Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Моделирование микроорганизмов и микрочастиц с помощью последовательной сборки с помощью капиллярности

Published: November 4, 2021 doi: 10.3791/63131
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute of Environmental Engineering, Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, ETH Zurich, 2Department of Materials, ETH Zurich

Summary

Мы представляем технологию, которая использует сборку с помощью капиллярности в микрофлюидной платформе для формирования микроразмерных объектов, взвешенных в жидкости, таких как бактерии и коллоиды, в предписанные массивы на полидиметилсилоксановой подложке.

Abstract

Контролируемое формирование микроорганизмов в определенные пространственные механизмы предлагает уникальные возможности для широкого спектра биологических применений, включая исследования микробной физиологии и взаимодействий. На простейшем уровне точное пространственное моделирование микроорганизмов позволит получить надежную, долгосрочную визуализацию большого количества отдельных клеток и трансформирует способность количественно изучать зависящие от расстояния взаимодействия микробов и микробов. Более уникально то, что соединение точного пространственного моделирования и полного контроля над условиями окружающей среды, как предлагает микрофлюидная технология, обеспечит мощную и универсальную платформу для одноклеточных исследований в микробной экологии.

В данной работе представлена микрофлюидная платформа для получения универсальных и определяемых пользователем паттернов микроорганизмов в микрофлюидном канале, обеспечивающая полный оптический доступ для долгосрочного высокопроизводительного мониторинга. Эта новая микрофлюидная технология основана на сборке частиц с помощью капиллярности и использует капиллярные силы, возникающие в результате контролируемого движения испаряющейся суспензии внутри микрофлюидного канала, для осаждения отдельных микроразмерных объектов в массиве ловушек, микрофабрикованных на подложке из полидиметилсилоксана (PDMS). Последовательные осаждения генерируют желаемое пространственное расположение одиночных или нескольких типов микроразмерных объектов, продиктованное исключительно геометрией ловушек и последовательностью заполнения.

Платформа была откалибрована с использованием коллоидных частиц различных размеров и материалов: она зарекомендовала себя как мощный инструмент для генерации разнообразных коллоидных паттернов и выполнения функционализации поверхности захваченных частиц. Кроме того, платформа была протестирована на микробных клетках, используя клетки Escherichia coli в качестве модельной бактерии. Тысячи отдельных клеток были структурированы на поверхности, и их рост контролировался с течением времени. В этой платформе связь одноклеточного осаждения и микрофлюидной технологии позволяет как геометрически моделировать микроорганизмы, так и точно контролировать условия окружающей среды. Таким образом, он открывает окно в физиологию отдельных микробов и экологию взаимодействий микроб-микроб, как показали предварительные эксперименты.

Introduction

Пространственное моделирование отдельных микроорганизмов, особенно в экспериментальных областях, которые обеспечивают полный контроль над условиями окружающей среды, такими как микрофлюидные устройства, крайне желательно в широком диапазоне контекстов. Например, организация микроорганизмов в регулярные массивы позволит точно визуализировать большое количество отдельных клеток и изучать их рост, физиологию, экспрессию генов в ответ на стимулы окружающей среды и восприимчивость к лекарственным средствам. Это также позволило бы изучать клеточно-клеточные взаимодействия, представляющие особый интерес в исследованиях клеточной связи (например, зондирование кворума), перекрестное кормление (например, водорослево-бактериальный симбиоз) или антагонизм (например, аллелопатия) с полным контролем над пространственной локализацией клеток относительно друг друга. Исследования клеточной физиологии и эволюции1, исследования взаимодействия клеток2, скрининг фенотипической дифференцировки3, мониторинг окружающей среды4 и скрининг лекарств5 относятся к числу областей, которые могут извлечь большую пользу из технологии, способной достичь такого количественного одноклеточного анализа.

В последние годы было предложено несколько стратегий изоляции и обработки отдельных клеток, от голографических оптических ловушек6 и методов функционализации гетерогенной поверхности7,8,9,10 до одноклеточных хемостатов11 и капельной микрофлюидики12. Эти методы либо технически очень требовательны, либо влияют на физиологию клеток и не обеспечивают высокопроизводительную платформу для моделирования микробов, которые можно изучать в течение длительных периодов времени, обеспечивая одноклеточное разрешение, полный оптический доступ и контроль над условиями окружающей среды. Целью данной статьи является описание платформы для моделирования бактерий с микрометрической точностью в предписанные пространственные расположения на поверхности PDMS посредством сборки с помощью капиллярности. Эта платформа обеспечивает точное и гибкое пространственное моделирование микробов и обеспечивает полный оптический доступ и контроль над условиями окружающей среды благодаря своей микрофлюидной природе.

