Summary
Vi præsenterer en teknologi, der bruger kapillaritetsassisteret samling i en mikrofluidisk platform til at mønstre objekter i mikrostørrelse suspenderet i en væske, såsom bakterier og kolloider, i foreskrevne arrays på et polydimethylsiloxansubstrat.
Abstract
Kontrolleret mønster af mikroorganismer i definerede rumlige arrangementer giver unikke muligheder for en bred vifte af biologiske anvendelser, herunder studier af mikrobiel fysiologi og interaktioner. På det enkleste niveau vil nøjagtig rumlig mønsterdannelse af mikroorganismer muliggøre pålidelig, langsigtet billeddannelse af et stort antal individuelle celler og transformere evnen til kvantitativt at studere afstandsafhængige mikrobe-mikrobe-interaktioner. Mere unikt er det, at kobling af nøjagtige rumlige mønstre og fuld kontrol over miljøforholdene, som tilbydes af mikrofluidisk teknologi, ville give en kraftfuld og alsidig platform for enkeltcellestudier inden for mikrobiel økologi.
Dette papir præsenterer en mikrofluidisk platform til fremstilling af alsidige og brugerdefinerede mønstre af mikroorganismer inden for en mikrofluidisk kanal, hvilket muliggør fuldstændig optisk adgang til langsigtet overvågning med høj gennemstrømning. Denne nye mikrofluidiske teknologi er baseret på kapillaritetsassisteret partikelsamling og udnytter kapillærkræfterne, der opstår som følge af den kontrollerede bevægelse af en fordampende suspension inde i en mikrofluidisk kanal til at deponere individuelle mikrostørrelsesobjekter i en række fælder, der er mikrofabrikeret på et polydimethylsiloxan (PDMS) substrat. Sekventielle aflejringer genererer det ønskede rumlige layout af enkelte eller flere typer objekter i mikrostørrelse, der udelukkende dikteres af fældernes geometri og påfyldningssekvensen.
Platformen er kalibreret ved hjælp af kolloide partikler af forskellige dimensioner og materialer: det har vist sig at være et kraftfuldt værktøj til at generere forskellige kolloide mønstre og udføre overfladefunktionalisering af fangede partikler. Desuden blev platformen testet på mikrobielle celler ved hjælp af Escherichia coli-celler som modelbakterie. Tusindvis af individuelle celler blev mønstret på overfladen, og deres vækst blev overvåget over tid. I denne platform muliggør koblingen af enkeltcelleaflejring og mikrofluidisk teknologi både geometrisk mønster af mikroorganismer og præcis kontrol af miljøforholdene. Det åbner således et vindue ind i fysiologien af enkelte mikrober og økologien af mikrobe-mikrobe interaktioner, som det fremgår af foreløbige eksperimenter.
Introduction
Rumligt mønster af enkelte mikroorganismer, især inden for eksperimentelle arenaer, der muliggør fuld kontrol over miljøforholdene, såsom mikrofluidiske enheder, er yderst ønskeligt i en lang række sammenhænge. For eksempel ville arrangering af mikroorganismer i regelmæssige arrays muliggøre nøjagtig billeddannelse af et stort antal individuelle celler og undersøgelse af deres vækst, fysiologi, genekspression som reaktion på miljømæssige stimuli og lægemiddelmodtagelighed. Det ville også gøre det muligt at studere celle-celle-interaktioner af særlig interesse for forskning i cellulær kommunikation (f.eks. Quorum sensing), krydsfodring (f.eks. Alge-bakteriel symbiose) eller antagonisme (f.eks. Allelopati) med fuld kontrol over den rumlige lokalisering af celler i forhold til hinanden. Cellefysiologi og evolutionsstudier1, celle-celle-interaktionsstudier2, fænotypisk differentieringsscreening3, miljøovervågning4 og lægemiddelscreening5 er blandt de områder, der i høj grad kan drage fordel af en teknologi, der er i stand til at opnå en sådan kvantitativ enkeltcelleanalyse.
Flere strategier til isolering og håndtering af enkeltceller er blevet foreslået i de senere år, fra holografiske optiske fælder6 og heterogene overfladefunktionaliseringsmetoder7,8,9,10 til enkeltcellekemostaterne11 og dråbemikrofluidik12. Disse metoder er enten teknisk meget krævende eller påvirker cellefysiologien og giver ikke en platform med høj gennemstrømning til mønstermikrober, der kan studeres over lange perioder, hvilket sikrer enkeltcelleopløsning, fuld optisk adgang og kontrol over miljøforholdene. Målet med dette papir er at beskrive en platform til at mønstre bakterier med mikrometrisk præcision i foreskrevne rumlige arrangementer på en PDMS-overflade gennem kapillaritetsassisteret samling. Denne platform muliggør præcis og fleksibel rumlig mønster af mikrober og muliggør fuld optisk adgang og kontrol over miljøforholdene takket være dens mikrofluidiske natur.
