Summary
Nous présentons une technologie qui utilise l’assemblage assisté par capillarité dans une plate-forme microfluidique pour modeler des objets de taille micro en suspension dans un liquide, tels que des bactéries et des colloïdes, dans des réseaux prescrits sur un substrat de polydiméthylsiloxane.
Abstract
La modelage contrôlé des micro-organismes dans des arrangements spatiaux définis offre des possibilités uniques pour un large éventail d’applications biologiques, y compris des études de la physiologie microbienne et des interactions. Au niveau le plus simple, une modélisation spatiale précise des micro-organismes permettrait une imagerie fiable et à long terme d’un grand nombre de cellules individuelles et transformerait la capacité d’étudier quantitativement les interactions microbe-microbe dépendantes de la distance. De manière plus unique, le couplage d’une modélisation spatiale précise et d’un contrôle total des conditions environnementales, tel qu’offert par la technologie microfluidique, fournirait une plate-forme puissante et polyvalente pour les études unicellulaires en écologie microbienne.
Cet article présente une plate-forme microfluidique pour produire des modèles polyvalents et définis par l’utilisateur de micro-organismes dans un canal microfluidique, permettant un accès optique complet pour une surveillance à long terme et à haut débit. Cette nouvelle technologie microfluidique est basée sur l’assemblage de particules assisté par capillarité et exploite les forces capillaires résultant du mouvement contrôlé d’une suspension d’évaporation à l’intérieur d’un canal microfluidique pour déposer des objets microdimensionnels individuels dans un réseau de pièges microfabriqués sur un substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS). Les dépôts séquentiels génèrent la disposition spatiale souhaitée d’un ou de plusieurs types d’objets de micro-taille, dictée uniquement par la géométrie des pièges et la séquence de remplissage.
La plate-forme a été calibrée à l’aide de particules colloïdales de différentes dimensions et matériaux: elle s’est avérée être un outil puissant pour générer divers motifs colloïdaux et effectuer la fonctionnalisation de surface des particules piégées. En outre, la plate-forme a été testée sur des cellules microbiennes, en utilisant des cellules d’Escherichia coli comme bactérie modèle. Des milliers de cellules individuelles ont été modelées à la surface et leur croissance a été surveillée au fil du temps. Dans cette plate-forme, le couplage du dépôt unicellulaire et de la technologie microfluidique permet à la fois la modélisation géométrique des micro-organismes et le contrôle précis des conditions environnementales. Il ouvre ainsi une fenêtre sur la physiologie des microbes isolés et l’écologie des interactions microbe-microbe, comme le montrent des expériences préliminaires.
Introduction
La modélisation spatiale de micro-organismes uniques, en particulier dans les arènes expérimentales qui permettent un contrôle total des conditions environnementales, telles que les dispositifs microfluidiques, est hautement souhaitable dans un large éventail de contextes. Par exemple, organiser les micro-organismes en réseaux réguliers permettrait l’imagerie précise d’un grand nombre de cellules individuelles et l’étude de leur croissance, de leur physiologie, de leur expression génique en réponse à des stimuli environnementaux et de leur susceptibilité aux médicaments. Il permettrait également d’étudier les interactions cellule-cellule présentant un intérêt particulier dans la recherche sur la communication cellulaire (p. ex., la détection du quorum), l’alimentation croisée (p. ex., symbiose algale-bactérienne) ou l’antagonisme (p. ex., l’allélopathie), avec un contrôle total sur la localisation spatiale des cellules les unes par rapport aux autres. Les études de physiologie et d’évolution cellulaire1, les études d’interaction cellule-cellule2, le dépistage de la différenciation phénotypique3, la surveillance de l’environnement4 et le dépistage des médicaments5 font partie des domaines qui peuvent grandement bénéficier d’une technologie capable de réaliser une telle analyse quantitative unicellulaire.
Plusieurs stratégies pour isoler et manipuler des cellules individuelles ont été proposées au cours des dernières années, allant des pièges optiques holographiques6 et des méthodes de fonctionnalisation de surface hétérogène7,8,9,10 aux chimiostats unicellulaires11 et à la microfluidique des gouttelettes12. Ces méthodes sont soit techniquement très exigeantes, soit affectent la physiologie cellulaire et ne parviennent pas à fournir une plate-forme à haut débit pour modéliser des microbes qui peuvent être étudiés sur de longues périodes, assurant une résolution d’une seule cellule, un accès optique complet et un contrôle des conditions environnementales. L’objectif de cet article est de décrire une plate-forme permettant de modeler les bactéries avec une précision micrométrique dans des arrangements spatiaux prescrits sur une surface PDMS grâce à un assemblage assisté par capillarité. Cette plate-forme permet une modélisation spatiale précise et flexible des microbes et permet un accès optique complet et un contrôle des conditions environnementales, grâce à sa nature microfluidique.