Технология, лежащая в основе этой платформы, представляет собой технологию сборки, разработанную в последние годы, названную sCAPA13,14,15 (последовательная сборка частиц с помощью капиллярности), которая была интегрирована в микрофлюидную платформу16. Мениск испаряющейся капли жидкости, отступая над узорчатым полидиметилсилоксановым (PDMS) субстратом внутри микрофлюидного канала, оказывает капиллярные силы, которые задерживают отдельные коллоидные частицы, взвешенные в жидкости, в микрометрические скважины, микрофабрикованные на подложке (рисунок 1A). Взвешенные частицы сначала транспортируются к границе раздела воздух-жидкость конвективными токами, а затем помещаются в ловушки по капиллярности. Капиллярные силы, оказываемые движущимся мениском, действуют в большем масштабе по сравнению с силами, участвующими во взаимодействиях частиц.

Таким образом, на механизм сборки не влияют материал, размеры и поверхностные свойства частиц. Такие параметры, как концентрация частиц, скорость мениска, температура и поверхностное натяжение суспензии, являются единственными параметрами, которые влияют на выход процесса моделирования. Подробное описание влияния вышеуказанных параметров на процесс паттернирования читатель может найти в 13,14,15. В оригинальной технологии sCAPA13,14,15 процесс коллоидного моделирования осуществлялся в открытой системе и требовал высокоточной пьезоэлектрической ступени для привода подвески по шаблону. Эта платформа использует другую стратегию и позволяет выполнять моделирование с помощью стандартного оборудования, обычно используемого в микрофлюидике в контролируемой среде, тем самым сводя к минимуму риски загрязнения образцов.

Эта микрофлюидная платформа была сначала оптимизирована на коллоидных частицах для создания регулярных массивов инертных частиц, а затем успешно применена к бактериям. Обе микрофлюидные платформы описаны в этой статье (рисунок 1B,C). Большинство подготовительных этапов и экспериментальное оборудование, описанные в протоколе, являются общими для двух применений (рисунок 2). Мы сообщаем о коллоидном паттерне, чтобы продемонстрировать, что метод может быть использован для выполнения нескольких последовательных отложений на одной и той же поверхности для создания сложных, многоматериальных паттернов. В частности, на каждую ступень на каждую ловушку наносили одну частицу для формирования коллоидных массивов с определенной геометрией и составом, продиктованным исключительно геометрией ловушек и последовательностью заполнения. Что касается бактериальной структуры, то описываются единичные осаждения, в результате чего одна бактерия осаждается на каждую ловушку. Как только клетки получают рисунок на поверхности, микрофлюидный канал промывается средой для стимулирования роста бактерий, что является предварительным этапом любого одноклеточного исследования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка силиконового мастера

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблоны PDMS, содержащие микрофабрикированные ловушки, которые образуют шаблон для коллоидного и микробного паттерна, были изготовлены в соответствии с методом, представленным Geissler et al. 17. Кремниевый мастер был подготовлен методом обычной литографии в чистом помещении. Ознакомьтесь со следующими шагами для процедуры и таблицей материалов для оборудования.

  1. Проектирование функций с помощью программного обеспечения автоматизированного проектирования (САПР).
  2. Подготовьте хромированную маску со слоем положительного фоторезиста, обнажив разработанные особенности с помощью прямого УФ-лазера.
    1. Разработайте хромированную маску со спин-разработчиком, используя разработчика при соотношении фоторезиста к воде 1:4 в течение 15 с.
    2. Погрузите маску в хромовый травиль на 50 с.
    3. Плазменная обработка кремниевой пластиной 10 см в течение 3 мин при 600 Вт.
    4. Осаждение парами слоя гексаметилдисилизана и выпекание при 110 °C для улучшения адгезии к фоторезисту.
    5. Нанесите слой фоторезиста на 4 500 × г в течение 2 мин.
    6. Подвергайте функцию воздействию ультрафиолета через хромированную маску с выравнивателем маски в течение 2 с и разрабатывайте с разработчиком как для маски.
  3. Чтобы завершить изготовление кремниевого мастера, травите пластину с помощью глубокого реакционноспособного ионного обмена, регулируя время травления (<2 мин) для достижения желаемой глубины (измеренной с помощью профилометра).

2. Микроканальная подготовка пресс-форм

  1. Спроектируйте канал с помощью программного обеспечения CAD и нарежьте его с помощью программного обеспечения слайсера, чтобы преобразовать разработанную модель в инструкции для 3D-принтера, установив расстояние нарезки на 0,05 мм.
  2. Печать канала с помощью 3D-принтера в течение ~1 ч.
  3. Мойте и вытирайте форму в специальной отверждающей и стиральной машине.
    1. Поместите форму в емкость, наполненную чистым изопропиловым спиртом (IPA) и вихреобразите жидкость (промыть в течение 20 мин). Выньте контейнер, наполненный IPA, из машины.
    2. После того, как вымытая форма будет удалена из контейнера IPA, поместите ее обратно в стиральную и отверждающую машину и вытрите ее в течение 15 минут при 35 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В Таблице материалов сообщается о 3D-принтере и отверждающей и стиральной машине, используемой в протоколе подготовки пресс-формы. 3D-модель была разрезана с помощью проприетарного программного обеспечения слайсера 3D-принтера.
  4. Поместите отпечаток в УФ-печь на 12 ч и поместите в духовку при температуре 80 °C в течение 12 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап гарантирует, что весь полимер отверждается, а весь неотвержденный полимер удаляется из печати, поскольку это предотвратит отверждение PDMS.
  5. Силанизация плесени путем осаждения из паров трихлора (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил) силана.
    1. Поместите 3D-форму в вакуумный адсикатор вместе с 20 мкл 100% концентрированного трихлора (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил) силана, пипетированного на алюминиевой фольге, размещенной близко к пресс-форме.
    2. Создайте вакуум в осушителе для образования пара и оставьте на 40 минут.
    3. Удалите форму из осушителя и промойте ее чистым этанолом, прежде чем вылить на него PDMS.