Teknologien bag denne platform er en monteringsteknologi, der er udviklet i de senere år, ved navn sCAPA13,14,15 (sekventiel kapillaritetsassisteret partikelsamling), der blev integreret i en mikrofluidisk platform16. Menisken af en fordampende flydende dråbe, mens den trækker sig tilbage over et mønstret polydimethylsiloxan (PDMS) substrat inde i en mikrofluidisk kanal, udøver kapillærkræfter, der fanger de enkelte kolloide partikler suspenderet i væsken i mikrometriske brønde mikrofabrikeret på substratet (figur 1A). Suspenderede partikler transporteres først til luft-væske-grænsefladen ved hjælp af konvektive strømme og placeres derefter i fælderne ved kapillaritet. Kapillærkræfter, der udøves af den bevægelige menisk, virker i større skala sammenlignet med kræfter involveret i partikelinteraktioner.
Således påvirkes monteringsmekanismen ikke af partiklernes materiale, dimensioner og overfladeegenskaber. Parametre som partikelkoncentration, hastigheden af menisken, temperaturen og overfladespændingen af suspensionen er de eneste parametre, der påvirker udbyttet af mønsterprocessen. Læseren kan finde en detaljeret beskrivelse af de førnævnte parametres indflydelse på mønsterprocessen i13,14,15. I den oprindelige sCAPA-teknologi13,14,15 blev den kolloide mønsterproces udført i et åbent system og krævede et piezoelektrisk trin med høj præcision for at drive suspensionen på tværs af skabelonen. Denne platform udnytter en anden strategi og gør det muligt at udføre mønstret med standardudstyr, der generelt anvendes i mikrofluidik i et kontrolleret miljø, hvilket minimerer risikoen for at forurene prøverne.
Denne mikrofluidiske platform blev først optimeret på kolloide partikler for at skabe regelmæssige arrays af inerte partikler og derefter med succes anvendt på bakterier. Begge mikrofluidiske platforme er beskrevet i dette papir (figur 1B,C). De fleste af de forberedende trin og det eksperimentelle udstyr, der er beskrevet i protokollen, er fælles for de to applikationer (figur 2). Vi rapporterer kolloidt mønster for at demonstrere, at teknikken kan bruges til at udføre flere sekventielle aflejringer på samme overflade for at skabe komplekse, multimaterialemønstre. Især blev en enkelt partikel deponeret pr. fælde for hvert trin for at danne kolloide arrays med en specifik geometri og sammensætning, udelukkende dikteret af fældernes geometri og påfyldningssekvens. Med hensyn til bakteriemønster beskrives enkeltaflejringer, hvilket resulterer i, at en bakterie deponeres pr. Fælde. Når celler er mønstret på overfladen, skylles den mikrofluidiske kanal med medium for at fremme bakterievækst, det indledende trin i enhver enkeltcelleundersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af siliciummaster
BEMÆRK: PDMS-skabelonerne med de mikrofabrikerede fælder, der danner skabelonen for kolloidt og mikrobielt mønster, blev fremstillet i henhold til den metode, der blev introduceret af Geissler et al. 17. Siliciummesteren blev fremstillet ved konventionel litografi i et renrum. Se følgende trin for proceduren og tabellen over materialer til udstyret.
- Design funktionerne ved hjælp af CAD-software (Computer Aided Design).
- Forbered kromglasmasken med et lag positivt photoresist ved at udsætte de designede funktioner med en UV-direkte laserskriver.
- Udvikl kromglasmasken med en spinudvikler ved hjælp af en udvikler i forholdet 1: 4 photoresist til vand i 15 s.
- Sænk masken i krom etchant i 50 s.
- Plasma-behandle en 10 cm siliciumskive i 3 min ved 600 W.
- Dampdeponere et lag hexamethyldisilizan og bage ved 110 ° C for at forbedre vedhæftningen mod fotoresisten.
- Aflejr et lag photoresist ved 4.500 × g i 2 min.
- Udsæt funktionen for UV gennem kromglasmasken med en maskejustering i 2 s og udvikl med en udvikler som for masken.
- For at afslutte fremstillingen af siliciummasteren skal du ætse waferen via dyb reaktiv ionbytning og justere ætsningstiden (<2 min) for at opnå den ønskede dybde (målt med et profilometer).
2. Forberedelse af mikrokanalform
- Design kanalen med CAD-software, og skær den i skiver med en udsnitssoftware for at konvertere den designede model til instruktioner til 3D-printeren, og indstille skæreafstanden til 0,05 mm.
- Udskriv kanalen med en 3D-printer i ~1 time.