La technologie derrière cette plate-forme est une technologie d’assemblage développée ces dernières années, nommée sCAPA13,14,15 (assemblage séquentiel de particules assistées par capillarité) qui a été intégrée dans une plate-forme microfluidique16. Le ménisque d’une gouttelette liquide en évaporation, tout en reculant sur un substrat de polydiméthylsiloxane à motifs (PDMS) à l’intérieur d’un canal microfluidique, exerce des forces capillaires qui piègent les particules colloïdales individuelles en suspension dans le liquide dans des puits micrométriques microfabriqués sur le substrat (Figure 1A). Les particules en suspension sont d’abord transportées vers l’interface air-liquide par des courants convectifs, puis placées dans les pièges par capillarité. Les forces capillaires exercées par le ménisque en mouvement agissent à plus grande échelle par rapport aux forces impliquées dans les interactions des particules.
Ainsi, le mécanisme d’assemblage n’est pas influencé par le matériau, les dimensions et les propriétés de surface des particules. Des paramètres tels que la concentration en particules, la vitesse du ménisque, la température et la tension superficielle de la suspension sont les seuls paramètres qui influencent le rendement du processus de modelage. Le lecteur peut trouver une description détaillée de l’influence des paramètres susmentionnés sur le processus de modelage dans 13,14,15. Dans la technologie sCAPA d’origine13,14,15, le processus de modelage colloïdal était effectué dans un système ouvert et nécessitait un étage piézoélectrique de haute précision pour entraîner la suspension à travers le gabarit. Cette plateforme exploite une stratégie différente et permet d’effectuer le modelage avec des équipements standards généralement utilisés en microfluidique dans un environnement contrôlé, minimisant ainsi les risques de contamination des échantillons.
Cette plate-forme microfluidique a d’abord été optimisée sur des particules colloïdales pour créer des réseaux réguliers de particules inertes, puis appliquée avec succès aux bactéries. Les deux plateformes microfluidiques sont décrites dans cet article (Figure 1B,C). La plupart des étapes préparatoires et de l’équipement expérimental décrits dans le protocole sont communs pour les deux applications (Figure 2). Nous rapportons des motifs colloïdaux pour démontrer que la technique peut être utilisée pour effectuer plusieurs dépôts séquentiels sur la même surface afin de créer des motifs complexes et multimatériaux. En particulier, une seule particule a été déposée par piège pour chaque étape afin de former des réseaux colloïdaux avec une géométrie et une composition spécifiques, uniquement dictées par la géométrie et la séquence de remplissage des pièges. En ce qui concerne les motifs bactériens, des dépôts uniques sont décrits, ce qui entraîne le dépôt d’une bactérie par piège. Une fois que les cellules sont modelées à la surface, le canal microfluidique est rincé avec un milieu pour favoriser la croissance bactérienne, l’étape préliminaire de toute étude unicellulaire.
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Protocol
1. Préparation du maître de silicium
REMARQUE: Les modèles PDMS portant les pièges microfabriqués qui forment le modèle pour les motifs colloïdaux et microbiens ont été fabriqués selon la méthode introduite par Geissler et al. 17. Le maître de silicium a été préparé par lithographie conventionnelle dans une salle blanche. Reportez-vous aux étapes suivantes pour la procédure et à la table des matériaux pour l’équipement.
- Concevez les fonctionnalités à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO).
- Préparez le masque en verre chromé avec une couche de résine photosensible positive en exposant les caractéristiques conçues avec un enregistreur laser direct UV.
- Développez le masque chrome-verre avec un développeur de spin en utilisant un développeur au rapport photorésine / eau de 1: 4 pendant 15 s.
- Immerger le masque dans un éthographe au chrome pendant 50 s.
- Traiter au plasma une plaquette de silicium de 10 cm pendant 3 min à 600 W.
- Déposer à la vapeur une couche d’hexaméthyldisilizane et cuire au four à 110 °C pour améliorer l’adhérence vers la résine photosensible.
- Déposez une couche de résine photosensible à 4 500 × g pendant 2 min.
- Exposez la fonction aux UV à travers le masque en verre chromé avec un aligneur de masque pendant 2 s et développez-la avec un développeur comme pour le masque.
- Pour compléter la fabrication du maître de silicium, gravez la plaquette via un échange d’ions réactif profond, en ajustant le temps de gravure (<2 min) pour atteindre la profondeur souhaitée (mesurée avec un profilomètre).
2. Préparation de moules à microcanaux
- Concevez le canal avec un logiciel de CAO et découpez-le avec un logiciel de découpe pour convertir le modèle conçu en instructions pour l’imprimante 3D, en réglant la distance de découpage à 0,05 mm.