3. Изготовление микрофлюидного чипа

  1. Приготовьте смесь PDMS путем смешивания эластомера с его сшивающим агентом (Таблица материалов). Энергично перемешайте смесь, чтобы равномерно смешать два компонента, пока не образуются пузырьки воздуха, и смесь PDMS не будет выглядеть непрозрачной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество поперечного компоновщика должно составлять 10% от массы от количества эластомера.
  2. Дегазировать смесь эластомера и сшивающего агента в вакуумном осушителе для удаления захваченных пузырьков воздуха. Переложите смесь в осушителе в контейнер, используемый для смешивания (этап 3.1). Продолжайте процесс дегазации до тех пор, пока все пузырьки не будут удалены и смесь снова не станет прозрачной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время, обычно необходимое для высыхания, составляет 30 минут.
  3. Налейте 3 г смеси на кремниевый мастер для получения шаблона, который будет служить «полом» микрофлюидного чипа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толщину слоя PDMS можно настроить, изменив количество смеси, налитой на кремниевый мастер.
    1. Чтобы получить шаблон толщиной 400 мкм, налейте 3 г PDMS на кремниевый мастер, поместите кремниевый мастер на спин-коатер и спиновое покрытие на 21 × г в течение 5 с и 54 × г в течение 10 с, а затем снова дегазируйте, как описано на этапе 3.2, чтобы удалить захваченные пузырьки воздуха.
  4. Вылейте 20 г смеси PDMS на 3D-печатную форму, чтобы сделать микроканал, который будет служить «крышей» микрофлюидного чипа, и дегазировать его, как описано в шаге 3.2 в течение 30 мин.
  5. Выпекайте кремниевую пластину и 3D-печатную форму при температуре 70 °C в течение не менее 2 ч.
  6. Снимите слой PDMS с 3D-печатной формы, вырежьте PDMS лезвием вокруг микроканалов и пробьете отверстия, которые будут служить входом и выходом микрофлюидного канала.
  7. Снимите PDMS с кремниевого мастера и разрежьте слой PDMS на более мелкие куски с теми же размерами микрофлюидных каналов, которые будут скреплены поверх шаблонов.
  8. Аккуратно протрите шаблоны и микроканалы с помощью 1% моющего раствора (см. Таблицу материалов) в течение 5 мин, а затем промойте деионизированной водой. Далее промойте шаблоны и микроканалы изопропанолом и промойте их деионизированной водой. Высушите шаблоны и микроканалы при комнатной температуре в течение 1 мин сжатым воздухом при 1 баре.
  9. Поместите шаблоны и микроканалы в плазмоочиститель с поверхностями, которые должны быть склеены, обращенными вверх. Включите плазмоочиститель, и плазменная обработка шаблонов и микроканалов в течение 40 с. Извлеките их из плазменного очистителя и немедленно свяжите микроканалы поверх шаблонов, поместив их в контакт друг с другом.
  10. Храните микрофлюидные чипсы в духовке при температуре 70 °C в течение пяти дней, чтобы обеспечить гидрофобное восстановление PDMS и иметь отступающий угол контакта в оптимальном диапазоне, от 30 до 60 ° 10,11.

