离心机小瓶中，加入10μL0.132M磷酸钾（K2HPO4）。将过夜培养物从37°C培养箱中取出，等分100μL放入离心机小瓶中，并以2，300×g离心培养物2分钟。轻轻地将上清液从离心机小瓶中移出，并将沉淀重悬于1mL新鲜MOPS培养基中，其中吐温20的0.015%v / v和0.01%v / v的磷酸钾。
注意：细菌悬浮液的典型浓度在0.015-0.15体积%的范围内，这确保了形成一个扩展和移动的积累区，并防止颗粒在基质上积聚。用新鲜培养基代替过夜培养基可最大限度地降低在模板上释放细菌膜的风险。新鲜培养基中缺乏碳源会阻止细胞在模板图案化过程中在悬浮液中生长。悬浮液中吐温 20 的浓度为 0.015% v/v，对于 PDMS 模板上后退液体的接触角在 30 和 60° 之间的最佳范围内是必要的。 - 将细菌悬浮液装入1 mL注射器中，并通过微流体管将注射器连接到芯片上。
- 要固定注射器和管子之间的连接，请直接将外径为0.6 mm的针头插入管中。为避免将留在入口附近的任何悬浮液散布到通道上，请将新鲜介质冲洗穿过图案化过程中用作出口的孔（图3A-III），而不是用作入口的孔。
- 将注射器安装在注射器泵上，并通过位于通道上游部分的入口将悬浮液注入微流控芯片中，直到悬浮液用陷阱覆盖模板区域。
注：在液体注入过程中，空气可以通过位于通道下游端的出口逸出。 - 将注射泵设置为以0.07-0.2μL / min的流速抽出细菌悬浮液（图3A-I），在所述几何形状中对应于80-100μm / min的半月板后退速度。
- 通过显微镜软件监控图案化过程。
注意：此处，使用10倍放大倍率来监测模板上后退的半月板，并使用20倍放大倍率监测单个细菌沉积到微细制陷阱中。
- 一旦模板用细胞图案化（图3A-II），增加退出流速以快速清空微流体通道，并用先前脱气至少30分钟并在30°C下预热的新鲜LB冲洗它。
- 将注射泵设置为2μL/min的流速，以轻轻冲洗通道。一旦通道被填满，根据特定的实验需要增加流速（15μL/min）。
- 以所需的放大倍率和时间间隔获取细菌生长的图像。
5. 胶体图案
- 将900μL的0.015%v / v吐温20水溶液移入离心机小瓶中，并将100μL的原始胶体悬浮液移入其中。将悬浮液以13，500× g 离心1分钟。轻轻除去上清液，并用吐温20（0.015%v / v）水溶液代替。重复此过程三次，以确保从库存悬浮液中完全更换供应商的溶剂。
- 将胶体悬浮液装入1 mL注射器中，并通过微流体管将注射器连接到芯片。通过位于中央部分的入口，在通道的上游部分，将悬浮液注入微流控芯片中，并逐渐推动悬浮液直到模板被覆盖。
- 以0.07-0.2μL/min的流速（对应于1-2μm/min的半月板后退速度）取出胶体悬浮液，并通过显微镜软件对图案化过程进行成像。使用 10 倍放大倍率监测模板上后退的半月板，使用 20 倍放大倍率观察单个颗粒在微加工陷阱中的沉积情况。一旦半月板到达模板的末端，增加流速以快速清空通道。
注：由多个颗粒组成的胶体阵列可以通过串联运行步骤5.1至5.3的图案化过程来生产。通道在每次迭代时根据所需的胶体阵列组成加载新的胶体悬浮液。每个图案化步骤都会向胶体阵列添加一个粒子，并且可以按顺序运行，直到陷阱被所需的粒子序列填充。所得胶体阵列的组成仅由用于填充陷阱的胶体悬浮液序列给出（图3B）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