- Imprimez le canal avec une imprimante 3D pendant environ 1 h.
- Lavez et postcurez le moule dans une machine à durcir et à laver dédiée.
- Mettez le moule dans un récipient rempli d’alcool isopropylique pur (IPA) et vortexez le liquide (laver pendant 20 min). Sortez le récipient rempli d’IPA de la machine.
- Une fois le moule lavé retiré du récipient IPA, remettez-le dans la machine à laver et à durcir et postcurez-le pendant 15 min à 35 °C.
REMARQUE: La table des matériaux indique l’imprimante 3D et la machine de durcissement et de lavage utilisée dans le protocole de préparation du moule. Le modèle 3D a été découpé avec le logiciel de découpe propriétaire de l’imprimante 3D.
- Placez l’impression dans un four UV pendant 12 h et placez-la dans un four à 80 °C pendant 12 h.
REMARQUE: Cette étape garantit que tout le polymère est durci et que tout le polymère non durci est retiré de l’impression, car cela empêcherait le durcissement du PDMS. - Silaniser le moule par dépôt en phase vapeur de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane.
- Placez le moule 3D dans un dessiccateur sous vide avec 20 μL de trichloro concentré à 100% (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane pipeté sur une feuille d’aluminium placée près du moule.
- Créez un vide dans le dessiccateur pour générer de la vapeur et laissez agir pendant 40 min.
- Retirez le moule du dessiccateur et rincez-le avec de l’éthanol pur avant de verser du PDMS dessus.
3. Fabrication de la puce microfluidique
- Préparer un mélange PDMS en mélangeant l’élastomère avec son agent de réticulation (Table des matériaux). Remuez vigoureusement le mélange pour mélanger les deux composants uniformément jusqu’à ce que des bulles d’air se forment et que le mélange PDMS semble opaque.
REMARQUE: La quantité de réticulation doit être de 10% en poids de la quantité d’élastomère. - Dégazez le mélange d’élastomère et d’agent de réticulation dans un dessiccateur sous vide pour éliminer les bulles d’air piégées. Transférer le mélange dans le dessiccateur dans le récipient utilisé pour le mélange (étape 3.1). Continuez le processus de dégazage jusqu’à ce que toutes les bulles aient été enlevées et que le mélange ait à nouveau l’air transparent.
REMARQUE: Le temps généralement requis pour la dessiccation est de 30 min. - Versez 3 g du mélange sur le maître de silicium pour produire le gabarit, qui servira de « plancher » de la puce microfluidique.
REMARQUE: L’épaisseur de la couche PDMS peut être réglée en modifiant la quantité de mélange versée sur le maître de silicium.- Pour obtenir un gabarit de 400 μm d’épaisseur, versez 3 g de PDMS sur le maître de silicium, placez le maître de silicium sur un enduit de spin et faites tourner le manteau à 21 × g pendant 5 s et 54 × g pendant 10 s, puis dégazez à nouveau comme décrit à l’étape 3.2 pour éliminer les bulles d’air piégées.
- Versez 20 g du mélange PDMS sur le moule imprimé en 3D pour fabriquer le microcanal, qui servira de « toit » de la puce microfluidique, et dégazez-le comme décrit à l’étape 3.2 pendant 30 min.
- Cuire la plaquette de silicium et le moule imprimé en 3D à 70 °C pendant au moins 2 h.
- Décollez la couche PDMS du moule imprimé en 3D, coupez le PDMS avec une lame autour des microcanaux et percez les trous qui serviront d’entrée et de sortie du canal microfluidique.
- Retirez le PDMS du maître de silicium et coupez la couche PDMS en morceaux plus petits avec les mêmes dimensions que les canaux microfluidiques qui seront collés sur les gabarits.
- Frottez doucement les gabarits et les microcanaux à l’aide d’une solution détergente à 1% (voir le tableau des matériaux) pendant 5 min, puis rincez à l’eau désionisée. Ensuite, rincez les gabarits et les microcanaux avec de l’isopropanol et rincez-les à l’eau désionisée. Sécher les gabarits et les microcanaux à température ambiante pendant 1 min avec de l’air comprimé à 1 bar.
- Placez les gabarits et les microcanaux dans un nettoyeur plasma avec les surfaces à coller vers le haut. Allumez le nettoyeur plasma et traitez les modèles et les microcanaux au plasma pendant 40 s. Retirez-les du nettoyeur plasma et liez immédiatement les microcanaux au-dessus des gabarits en les mettant en contact les uns avec les autres.
- Conservez les puces microfluidiques dans un four à 70 °C pendant cinq jours pour assurer la récupération hydrophobe du PDMS et avoir un angle de contact en recul dans la plage optimale, entre 30 et 60 °10,11.
