Summary
Vi presenterer en teknologi som bruker kapillæritetsassistert montering i en mikrofluidisk plattform for å mønstre mikrostore gjenstander suspendert i en væske, for eksempel bakterier og kolloider, i foreskrevne matriser på et polydimetylsiloksansubstrat.
Abstract
Kontrollert mønster av mikroorganismer i definerte romlige ordninger gir unike muligheter for et bredt spekter av biologiske anvendelser, inkludert studier av mikrobiell fysiologi og interaksjoner. På det enkleste nivået vil nøyaktig romlig mønster av mikroorganismer muliggjøre pålitelig, langsiktig avbildning av et stort antall individuelle celler og forvandle evnen til kvantitativt å studere avstandsavhengige mikrobemikrobeinteraksjoner. Mer unikt vil kobling av nøyaktig romlig mønster og full kontroll over miljøforholdene, som tilbys av mikrofluidisk teknologi, gi en kraftig og allsidig plattform for encellede studier i mikrobiell økologi.
Dette dokumentet presenterer en mikrofluidisk plattform for å produsere allsidige og brukerdefinerte mønstre av mikroorganismer i en mikrofluidisk kanal, noe som gir fullstendig optisk tilgang for langsiktig overvåking av høy gjennomstrømning. Denne nye mikrofluidiske teknologien er basert på kapillæritetsassistert partikkelmontering og utnytter kapillærkreftene som oppstår fra den kontrollerte bevegelsen av en fordampende suspensjon inne i en mikrofluidisk kanal for å deponere individuelle mikrosized objekter i en rekke feller mikrofabricated på en polydimetylsiloxan (PDMS) substrat. Sekvensielle avsetninger genererer ønsket romlig layout av enkelt- eller flere typer mikrostore objekter, diktert utelukkende av geometrien til fellene og fyllingssekvensen.
Plattformen har blitt kalibrert ved hjelp av kolloidale partikler av forskjellige dimensjoner og materialer: det har vist seg å være et kraftig verktøy for å generere forskjellige kolloidale mønstre og utføre overflatefunksjonalisering av fanget partikler. Videre ble plattformen testet på mikrobielle celler, ved hjelp av Escherichia coli-celler som modellbakterie. Tusenvis av individuelle celler ble mønstret på overflaten, og veksten ble overvåket over tid. I denne plattformen tillater koblingen av encellet avsetning og mikrofluidisk teknologi både geometrisk mønster av mikroorganismer og presis kontroll av miljøforhold. Det åpner dermed et vindu inn i fysiologien til enkeltmikrober og økologien til mikrobe-mikrobe interaksjoner, som vist ved foreløpige eksperimenter.
Introduction
Romlig mønster av enkeltmikroorganismer, spesielt innenfor eksperimentelle arenaer som muliggjør full kontroll over miljøforhold, som mikrofluidiske enheter, er svært ønskelig i et bredt spekter av sammenhenger. For eksempel vil det å arrangere mikroorganismer i vanlige matriser tillate nøyaktig avbildning av et stort antall individuelle celler og studiet av vekst, fysiologi, genuttrykk som svar på miljøstimuli og narkotikafølsomhet. Det vil også tillate å studere cellecelleinteraksjoner av spesiell interesse for forskning på cellulær kommunikasjon (f.eks. quorumssensor), kryssfôring (f.eks. algebakteriell symbiose) eller antagonisme (f.eks. allelopati), med full kontroll over den romlige lokaliseringen av celler i forhold til hverandre. Cellefysiologi og evolusjonsstudier1, cellecelleinteraksjonsstudier2, fenotypisk differensieringsscreening3, miljøovervåking4 og legemiddelscreening5 er blant feltene som i stor grad kan dra nytte av en teknologi som er i stand til å oppnå en slik kvantitativ encellet analyse.
Flere strategier for å isolere og håndtere enkeltceller har blitt foreslått de siste årene, fra holografiske optiske feller6 og heterogene overflatefunksjonaliseringsmetoder7,8,9,10 til encellede kjemostater11 og dråpemikrofluidikk12. Disse metodene er enten teknisk svært krevende eller påvirker cellefysiologi og klarer ikke å gi en plattform med høy gjennomstrømning for å mønstre mikrober som kan studeres over lange perioder, noe som sikrer encellet oppløsning, full optisk tilgang og kontroll over miljøforholdene. Målet med dette dokumentet er å beskrive en plattform for å mønstre bakterier med mikrometrisk presisjon i foreskrevne romlige ordninger på en PDMS-overflate gjennom kapillæritetsassistert montering. Denne plattformen tillater presis og fleksibel romlig mønster av mikrober og muliggjør full optisk tilgang og kontroll over miljøforholdene, takket være dens mikrofluidiske natur.