4. Бактериальный паттерн

  1. За сутки до начала эксперимента вырастите популяцию кишечной палочки (штамм MG1655 prpsM-GFP). Инокулируют культуру непосредственно из замороженного бульона и выращивают в течение ночи в течение 20 ч в среде лизогенного бульона (LB) в шейкерном инкубаторе при 37 °C. Добавьте 50 мкг/мл канамицина, чтобы клетки сохранили плазмиду prpsM-GFP.
  2. В день эксперимента установите коробчатый инкубатор (рисунок 2А) при 37 °C за несколько часов до начала эксперимента, чтобы иметь равномерную и стабильную температуру перед началом эксперимента. Настройте шприцевой насос и нагретую стеклянную пластину на ступень микроскопа (рисунок 2B,C), установив температуру на той же температуре, что и в коробчатом инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коробчатый инкубатор, в который заключена вся система, включая микроскоп (рисунок 2Е), обеспечивает поддержание равномерной и постоянной температуры на протяжении всего эксперимента при промывке канала средой.
  3. За девяносто минут до эксперимента поместите микрофлюидный чип в сосуд, наполненный 100% этанолом (EtOH) и промывайте канал 100% EtOH в течение не менее 10 минут. Поместите микрофлюидный чип в вакуумный осушитель и дегазируйте не менее чем на 30 минут. Замените EtOH дистиллированной водой и обработайте чип в вакууме не менее 30 минут. Поместите микрофлюидный чип в духовку при 70 °C в течение 10 минут, чтобы удалить любые следы жидкости, оставшиеся в канале.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап необходим для предотвращения образования пузырьков в канале при промывке питательной средой. Этот протокол предотвращения пузырьков был адаптирован из Wang et al.18.
  4. Пипетка 1 мл среды 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (МОПС) (1x) во флакон центрифуги и добавить 10 мкл 0,132 М фосфата калия (K2HPO4). Возьмите культуру на ночь из инкубатора с температурой 37 °C и аликвотируйте 100 мкл во флакон центрифуги и центрифугируйте культуру при 2 300 × г в течение 2 мин. Аккуратно выпейте супернатант из флаконов центрифуги и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл свежей среды MOPS с 0,015% v/v Tween 20 и 0,01% v/v калия фосфата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная концентрация бактериальной суспензии находится в диапазоне 0,015-0,15 об.%, что обеспечивает образование расширенной и подвижной зоны накопления и предотвращает накопление частиц на подложке. Замена ночной среды на свежую среду минимизирует риски высвобождения пленок бактерий на шаблоне. Отсутствие источника углерода в свежей среде препятствует росту клеток в суспензии во время шаблонного моделирования. Концентрация 0,015% v/v Tween 20 в суспензии необходима для того, чтобы угол контакта отступающей жидкости на шаблоне PDMS находился в оптимальном диапазоне, между 30 и 60°.
  5. Загрузите бактериальную суспензию в шприц объемом 1 мл и подключите шприц к чипу через микрофлюидную трубку.
    1. Чтобы закрепить соединение между шприцем и трубкой, непосредственно вставьте в трубку иглу с наружным диаметром 0,6 мм. Чтобы избежать рассеивания любой суспензии, оставшейся в непосредственной близости от входного отверстия по каналу, промывайте свежую среду через отверстие, используемое в качестве выхода во время процесса моделирования (рисунок 3A-III), а не отверстие, используемое в качестве входного отверстия.
    2. Установите шприц на шприцевой насос и впрыскивайте суспензию в микрофлюидную стружку через входное отверстие, расположенное в верхней части канала, пока подвеска не закроет область шаблона ловушками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процесса впрыска жидкости воздух может выходить через выходное отверстие, расположенное в нижнем конце канала.
    3. Установите шприцевой насос для вывода бактериальной суспензии (рис. 3А-I) со скоростью потока 0,07-0,2 мкл/мин, что в описанной геометрии соответствует скорости отступления мениска 80-100 мкм/мин.
    4. Контролируйте процесс формирования паттернов с помощью программного обеспечения микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь 10-кратное увеличение использовалось для мониторинга отступающего мениска на шаблоне, а 20-кратное увеличение использовалось для мониторинга осаждения отдельных бактерий в микрофабрикированные ловушки.
  6. После того, как шаблон был структурирован с ячейками (рисунок 3A-II), увеличьте скорость потока вывода, чтобы быстро опорожнить микрофлюидный канал и промыть его свежим LB, который ранее был дегазирован в течение не менее 30 мин и предварительно расплавлен при 30 °C.
  7. Установите шприцевой насос со скоростью потока 2 мкл/мин, чтобы осторожно промыть канал. После заполнения канала увеличьте скорость потока (15 мкл/мин) в соответствии с конкретными экспериментальными потребностями.
  8. Получайте изображения растущих бактерий при желаемом увеличении и временном интервале.