4. Motif bactérien
- Un jour avant l’expérience, développer une population d’Escherichia coli (souche MG1655 prpsM-GFP). Inoculer la culture directement à partir du bouillon congelé et faire pousser pendant la nuit pendant 20 h dans un bouillon de lysogénie (LB) dans un incubateur agitateur à 37 °C. Ajouter 50 μg/mL de kanamycine pour que les cellules retiennent le plasmide prpsM-GFP.
- Le jour de l’expérience, réglez l’incubateur de boîte (Figure 2A) à 37 °C plusieurs heures avant l’expérience pour avoir une température uniforme et stable avant de commencer l’expérience. Installez la pompe à seringue et la plaque de verre chauffée sur l’étage du microscope (Figure 2B, C), en réglant la température à la même température que l’incubateur de boîte.
REMARQUE: L’incubateur de boîte dans lequel l’ensemble du système, y compris le microscope (Figure 2E), est enfermé garantit qu’une température uniforme et constante est maintenue tout au long de l’expérience lorsque le canal est rincé avec du milieu. - Quatre-vingt-dix minutes avant l’expérience, placez la puce microfluidique dans un récipient rempli de 100% d’éthanol (EtOH) et rincez le canal avec 100% d’EtOH pendant au moins 10 min. Placez la puce microfluidique dans un dessiccateur sous vide et dégazez pendant au moins 30 min. Échangez l’EtOH avec de l’eau distillée et traitez la puce sous vide pendant au moins 30 min. Mettez la puce microfluidique dans le four à 70 °C pendant 10 min pour éliminer toute trace de liquide laissée dans le canal.
REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour empêcher la formation de bulles dans le canal lorsqu’il est rincé avec un milieu de culture. Ce protocole de prévention des bulles a été adapté de Wang et al.18. - Pipette 1 mL de milieu d’acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS) (1x) dans un flacon de centrifugeuse et ajouter 10 μL de phosphate de potassium 0,132 M (K2HPO4). Sortir la culture de nuit de l’incubateur à 37 °C et aliquoter 100 μL dans le flacon de centrifugeuse et centrifuger la culture à 2 300 × g pendant 2 min. Pipeter doucement le surnageant hors des flacons de centrifugeuse et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu MOPS frais avec 0,015 % v/v de Tween 20 et 0,01 % v/v de phosphate de potassium.
REMARQUE: La concentration typique de la suspension bactérienne est comprise entre 0,015 et 0,15 vol%, ce qui assure la formation d’une zone d’accumulation étendue et mobile et empêche l’accumulation de particules sur le substrat. Le remplacement du milieu de nuit par un milieu frais minimise les risques de libération de films de bactéries sur le gabarit. Le manque de source de carbone dans le milieu frais empêche les cellules de se développer dans la suspension pendant le modelage du gabarit. Une concentration de 0,015 % v/v de Tween 20 dans la suspension est nécessaire pour que l’angle de contact du liquide en recul sur le gabarit PDMS se situe dans la plage optimale, entre 30 et 60°. - Chargez la suspension bactérienne dans une seringue de 1 mL et connectez la seringue à la puce à travers un tube microfluidique.
- Pour fixer la connexion entre la seringue et le tube, insérez directement une aiguille d’un diamètre extérieur de 0,6 mm dans le tube. Pour éviter de disperser toute suspension restant dans le voisinage de l’entrée à travers le canal, rincer le milieu frais à travers le trou utilisé comme sortie pendant le processus de modelage (figure 3A-III), plutôt que le trou utilisé comme entrée.
- Montez la seringue sur la pompe à seringue et injectez la suspension dans la puce microfluidique par l’entrée située dans la partie amont du canal jusqu’à ce que la suspension recouvre la région du gabarit avec des pièges.
REMARQUE: Pendant le processus d’injection de liquide, l’air peut s’échapper par une sortie située à l’extrémité aval du canal. - Réglez la pompe à seringue pour prélever la suspension bactérienne (figure 3A-I) à un débit de 0,07-0,2 μL/min, ce qui, dans la géométrie décrite, correspond à une vitesse de recul du ménisque de 80 à 100 μm/min.
- Surveillez le processus de modelage via un logiciel de microscope.
REMARQUE: Ici, un grossissement de 10x a été utilisé pour surveiller le ménisque en recul sur le gabarit, et un grossissement de 20x a été utilisé pour surveiller le dépôt de bactéries individuelles dans les pièges microfabriqués.
- Une fois que le gabarit a été modelé avec des cellules (Figure 3A-II), augmentez le débit de retrait pour vider rapidement le canal microfluidique et rincez-le avec du LB frais qui a été préalablement dégazé pendant au moins 30 min et préavertissé à 30 °C.