Teknologien bak denne plattformen er en monteringsteknologi utviklet de siste årene, kalt sCAPA13,14,15 (sekvensiell kapillæritetsassistert partikkelmontering) som ble integrert i en mikrofluidisk plattform16. Menisken til en fordampende væskedråpe, mens den trekker seg tilbake over et mønstret polydimetylsiloksan (PDMS) substrat inne i en mikrofluidisk kanal, utøver kapillære krefter som fanger de enkelte kolloidale partiklene suspendert i væsken i mikrometriske brønner mikrofabricated på substratet (figur 1A). Suspenderte partikler transporteres først til luftvæskegrensesnittet ved konvektive strømmer og plasseres deretter i fellene etter kapillæritet. Kapillære krefter utøvet av den bevegelige menisken virker i større skala sammenlignet med krefter involvert i partikkelinteraksjoner.
Dermed påvirkes monteringsmekanismen ikke av partiklenes materiale, dimensjoner og overflateegenskaper. Parametere som partikkelkonsentrasjon, hastigheten på menisken, temperaturen og overflatespenningen til suspensjonen er de eneste parametrene som påvirker utbyttet av mønsterprosessen. Leseren kan finne en detaljert beskrivelse av påvirkningen av de nevnte parametrene på mønsterprosessen i13,14,15. I den opprinnelige sCAPA-teknologien13,14,15 ble den kolloidale mønsterprosessen utført i et åpent system og krevde et høypresisjons piezoelektrisk stadium for å drive suspensjonen over malen. Denne plattformen utnytter en annen strategi og gjør det mulig å utføre mønsteret med standardutstyr som vanligvis brukes i mikrofluidikk i et kontrollert miljø, og dermed minimere risikoen for å forurense prøvene.
Denne mikrofluidiske plattformen ble først optimalisert på kolloidale partikler for å skape vanlige matriser av inert partikler og deretter vellykket påført bakterier. Begge mikrofluidiske plattformer er beskrevet i dette dokumentet (figur 1B,C). De fleste forberedende trinnene og det eksperimentelle utstyret som er beskrevet i protokollen, er vanlige for de to bruksområdene (figur 2). Vi rapporterer kolloidal mønster for å demonstrere at teknikken kan brukes til å utføre flere sekvensielle avsetninger på samme overflate for å skape komplekse, multimateriale mønstre. Spesielt ble en enkelt partikkel avsatt per felle for hvert trinn for å danne kolloidale matriser med en bestemt geometri og sammensetning, utelukkende diktert av fellenes geometri og fyllingssekvens. Når det gjelder bakteriell mønster, beskrives enkle avsetninger, noe som resulterer i at en bakterie blir avsatt per felle. Når cellene er mønstret på overflaten, skylles den mikrofluidiske kanalen med medium for å fremme bakterievekst, det foreløpige trinnet i en enkeltcellet studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Silikon master forberedelse
MERK: PDMS-malene som bærer de mikrofabricated fellene som danner malen for kolloidal og mikrobiell mønster, ble fremstilt i henhold til metoden introdusert av Geissler et al. 17. Silisiummesteren ble utarbeidet av konvensjonell litografi i et rent rom. Se følgende trinn for prosedyren og materiallisten for utstyret.
- Utform funksjonene ved hjelp av CAD-programvare (Computer-Aided Design).
- Forbered kromglassmasken med et lag med positiv fotoresist ved å eksponere de designede funksjonene med en UV direkte laserskriver.
- Utvikle kromglassmasken med en spinnutvikler ved hjelp av en utvikler med 1:4 fotoresist-til-vann-forhold for 15 s.
- Senk masken ned i krometermokken i 50 s.
- Plasma-behandle en 10 cm silisiumskive i 3 min ved 600 W.
- Dampavsetning et lag av heksametyldisilizan og bake ved 110 °C for å forbedre vedheften mot fotoresisten.
- Deponer et lag fotoresist på 4500 × g i 2 min.
- Utsett funksjonen for UV gjennom kromglassmasken med en maskejustering i 2 s og utvikle med en utvikler som for masken.
- For å fullføre fabrikasjonen av silisiummesteren, ets waferen via dyp reaktiv ionutveksling, juster etsetiden (<2 min) for å oppnå ønsket dybde (målt med et profilometer).
2. Mikrokanal mold forberedelse
- Design kanalen med CAD-programvare og skjær den med en slicerprogramvare for å konvertere den designede modellen til instruksjoner for 3D-skriveren, og angi skjæreavstanden til 0,05 mm.
- Skriv ut kanalen med en 3D-skriver i ~1 t.
- Vask og legg formen i en dedikert herding og vaskemaskin.