- Vask og efterkæle formen i en dedikeret hærdnings- og vaskemaskine.
- Kom formen i en beholder fyldt med ren isopropylalkohol (IPA) og hvirvel væsken (vask i 20 min). Tag beholderen fyldt med IPA ud af maskinen.
- Når den vaskede form er fjernet fra IPA-beholderen, skal du lægge den tilbage i vaske- og hærdningsmaskinen og postcure den i 15 minutter ved 35 ° C.
BEMÆRK: Materialetabellen rapporterer 3D-printeren og hærdnings- og vaskemaskinen, der bruges i protokollen til fremstilling af forme. 3D-modellen blev skåret i skiver med 3D-printerens proprietære udsnitssoftware.
- Anbring printet i en UV-ovn i 12 timer, og anbring det i en ovn ved 80 °C i 12 timer.
BEMÆRK: Dette trin sikrer, at al polymer hærdes, og at al uhærdet polymer fjernes fra udskriften, da det forhindrer PDMS i at hærde. - Silaniser formen gennem dampaflejring af trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan.
- Anbring 3D-formen i en vakuumtørrer sammen med 20 μL 100% koncentreret Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan pipetteret på en aluminiumsfolie placeret tæt på formen.
- Opret et vakuum i tørrekatoren for at generere damp og lad det stå i 40 minutter.
- Fjern formen fra tørremaskinen, og skyl den med ren ethanol, inden du hælder PDMS på den.
3. Fremstilling af den mikrofluidiske chip
- Forbered en PDMS-blanding ved at blande elastomeren med dens tværbindingsmiddel (Materialetabel). Rør blandingen kraftigt for at blande de to komponenter ensartet, indtil der dannes luftbobler, og PDMS-blandingen ser uigennemsigtig ud.
BEMÆRK: Mængden af tværbindingsled skal være 10 vægtprocent af mængden af elastomer. - Afgas blandingen af elastomer og tværbindingsmiddel i en vakuumtørrer for at fjerne de fangede luftbobler. Blandingen i tørremaskinen overføres til den beholder, der anvendes til blanding (trin 3.1). Fortsæt afgasningsprocessen, indtil alle boblerne er fjernet, og blandingen ser gennemsigtig ud igen.
BEMÆRK: Den tid, der typisk kræves til udtørring, er 30 minutter. - Hæld 3 g af blandingen på siliciummasteren for at producere skabelonen, som vil tjene som "gulvet" i den mikrofluidiske chip.
BEMÆRK: Tykkelsen af PDMS-laget kan indstilles ved at ændre mængden af blanding, der hældes på siliciummasteren.- For at opnå en 400 μm tyk skabelon skal du hælde 3 g PDMS på siliciummasteren, placere siliciummasteren på en spincoater og dreje frakke ved 21 × g i 5 s og 54 × g i 10 s og derefter afgasse igen som beskrevet i trin 3.2 for at fjerne fangede luftbobler.
- Hæld 20 g PDMS-blandingen på den 3D-printede form for at fremstille mikrokanalen, der vil fungere som "tag" på den mikrofluidiske chip, og afgasse den som beskrevet i trin 3.2 i 30 minutter.
- Bag både siliciumskiven og den 3D-printede form ved 70 °C i mindst 2 timer.
- Skræl PDMS-laget af den 3D-trykte form, skær PDMS med et blad rundt om mikrokanalerne, og stans hullerne, der vil fungere som indløb og udløb af den mikrofluidiske kanal.
- Skræl PDMS af siliciummasteren, og skær PDMS-laget i mindre stykker med de samme dimensioner af de mikrofluidiske kanaler, der vil blive bundet oven på skabelonerne.
- Gnid forsigtigt skabelonerne og mikrokanalerne ved hjælp af en 1% vaskemiddelopløsning (se materialetabellen) i 5 minutter og skyl derefter med deioniseret vand. Skyl derefter skabelonerne og mikrokanalerne med isopropanol og skyl dem med deioniseret vand. Tør skabelonerne og mikrokanalerne ved stuetemperatur i 1 min med trykluft ved 1 bar.
- Placer skabelonerne og mikrokanalerne i en plasmarenser med overfladerne, der skal limes, vendt mod op. Tænd plasmarenseren, og plasmabehandling skabelonerne og mikrokanalerne i 40 s. Tag dem ud af plasmarenseren og lim straks mikrokanalerne oven på skabelonerne ved at sætte dem i kontakt med hinanden.
- Opbevar de mikrofluidiske chips i en ovn ved 70 °C i fem dage for at sikre PDMS hydrofob genvinding og have en vigende kontaktvinkel inden for det optimale område, mellem 30 og 60 °10,11.