- Réglez la pompe à seringue à un débit de 2 μL/min pour rincer doucement le canal. Une fois le canal rempli, augmenter le débit (15 μL/min) en fonction des besoins expérimentaux spécifiques.
- Acquérir des images de bactéries en croissance au grossissement et à l’intervalle de temps souhaités.
5. Motifs colloïdaux
- Pipette 900 μL d’une solution aqueuse Tween 20 à 0,015 % v/v dans un flacon de centrifugeuse et pipette 100 μL de la suspension colloïdale d’origine. Centrifuger la suspension à 13 500 × g pendant 1 min. Retirez délicatement le surnageant et remplacez-le par la solution aqueuse Tween 20 (0,015 % v/v). Répétez ce processus trois fois pour assurer le remplacement complet du solvant du fournisseur de la suspension de stock.
- Chargez la suspension colloïdale dans une seringue de 1 mL et connectez la seringue à la puce à travers un tube microfluidique. Injecter la suspension dans la puce microfluidique à travers l’entrée située dans la section centrale, dans la partie amont du canal, et pousser progressivement la suspension jusqu’à ce que le gabarit soit recouvert.
- Prélever la suspension colloïdale à un débit de 0,07-0,2 μL/min, ce qui correspond à une vitesse de recul du ménisque de 1-2 μm/min, et imager le processus de modelage via un logiciel de microscope. Utilisez un grossissement de 10x pour surveiller le ménisque en recul sur le gabarit et un grossissement de 20x pour observer le dépôt de particules individuelles dans les pièges microfabriqués. Augmentez le débit une fois que le ménisque atteint la fin du gabarit pour vider le canal rapidement.
REMARQUE: Des réseaux colloïdaux composés de plusieurs particules peuvent être produits en exécutant le processus de modelage des étapes 5.1 à 5.3 en série. Le canal est chargé d’une nouvelle suspension colloïdale à chaque itération en fonction de la composition des réseaux colloïdaux souhaités. Chaque étape de modelage ajoute une particule au réseau colloïdal et peut être exécutée séquentiellement jusqu’à ce que les pièges aient été remplis avec la séquence de particules souhaitée. La composition des réseaux colloïdaux résultants est uniquement donnée par la séquence de suspensions colloïdales utilisées pour remplir les pièges (Figure 3B).
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Representative Results
Une plate-forme microfluidique qui exploite l’assemblage assisté par capillarité pour modeler des particules colloïdales et des bactéries dans des pièges microfabriqués sur un modèle PDMS a été développée. Deux géométries de canaux différentes ont été conçues pour optimiser le modelage des colloïdes et des bactéries grâce à l’assemblage assisté par capillarité. La première géométrie du canal (figure 1B) se compose de trois sections parallèles de 23 mm de long sans barrière physique entre elles. Les deux sections sur les côtés ont une largeur de 5 mm et une hauteur de 1 mm, tandis que la section centrale mesure 7 mm de large et 500 μm de haut. Cette conception aide à maintenir une gouttelette mobile bien définie avec un ménisque de forme convexe en recul. Le principe de fonctionnement de cette plateforme est décrit en détail par Pioli et al.11. Si l’expérience nécessite de remplir les canaux latéraux, comme dans le cas de la culture de bactéries, des poches d’air se forment généralement. Pour cette raison, nous avons conçu et testé une deuxième géométrie qui simplifie le processus de remplissage lorsque le canal est rincé avec du milieu. Dans ce cas, la plate-forme (Figure 1C) se compose d’un seul canal droit de 20 mm de long, 3 mm de large et 500 μm de haut.
La température dans le canal microfluidique est un paramètre important pour assurer un processus de dépôt efficace. Il doit être maintenu à 15 °C au-dessus du point de rosée de l’eau pour éviter la condensation sur le gabarit. La plaque de verre chauffée sous le canal (Figure 2D) assure une température uniforme à travers le gabarit pour éviter la condensation pendant le processus de modelage dans la région proche de l’interface liquide-air, caractérisée par une forte concentration de vapeur dans l’air. La température de la plaque de verre chauffée doit être la même que celle de l’incubateur de boîte pour éviter la condensation sur le gabarit.
La géométrie du canal droit a été exploitée pour modeler des cellules stationnaires (Figure 4A) d’une souche fluorescente d’E. coli (MG1655 prpsM-GFP). Les bactéries se sont déposées dans 83 % des 5 000 pièges analysés. Les cellules ont d’abord été placées dans les pièges selon le protocole présenté, puis cultivées pendant 4 h à 37 °C dans du LB rincé à 10 mm/min. Les bactéries à motifs ont repris leur croissance à différents moments dans les 1,5 h suivant le remplissage du canal avec du LB frais (figure 4B-I), la médiane étant de 44 min. Une fois la croissance reprise, les cellules bactériennes simples commencent à former des colonies individuelles, qui se dilatent (figure 4B-II) jusqu’à ce qu’une couche superficielle se forme (3,5 h) et que la résolution d’une seule cellule soit perdue (figure 4B-III).