- Legg formen i en beholder fylt med ren isopropylalkohol (IPA) og virvel væsken (vask i 20 min). Ta beholderen fylt med IPA ut av maskinen.
- Når den vaskede formen er fjernet fra IPA-beholderen, legg den tilbake i vaske- og herdemaskinen og legg den i 15 min ved 35 °C.
MERK: Materialtabellen rapporterer 3D-skriveren og herdings- og vaskemaskinen som brukes i formforberedelsesprotokollen. 3D-modellen ble kuttet med 3D-skriverens proprietære slicerprogramvare.
- Legg trykket i en UV-ovn i 12 timer og legg det i en ovn ved 80 °C i 12 timer.
MERK: Dette trinnet sikrer at all polymeren er herdet og at all usikret polymer fjernes fra trykket, da det vil forhindre at PDMS herdes. - Silaniser formen gjennom dampavsetning av Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan.
- Plasser 3D-formen i en vakuumdesiccator sammen med 20 μL 100% konsentrert Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan pipettert på en aluminiumsfolie plassert nær formen.
- Lag et vakuum i tørkeapparatet for å generere damp og la det stå i 40 minutter.
- Fjern formen fra tørkeapparatet og skyll det med rent etanol før du heller PDMS på den.
3. Fabrikasjon av mikrofluidisk brikke
- Forbered en PDMS-blanding ved å blande elastomeren med krysskoblingsmiddelet (Materialtabell). Rør blandingen kraftig for å blande de to komponentene jevnt til luftbobler dannes, og PDMS-blandingen ser ugjennomsiktig ut.
MERK: Mengden krysskobling bør være 10% etter vekt av mengden elastomer. - Degas blandingen av elastomer og krysskoblingsmiddel i en vakuumdesiccator for å fjerne de fangede luftboblene. Overfør blandingen i tørkemiddelet til beholderen som brukes til blanding (trinn 3.1). Fortsett avgassingsprosessen til alle boblene er fjernet og blandingen ser gjennomsiktig ut igjen.
MERK: Tiden som vanligvis kreves for uttørking er 30 min. - Hell 3 g av blandingen på silisiummesteren for å produsere malen, som vil tjene som "gulvet" på mikrofluidisk chip.
MERK: Tykkelsen på PDMS-laget kan justeres ved å endre mengden blanding som helles på silisiummesteren.- For å få en 400 μm tykk mal, hell 3 g PDMS på silisiummesteren, plasser silisiummesteren på en spinnfrakker og spinnbelegg på 21 × g i 5 s og 54 × g i 10 s, og avfett deretter igjen som beskrevet i trinn 3.2 for å fjerne fanget luftbobler.
- Hell 20 g av PDMS-blandingen på den 3D-trykte formen for å lage mikrokanal, som vil fungere som "taket" på mikrofluidisk brikke, og degas den som beskrevet i trinn 3.2 i 30 minutter.
- Stek både silisiumskiven og den 3D-trykte formen ved 70 °C i minst 2 timer.
- Skrell PDMS-laget av den 3D-trykte formen, klipp PDMS med et blad rundt mikrokanalene, og stans hullene som vil fungere som innløp og utløp av den mikrofluidiske kanalen.
- Skrell PDMS av silisiummesteren og skjær PDMS-laget i mindre biter med de samme dimensjonene på de mikrofluidiske kanalene som skal bindes på toppen av malene.
- Gni forsiktig malene og mikrokanalnelene ved hjelp av en 1% vaskemiddelløsning (se materialtabellen) i 5 min og skyll deretter med deionisert vann. Skyll deretter malene og mikrokanalene med isopropanol og skyll dem med deionisert vann. Tørk malene og mikrokanalene ved romtemperatur i 1 min med trykkluft på 1 bar.
- Plasser malene og mikrokanalene i en plasmarenser med overflatene som skal bindes opp. Slå på plasmarenseren, og plasma behandler malene og mikrokanalene i 40 s. Ta dem ut fra plasmarenseren og bind umiddelbart mikrokanalene på toppen av malene ved å sette dem i kontakt med hverandre.
- Oppbevar mikrofluidflisene i en ovn ved 70 °C i fem dager for å sikre at PDMS-hydrofob utvinning og har en avtagende kontaktvinkel innenfor det optimale området, mellom 30 og 60 °10,11.
4. Bakteriell mønster
- En dag før eksperimentet, vokse en befolkning av Escherichia coli (stamme MG1655 prpsM-GFP). Inokuler kulturen direkte fra den frosne bestanden og vokse over natten i 20 timer i lysogen buljong (LB) medium i en shaker inkubator ved 37 °C. Tilsett 50 μg/ml kanamycin til cellene for å beholde prpsM-GFP-plasmidet.