5. Коллоидный рисунок

  1. Пипетка 900 мкл 0,015% v/v Tween 20 водным раствором во флакон центрифуги и пипетка 100 мкл исходной коллоидной суспензии в нее. Центрифугируют суспензию при 13 500 × г в течение 1 мин. Аккуратно удалите супернатант и замените его водным раствором Tween 20 (0,015% v/v). Повторите этот процесс три раза, чтобы обеспечить полную замену растворителя поставщика из складской суспензии.
  2. Загрузите коллоидную суспензию в шприц объемом 1 мл и подключите шприц к чипу через микрофлюидную трубку. Введите суспензию в микрофлюидную стружку через входное отверстие, расположенное в центральной секции, в верхней части канала, и постепенно нажимайте на подвеску, пока шаблон не будет покрыт.
  3. Извлеките коллоидную суспензию со скоростью потока 0,07-0,2 мкл/мин, что соответствует скорости отступления мениска 1-2 мкм/мин, и визуализируйте процесс формирования с помощью программного обеспечения микроскопа. Используйте 10-кратное увеличение для мониторинга отступающего мениска на шаблоне и 20-кратное увеличение для наблюдения за осаждением отдельных частиц в микрофабрикированные ловушки. Увеличьте скорость потока, как только мениск достигнет конца шаблона, чтобы быстро опорожнить канал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коллоидные массивы, состоящие из нескольких частиц, могут быть получены путем последовательного запуска процесса моделирования с этапов 5.1 до 5.3. Канал загружается новой коллоидной суспензией на каждой итерации в соответствии с желаемым составом коллоидных массивов. Каждый этап моделирования добавляет одну частицу к коллоидному массиву и может выполняться последовательно, пока ловушки не будут заполнены желаемой последовательностью частиц. Состав полученных коллоидных массивов задается исключительно последовательностью коллоидных суспензий, используемых для заполнения ловушек (рис. 3В).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Была разработана микрофлюидная платформа, которая использует сборку с помощью капиллярности для формирования коллоидных частиц и бактерий в ловушки, микрофабрикованные на шаблоне PDMS. Две различные геометрии каналов были разработаны для оптимизации структурирования коллоидов и бактерий через сборку с помощью капиллярности. Геометрия первого канала (рисунок 1B) состоит из трех параллельных секций длиной 23 мм без физического барьера между ними. Две секции по бокам имеют ширину 5 мм и высоту 1 мм, в то время как центральная секция имеет ширину 7 мм и высоту 500 мкм. Такая конструкция помогает поддерживать четко выраженную движущуюся каплю с отступающим выпуклым мениском. Принцип работы этой платформы подробно описан Pioli et al.11. Если эксперимент требует заполнения боковых каналов, как в случае культивирования бактерий, обычно образуются воздушные карманы. По этой причине мы разработали и протестировали вторую геометрию, которая упрощает процесс заполнения при промывке канала средой. В этом случае платформа (рисунок 1С) состоит из одного прямого канала длиной 20 мм, шириной 3 мм и высотой 500 мкм.

Температура в микрофлюидном канале является важным параметром для обеспечения эффективного процесса осаждения. Он должен поддерживаться на 15 °C выше точки росы воды, чтобы избежать конденсации на шаблоне. Нагретая стеклянная пластина под каналом (рисунок 2D) обеспечивает равномерную температуру по всему шаблону для предотвращения конденсации во время процесса моделирования в области, близкой к границе раздела жидкость-воздух, характеризующейся высокой концентрацией пара в воздухе. Температура нагретой стеклянной пластины должна быть такой же, как и у коробочного инкубатора, чтобы избежать конденсации на шаблоне.

Геометрия прямого канала была использована для построения стационарных фазированных ячеек (рисунок 4A) флуоресцентной деформации E. coli (MG1655 prpsM-GFP). Бактерии были отложены в 83% из 5000 проанализированных ловушек. Клетки сначала помещали в ловушки в соответствии с представленным протоколом и впоследствии выращивали в течение 4 ч при 37 °C в LB, промытых со скоростью 10 мм/мин. Узорчатые бактерии возобновляли рост в разное время в течение 1,5 ч с момента заполнения канала свежим LB (рисунок 4B-I), со медианой через 44 мин. Как только рост возобновляется, одиночные бактериальные клетки начинают формировать отдельные колонии, которые расширяются (рисунок 4B-II) до тех пор, пока не образуется поверхностный слой (3,5 ч) и не теряется одноклеточное разрешение (рисунок 4B-III).

Этот эксперимент с доказательством концепции показывает, что сборка с помощью капиллярности в микрофлюидном канале может быть использована для моделирования поверхности с тысячами жизнеспособных клеток одиночных бактерий. Одиннадцать реплик показывают, что узорчатые клетки росли в 45,5% случаев в течение 7-часового окна. Четыре теста, проведенные с добавлением йодида пропидия (PI), живого мертвого пятна19, к свежему LB, смытому в канал после осаждения, доказали, что нерастающие, узорчатые бактерии не окрашиваются. Поскольку PI связывается с ДНК, но не может проникать в клетки с неповрежденной мембраной, эксперимент по окрашиванию PI показывает, что ни процесс моделирования, ни процессы высыхания и регидратации не повредили мембрану клеток.

Трехсекционная геометрия канала использовалась для получения линейных коллоидных массивов с различным составом путем выполнения последовательного паттернирования коллоидных частиц. На рисунке 5 показаны различные коллоидные массивы, сформированные путем последовательного паттерна, включая димеры (рисунок 5A, B) и тримеры (рисунок 5C), содержащие две и три последовательно захваченные частицы соответственно. Зеленые и красные флуоресцентные частицы полистирола использовались для сборки как димеров, так и тримеров. Анализ, проведенный более чем 55 000 ловушек, показывает, что зелено-красные (G-R) димеры (рисунок 5A,B), изготовленные частицами диаметром 2 мкм и 1 мкм, образовались в 93% и 89% проанализированных ловушек соответственно. Зелено-красно-зеленые (G-R-G) тримеры (рисунок 5C) образовались в 52% из 55 000 проанализированных ловушек11. Димеры и тримеры были собраны путем последовательного осаждения, при этом коллоидные суспензии двигались в одном направлении по всем последовательным осаждениям (рисунок 3B). В результате частицы, захваченные на каждой стадии осаждения, находятся в непосредственном контакте с частицами, захваченными на предыдущей.