Cette expérience de preuve de concept montre que l’assemblage assisté par capillarité dans un canal microfluidique peut être utilisé pour modeler une surface avec des milliers de cellules monobactéries viables. Onze répliques montrent que les cellules à motifs ont augmenté dans 45,5% des cas dans une fenêtre de 7 heures. Quatre tests effectués en ajoutant de l’iodure de propidium (IP), une tache morte vivante19, au LB frais rincé dans le canal après le dépôt ont prouvé que les bactéries non en croissance et à motifs ne se sont pas colorées. Comme l’IP se lie à l’ADN mais ne peut pas pénétrer dans les cellules avec une membrane intacte, l’expérience de coloration PI montre que ni le processus de modelage ni les processus de dessiccation et de réhydratation n’ont endommagé la membrane des cellules.
La géométrie des canaux à trois sections a été utilisée pour produire des réseaux colloïdaux linéaires avec différentes compositions en effectuant des motifs séquentiels de particules colloïdales. La figure 5 montre les différents réseaux colloïdaux formés par motif séquentiel, y compris les dimères (Figure 5A, B) et les trimères (Figure 5C), contenant respectivement deux et trois particules piégées séquentiellement. Des particules de polystyrène fluorescentes vertes et rouges ont été utilisées pour assembler les dimères et les trimères. L’analyse effectuée sur plus de 55 000 pièges montre que des dimères vert-rouge (G-R) (Figure 5A,B) fabriqués par des particules de 2 μm et 1 μm de diamètre ont été formés dans 93 % et 89 % des pièges analysés, respectivement. Des trimères vert-rouge-vert (G-R-G) (figure 5C) ont été formés dans 52 % des 55 000 pièges analysés11. Les dimères et les trimères ont été assemblés en exécutant des dépôts séquentiels, les suspensions colloïdales se déplaçant dans la même direction sur tous les dépôts séquentiels (figure 3B). En conséquence, les particules piégées à chaque étape de dépôt sont en contact direct avec celles piégées dans la précédente.
Le positionnement précis des particules ne nécessite pas de contact direct entre les particules déposées. La distance entre les particules à motifs peut être contrôlée avec précision en effectuant deux dépôts dans des directions opposées, piégeant ainsi ces particules aux extrémités opposées de chaque piège (Figure 5D). La distance entre les particules piégées peut être réglée en concevant des pièges avec la longueur souhaitée. Une possibilité supplémentaire offerte par la plate-forme est le modelage chimique de la surface avec une précision micrométrique. Ce résultat peut être obtenu en modelant le gabarit avec des particules fonctionnalisées chimiquement11.
Figure 1 : Géométries et processus de modelage des canaux microfluidiques. (A) Schéma d’une section de vue latérale du canal microfluidique lors de la modelage des particules colloïdales. La suspension liquide s’évapore à l’intérieur du canal microfluidique et les courants convectifs transportent les particules en suspension vers l’interface air-liquide. Les particules s’accumulent ainsi et forment la zone d’accumulation. La pompe à seringue tire la suspension liquide, l’incitant à reculer, et les particules individuelles sont piégées pendant la récession liquide sur le gabarit. La flèche représente la direction dans laquelle la suspension se déplace. (B) Schéma de la géométrie du canal utilisé pour modeler les particules colloïdales sur le modèle PDMS. Le canal mesure 23 mm de long et 17 mm de large et se compose de trois sections: une centrale de 7 mm de large et deux latérales de 5 mm de large. Le gabarit se trouve sur le plancher du canal, dans la section centrale. La section transversale montre que la section centrale du canal microfluidique, où la suspension liquide est confinée tout au long du processus de modelage, est la partie la moins profonde du canal et mesure 500 μm de haut, tandis que les deux sections latérales mesurent toutes deux 1 mm de haut. (C) Schéma de la géométrie du canal droit utilisé pour modeler les bactéries. Le dispositif microfluidique se compose d’un canal droit de 20 mm de long, 3 mm de large et 500 μm de haut. La section rectangulaire de ce dispositif microfluidique, représentée dans la section transversale, simplifie le processus de remplissage du canal avec du milieu. L’image SEM montre une petite partie du modèle PDMS avec des pièges microfabriqués de 2 μm de long, 1 μm de large et 500 nm de profondeur. Barre d’échelle = 2 μm. Abréviations : PDMS = polydiméthylsiloxane; MEB = microscopie électronique à balayage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schéma de la plate-forme pour l’assemblage séquentiel assisté par capillarité dans un canal microfluidique. (A) Incubateur de boîtes. L’incubateur à boîte maintient une température uniforme et constante (ici, 30 °C) à l’intérieur du canal microfluidique. (B) Seringue chargée d’une suspension liquide. La seringue est contrôlée par une pompe à seringue (non montrée) et est utilisée pour