开发了一种微流体平台，该平台利用毛细管辅助组装将胶体颗粒和细菌图案化为PDMS模板上微制造的陷阱。设计了两种不同的通道几何形状，以通过毛细管辅助组件优化胶体和细菌的图案化。第一个通道几何形状（图1B）由三个23毫米长的平行部分组成，它们之间没有物理屏障。侧面的两个部分宽5毫米，高1毫米，而中心部分宽7毫米，高500微米。这种设计有助于保持具有后退凸形半月板的明确定义的移动液滴。Pioli等人11详细描述了该平台的工作原理。如果实验需要填充侧通道，例如在细菌培养的情况下，通常会形成气穴。出于这个原因，我们设计并测试了第二种几何形状，当通道被介质冲洗时，它简化了填充过程。在这种情况下，平台（图1C）由一个20 mm长，3 mm宽和500μm高的直通道组成。
微流体通道中的温度是确保高效沉积过程的重要参数。必须保持在水露点以上15°C，以避免模板上结露。通道下方的加热玻璃板（图2D）确保整个模板的温度均匀，以防止在靠近液 -空气界面的区域的图案化过程中冷凝，其特征在于空气中的蒸汽浓度很高。加热玻璃板的温度必须与箱式培养箱的温度相同，以避免模板上结露。
利用直通道几何形状对荧光大肠杆菌菌株（MG1655 prpsM-GFP）的固定相细胞（图4A）进行模式分析。细菌沉积在5，000个分析陷阱中的83%。首先根据所提出的方案将细胞置于陷阱中，随后在LB中以10mm / min冲洗的LB中生长4小时。图案细菌在1.5小时内的不同时间恢复生长，当通道充满新鲜的LB（图4B-I），中位数为44分钟。一旦恢复生长，单个细菌细胞开始形成单个菌落，其膨胀（图4B-II），直到形成表层（3.5小时）并且失去单细胞分辨率（图4B-III）。
这个概念验证实验表明，微流体通道中的毛细血管辅助组装可用于用数千个活的单细菌细胞来图案化表面。11个重复显示，图案细胞在7小时内在45.5%的病例中生长。在沉积后，将碘化丙啶（PI）（一种活死染色剂19）添加到冲洗到通道中的新鲜LB中进行的四项测试证明，未生长的图案化细菌没有被染色。由于PI与DNA结合但不能用完整的膜穿透细胞，PI染色实验表明，图案化过程以及干燥和再水合作用过程都没有破坏细胞膜。
三段通道几何形状用于通过对胶体颗粒进行顺序图案化来生产具有不同成分的线性胶体阵列。 图5 显示了通过顺序图案化形成的不同胶体阵列，包括二聚体（图5A，B）和三聚体（图5C），分别包含两个和三个顺序捕获的颗粒。绿色和红色荧光聚苯乙烯颗粒用于组装二聚体和三聚体。超过55，000个捕集器的分析表明，由直径为2μm和1μm的颗粒制成的绿红色（G-R）二聚体（图5A，B）分别在93%和89%的分析阱中形成。绿-红-绿（G-R-G）三聚体（图5C）在55，000个分析的陷阱中有52%形成11。二聚体和三聚体通过运行顺序沉积来组装，胶体悬浮液在所有顺序沉积中沿同一方向移动（图3B）。因此，在每个沉积步骤中捕获的颗粒与在前一个沉积步骤中捕获的颗粒直接接触。
颗粒的精确定位不需要沉积颗粒之间的直接接触。图案化粒子之间的距离可以通过在相反方向上进行两次沉积来精确控制，从而在每个陷阱的两端捕获这些粒子（图5D）。通过设计具有所需长度的陷阱，可以调整被捕获粒子之间的距离。该平台提供的另一种可能性是具有微米精度的表面化学图案化。该结果可以通过用化学功能化颗粒对模板进行图案化来实现11。
图1：微流体通道的几何形状和图案化过程。 （A）胶体颗粒图案化过程中微流体通道的侧视图部分的示意图。液体悬浮液在微流体通道内蒸发，对流将悬浮颗粒输送到气液界面。因此，颗粒积聚并形成积聚区。注射泵拉动液体悬浮液，促使其后退，并且在模板上的液体衰退期间，单个颗粒被捕获。箭头表示悬架移动的方向。（B） 用于在 PDMS 模板上对胶体粒子进行图案化的通道几何图形的示意图。通道长23毫米，宽17毫米，由三部分组成：一个中央部分宽7毫米，两个横向部分宽5毫米。模板位于频道的楼层，位于中央部分内。横截面显示，微流体通道的中心部分，其中液体悬浮液在整个图案化过程中受到限制，是通道的最浅部分，高500μm，而两个侧截面均为1 mm高。