Точное позиционирование частиц не требует прямого контакта между осажденными частицами. Расстояние между узорчатыми частицами можно точно контролировать, выполняя два осаждения в противоположных направлениях, таким образом захватывая такие частицы на противоположных концах каждой ловушки (рисунок 5D). Расстояние между захваченными частицами можно настроить, спроектировав ловушки нужной длины. Дополнительной возможностью, предлагаемой платформой, является химическое моделирование поверхности с микрометрической точностью. Этот результат может быть достигнут путем структурирования шаблона химически функционализированными частицами11.

Figure 1
Рисунок 1: Геометрия микрофлюидных каналов и процесс формирования паттернов. (А) Схема бокового среза микрофлюидного канала при формировании коллоидных частиц. Жидкая суспензия испаряется внутри микрофлюидного канала, а конвективные токи переносят взвешенные частицы к границе раздела воздух-жидкость. Таким образом, частицы накапливаются и образуют зону накопления. Шприцевой насос тянет жидкую суспензию, побуждая ее отступать, и отдельные частицы попадают в ловушку во время спада жидкости на шаблоне. Стрелка обозначает направление, в котором движется подвеска. (B) Схема геометрии канала, используемой для построения коллоидных частиц на шаблоне PDMS. Канал имеет длину 23 мм и ширину 17 мм и состоит из трех секций: центральной шириной 7 мм и двух боковых секций шириной 5 мм. Шаблон находится на полу канала, в центральной секции. Поперечное сечение показывает, что центральное сечение микрофлюидного канала, где жидкая суспензия ограничена на протяжении всего процесса моделирования, является самой мелкой частью канала и имеет высоту 500 мкм, в то время как две боковые секции имеют высоту 1 мм. (C) Схема геометрии прямого канала, используемой для моделирования бактерий. Микрофлюидное устройство состоит из прямого канала длиной 20 мм, шириной 3 мм и высотой 500 мкм. Прямоугольное сечение этого микрофлюидного устройства, показанное в поперечном сечении, упрощает процесс заполнения канала средой. На изображении SEM показана небольшая часть шаблона PDMS с микрофабрикатами длиной 2 мкм, шириной 1 мкм и глубиной 500 нм. Шкала = 2 мкм. Сокращения: PDMS = полидиметилсилоксан; SEM = сканирующая электронная микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схема платформы для последовательной сборки с помощью капиллярности в микрофлюидном канале. (A) Коробчатый инкубатор. Коробчатый инкубатор поддерживает равномерную и постоянную температуру (здесь 30 °C) внутри микрофлюидного канала. (B) Шприц, загруженный жидкой суспензией. Шприц управляется шприцевым насосом (не показан) и используется для управления движением жидкости во время процесса моделирования. (C) Нагретая стеклянная пластина. Нагретая стеклянная пластина размещается под микрофлюидным каналом и обеспечивает равномерную температуру (здесь 30 °C) по всему шаблону, что имеет решающее значение для предотвращения конденсации в непосредственной близости от границы раздела воздух-жидкость. (D) Микрофлюидный чип, загруженный жидкой суспензией. Пол микрофлюидного чипа несет ловушки, в которых бактерии и коллоиды получают паттерн во время процесса моделирования. (E) Микроскоп. Нагретая стеклянная пластина и микрофлюидный чип помещаются на ступень микроскопа, обеспечивая полный оптический доступ во время процесса моделирования и всех последующих этапов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Схема этапов, участвующих в бактериальном и коллоидном паттерне. Каждая панель показывает внутренний вид микрофлюидного канала и включает только небольшую часть шаблона PDMS. (A) Формирование бактерий с помощью сборки с помощью капиллярности. (I) Бактериальная суспензия испаряется внутри микрофлюидного канала, заставляя конвективные токи транспортировать взвешенные бактерии на воздушно-жидкостную границу раздела, образуя таким образом зону накопления. Между тем, подвеска тянется шприцевым насосом и отступает на шаблон. Стрелка представляет направление, в котором движется бактериальная суспензия. Отступающая суспензия проносится по шаблону, и отдельные клетки осаждаются в микрофабрикированные ловушки. (II) Депонированные бактерии подвергаются воздействию воздуха до тех пор, пока канал не будет промыт свежей средой. Процесс осаждения заканчивается, когда жидкая суспензия достигает конца шаблона. (III) Микрофлюидный канал промывают свежей средой (т.е. LB). Стрелка представляет направление, в котором смывается свежая среда. (B) Формирование коллоидных частиц с помощью последовательной сборки с помощью капиллярности. (I) Коллоидная суспензия отступает на шаблоне во время испарения, и частицы накапливаются на границе раздела воздух-жидкость, образуя зону накопления. Отдельные частицы осаждаются в ловушки, микрофабрикованные на шаблоне. Стрелка представляет направление, в котором движется коллоидная подвеска. II) Процесс осаждения завершается, когда жидкая суспензия достигает конца шаблона. III) Второе осаждение проводится в том же направлении, что и первое осаждение, с тем чтобы поместить вторую частицу в каждую ловушку на шаблоне. IV) По окончании второго осаждения шаблон узором обшивается димерами одной зеленой и одной красной частицы. Сокращения: PDMS = полидиметилсилоксан; LB = Лисолейный бульон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Шаблон PDMS с изображением клеток E. coli (штамм MG1655 prpsM-GFP). (A) SEM-изображение отдельных клеток E. coli , захваченных в ловушках длиной 2 мкм, шириной 1 мкм и глубиной 500 нм. Клетки были захвачены после одного единственного осаждения. Шкала бара = 2 мкм. (B) Эпифлуоресцентные изображения небольшой части шаблона PDMS (приблизительно 80 мкм х 80 мкм) с захваченными клетками E. coli после того, как микрофлюидный канал заполняют питательной средой (отвар лизогении) с начальной скоростью 1,3 мм/мин, которую затем увеличивают до 10 мм/мин. Захваченные клетки растут и делятся несколько раз в течение 4 ч, в конечном итоге сливаясь с клетками из соседних ловушек и покрывая поверхность. Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: PDMS = полидиметилсилоксан; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Коллоидные кластеры, собранные с помощью последовательной сборки частиц с помощью капиллярности в микрофлюидной платформе (геометрия первого канала). Эпифлуоресцентная микроскопия изображения (А) 15 димеров, собранных из частиц полистирола диаметром 2 мкм с двумя последовательными осаждениями. (B) Димеры (n = 15), собранные из частиц полистирола диаметром 1 мкм с двумя последовательными осаждениями. с) тримеры (n = 15), собранные из частиц полистирола диаметром 1 мкм с тремя последовательными осаждениями. D) ловушки (n = 15) с частицами, расположенными в конце каждой ловушки путем проведения двух последовательных отложений в противоположных направлениях. Расстояние между частицами в ловушке составляет 2 мкм. Шкала = 4 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Микрофлюидная платформа, описанная здесь, позволяет структурировать микроразмерные объекты, такие как коллоиды и бактерии, в предписанные пространственные расположения на субстрате PDMS. Полный контроль над условиями окружающей среды, предлагаемый микрофлюидикой, и способность моделировать клетки с микрометрической точностью, предоставляемой технологией sCAPA, делают ее очень перспективной платформой для будущих исследований физиологии и экологии.