contrôler le mouvement du liquide pendant le processus de modelage. (C) Plaque de verre chauffée. La plaque de verre chauffée est placée sous le canal microfluidique et assure une température uniforme (ici, 30 °C) à travers le gabarit, ce qui est essentiel pour éviter la condensation à proximité de l’interface air-liquide. D) Puce microfluidique chargée d’une suspension liquide. Le sol de la puce microfluidique porte les pièges dans lesquels les bactéries et les colloïdes sont modelés pendant le processus de modelage. E) Microscope. La plaque de verre chauffée et la puce microfluidique sont placées sur une scène de microscope, ce qui permet un accès optique complet pendant le processus de modelage et toutes les étapes suivantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Schéma des étapes impliquées dans le modelage bactérien et colloïdal. Chaque panneau affiche une vue interne du canal microfluidique et n’inclut qu’une petite partie du modèle PDMS. (A) Modelage des bactéries par assemblage assisté par capillarité. (I) La suspension bactérienne s’évapore à l’intérieur du canal microfluidique, provoquant le transport des bactéries en suspension par les courants convectifs vers l’interface air-liquide, formant ainsi la zone d’accumulation. Pendant ce temps, la suspension est tirée par la pompe à seringue et recule sur le gabarit. La flèche représente la direction dans laquelle la suspension bactérienne se déplace. La suspension en recul balaye le gabarit et des cellules individuelles sont déposées dans les pièges microfabriqués. (II) Les bactéries déposées sont exposées à l’air jusqu’à ce que le canal soit rincé avec du milieu frais. Le processus de dépôt est terminé lorsque la suspension liquide atteint la fin du gabarit. (III) Le canal microfluidique est rincé avec un milieu frais (c.-à-d. LB). La flèche représente la direction dans laquelle le milieu frais est rincé. (B) Modelage des particules colloïdales par assemblage séquentiel assisté par capillarité. (I) La suspension colloïdale recule sur le gabarit en s’évaporant et les particules s’accumulent à l’interface air-liquide, formant la zone d’accumulation. Des particules individuelles sont déposées dans les pièges microfabriqués sur le gabarit. La flèche représente la direction dans laquelle la suspension colloïdale se déplace. (II) Le processus de dépôt est terminé lorsque la suspension liquide atteint la fin du gabarit. (III) Un deuxième dépôt est exécuté dans la même direction que le premier dépôt pour placer une deuxième particule dans chaque piège sur le gabarit. (IV) Une fois le deuxième dépôt terminé, le gabarit est modelé avec des dimères d’une particule verte et d’une particule rouge. Abréviations : PDMS = polydiméthylsiloxane; LB = Bouillon de lysogénie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Modèle PDMS avec des cellules E. coli (souche MG1655 prpsM-GFP). (A) Image SEM de cellules individuelles d’E. coli piégées dans des pièges de 2 μm de long, 1 μm de large et 500 nm de profondeur. Les cellules ont été piégées après un seul dépôt. Barre d’échelle = 2 μm. (B) Images d’épifluorescence d’une petite partie du gabarit PDMS (environ 80 μm x 80 μm) avec des cellules piégées d’E. coli après que le canal microfluidique est rempli de milieu de culture (bouillon de lysogénie) à une vitesse initiale de 1,3 mm/ min, qui est ensuite augmentée à 10 mm / min. Les cellules piégées se développent et se divisent plusieurs fois pendant 4 h, fusionnant finalement avec les cellules des pièges voisins et recouvrant la surface. Barres d’échelle = 10 μm. Abréviations : PDMS = polydiméthylsiloxane; GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Amas colloïdaux assemblés par assemblage séquentiel de particules assistées par capillarité dans la plate-forme microfluidique (géométrie du premier canal). Image de microscopie à épifluorescence de (A) 15 dimères assemblés à partir de particules de polystyrène de 2 μm de diamètre avec deux dépôts séquentiels. (B) Dimères (n = 15) assemblés à partir de particules de polystyrène de 1 μm de diamètre avec deux dépôts séquentiels. (C) Trimères (n = 15) assemblés à partir de particules de polystyrène de 1 μm de diamètre avec trois dépôts séquentiels. (D) Pièges (n = 15) avec des particules modelées aux extrémités de chaque piège en exécutant deux dépôts séquentiels dans des directions opposées. La distance entre les particules dans un piège est de 2 μm. Barres d’échelle = 4 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La plate-forme microfluidique décrite ici permet de modeler des objets de taille micro, tels que des colloïdes et des bactéries, dans des arrangements spatiaux prescrits sur un substrat PDMS. Le contrôle total des conditions environnementales offertes par la microfluidique et la capacité de modeler les cellules avec une précision micrométrique accordée par la technologie sCAPA en font une plate-forme très prometteuse pour les futures études de physiologie et d’écologie.