- På eksperimentets dag setter du boksinkubatoren (figur 2A) ved 37 °C flere timer før eksperimentet har en jevn og stabil temperatur før du starter eksperimentet. Sett opp sprøytepumpen og den oppvarmede glassplaten på mikroskopstadiet (figur 2B,C), og still inn temperaturen ved samme temperatur som boksinkubatoren.
MERK: Boksinkubatoren der hele systemet, inkludert mikroskopet (figur 2E), er vedlagt sikrer at en jevn og konstant temperatur opprettholdes gjennom hele eksperimentet når kanalen skylles med medium. - Nitti minutter før eksperimentet, legg den mikrofluidiske brikken i et kar fylt med 100% etanol (EtOH) og skyll kanalen med 100% EtOH i minst 10 minutter. Plasser mikrofluidisk brikke i en vakuumdesiccator og degas i minst 30 minutter. Bytt etOH med destillert vann og vakuumbehandle brikken i minst 30 minutter. Sett den mikrofluidiske brikken i ovnen ved 70 °C i 10 minutter for å fjerne eventuelle spor av væske som er igjen i kanalen.
MERK: Dette trinnet er nødvendig for å forhindre bobledannelse i kanalen når den skylles med kulturmedium. Denne bobleforebyggende protokollen ble tilpasset fra Wang et al.18. - Pipette 1 ml 3-(N-morpholino)propansulfonsyre (MOPS) medium (1x) i et sentrifuge hetteglass og tilsett 10 μL 0,132 M kaliumfosfat (K2HPO4). Ta nattkulturen ut av 37 °C inkubatoren og aliquot 100 μL inn i sentrifuge-hetteglasset og sentrifuger kulturen på 2300 × g i 2 minutter. Rør forsiktig supernatanten ut av sentrifuge-hetteglassene, og bland pelletsen forsiktig i 1 ml friskt MOPS-medium med 0,015% v / v Tween 20 og 0,01% v / v kaliumfosfat.
MERK: Den typiske konsentrasjonen av bakteriell suspensjon er i området 0,015-0,15 vol%, noe som sikrer dannelsen av en utvidet og mobil akkumuleringssone og forhindrer opphopning av partikler på substratet. Utskifting av nattmediet med friskt medium minimerer risikoen for å slippe filmer av bakterier på malen. Mangelen på karbonkilde i det friske mediet hindrer celler i å vokse i suspensjonen under malmønster. En konsentrasjon på 0,015% v/v av Tween 20 i suspensjonen er nødvendig for at kontaktvinkelen til den tilbaketrukne væsken på PDMS-malen skal falle innenfor det optimale området, mellom 30 og 60°. - Legg bakteriell suspensjon i en 1 ml sprøyte og koble sprøyten til brikken gjennom mikrofluidisk rør.
- For å sikre forbindelsen mellom sprøyten og slangen, sett direkte inn en nål med en ytre diameter på 0,6 mm inn i slangen. For å unngå spredning av suspensjoner som er igjen i innløps nærhet over kanalen, skyll friskt medium gjennom hullet som brukes som utløp under mønsterprosessen (figur 3A-III), i stedet for hullet som brukes som innløp.
- Monter sprøyten på sprøytepumpen og injiser suspensjonen i mikrofluidisk brikke gjennom innløpet som er plassert i oppstrømsdelen av kanalen til suspensjonen dekker malområdet med feller.
MERK: Under væskeinjeksjonsprosessen kan luft slippe ut gjennom et uttak som er plassert i nedstrøms enden av kanalen. - Sett sprøytepumpen til å trekke ut bakteriell suspensjon (figur 3A-I) med en strømningshastighet på 0,07-0,2 μL/min, som i den beskrevne geometrien tilsvarer en menisk som avtar hastigheten på 80-100 μm/min.
- Overvåk mønsterprosessen via mikroskopprogramvare.
MERK: Her ble en 10x forstørrelse brukt til å overvåke den tilbaketrukne menisken på malen, og en 20x forstørrelse ble brukt til å overvåke avsetningen av individuelle bakterier i de mikrofabrerte fellene.
- Når malen er mønstret med celler (figur 3A-II), øker du uttaksstrømmen for raskt å tømme den mikrofluidiske kanalen og skylle den med fersk LB som tidligere ble avgasset i minst 30 minutter og forhåndsvarslet ved 30 °C.
- Sett sprøytepumpen i en strømningshastighet på 2 μL/min for å skylle kanalen forsiktig. Når kanalen er fylt, øker du strømningshastigheten (15 μL/min) i henhold til de spesifikke eksperimentelle behovene.