В экспериментах, представленных в этой работе, кремниевый мастер был реализован с использованием фоторезиста, описанного в Таблице материалов. Тем не менее, может быть использован любой фоторезист, подходящий для создания объектов в описанном диапазоне размеров и пригодный для использования с формованием PDMS. То же самое относится и к смоле для 3D-печати, используемой для подготовки микроканальной формы. Может быть использована любая смола, способная производить признаки описанного размера и совместимая с формованием PDMS.

В этом протоколе хранение микрофлюидных чипов при 70 °C в течение 5 дней оптимизирует гидрофильность поверхности (угол контакта, уходящий между 30 и 60°), когда Tween 20 добавляется к бактериальной или коллоидной суспензии. Эта процедура обеспечивает наилучшую воспроизводимость угла отступающего контакта в этих экспериментальных условиях; тем не менее, другие сроки хранения и температуры также могут работать.

Представлены два применения этого микрофлюидного метода: 1) бактериальный паттерн с участием отдельных отложений бактериальных клеток в ловушки на субстрате PDMS и 2) коллоидный паттерн с участием последовательных отложений коллоидов, получение коллоидных массивов различного состава. Эта платформа была полностью оптимизирована для обеспечения высоких выходов бактериального осаждения, с тысячами клеток, узорчатых на шаблоне PDMS. Сочетание сборки с помощью капиллярности и микрофлюидики обеспечивает одноклеточное разрешение и стабильный поток питательных веществ в течение нескольких часов с полным оптическим доступом на протяжении всего процесса. Клетки с паттернами способны возобновить рост после того, как микрофлюидный канал промыт свежей средой, хотя жизнеспособность узорчатых клеток все еще нуждается в оптимизации.

В настоящее время основным ограничением этой методики является отсутствие роста узорчатых клеток в 54,5% экспериментов в течение 7-часового окна. Этот аспект может быть связан с конкретными видами бактерий и нуждается в дальнейшем исследовании, чтобы определить основную причину стресса, который препятствует восстановлению клеток. Воздействие воздуха и сила, оказываемая мениском во время процесса формирования паттерна, могут быть одними из основных факторов бактериального стресса. Несколько возможных решений могут быть реализованы для уменьшения таких источников стресса, включая использование более глубоких ловушек для уменьшения силы, приложенной к клеткам мениском во время процесса моделирования. Дополнительной опцией для снижения напряжения, связанного с воздействием воздуха, будет снижение температуры нагреваемой стеклянной пластины. Температура 30 °C обеспечивает достаточную скорость испарения жидкой суспензии во время процесса моделирования и уменьшит тепло, которому подвергаются бактерии после того, как они будут нанесены на шаблон перед промывкой среды.