（C）用于对细菌进行图案化的直通道几何形状的示意图。微流体装置由20 mm长，3 mm宽和500μm高的直通道组成。该微流体装置的矩形截面（如横截面所示）简化了用介质填充通道的过程。SEM图像显示了PDMS模板的一小部分，其上具有2μm长，1μm宽和500 nm深的微加工陷阱。比例尺 = 2 μm。缩写： PDMS = 聚二甲基硅氧烷;扫描电镜 = 扫描电子显微镜。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：微流体通道中顺序毛细管辅助组装的平台示意图。 （A）箱式培养箱。箱式培养箱在微流体通道内保持均匀恒定的温度（此处为30°C）。（B）装有液体悬浮液的注射器。注射器由注射器泵（未显示）控制，用于在图案化过程中控制液体的运动。（三）加热玻璃板。加热的玻璃板放置在微流体通道下方，并确保整个模板的温度均匀（此处为30°C），这对于避免气液界面附近的冷凝至关重要。（D）装有液体悬浮液的微流控芯片。微流控芯片的地板带有陷阱，细菌和胶体在图案化过程中被图案化。（E） 显微镜。将加热的玻璃板和微流控芯片放置在显微镜载物台上，在图案化过程和所有后续步骤中允许完全光学访问。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：细菌和胶体图案化所涉及的步骤示意图。 每个面板都显示微流体通道的内部视图，并且仅包括PDMS模板的一小部分。（A）通过毛细血管辅助组装对细菌进行图案化。（I）细菌悬浮液在微流体通道内蒸发，引起对流将悬浮细菌输送到气液界面，从而形成积聚区。同时，悬浮液被注射器泵拉动并退到模板上。箭头表示细菌悬浮液移动的方向。后退的悬浮液扫过模板，单个细胞被沉积到微细加工的陷阱中。（II）沉积的细菌暴露在空气中，直到通道被新鲜介质冲洗。当液体悬浮液到达模板的末端时，沉积过程结束。（III）微流体通道用新鲜培养基（即LB）冲洗。箭头表示新鲜培养基的冲洗方向。（B）通过顺序毛细管辅助组装对胶体颗粒进行图案化。（I）胶体悬浮液在蒸发时在模板上后退，颗粒在气液界面处积聚，形成积聚区。单个颗粒被沉积到模板上微细制造的陷阱中。箭头表示胶体悬浮液移动的方向。（II）当液体悬浮液到达模板末端时，沉积过程完成。（III）第二次沉积与第一次沉积的方向相同，以将第二个粒子放入模板上的每个陷阱中。（IV）一旦第二次沉积结束，模板将用一个绿色和一个红色粒子的二聚体图案化。缩写： PDMS = 聚二甲基硅氧烷;LB = 溶血性肉汤。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：用 大肠杆菌 （菌株MG1655 prpsM-GFP）细胞图案化的PDMS模板。 （A）被困在2μm长，1μm宽和500nm深度陷阱中的单个 大肠杆菌 细胞的SEM图像。细胞在一次沉积后被捕获。比例尺= 2μm.（B）在微流体通道以1.3 mm / min的初始速度充满培养基（溶血性肉汤 ）后， PDMS模板的一小部分（约80μmx 80μm）的落射荧光图像，然后增加到10mm / min。被困细胞多次生长和分裂4小时，最终与来自邻近陷阱的细胞合并并覆盖表面。比例尺 = 10 μm。缩写： PDMS = 聚二甲基硅氧烷;GFP = 绿色荧光蛋白。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：通过微流体平台（第一通道几何形状）中的顺序毛细管辅助颗粒组装的胶体簇。 （A）15个二聚体的落射荧光显微镜图像，由直径为2μm的聚苯乙烯颗粒组装而成，具有两个连续沉积。（B）二聚体（n = 15）由直径为1μm的聚苯乙烯颗粒组装而成，具有两个连续的沉积。