- Skaff bilder av voksende bakterier ved ønsket forstørrelse og tidsintervall.
5. Kolloidal mønster
- Pipette 900 μL av en 0,015% v / v Tween 20 vandig løsning i et sentrifuge hetteglass og pipette 100 μL av den opprinnelige kolloidale suspensjonen i den. Sentrifuger suspensjonen ved 13.500 × g i 1 min. Fjern supernatanten forsiktig og erstatt den med den vandige Tween 20 (0,015% v / v) løsningen. Gjenta denne prosessen tre ganger for å sikre fullstendig utskifting av leverandørens løsningsmiddel fra lagerfjæringen.
- Legg kolloidal suspensjonen i en 1 ml sprøyte og koble sprøyten til brikken gjennom mikrofluidisk slange. Injiser suspensjonen i mikrofluidisk brikke gjennom innløpet som ligger i den sentrale delen, i oppstrømsdelen av kanalen, og skyv gradvis suspensjonen til malen er dekket.
- Trekk ut kolloidal suspensjon med en strømningshastighet på 0,07-0,2 μL/min, noe som tilsvarer en menisk-avtagende hastighet på 1-2 μm/min, og avbilde mønsterprosessen via mikroskopprogramvare. Bruk 10x forstørrelse for å overvåke den tilbaketrukne menisken på malen og 20x forstørrelse for å observere avsetningen av individuelle partikler i de mikrofabrerte fellene. Øk strømningshastigheten når menisken når slutten av malen for å tømme kanalen raskt.
MERK: Kolloidale matriser som består av flere partikler, kan produseres ved å kjøre mønsterprosessen fra trinn 5,1 til 5,3 i serie. Kanalen er lastet med en ny kolloidal suspensjon ved hver iterasjon i henhold til ønsket kolloidale matrisesammensetning. Hvert mønstertrinn legger til en partikkel i kolloidalmatrisen og kan kjøres sekvensielt til fellene er fylt med ønsket partiklesekvens. Sammensetningen av de resulterende kolloidale matrisene er utelukkende gitt av sekvensen av kolloidale suspensjoner som brukes til å fylle fellene (figur 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mikrofluidisk plattform som utnytter kapillæritetsassistert montering for å mønster kolloidale partikler og bakterier i feller mikrofabricated på en PDMS mal ble utviklet. To forskjellige kanalgeometrier er designet for å optimalisere mønsteret av kolloider og bakterier gjennom kapillæritetsassistert montering. Den første kanalgeometrien (figur 1B) består av tre 23 mm lange parallelle seksjoner uten fysisk barriere mellom dem. De to seksjonene på sidene er 5 mm brede og 1 mm høye, mens den sentrale delen er 7 mm bred og 500 μm høy. Denne designen bidrar til å opprettholde en veldefinert bevegelig dråpe med en avtagende konveksformet menisk. Arbeidsprinsippet for denne plattformen er beskrevet i detalj av Pioli et al.11. Hvis eksperimentet krever å fylle sidekanalene, som i tilfelle bakterier som dyrker, dannes luftlommer vanligvis. Av denne grunn designet og testet vi en annen geometri som forenkler fyllingsprosessen når kanalen skylles med medium. I dette tilfellet består plattformen (figur 1C) av en enkelt 20 mm lang, 3 mm bred og 500 μm høy rett kanal.
Temperaturen i den mikrofluidiske kanalen er en viktig parameter for å sikre en effektiv avsetningsprosess. Det må opprettholdes 15 °C over duggpunktet for å unngå kondens på malen. Den oppvarmede glassplaten under kanalen (figur 2D) sikrer en jevn temperatur over hele malen for å forhindre kondens under mønsterprosessen i området nær væske-luft-grensesnittet, preget av en høy dampkonsentrasjon i luften. Temperaturen på den oppvarmede glassplaten må være den samme som for boksinkubatoren for å unngå kondens på malen.
Den rette kanalgeometrien ble utnyttet til å mønstre stasjonære fasede celler (figur 4A) av en fluorescerende E. coli-stamme (MG1655 prpsM-GFP). Bakterier ble avsatt i 83% av de 5000 analyserte fellene. Cellene ble først plassert i fellene i henhold til den presenterte protokollen og deretter vokst i 4 timer ved 37 °C i LB spylt ved 10 mm/min. Mønstrede bakterier gjenopptok veksten på forskjellige tidspunkter innen 1,5 timer fra da kanalen ble fylt med frisk LB (figur 4B-I), med medianen på 44 min. Når veksten er gjenopptatt, begynner enkeltbakterielle celler å danne individuelle kolonier, som ekspanderer (figur 4B-II) til et overflatelag dannes (3,5 timer) og encellet oppløsning går tapt (figur 4B-III).