4. Bakteriel mønster
- En dag før eksperimentet vokser en population af Escherichia coli (stamme MG1655 prpsM-GFP). Inokuler kulturen direkte fra den frosne bestand og dyrk natten over i 20 timer i lysogent bouillon (LB) medium i en shaker inkubator ved 37 ° C. Tilsæt 50 μg/ml kanamycin for cellerne for at bevare prpsM-GFP-plasmidet.
- På forsøgsdagen skal kasseinkubatoren (figur 2A) sættes til 37 °C flere timer før forsøget for at have en ensartet og stabil temperatur, inden forsøget påbegyndes. Sæt sprøjtepumpen og den opvarmede glasplade op på mikroskoptrinnet (figur 2B,C), og indstil temperaturen til samme temperatur som kasseinkubatoren.
BEMÆRK: Kasseinkubatoren, hvor hele systemet, inklusive mikroskopet (figur 2E), er lukket, sikrer, at der opretholdes en ensartet og konstant temperatur gennem hele eksperimentet, når kanalen skylles med medium. - Halvfems minutter før eksperimentet skal du lægge den mikrofluidiske chip i en beholder fyldt med 100% ethanol (EtOH) og skylle kanalen med 100% EtOH i mindst 10 minutter. Anbring den mikrofluidiske chip i en vakuumtørrer og afgas i mindst 30 minutter. Udskift EtOH med destilleret vand, og vakuumbehandl chippen i mindst 30 minutter. Sæt den mikrofluidiske chip i ovnen ved 70 °C i 10 minutter for at fjerne eventuelle spor af væske, der er tilbage i kanalen.
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at forhindre bobledannelse i kanalen, når den skylles med kulturmedium. Denne bobleforebyggelsesprotokol blev tilpasset fra Wang et al.18. - Pipette 1 ml 3-(N-morpholino)propansulfonsyre (MOPS) medium (1x) i et hætteglas med centrifuge og tilsættes 10 μL 0,132 M kaliumphosphat (K2HPO4). Tag overnatningskulturen ud af 37 °C-inkubatoren og aliquot 100 μL i centrifugehætteglasset og centrifuger kulturen ved 2.300 × g i 2 minutter. Rør forsigtigt supernatanten ud af centrifugehætteglassene, og resuspend pillen i 1 ml frisk MOPS-medium med 0,015% v/v Tween 20 og 0,01% v/v kaliumphosphat.
BEMÆRK: Den typiske koncentration af bakteriesuspensionen ligger i området 0,015-0,15 vol%, hvilket sikrer dannelsen af en udvidet og mobil akkumuleringszone og forhindrer akkumulering af partikler på substratet. Udskiftning af natmediet med frisk medium minimerer risikoen for at frigive film af bakterier på skabelonen. Manglen på kulstofkilde i det friske medium forhindrer celler i at vokse i suspensionen under skabelonmønster. En koncentration på 0,015 % v/v tween 20 i suspensionen er nødvendig for, at kontaktvinklen for den vigende væske på PDMS-skabelonen kan falde inden for det optimale område mellem 30 og 60°. - Læg bakteriesuspensionen i en 1 ml sprøjte og tilslut sprøjten til chippen gennem mikrofluidisk slange.
- For at sikre forbindelsen mellem sprøjten og slangen skal du indsætte en nål med en ydre diameter på 0,6 mm direkte i slangen. For at undgå spredning af ophæng, der er tilbage i indløbets nærhed over kanalen, skylles frisk medium gennem hullet, der anvendes som udløb under mønsterprocessen (figur 3A-III), i stedet for det hul, der anvendes som indløb.
- Monter sprøjten på sprøjtepumpen, og injicer suspensionen i den mikrofluidiske chip gennem indløbet placeret ved den opstrøms del af kanalen, indtil suspensionen dækker skabelonområdet med fælder.
BEMÆRK: Under væskeindsprøjtningsprocessen kan luft slippe ud gennem et udløb placeret i den nedstrøms ende af kanalen. - Sæt sprøjtepumpen til at trække bakteriesuspensionen (figur 3A-I) ud med en strømningshastighed på 0,07-0,2 μL/min, hvilket i den beskrevne geometri svarer til en menisk vigende hastighed på 80-100 μm/min.
- Overvåg mønsterprocessen via mikroskopsoftware.
BEMÆRK: Her blev en 10x forstørrelse brugt til at overvåge den vigende menisk på skabelonen, og en 20x forstørrelse blev brugt til at overvåge aflejringen af individuelle bakterier i de mikrofabrikerede fælder.
- Når skabelonen er blevet mønstret med celler (figur 3A-II), skal du øge tilbagetrækningsstrømningshastigheden for hurtigt at tømme den mikrofluidiske kanal og skylle den med frisk LB, der tidligere blev afgasset i mindst 30 minutter og forvarmet ved 30 ° C.