（C）三聚体（n = 15），由直径为1μm的聚苯乙烯颗粒组装而成，具有三个连续沉积。（D）陷阱（n = 15），其颗粒在每个陷阱的末端通过向相反方向运行两个连续沉积而图案化。捕集器中颗粒之间的距离为2μm。比例尺 = 4 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里描述的微流体平台允许将微尺寸的物体（如胶体和细菌）图案化为PDMS底物上规定的空间排列。微流体对环境条件的完全控制以及sCAPA技术赋予的以微米精度对细胞进行图案化的能力使其成为未来生理学和生态学研究的非常有前途的平台。
在这项工作中提出的实验中，使用 材料表中报告的光刻胶实现了硅母版。但是，可以使用任何适合在所描述的尺寸范围内产生特征的光刻胶，并且可以在PDMS成型中使用。这同样适用于用于制备微通道模具的3D打印树脂。可以使用任何能够产生所述尺寸的特征并与PDMS成型兼容的树脂。
在该协议中，将微流控芯片在70°C下储存5天可优化表面亲水性（接触角落在30至60°之间），当吐温20加入细菌或胶体悬浮液中时。该程序确保了在这些实验条件下后退接触角的最佳再现性;但是，其他储存时间和温度也可能有效。
已经提出了这种微流体技术的两种应用：1）细菌图案化涉及细菌细胞的单个沉积到PDMS底物上的陷阱中，以及2）胶体图案化涉及胶体的顺序沉积，获得不同组合物的胶体阵列。该平台已经过全面优化，以确保细菌沉积的高产量，在PDMS模板上图案化了数千个细胞。毛细管辅助组装和微流体的组合确保了单细胞分辨率和营养物质的稳定流动数小时，并在整个过程中具有完全的光学访问。一旦微流体通道被新鲜培养基冲洗，图案化细胞就能够恢复生长，尽管图案化细胞的活力仍需要优化。
目前，该技术的主要局限性是在7小时内54.5%的实验中缺乏图案化细胞的生长。这方面可能与特定的细菌种类有关，需要进一步研究以确定阻止细胞再生的应激的根本原因。空气暴露和半月板在图案化过程中施加的力可能是细菌应激的主要因素之一。可以实施几种可能的解决方案来减少这些压力源，包括使用更深的陷阱来减少在图案化过程中半月板施加在细胞上的力。减少与空气暴露相关的应力的另一种选择是降低加热玻璃板的温度。30°C的温度确保了在图案化过程中液体悬浮液的足够蒸发速率，并且可以减少细菌在冲洗介质之前在模板上图案化后暴露的热量。
一旦完全优化，我们设想该平台将用于涉及定量单细胞分析的各种生物学研究。该技术的高通量特性允许对数千个细胞进行模式化，从而在同一实验领域内提供大量统计数据。全光学访问可以跟踪大量单一微生物随时间的变化、生长和分子活性，从而为研究均质环境条件下的表型异质性提供了主要优势。该平台的微流体特性确保了对环境条件的完全可控性，例如介质成分，流速和温度，仅举几例。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者感谢SNSF PRIMA赠款179834（对E.S.），ETH研究资助ETH-15 17-1（R.S.）以及Gordon和Betty Moore基金会水生微生物共生研究员奖（授予GBMF9197）（R.S.）的支持。作者感谢Miguel Angel Fernandez-Rodriguez博士（西班牙格拉纳达大学）对细菌进行SEM成像和富有洞察力的讨论。作者感谢Jen Nguyen博士（加拿大不列颠哥伦比亚大学），Laura Alvarez博士（瑞士苏黎世联邦理工学院），Cameron Boggon博士（瑞士苏黎世联邦理工学院）和Fabio Grillo博士进行了富有洞察力的讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