Dette konseptgodkjenningseksperimentet viser at kapillæritetsassistert montering i en mikrofluidisk kanal kan brukes til å mønstre en overflate med tusenvis av levedyktige enkeltbakterieceller. Elleve replikeringer viser at mønstrede celler vokste i 45,5% av tilfellene i et vindu på 7 timer. Fire tester utført ved å tilsette propidiumjodid (PI), en levende død flekk19, til den friske LB spylt inn i kanalen etter avsetningen viste at ikke-voksende, mønstrede bakterier ikke ble farget. Når PI binder seg til DNA, men ikke kan trenge inn i celler med en intakt membran, viser PI-fargingseksperimentet at verken mønsterprosessen eller uttørkings- og rehydreringsprosessene skadet cellenes membran.
Tre-seksjons kanalgeometrien ble brukt til å produsere lineære kolloidale matriser med forskjellige komposisjoner ved å utføre sekvensiell mønster av kolloidale partikler. Figur 5 viser de forskjellige kolloidale matrisene som dannes gjennom sekvensiell mønster, inkludert dimmere (figur 5A, B) og trimmere (figur 5C), som inneholder henholdsvis to og tre sekvensielt fanget partikler. Grønne og røde fluorescerende polystyrenpartikler ble brukt til å montere både dimmere og trimers. Analyser utført over 55 000 feller viser at grønnrøde (G-R) dimmere (figur 5A,B) laget av partikler med henholdsvis 2 μm og 1 μm i diameter ble dannet i henholdsvis 93% og 89% av analyserte feller. Grønn-rødgrønne (G-R-G) trimers (Figur 5C) ble dannet i 52% av de 55,000 analyserte feller11. Dimers og trimers ble montert ved å kjøre sekvensielle avsetninger, med kolloidale suspensjoner som beveger seg i samme retning over alle sekvensielle avsetninger (figur 3B). Som et resultat er partikler fanget i hvert avsetningstrinn i direkte kontakt med de som er fanget i den forrige.
Nøyaktig posisjonering av partikler krever ikke direkte kontakt mellom avsatte partikler. Avstanden mellom mønstrede partikler kan kontrolleres nøyaktig ved å utføre to avsetninger i motsatte retninger, og dermed fange slike partikler i motsatte ender av hver felle (figur 5D). Avstanden mellom de fangede partiklene kan justeres ved å designe feller med ønsket lengde. En ekstra mulighet som tilbys av plattformen er kjemisk mønster av overflaten med mikrometrisk presisjon. Dette resultatet kan oppnås ved å mønstre malen med kjemisk funksjonaliserte partikler11.
Figur 1: Mikrofluidiske kanalers geometrier og mønsterprosess. (A) Skjematisk for en sidevisningsdel av den mikrofluidiske kanalen under mønster av kolloidale partikler. Væskefjæringen fordampes inne i den mikrofluidiske kanalen, og konvektive strømmer transporterer suspenderte partikler mot luftvæskegrensesnittet. Partikler akkumuleres dermed og danner akkumuleringssonen. Sprøytepumpen trekker væskefjæringen, ber den om å trekke seg tilbake, og individuelle partikler blir fanget under væskekonjunkturen på malen. Pilen representerer retningen suspensjonen beveger seg i. (B) Skjematisk for kanalgeometrien som brukes til å mønstre kolloidale partikler på PDMS-malen. Kanalen er 23 mm lang og 17 mm bred og består av tre seksjoner: en sentral som er 7 mm bred og to laterale som er 5 mm brede. Malen ligger på kanalens gulv, innenfor den sentrale delen. Tverrsnittet viser at den sentrale delen av den mikrofluidiske kanalen, hvor væskefjæringen er begrenset gjennom hele mønsterprosessen, er den grunneste delen av kanalen og er 500 μm høy, mens de to sidedelene begge er 1 mm høye. (C) Skjematisk for den rette kanalgeometrien som brukes til å mønstre bakterier. Den mikrofluidiske enheten består av en 20 mm lang, 3 mm bred og 500 μm høy rett kanal. Den rektangulære delen av denne mikrofluidiske enheten, vist i tverrsnittet, forenkler fyllingsprosessen til kanalen med middels. SEM-bildet viser en liten del av PDMS-malen med 2 μm-lange, 1 μm brede og 500 nm dype feller mikrofabricated på den. Skalastang = 2 μm. Forkortelser: PDMS = polydimetylsiloksan; SEM = skanning elektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk for plattformen for sekvensiell kapillæritetsassistert montering i en mikrofluidisk kanal. (A) Boks inkubator. Boksinkubatoren opprettholder en jevn og konstant temperatur (her 30 °C) inne i den mikrofluidiske kanalen. (B) Sprøyte lastet med væskeoppheng. Sprøyten styres av en sprøytepumpe (ikke vist) og brukes til å kontrollere væskens bevegelse under