- Indstil sprøjtepumpen til en strømningshastighed på 2 μL/min for forsigtigt at skylle kanalen. Når kanalen er fyldt, øges strømningshastigheden (15 μL/min) i henhold til de specifikke eksperimentelle behov.
- Erhverv billeder af voksende bakterier ved den ønskede forstørrelse og tidsinterval.
5. Kolloidt mønster
- Pipette 900 μL af en 0,015 % v/v Tween 20 vandig opløsning i et hætteglas med centrifuger og pipette 100 μL af den oprindelige kolloide suspension ind i den. Centrifugering af suspensionen ved 13.500 × g i 1 min. Fjern forsigtigt supernatanten, og udskift den med den vandige Tween 20 (0,015 % v/v) opløsning. Gentag denne proces tre gange for at sikre fuldstændig udskiftning af leverandørens opløsningsmiddel fra lagersuspensionen.
- Læg den kolloide suspension i en 1 ml sprøjte og tilslut sprøjten til chippen gennem mikrofluidisk slange. Injicer suspensionen i den mikrofluidiske chip gennem indløbet placeret i den centrale sektion ved den opstrøms del af kanalen, og skub gradvist suspensionen, indtil skabelonen er dækket.
- Træk den kolloide suspension ud med en strømningshastighed på 0,07-0,2 μL/min, hvilket svarer til en menisk vigendehastighed på 1-2 μm/min, og aftryk mønsterprocessen via mikroskopsoftware. Brug 10x forstørrelse til at overvåge den vigende menisk på skabelonen og 20x forstørrelse for at observere aflejringen af individuelle partikler i de mikrofabrikerede fælder. Forøg strømningshastigheden, når menisken når slutningen af skabelonen for hurtigt at tømme kanalen.
BEMÆRK: Kolloide arrays sammensat af flere partikler kan fremstilles ved at køre mønsterprocessen fra trin 5.1 til 5.3 i serie. Kanalen er fyldt med en ny kolloidal suspension ved hver iteration i henhold til den ønskede kolloide arrays sammensætning. Hvert mønstertrin tilføjer en partikel til det kolloide array og kan køres sekventielt, indtil fælderne er blevet fyldt med den ønskede partiklers sekvens. Sammensætningen af de resulterende kolloide arrays er udelukkende givet ved sekvensen af kolloide suspensioner, der anvendes til at fylde fælderne (figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mikrofluidisk platform, der udnytter kapillaritetsassisteret samling til at mønstre kolloide partikler og bakterier i fælder, der er mikrofabrikerede på en PDMS-skabelon, blev udviklet. To forskellige kanalgeometrier er designet til at optimere mønstret af kolloider og bakterier gennem den kapillaritetsassisterede samling. Den første kanalgeometri (figur 1B) består af tre 23 mm lange parallelle sektioner uden fysisk barriere mellem dem. De to sektioner på siderne er 5 mm brede og 1 mm høje, mens den centrale sektion er 7 mm bred og 500 μm høj. Dette design hjælper med at opretholde en veldefineret bevægelig dråbe med en vigende konveksformet menisk. Arbejdsprincippet for denne platform er beskrevet detaljeret af Pioli et al.11. Hvis eksperimentet kræver fyldning af laterale kanaler, som i tilfælde af bakteriedyrkning, dannes der normalt luftlommer. Af denne grund designede og testede vi en anden geometri, der forenkler påfyldningsprocessen, når kanalen skylles med medium. I dette tilfælde består platformen (figur 1C) af en enkelt 20 mm lang, 3 mm bred og 500 μm høj lige kanal.
Temperaturen i den mikrofluide kanal er en vigtig parameter for at sikre en effektiv aflejringsproces. Det skal holdes 15 °C over dugpunktet for vand for at undgå kondens på skabelonen. Den opvarmede glasplade under kanalen (figur 2D) sikrer en ensartet temperatur på tværs af skabelonen for at forhindre kondens under mønsterprocessen i området tæt på væske-luft-grænsefladen, der er kendetegnet ved en høj dampkoncentration i luften. Temperaturen på den opvarmede glasplade skal være den samme som for kasseinkubatoren for at undgå kondens på skabelonen.
Den lige kanalgeometri blev udnyttet til at mønstre stationære fasede celler (figur 4A) af en fluorescerende E. coli-stamme (MG1655 prpsM-GFP). Bakterier blev deponeret i 83% af de 5.000 analyserede fælder. Cellerne blev først anbragt i fælderne i henhold til den fremlagte protokol og derefter dyrket i 4 timer ved 37 °C i LB skyllet ved 10 mm/min. Mønstrede bakterier genoptog væksten på forskellige tidspunkter inden for 1,5 timer fra, da kanalen blev fyldt med frisk LB (figur 4B-I), med medianen på 44 minutter. Når væksten er genoptaget, begynder enkelte bakterieceller at danne individuelle kolonier, som udvider sig (figur 4B-II), indtil der dannes et overfladelag (3,5 timer), og enkeltcelleopløsningen går tabt (figur 4B-III).
Dette proof-of-concept-eksperiment viser, at kapillaritetsassisteret samling i en mikrofluidisk kanal kan bruges til at mønstre en overflade med tusindvis af levedygtige enkeltbakterieceller. Elleve replikater viser, at mønstrede celler voksede i 45,5% af tilfældene inden for et 7 timers vindue. Fire tests udført tilsætning af propidiumiodid (PI), en levende-død plet19, til den friske LB skyllet ind i kanalen efter aflejringen viste, at ikke-voksende, mønstrede bakterier ikke blev farvet. Da PI binder sig til DNA, men ikke kan trænge ind i celler med en intakt membran, viser PI-farvningseksperimentet, at hverken mønsterprocessen eller udtørrings- og rehydreringsprocesserne beskadigede cellernes membran.
Den tre-sektions kanalgeometri blev brugt til at producere lineære kolloide arrays med forskellige sammensætninger ved at udføre sekventiel mønster af kolloide partikler. Figur 5 viser de forskellige kolloide arrays dannet gennem sekventiel mønster, herunder dimerer (figur 5A,B) og trimere (figur 5C), der indeholder henholdsvis to og tre sekventielt fangede partikler. Grønne og røde fluorescerende polystyrenpartikler blev brugt til at samle både dimerer og trimere. Analyse udført over 55.000 fælder viser, at grøn-røde (G-R) dimerer (figur 5A,B) fremstillet af partikler med 2 μm og 1 μm i diameter blev dannet i henholdsvis 93% og 89% af de analyserede fælder. Grøn-rød-grøn (G-R-G) trimmere (figur 5C) blev dannet i 52% af de 55.000 analyserede fælder11. Dimers og trimers blev samlet ved at køre sekventielle aflejringer, hvor de kolloide suspensioner bevægede sig i samme retning på tværs af alle sekventielle aflejringer (figur 3B). Som følge heraf er partikler fanget i hvert aflejringstrin i direkte kontakt med dem, der er fanget i den foregående.
Præcis positionering af partikler kræver ikke direkte kontakt mellem deponerede partikler. Afstanden mellem mønstrede partikler kan styres præcist ved at udføre to aflejringer i modsatte retninger og dermed fange sådanne partikler i de modsatte ender af hver fælde (figur 5D). Afstanden mellem de fangede partikler kan indstilles ved at designe fælder med den ønskede længde. En yderligere mulighed, som platformen tilbyder, er kemisk mønster af overfladen med mikrometrisk præcision. Dette resultat kan opnås ved at mønstre skabelonen med kemisk funktionaliserede partikler11.
Figur 1: Mikrofluidiske kanalers geometrier og mønsterproces. A) Skematisk oversigt over et sidebillede af den mikrofluidiske kanal under mønster af kolloide partikler. Den flydende suspension fordamper inde i den mikrofluidiske kanal, og konvektive strømme transporterer suspenderede partikler mod luft-væske-grænsefladen. Partikler akkumuleres således og danner akkumuleringszonen. Sprøjtepumpen trækker væskesuspensionen, hvilket får den til at trække sig tilbage, og individuelle partikler bliver fanget under den flydende recession på skabelonen. Pilen repræsenterer den retning, hvor suspensionen bevæger sig. B) Skematisk oversigt over den kanalgeometri, der anvendes til at mønstre kolloide partikler på PDMS-skabelonen. Kanalen er 23 mm lang og 17 mm bred og består af tre sektioner: en central, der er 7 mm bred og to laterale, der er 5 mm brede. Skabelonen er på kanalens gulv inden for den centrale sektion. Tværsnittet viser, at den centrale del af den mikrofluidiske kanal, hvor væskesuspensionen er begrænset gennem hele mønsterprocessen, er den laveste del af kanalen og er 500 μm høj, mens de to laterale sektioner begge er 1 mm høje. (C) Skematisk oversigt over den lige kanalgeometri, der anvendes til at mønstre bakterier. Den mikrofluidiske enhed består af en 20 mm lang, 3 mm bred og 500 μm høj lige kanal. Den rektangulære sektion af denne mikrofluidiske enhed, vist i tværsnittet, forenkler kanalens påfyldningsproces med medium. SEM-billedet viser en lille del af PDMS-skabelonen med 2 μm lange, 1 μm brede og 500 nm dybe fælder mikrofabrikeret på den. Skalastang = 2 μm. Forkortelser: PDMS = polydimethylsiloxan; SEM = scanning elektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skematisk oversigt over platformen til sekventiel kapillaritetsassisteret samling i en mikrofluidisk kanal. A) Kasseinkubator. Kasseinkubatoren opretholder en ensartet og konstant temperatur (her 30 °C) inde i den mikrofluidiske kanal. (B) Sprøjte fyldt med flydende suspension. Sprøjten styres af en sprøjtepumpe (ikke vist) og bruges til at styre væskens bevægelse under mønsterprocessen. C) Opvarmet glasplade. Den opvarmede glasplade placeres under den mikrofluidiske kanal og sikrer en ensartet temperatur (her 30 °C) på tværs af skabelonen, hvilket er afgørende for at undgå kondens i nærheden af luft-væske-grænsefladen. D) Mikrofluidisk chip fyldt med en flydende suspension. Den mikrofluidiske chips gulv bærer fælderne, hvor bakterier og kolloider bliver mønstret under mønsterprocessen. E) Mikroskop. Den opvarmede glasplade og den mikrofluidiske chip placeres på et mikroskopstadium, der giver fuld optisk adgang under mønsterprocessen og alle de følgende trin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skematisk over de trin, der er involveret i bakteriel og kolloid mønster. Hvert panel viser en indre visning af den mikrofluidiske kanal og indeholder kun en lille del af PDMS-skabelonen. (A) Mønster af bakterier gennem kapillaritetsassisteret samling. (I) Bakteriesuspensionen fordamper inde i den mikrofluidiske kanal, hvilket får konvektive strømme til at transportere suspenderede bakterier til luft-væske-grænsefladen og danner således akkumuleringszonen. I mellemtiden trækkes suspensionen af sprøjtepumpen og trækker sig tilbage på skabelonen. Pilen repræsenterer den retning, hvor bakteriesuspensionen bevæger sig. Den vigende suspension fejer hen over skabelonen, og individuelle celler deponeres i de mikrofabrikerede fælder. (II) Aflejrede bakterier udsættes for luft, indtil kanalen skylles med frisk medium. Aflejringsprocessen er overstået, når den flydende suspension når slutningen af skabelonen. (III) Den mikrofluidiske kanal skylles med frisk medium (dvs. LB). Pilen repræsenterer den retning, hvor det friske medium skylles. (B) Mønster af kolloide partikler gennem sekventiel kapillaritetsassisteret samling. (I) Den kolloide suspension falder tilbage på skabelonen under fordampning, og partikler akkumuleres ved luft-væske-grænsefladen og danner akkumuleringszonen. Individuelle partikler deponeres i fælderne mikrofabrikeret på skabelonen. Pilen repræsenterer den retning, hvor den kolloide suspension bevæger sig. II) Aflejringsprocessen er afsluttet, når den flydende suspension når slutningen af skemaet. (III) En anden aflejring køres i samme retning som den første aflejring for at placere en anden partikel i hver fælde på skabelonen. (IV) Når den anden aflejring er overstået, er skabelonen mønstret med dimerer af en grøn og en rød partikel. Forkortelser: PDMS = polydimethylsiloxan; LB = Lysogeny bouillon. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: PDMS-skabelon mønstret med E. coli (stamme MG1655 prpsM-GFP) celler. A) SEM-billede af individuelle E. coli-celler , der er fanget i fælder på 2 μm, 1 μm brede og 500 nm. Celler blev fanget efter en enkelt aflejring. Skalabjælke = 2 μm. (B) Epifluorescensbilleder af en lille del af PDMS-skabelonen (ca. 80 μm x 80 μm) med fangede celler af E. coli , efter at den mikrofluidiske kanal er fyldt med dyrkningsmedium (lysogen bouillon) ved en starthastighed på 1,3 mm/min, som derefter øges til 10 mm/min. Fangede celler vokser og deler sig flere gange i 4 timer, til sidst fusionerer med celler fra nabofælder og dækker overfladen. Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: PDMS = polydimethylsiloxan; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kolloide klynger samlet gennem sekventiel kapillaritetsassisteret partikelsamling i den mikrofluidiske platform (første kanalgeometri). Epifluorescensmikroskopibillede af (A) 15 dimerer samlet af polystyrenpartikler med en diameter på 2 μm med to sekventielle aflejringer. B) Dimere (n = 15) samlet af polystyrenpartikler med en diameter på 1 μm med to sekventielle aflejringer. C) Trimere (n = 15) samlet af polystyrenpartikler med en diameter på 1 μm med tre sekventielle aflejringer. (D) Fælder (n = 15) med partikler mønstret i ekstremiteterne af hver fælde ved at køre to sekventielle aflejringer i modsatte retninger. Afstanden mellem partikler i en fælde er 2 μm. Skalabjælker = 4 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mikrofluidiske platform, der er beskrevet her, tillader mønster af objekter i mikrostørrelse, såsom kolloider og bakterier, i foreskrevne rumlige arrangementer på et PDMS-substrat. Den fulde kontrol over miljøforholdene, der tilbydes af mikrofluidik, og evnen til at mønstre celler med mikrometrisk præcision givet af sCAPA-teknologi gør det til en meget lovende platform for fremtidige fysiologiske og økologiske undersøgelser.
I de eksperimenter, der blev præsenteret i dette arbejde, blev siliciummesteren realiseret ved hjælp af photoresist rapporteret i table of Materials. Imidlertid kan enhver fotoresist, der er egnet til at producere funktioner i det beskrevne størrelsesområde og kan bruges med PDMS-støbning, bruges. Det samme gælder for 3D-udskrivningsharpiksen, der bruges til at forberede mikrokanalformen. Enhver harpiks, der er i stand til at producere egenskaber af den beskrevne dimension og kompatibel med PDMS-støbning, kan anvendes.
I denne protokol optimerer opbevaring af de mikrofluidiske chips ved 70 °C i 5 dage overfladehydrofiliciteten (kontaktvinklen falder mellem 30 og 60 °), når Tween 20 tilsættes til bakteriesuspensionen eller den kolloide suspension. Denne procedure sikrer den bedste reproducerbarhed for den vigende kontaktvinkel under disse forsøgsbetingelser; andre opbevaringstider og temperaturer kan dog også fungere.
To anvendelser af denne mikrofluidiske teknik er blevet præsenteret: 1) bakteriemønster, der involverer individuelle aflejringer af bakterieceller i fælderne på PDMS-substratet, og 2) kolloidt mønster, der involverer sekventielle aflejringer af kolloider, opnåelse af kolloide arrays af forskellige sammensætninger. Denne platform er fuldt optimeret til at sikre høje udbytter af bakteriel aflejring, med tusindvis af celler mønstret på PDMS-skabelonen. Kombinationen af kapillaritetsassisteret samling og mikrofluidik sikrer enkeltcelleopløsning og stabil strøm af næringsstoffer i flere timer med fuld optisk adgang gennem hele processen. De mønstrede celler er i stand til at genoptage væksten, når den mikrofluidiske kanal skylles med frisk medium, selvom levedygtigheden af de mønstrede celler stadig skal optimeres.
I øjeblikket er den største begrænsning af denne teknik manglen på vækst af mønstrede celler i 54,5% af eksperimenterne inden for et 7 timers vindue. Dette aspekt kan være relateret til de specifikke bakteriearter og skal undersøges yderligere for at bestemme årsagen til den stress, der forhindrer celler i at vokse igen. Lufteksponering og den kraft, der udøves af menisken under mønsterprocessen, kan være blandt de største bidragydere til bakteriel stress. Flere mulige løsninger kan implementeres for at reducere sådanne kilder til stress, herunder brugen af dybere fælder for at reducere den kraft, der påføres celler af menisken under mønsterprocessen. En yderligere mulighed for at reducere spændingen forbundet med lufteksponering ville være at sænke temperaturen på den opvarmede glasplade. En temperatur på 30 °C sikrer en tilstrækkelig fordampningshastighed af den flydende suspension under mønsterprocessen og vil reducere den varme, bakterier udsættes for, efter at de er mønstret på skabelonen, før mediet skylles.
Når den er fuldt optimeret, forestiller vi os, at denne platform vil blive brugt i en række biologiske undersøgelser, der involverer kvantitativ enkeltcelleanalyse. Teknikkens høje gennemstrømningskarakter tillader mønster af tusinder af celler, hvilket giver store statistikker inden for samme eksperimentelle arena. Fuld optisk adgang gør det muligt at spore adfærd, vækst og molekylære aktiviteter hos et stort antal enkeltmikroorganismer over tid, hvilket giver store fordele i undersøgelsen af fænotypisk heterogenitet under homogene miljøforhold. Den mikrofluidiske karakter af denne platform sikrer fuld kontrollerbarhed over miljøforhold såsom mediesammensætning, strømningshastighed og temperatur, for blot at nævne nogle få.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender støtte fra SNSF PRIMA grant 179834 (til ES), et ETH Research Grant ETH-15 17-1 (RS) og en Gordon og Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (grant GBMF9197) (R. S.). Forfatterne takker Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (University of Granada, Spanien) for SEM-billeddannelse af bakterier og for de indsigtsfulde diskussioner. Forfatterne takker Dr. Jen Nguyen (University of British Columbia, Canada), Dr. Laura Alvarez (ETH Zürich, Schweiz), Cameron Boggon (ETH Zürich, Schweiz) og Dr. Fabio Grillo for de indsigtsfulde diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