Dans les expériences présentées dans ce travail, le maître de silicium a été réalisé en utilisant la résine photosensible rapportée dans la Table des Matériaux. Cependant, toute résine photosensible adaptée pour produire des caractéristiques dans la gamme de tailles décrite et utilisable avec le moulage PDMS pourrait être utilisée. Il en va de même pour la résine d’impression 3D utilisée pour préparer le moule à microcanaux. Toute résine capable de produire des caractéristiques de la dimension décrite et compatible avec le moulage PDMS peut être utilisée.
Dans ce protocole, le stockage des puces microfluidiques à 70 °C pendant 5 jours optimise l’hydrophilie de surface (angle de contact compris entre 30 et 60°) lorsque Tween 20 est ajouté à la suspension bactérienne ou colloïdale. Cette procédure assure la meilleure reproductibilité pour l’angle de contact en recul dans ces conditions expérimentales; cependant, d’autres temps et températures de stockage peuvent également fonctionner.
Deux applications de cette technique microfluidique ont été présentées: 1) le modelage bactérien impliquant des dépôts individuels de cellules bactériennes dans les pièges sur le substrat PDMS, et 2) le modelage colloïdal impliquant des dépôts séquentiels de colloïdes, obtenant des réseaux colloïdaux de compositions différentes. Cette plate-forme a été entièrement optimisée pour assurer des rendements élevés de dépôts bactériens, avec des milliers de cellules modelées sur le modèle PDMS. La combinaison de l’assemblage assisté par capillarité et de la microfluidique assure une résolution unicellulaire et un flux stable de nutriments pendant plusieurs heures, avec un accès optique complet tout au long du processus. Les cellules à motifs sont capables de reprendre leur croissance une fois que le canal microfluidique est rincé avec un milieu frais, bien que la viabilité des cellules à motifs doive encore être optimisée.
Actuellement, la principale limite de cette technique est le manque de croissance des cellules à motifs dans 54,5% des expériences dans une fenêtre de 7 heures. Cet aspect peut être lié à l’espèce bactérienne spécifique et doit être étudié plus avant pour déterminer la cause profonde du stress qui empêche les cellules de repousser. L’exposition à l’air et la force exercée par le ménisque pendant le processus de modelage peuvent être parmi les principaux contributeurs au stress bactérien. Plusieurs solutions possibles peuvent être mises en œuvre pour réduire ces sources de stress, y compris l’utilisation de pièges plus profonds pour réduire la force appliquée sur les cellules par le ménisque pendant le processus de modelage. Une option supplémentaire pour réduire le stress associé à l’exposition à l’air serait de diminuer la température de la plaque de verre chauffée. Une température de 30 °C assure un taux d’évaporation suffisant de la suspension liquide pendant le processus de modelage et réduirait la chaleur à laquelle les bactéries sont exposées après avoir été modelées sur le gabarit avant que le milieu ne soit rincé.
Une fois entièrement optimisée, nous prévoyons que cette plate-forme sera utilisée dans une variété d’études biologiques impliquant une analyse quantitative unicellulaire. La nature à haut débit de la technique permet de modéliser des milliers de cellules, fournissant de grandes statistiques dans la même arène expérimentale. L’accès optique complet permet de suivre le comportement, la croissance et les activités moléculaires d’un grand nombre de micro-organismes uniques au fil du temps, offrant ainsi des avantages majeurs dans l’étude de l’hétérogénéité phénotypique dans des conditions environnementales homogènes. La nature microfluidique de cette plate-forme assure une contrôlabilité totale sur les conditions environnementales telles que la composition du milieu, le débit et la température, pour n’en nommer que quelques-unes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le soutien de la subvention PRIMA du FNS 179834 (à E.S.), d’une subvention de recherche de l’ETH ETH-15 17-1 (R. S.) et d’une bourse de chercheur de la Fondation Gordon et Betty Moore sur la symbiose microbienne aquatique (subvention GBMF9197) (R. S.). Les auteurs remercient le Dr Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (Université de Grenade, Espagne) pour l’imagerie SEM des bactéries et pour les discussions perspicaces. Les auteurs remercient le Dr Jen Nguyen (Université de la Colombie-Britannique, Canada), la Dre Laura Alvarez (ETH Zürich, Suisse), Cameron Boggon (ETH Zürich, Suisse) et le Dr Fabio Grillo pour leurs discussions perspicaces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
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