mønsterprosessen. (C) Oppvarmet glassplate. Den oppvarmede glassplaten er plassert under den mikrofluidiske kanalen og sikrer en jevn temperatur (her, 30 °C) over malen, noe som er avgjørende for å unngå kondens i nærheten av luftvæskegrensesnittet. (D) Mikrofluidisk brikke lastet med en flytende suspensjon. Den mikrofluidiske brikkens gulv bærer fellene der bakterier og kolloider blir mønstret under mønsterprosessen. (E) Mikroskop. Den oppvarmede glassplaten og den mikrofluidiske brikken plasseres på et mikroskopstadium, og gir full optisk tilgang under mønsterprosessen og alle følgende trinn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematisk for trinnene som er involvert i bakteriell og kolloidal mønster. Hvert panel viser en indre visning av den mikrofluidiske kanalen og inneholder bare en liten del av PDMS-malen. (A) Mønster av bakterier gjennom kapillæritetsassistert montering. (I) Bakteriell suspensjon fordampes inne i den mikrofluidiske kanalen, noe som får konvektive strømmer til å transportere suspenderte bakterier til luftvæskegrensesnittet, og danner dermed akkumuleringssonen. I mellomtiden trekkes suspensjonen av sprøytepumpen og trekker seg tilbake på malen. Pilen representerer retningen bakteriell suspensjon beveger seg i. Den tilbaketrukne suspensjonen feier over malen, og individuelle celler blir avsatt i de mikrofabrerte fellene. (II) Avsatte bakterier utsettes for luft til kanalen skylles med friskt medium. Avsetningsprosessen er over når væskefjæringen når slutten av malen. (III) Den mikrofluidiske kanalen skylles med friskt medium (dvs. LB). Pilen representerer retningen det friske mediet skylles i. (B) Mønster av kolloidale partikler gjennom sekvensiell kapillæritetsassistert montering. (I) Kolloidal suspensjonen avtar på malen under fordampning, og partikler akkumuleres ved luftvæskegrensesnittet og danner akkumuleringssonen. Individuelle partikler deponeres i fellene mikrofabricated på malen. Pilen representerer retningen kolloidal suspensjon beveger seg i. (II) Avsetningsprosessen er fullført når væskefjæringen når slutten av malen. (III) En annen avsetning kjøres i samme retning som den første avsetningen for å plassere en andre partikkel i hver felle på malen. (IV) Når den andre avsetningen er over, er malen mønstret med dimmere av en grønn og en rød partikkel. Forkortelser: PDMS = polydimetylsiloksan; LB = Lysogeny kjøttkraft. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: PDMS-mal mønstret med E. coli-celler (stamme MG1655 prpsM-GFP). (A) SEM-bilde av individuelle E. coli-celler fanget i 2 μm-lange, 1 μm-brede og 500 nm-dype feller. Celler ble fanget etter en enkelt avsetning. Skalastang = 2 μm. (B) Epifluorescence bilder av en liten del av PDMS-malen (ca. 80 μm x 80 μm) med fanget celler av E. coli etter at den mikrofluidiske kanalen er fylt med kulturmedium (Lysogeny buljong) med en starthastighet på 1,3 mm / min, som deretter økes til 10 mm / min. Fanget celler vokser og deler flere ganger i 4 timer, til slutt fusjonerer med celler fra nærliggende feller og dekker overflaten. Skalastenger = 10 μm. Forkortelser: PDMS = polydimetylsiloksan; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kolloidale klynger samlet gjennom sekvensiell kapillæritetsassistert partikkelmontering i den mikrofluidiske plattformen (første kanalgeometri). Epifluorescence mikroskopi bilde av (A) 15 dimmere montert fra polystyren partikler med 2 μm i diameter med to sekvensielle avsetninger. (B) Dimers (n = 15) montert fra polystyrenpartikler med 1 μm i diameter med to sekvensielle avsetninger. (C) Trimers (n = 15) montert fra polystyrenpartikler med 1 μm i diameter med tre sekvensielle avsetninger. (D) Feller (n = 15) med partikler mønstret i ekstremitetene i hver felle ved å kjøre to sekvensielle avsetninger i motsatte retninger. Avstanden mellom partikler i en felle er 2 μm. Skalastenger = 4 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mikrofluidiske plattformen som er beskrevet her, tillater mønster av mikrostore gjenstander, for eksempel kolloider og bakterier, til foreskrevne romlige ordninger på et PDMS-substrat. Full kontroll over miljøforholdene som tilbys av mikrofluidikk og evnen til å mønstre celler med mikrometrisk presisjon gitt av sCAPA-teknologi, gjør det til en svært lovende plattform for fremtidige fysiologi- og økologistudier.
I forsøkene som ble presentert i dette arbeidet, ble silisiummesteren realisert ved hjelp av fotoresisten som er rapportert i materialtabellen. Enhver fotoresist som er egnet til å produsere funksjoner i størrelsesområdet som er beskrevet og brukbar med PDMS-støping, kan imidlertid brukes. Det samme gjelder 3D-printingharpiksen som brukes til å forberede mikrokanalformen. Enhver harpiks som er i stand til å produsere funksjoner i den beskrevne dimensjonen og kompatibel med PDMS-støping, kan brukes.
I denne protokollen optimaliserer lagring av mikrofluidiske sjetonger ved 70 °C i 5 dager overflaten hydrofilisitet (kontaktvinkel som faller mellom 30 og 60°) når Tween 20 tilsetts bakteriell eller kolloidal suspensjon. Denne prosedyren sikrer den beste reproduserbarheten for den tilbaketrukne kontaktvinkelen under disse eksperimentelle forholdene; Andre lagringstider og temperaturer kan imidlertid også fungere.
To anvendelser av denne mikrofluidiske teknikken har blitt presentert: 1) bakteriell mønster som involverer individuelle avsetninger av bakterieceller i fellene på PDMS-substratet, og 2) kolloidal mønster som involverer sekvensielle avsetninger av kolloider, og oppnår kolloidale matriser av forskjellige komposisjoner. Denne plattformen er fullt optimalisert for å sikre høye utbytter av bakteriell avsetning, med tusenvis av celler mønstret på PDMS-malen. Kombinasjonen av kapillæritetsassistert montering og mikrofluidikk sikrer encellet oppløsning og stabil strøm av næringsstoffer i flere timer, med full optisk tilgang gjennom hele prosessen. De mønstrede cellene er i stand til å gjenoppta veksten når den mikrofluidiske kanalen skylles med friskt medium, selv om levedyktigheten til de mønstrede cellene fortsatt må optimaliseres.
For tiden er den største begrensningen av denne teknikken mangelen på vekst av mønstrede celler i 54,5% av forsøkene i et 7 h vindu. Dette aspektet kan være relatert til de spesifikke bakterielle artene og må undersøkes nærmere for å bestemme årsaken til stresset som forhindrer celler i å regrowing. Lufteksponering og kraften som menisken utøver under mønsterprosessen, kan være blant de viktigste bidragsyterne til bakteriell stress. Flere mulige løsninger kan implementeres for å redusere slike stresskilder, inkludert bruk av dypere feller for å redusere kraften som brukes på celler av menisken under mønsterprosessen. Et ekstra alternativ for å redusere stresset forbundet med lufteksponering ville være å redusere temperaturen på den oppvarmede glassplaten. En temperatur på 30 °C sikrer tilstrekkelig fordampningshastighet av væskefjæringen under mønsterprosessen og vil redusere varmebakteriene som utsettes for etter at de er mønstret på malen før mediet skylles.
Når plattformen er fullstendig optimalisert, ser vi for oss at denne plattformen vil bli brukt i en rekke biologiske studier som involverer kvantitativ encellet analyse. Teknikkens høye gjennomstrømnings natur tillater mønster av tusenvis av celler, og gir stor statistikk innenfor samme eksperimentelle arena. Full optisk tilgang gjør det mulig å spore oppførselen, veksten og molekylære aktiviteter til et stort antall enkeltmikroorganismer over tid, og gir dermed store fordeler i studiet av fenotypisk heterogenitet under homogene miljøforhold. Plattformens mikrofluidiske natur sikrer full kontrollerbarhet over miljøforhold som mediesammensetning, strømningshastighet og temperatur, bare for å nevne noen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner støtte fra SNSF PRIMA grant 179834 (til E.S.), et ETH Research Grant ETH-15 17-1 (R. S.), og en Gordon og Betty Moore Foundation Investigator Award on Aquatic Microbial Symbiosis (grant GBMF9197) (R. S.). Forfatterne takker Dr. Miguel Angel Fernandez-Rodriguez (Universitetet i Granada, Spania) for SEM-avbildning av bakterier og for innsiktsfulle diskusjoner. Forfatterne takker Dr. Jen Nguyen (University of British Columbia, Canada), Dr. Laura Alvarez (ETH Zürich, Sveits), Cameron Boggon (ETH Zürich, Sveits) og Dr. Fabio Grillo for innsiktsfulle diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
- Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
- Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
- Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
- Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
- Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
- Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
- Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
- Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
- Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
- Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
- Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
- Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
- Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
- Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).