После полной оптимизации мы предполагаем, что эта платформа будет использоваться в различных биологических исследованиях, включающих количественный анализ одной клетки. Высокопроизводительный характер метода позволяет моделировать тысячи клеток, обеспечивая большую статистику в пределах одной экспериментальной арены. Полный оптический доступ позволяет отслеживать поведение, рост и молекулярную активность большого количества отдельных микроорганизмов с течением времени, обеспечивая тем самым основные преимущества в изучении фенотипической гетерогенности в однородных условиях окружающей среды. Микрофлюидная природа этой платформы обеспечивает полный контроль над условиями окружающей среды, такими как состав среды, скорость потока и температура, и это лишь некоторые из них.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Авторы признают поддержку со стороны гранта SNSF PRIMA 179834 (для E.S.), исследовательского гранта ETH-15 17-1 (R. S.) и премии Гордона и Бетти Мур Foundation Investigator Award по водному микробному симбиозу (грант GBMF9197) (R. S.). Авторы благодарят доктора Мигеля Анхеля Фернандеса-Родригеса (Университет Гранады, Испания) за визуализацию бактерий SEM и за проницательные дискуссии. Авторы благодарят д-ра Джен Нгуен (Университет Британской Колумбии, Канада), д-ра Лауру Альварес (ETH Zürich, Швейцария), Кэмерона Боггона (ETH Zürich, Швейцария) и д-ра Фабио Грилло за проницательные дискуссии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcatel AMS 200SE I-Speeder Alcatel Micro Machining System deep reactive ion exchange system
Alconox detergent
AZ400K developer MicroChemicals AZ400K
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) BD 300912 used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel
Box Incubator Life Imaging Services used to ensure a uniform and constant temperature in the channel
Centrifuge Eppendorf 5424R used to replace the overnight media with fresh minimal media
Centrifuge vial Eppendorf 30120086 1.5 mL
CETONI Base 120 CETONI GmbH syringe pump
Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) microParticles GmbH PS-FluoRed-Fi267
Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) microParticles GmbH PS-FluoGreen-Fi182
Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) microParticles GmbH PS-FluoGreen-Fi183
Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) microParticles GmbH PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M PVA TePla used to plasma treat a 10 cm silicon wafer
H401-T-CONTROLLER Okolab controller of the heated glass plate
H601-NIKON-TS2R-GLASS Okolab heated glass plate
Heidelberg DWL 2000 Heidelberg Instruments UV direct laser writer
Insulin syringes, U 100, with luer Codan Medical ApS CODA621640 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process
Klayout Opensource used to design the features on the silicon master
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific 244610 Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel
Masterflex transfer tubing Masterflex HV-06419-05 0.020'' ID, 0.06'' OD
MOPS (10x) Teknova M2101 diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium
Nikon Eclipse Ti2 Nikon Instruments microscope
openSCAD Opensource used to design the mold
OPTIspin SB20 ATM group 51-0002-01-00 spin developer
Plasma chamber Zepto Diener Electronic ZEPTO-1 used to plasma treat the template and microchannel to bond them
Positive photoresist AZ1505 MicroChemicals AZ1505
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786 added to MOPS 1x
Prusa curing and Washing machine CW1S Prusa used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold
Prusa Resin - Tough Prusa Research a.s. UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing
Prusa SL1 3d printer Prusa used to print the mold
Scale VWR-CH 611-2605 used to weight PDMS mixture
Silicon wafer (10 cm) Silicon Materials Inc. N/Phos <100> 1-10 Ω cm
Süss MA6 Mask aligner SUSS MicroTec Group used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate
Sylgard 184 Dow Corning silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01 Technic chromium etchant
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma Aldrich 448931 used to silianize the 3D printed mold
TWEEN 20 Sigma Aldrich P1379 used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process
Veeco Dektak 6 M Veeco profilometer
VTC-100 Vacuum Spin Coater MTI corporation vacuum spin coater

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Choi, C. H., et al. Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer. Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).
  2. Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).
  3. Thomas, C. M., Nielsen, K. M. Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).
  4. Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells. Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).
  5. Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).
  6. Akselrod, G. M., et al. Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays. Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).
  7. Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria. Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).
  8. Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography. Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).
  9. Rozhok, S., et al. Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays. Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).
  10. Xu, L., et al. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution. Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).
  11. Ingham, C. J., et al. The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).
  12. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
  13. Ni, S., Isa, L., Wolf, H. Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects. Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).
  14. Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly. Science Advances. 2 (4), 1501779 (2016).
  15. Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly. Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).
  16. Pioli, R., et al. Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel. Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).
  17. Geissler, M., et al. Fabrication of metal nanowires using microcontact printing. Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).
  18. Wang, Y., et al. Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device. Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).
  19. Crowley, L. C., et al. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).

Tags

Машиностроение выпуск 177
Моделирование микроорганизмов и микрочастиц с помощью последовательной сборки с помощью капиллярности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pioli, R., Stocker, R., Isa, L.,… More

Pioli, R., Stocker, R., Isa, L., Secchi, E. Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (177), e63131, doi:10.3791/63131 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter