Summary
Presentamos una tecnología que utiliza el ensamblaje asistido por capilaridad en una plataforma microfluídica para modelar objetos de tamaño micro suspendidos en un líquido, como bacterias y coloides, en matrices prescritas en un sustrato de polidimetilsiloxano.
Abstract
El modelado controlado de microorganismos en arreglos espaciales definidos ofrece posibilidades únicas para una amplia gama de aplicaciones biológicas, incluidos estudios de fisiología e interacciones microbianas. En el nivel más simple, el patrón espacial preciso de microorganismos permitiría obtener imágenes confiables a largo plazo de un gran número de células individuales y transformaría la capacidad de estudiar cuantitativamente las interacciones microbio-microbio dependientes de la distancia. De manera más singular, el acoplamiento de patrones espaciales precisos y el control total sobre las condiciones ambientales, como lo ofrece la tecnología microfluídica, proporcionaría una plataforma poderosa y versátil para estudios unicelulares en ecología microbiana.
Este documento presenta una plataforma microfluídica para producir patrones de microorganismos versátiles y definidos por el usuario dentro de un canal microfluídico, lo que permite un acceso óptico completo para un monitoreo a largo plazo y de alto rendimiento. Esta nueva tecnología microfluídica se basa en el ensamblaje de partículas asistido por capilaridad y explota las fuerzas capilares que surgen del movimiento controlado de una suspensión evaporadora dentro de un canal microfluídico para depositar objetos individuales de tamaño micrométrico en una serie de trampas microfabricadas sobre un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS). Las deposiciones secuenciales generan el diseño espacial deseado de uno o varios tipos de objetos de tamaño micro, dictado únicamente por la geometría de las trampas y la secuencia de relleno.
La plataforma ha sido calibrada utilizando partículas coloidales de diferentes dimensiones y materiales: ha demostrado ser una herramienta poderosa para generar diversos patrones coloidales y realizar la funcionalización superficial de partículas atrapadas. Además, la plataforma se probó en células microbianas, utilizando células de Escherichia coli como bacteria modelo. Miles de células individuales fueron modeladas en la superficie, y su crecimiento fue monitoreado a lo largo del tiempo. En esta plataforma, el acoplamiento de la deposición unicelular y la tecnología microfluídica permite tanto el modelado geométrico de microorganismos como el control preciso de las condiciones ambientales. Por lo tanto, abre una ventana a la fisiología de los microbios individuales y la ecología de las interacciones microbio-microbio, como lo demuestran los experimentos preliminares.
Introduction
El modelado espacial de microorganismos individuales, particularmente dentro de ámbitos experimentales que permiten un control total sobre las condiciones ambientales, como los dispositivos microfluídicos, es muy deseable en una amplia gama de contextos. Por ejemplo, la organización de microorganismos en matrices regulares permitiría la obtención de imágenes precisas de un gran número de células individuales y el estudio de su crecimiento, fisiología, expresión génica en respuesta a estímulos ambientales y susceptibilidad a los medicamentos. También permitiría estudiar las interacciones célula-célula de particular interés en la investigación de la comunicación celular (por ejemplo, la detección de quórum), la alimentación cruzada (por ejemplo, la simbiosis argalo-bacteriana) o el antagonismo (por ejemplo, la alelopatía), con control total sobre la localización espacial de las células entre sí. Los estudios de fisiología y evolución celular1, los estudios de interacción célula-célula2, el cribado de diferenciación fenotípica3, el monitoreo ambiental4 y el cribado farmacológico5 se encuentran entre los campos que pueden beneficiarse enormemente de una tecnología capaz de lograr dicho análisis cuantitativo unicelular.
En los últimos años se han propuesto varias estrategias para aislar y manejar células individuales, desde trampas ópticas holográficas6 y métodos heterogéneos de funcionalización de superficies7,8,9,10 hasta quimiostatos unicelulares11 y microfluídica de gotas12. Estos métodos son técnicamente muy exigentes o afectan la fisiología celular y no proporcionan una plataforma de alto rendimiento para modelar microbios que puedan estudiarse durante largos períodos, asegurando la resolución de una sola célula, el acceso óptico completo y el control sobre las condiciones ambientales. El objetivo de este artículo es describir una plataforma para modelar bacterias con precisión micrométrica en arreglos espaciales prescritos en una superficie PDMS a través del ensamblaje asistido por capilaridad. Esta plataforma permite un modelado espacial preciso y flexible de microbios y permite un acceso óptico completo y control sobre las condiciones ambientales, gracias a su naturaleza microfluídica.
La tecnología detrás de esta plataforma es una tecnología de ensamblaje desarrollada en los últimos años, denominada sCAPA13,14,15 (sequential capillarity-assisted particle assembly) que se integró en una plataforma microfluídica16. El menisco de una gota líquida que se evapora, mientras retrocede sobre un sustrato de polidimetilsiloxano (PDMS) patrón dentro de un canal microfluídico, ejerce fuerzas capilares que atrapan las partículas coloidales individuales suspendidas en el líquido en pozos micrométricos microfabricados sobre el sustrato (Figura 1A). Las partículas suspendidas se transportan primero a la interfaz aire-líquido por corrientes convectivas y luego se colocan en las trampas por capilaridad. Las fuerzas capilares ejercidas por el menisco en movimiento actúan a mayor escala en comparación con las fuerzas involucradas en las interacciones de partículas.
Por lo tanto, el mecanismo de ensamblaje no está influenciado por el material, las dimensiones y las propiedades superficiales de las partículas. Parámetros como la concentración de partículas, la velocidad del menisco, la temperatura y la tensión superficial de la suspensión son los únicos parámetros que influyen en el rendimiento del proceso de modelado. El lector puede encontrar una descripción detallada de la influencia de los parámetros antes mencionados en el proceso de patronaje en13,14,15. En la tecnología sCAPA original13,14,15, el proceso de modelado coloidal se llevó a cabo en un sistema abierto y requirió una etapa piezoeléctrica de alta precisión para impulsar la suspensión a través de la plantilla. Esta plataforma explota una estrategia diferente y permite realizar el patronaje con equipos estándar generalmente utilizados en microfluídica en un entorno controlado, minimizando así los riesgos de contaminación de las muestras.
Esta plataforma microfluídica se optimizó primero en partículas coloidales para crear matrices regulares de partículas inertes y luego se aplicó con éxito a las bacterias. Ambas plataformas microfluídicas se describen en este documento (Figura 1B, C). La mayoría de los pasos preparatorios y el equipo experimental descrito en el protocolo son comunes para las dos aplicaciones (Figura 2). Informamos sobre patrones coloidales para demostrar que la técnica se puede utilizar para realizar múltiples deposiciones secuenciales en la misma superficie para crear patrones complejos y multimateriales. En particular, se depositó una sola partícula por trampa para cada paso para formar matrices coloidales con una geometría y composición específicas, dictadas únicamente por la geometría de las trampas y la secuencia de llenado. En cuanto al patrón bacteriano, se describen deposiciones individuales, lo que resulta en un depósito de una bacteria por trampa. Una vez que las células están modeladas en la superficie, el canal microfluídico se enjuaga con medio para promover el crecimiento bacteriano, el paso preliminar de cualquier estudio unicelular.
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Protocol
1. Preparación maestra de silicio
NOTA: Las plantillas PDMS que llevan las trampas microfabricadas que forman la plantilla para patrones coloidales y microbianos se fabricaron de acuerdo con el método introducido por Geissler et al. 17. El maestro de silicio fue preparado por litografía convencional en una sala blanca. Consulte los siguientes pasos para conocer el procedimiento y la Tabla de materiales para el equipo.
- Diseñe las características utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD).
- Prepare la máscara de vidrio cromado con una capa de fotorresistente positiva exponiendo las características diseñadas con un escritor láser directo UV.
- Desarrolle la máscara de vidrio cromado con un revelador de giro utilizando un revelador en una proporción de fotorresistencia a agua de 1: 4 durante 15 s.
- Sumergir la mascarilla en cromo etchant durante 50 s.
- Tratamiento con plasma de una oblea de silicio de 10 cm durante 3 min a 600 W.
- Deposita vapor una capa de hexametildisilizano y hornea a 110 °C para mejorar la adhesión hacia la fotorresistente.
- Deposite una capa de fotorresistente a 4.500 × g durante 2 min.
- Exponga la función a los rayos UV a través de la máscara de vidrio cromado con un alineador de máscara para 2 s y desarrolle con un revelador como para la máscara.
- Para completar la fabricación del maestro de silicio, grabe la oblea a través de un intercambio iónico reactivo profundo, ajustando el tiempo de grabado (<2 min) para lograr la profundidad deseada (medida con un perfilómetro).
2. Preparación de moldes de microcanales
- Diseñe el canal con software CAD y córtelo con un software de segmentación de datos para convertir el modelo diseñado en instrucciones para la impresora 3D, estableciendo la distancia de corte en 0,05 mm.
- Imprima el canal con una impresora 3D durante ~1 h.
- Lave y postcure el molde en una máquina de curado y lavado dedicada.
- Coloque el molde en un recipiente lleno de alcohol isopropílico puro (IPA) y vórtice el líquido (lave durante 20 min). Saque el recipiente lleno de IPA de la máquina.
- Una vez que el molde lavado se retire del recipiente IPA, vuelva a colocarlo en la lavadora y curadora y vuelva a colocarlo durante 15 minutos a 35 ° C.
NOTA: La Tabla de Materiales informa de la impresora 3D y de la máquina de curado y lavado utilizada en el protocolo de preparación del molde. El modelo 3D fue cortado con el software de rebanadora patentado de la impresora 3D.
- Coloque la impresión en un horno UV durante 12 h y colóquela en un horno a 80 °C durante 12 h.
NOTA: Este paso garantiza que todo el polímero esté curado y que todo el polímero sin curar se elimine de la impresión, ya que evitaría que el PDMS se cure. - Silanizar el molde a través de la deposición de vapor de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano.
- Coloque el molde 3D en un desecador al vacío junto con 20 μL de tricloro 100% concentrado (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano pipeteado en una lámina de aluminio colocada cerca del molde.
- Crea un vacío en el desecador para generar vapor y deja actuar durante 40 min.
- Retire el molde del desecador y enjuáguelo con etanol puro antes de verter PDMS sobre él.
3. Fabricación del chip microfluídico
- Preparar una mezcla PDMS mezclando el elastómero con su agente de reticulación (Tabla de Materiales). Revuelva la mezcla vigorosamente para mezclar los dos componentes de manera uniforme hasta que se formen burbujas de aire y la mezcla de PDMS se vea opaca.
NOTA: La cantidad de reticulante debe ser del 10% en peso de la cantidad de elastómero. - Desgasifica la mezcla de elastómero y agente de reticulación en un desecador al vacío para eliminar las burbujas de aire atrapadas. Transfiera la mezcla en el desecador al recipiente utilizado para mezclar (paso 3.1). Continúe el proceso de desgasificación hasta que se hayan eliminado todas las burbujas y la mezcla se vea transparente nuevamente.
NOTA: El tiempo normalmente requerido para la desecación es de 30 minutos. - Vierta 3 g de la mezcla en el maestro de silicio para producir la plantilla, que servirá como el "piso" del chip microfluídico.
NOTA: El grosor de la capa PDMS se puede ajustar cambiando la cantidad de mezcla vertida en el maestro de silicio.- Para obtener una plantilla de 400 μm de espesor, vierta 3 g de PDMS en el maestro de silicio, coloque el maestro de silicio en un recubrimiento de espín y gire la capa a 21 × g durante 5 s y 54 × g durante 10 s, y luego desgasifique nuevamente como se describe en el paso 3.2 para eliminar las burbujas de aire atrapadas.
- Vierta 20 g de la mezcla PDMS en el molde impreso en 3D para hacer el microcanal, que servirá como el "techo" del chip microfluídico, y desgasifique como se describe en el paso 3.2 durante 30 minutos.
- Hornea tanto la oblea de silicio como el molde impreso en 3D a 70 °C durante al menos 2 h.
- Despegue la capa pdms del molde impreso en 3D, corte el PDMS con una cuchilla alrededor de los microcanales y perfore los orificios que servirán como entrada y salida del canal microfluídico.
- Despegue el PDMS del maestro de silicio y corte la capa de PDMS en trozos más pequeños con las mismas dimensiones de los canales microfluídicos que se unirán en la parte superior de las plantillas.
- Frote suavemente las plantillas y los microcanales con una solución de detergente al 1% (consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos y luego enjuague con agua desionizada. A continuación, enjuague las plantillas y microcanales con isopropanol y enjuáguelos con agua desionizada. Seque las plantillas y microcanales a temperatura ambiente durante 1 min con aire comprimido a 1 bar.
- Coloque las plantillas y los microcanales en un limpiador de plasma con las superficies a unir hacia arriba. Encienda el limpiador de plasma y trate con plasma las plantillas y los microcanales durante 40 s. Sácalos del limpiador de plasma e inmediatamente une los microcanales en la parte superior de las plantillas poniéndolos en contacto entre sí.
- Almacene los chips microfluídicos en un horno a 70 °C durante cinco días para garantizar la recuperación hidrofóbica de PDMS y tener un ángulo de contacto de retroceso dentro del rango óptimo, entre 30 y 60 °10,11.
4. Patrón bacteriano
- Un día antes del experimento, crece una población de Escherichia coli (cepa MG1655 prpsM-GFP). Inocular el cultivo directamente del caldo congelado y crecer durante la noche durante 20 h en caldo de lisogenia (LB) medio en una incubadora agitadora a 37 °C. Añadir 50 μg/ml de kanamicina para que las células retengan el plásmido prpsM-GFP.
- El día del experimento, ajuste la incubadora de cajas (Figura 2A) a 37 °C varias horas antes del experimento para tener una temperatura uniforme y estable antes de comenzar el experimento. Configure la bomba de jeringa y la placa de vidrio calentada en la etapa del microscopio (Figura 2B, C), ajustando la temperatura a la misma temperatura que la incubadora de cajas.
NOTA: La incubadora de cajas en la que se encierra todo el sistema, incluido el microscopio (Figura 2E), garantiza que se mantenga una temperatura uniforme y constante durante todo el experimento cuando el canal se enjuaga con medio. - Noventa minutos antes del experimento, coloque el chip microfluídico en un recipiente lleno de etanol al 100% (EtOH) y enjuague el canal con 100% etOH durante al menos 10 minutos. Coloque el chip microfluídico en un desecador al vacío y desgasifique durante al menos 30 minutos. Intercambie el EtOH con agua destilada y trate al vacío el chip durante al menos 30 minutos. Coloque el chip microfluídico en el horno a 70 °C durante 10 minutos para eliminar cualquier rastro de líquido que quede en el canal.
NOTA: Este paso es necesario para evitar la formación de burbujas en el canal cuando se enjuaga con medio de cultivo. Este protocolo de prevención de burbujas fue adaptado de Wang et al.18. - Pipetear 1 ml de medio de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) (1x) en un vial de centrífuga y añadir 10 μL de fosfato potásico de 0,132 M (K2HPO4). Saque el cultivo nocturno de la incubadora de 37 °C y alícuota 100 μL en el vial de la centrífuga y centrífique el cultivo a 2.300 × g durante 2 min. Pipetee suavemente el sobrenadante de los viales de la centrífuga y resuspenda el pellet en 1 ml de medio MOPS fresco con 0.015% v / v de Tween 20 y 0.01% v / v de fosfato de potasio.
NOTA: La concentración típica de la suspensión bacteriana está en el rango de 0.015-0.15 vol%, lo que asegura la formación de una zona de acumulación extendida y móvil y evita la acumulación de partículas en el sustrato. Reemplazar el medio nocturno con un medio fresco minimiza los riesgos de liberar películas de bacterias en la plantilla. La falta de fuente de carbono en el medio fresco impide que las células crezcan en la suspensión durante el modelado de la plantilla. Es necesaria una concentración de 0.015% v/v de Tween 20 en la suspensión para que el ángulo de contacto del líquido que retrocede en la plantilla PDMS caiga dentro del rango óptimo, entre 30 y 60°. - Cargue la suspensión bacteriana en una jeringa de 1 ml y conecte la jeringa al chip a través de tubos microfluídicos.
- Para asegurar la conexión entre la jeringa y el tubo, inserte directamente una aguja con un diámetro exterior de 0,6 mm en el tubo. Para evitar la dispersión de cualquier suspensión que quede en la vecindad de la entrada a través del canal, enjuague el medio fresco a través del orificio utilizado como salida durante el proceso de modelado (Figura 3A-III), en lugar del orificio utilizado como entrada.
- Monte la jeringa en la bomba de la jeringa e inyecte la suspensión en el chip microfluídico a través de la entrada ubicada en la parte aguas arriba del canal hasta que la suspensión cubra la región de la plantilla con trampas.
NOTA: Durante el proceso de inyección de líquido, el aire puede escapar a través de una salida ubicada en el extremo aguas abajo del canal. - Ajuste la bomba de la jeringa para retirar la suspensión bacteriana (Figura 3A-I) a un caudal de 0,07-0,2 μL/min, que en la geometría descrita corresponde a una velocidad de retroceso del menisco de 80-100 μm/min.
- Monitoree el proceso de modelado a través del software del microscopio.
NOTA: Aquí, se utilizó un aumento de 10x para monitorear el menisco en retroceso en la plantilla, y se usó un aumento de 20x para monitorear la deposición de bacterias individuales en las trampas microfabricadas.
- Una vez que la plantilla haya sido modelada con celdas (Figura 3A-II), aumente el caudal de extracción para vaciar rápidamente el canal microfluídico y enjuáguelo con LB fresco que se desgasificó previamente durante al menos 30 min y se precalenció a 30 ° C.
- Ajuste la bomba de la jeringa a un caudal de 2 μL/min para enjuagar suavemente el canal. Una vez que se haya llenado el canal, aumente el caudal (15 μL/min) de acuerdo con las necesidades experimentales específicas.
- Adquiera imágenes de bacterias en crecimiento en el aumento deseado y el intervalo de tiempo.
5. Patrón coloidal
- Pipetear 900 μL de una solución acuosa Tween 20 al 0,015% v/v en un vial de centrífuga y pipetear 100 μL de la suspensión coloidal original en él. Centrifugar la suspensión a 13.500 × g durante 1 min. Retire suavemente el sobrenadante y reemplácelo con la solución acuosa Tween 20 (0.015% v / v). Repita este proceso tres veces para garantizar la sustitución completa del disolvente del proveedor de la suspensión de stock.
- Cargue la suspensión coloidal en una jeringa de 1 ml y conecte la jeringa al chip a través de tubos microfluídicos. Inyecte la suspensión en el chip microfluídico a través de la entrada ubicada dentro de la sección central, en la parte aguas arriba del canal, y empuje gradualmente la suspensión hasta que la plantilla esté cubierta.
- Retire la suspensión coloidal a un caudal de 0,07-0,2 μL/min, que corresponde a una velocidad de retroceso del menisco de 1-2 μm/min, e imagine el proceso de modelado mediante un software de microscopio. Use un aumento de 10x para monitorear el menisco que retrocede en la plantilla y un aumento de 20x para observar la deposición de partículas individuales en las trampas microfabricadas. Aumente el caudal una vez que el menisco llegue al final de la plantilla para vaciar el canal rápidamente.
NOTA: Las matrices coloidales compuestas de varias partículas se pueden producir ejecutando el proceso de modelado de los pasos 5.1 a 5.3 en serie. El canal se carga con una nueva suspensión coloidal en cada iteración de acuerdo con la composición de las matrices coloidales deseadas. Cada paso de modelado agrega una partícula a la matriz coloidal y se puede ejecutar secuencialmente hasta que las trampas se hayan llenado con la secuencia de partículas deseada. La composición de las matrices coloidales resultantes viene dada únicamente por la secuencia de suspensiones coloidales utilizadas para llenar las trampas (Figura 3B).
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Representative Results
Se desarrolló una plataforma microfluídica que explota el ensamblaje asistido por capilaridad para modelar partículas coloidales y bacterias en trampas microfabricadas en una plantilla PDMS. Se han diseñado dos geometrías de canal diferentes para optimizar el modelado de coloides y bacterias a través del ensamblaje asistido por capilaridad. La primera geometría del canal (Figura 1B) consta de tres secciones paralelas de 23 mm de largo sin barrera física entre ellas. Las dos secciones en los lados tienen 5 mm de ancho y 1 mm de alto, mientras que la sección central es de 7 mm de ancho y 500 μm de alto. Este diseño ayuda a mantener una gota móvil bien definida con un menisco en forma de convexa en retroceso. El principio de funcionamiento de esta plataforma es descrito en detalle por Pioli et al.11. Si el experimento requiere llenar los canales laterales, como en el caso del cultivo de bacterias, generalmente se forman bolsas de aire. Por esta razón, diseñamos y probamos una segunda geometría que simplifica el proceso de llenado cuando el canal se enjuaga con medio. En este caso, la plataforma (Figura 1C) consta de un solo canal recto de 20 mm de largo, 3 mm de ancho y 500 μm de alto.
La temperatura en el canal microfluídico es un parámetro importante para garantizar un proceso de deposición eficiente. Debe mantenerse a 15 °C por encima del punto de rocío del agua para evitar la condensación en la plantilla. La placa de vidrio calentada debajo del canal (Figura 2D) garantiza una temperatura uniforme en toda la plantilla para evitar la condensación durante el proceso de modelado en la región cercana a la interfaz líquido-aire, caracterizada por una alta concentración de vapor en el aire. La temperatura de la placa de vidrio calentada debe ser la misma que la de la incubadora de cajas para evitar la condensación en la plantilla.
La geometría del canal recto se explotó para modelar células estacionarias en fase (Figura 4A) de una cepa fluorescente de E. coli (MG1655 prpsM-GFP). Las bacterias se depositaron en el 83% de las 5.000 trampas analizadas. Las células se colocaron primero en las trampas de acuerdo con el protocolo presentado y posteriormente se cultivaron durante 4 h a 37 ° C en LB enjuagado a 10 mm / min. Las bacterias con patrones reanudaron el crecimiento en diferentes momentos dentro de 1,5 h desde que el canal se llenó con LB fresco (Figura 4B-I), con la mediana a 44 min. Una vez que se reanuda el crecimiento, las células bacterianas individuales comienzan a formar colonias individuales, que se expanden (Figura 4B-II) hasta que se forma una capa superficial (3,5 h) y se pierde la resolución de una sola célula (Figura 4B-III).
Este experimento de prueba de concepto muestra que el ensamblaje asistido por capilaridad en un canal microfluídico se puede utilizar para modelar una superficie con miles de células viables de bacterias individuales. Once réplicas muestran que las células modeladas crecieron en el 45,5% de los casos dentro de una ventana de 7 h. Cuatro pruebas realizadas agregando yoduro de propidio (PI), una mancha de muerto vivo19, al LB fresco enjuagado en el canal después de la deposición demostraron que las bacterias con patrones que no crecían no se manchaban. Como PI se une al ADN pero no puede penetrar en las células con una membrana intacta, el experimento de tinción de PI muestra que ni el proceso de modelado ni los procesos de desecación y rehidratación dañaron la membrana de las células.
La geometría del canal de tres secciones se utilizó para producir matrices coloidales lineales con diferentes composiciones mediante la realización de patrones secuenciales de partículas coloidales. La Figura 5 muestra las diferentes matrices coloidales formadas a través de patrones secuenciales, incluidos los dímeros (Figura 5A, B) y los trímeros (Figura 5C), que contienen dos y tres partículas atrapadas secuencialmente, respectivamente. Se utilizaron partículas de poliestireno fluorescente verde y rojo para ensamblar dímeros y trímeros. El análisis realizado sobre 55.000 trampas muestra que los dímeros verde-rojo (G-R) (Figura 5A, B) hechos por partículas con 2 μm y 1 μm de diámetro se formaron en el 93% y el 89% de las trampas analizadas, respectivamente. Se formaron trímeros verde-rojo-verde (G-R-G) (Figura 5C) en el 52% de las 55.000 trampas analizadas11. Los dímeros y trímeros se ensamblaron ejecutando deposiciones secuenciales, con las suspensiones coloidales moviéndose en la misma dirección en todas las deposiciones secuenciales (Figura 3B). Como resultado, las partículas atrapadas en cada paso de deposición están en contacto directo con las atrapadas en el anterior.
El posicionamiento preciso de las partículas no requiere contacto directo entre las partículas depositadas. La distancia entre partículas modeladas se puede controlar con precisión realizando dos deposiciones en direcciones opuestas, atrapando así dichas partículas en los extremos opuestos de cada trampa (Figura 5D). La distancia entre las partículas atrapadas se puede ajustar diseñando trampas con la longitud deseada. Una posibilidad adicional que ofrece la plataforma es el modelado químico de la superficie con precisión micrométrica. Este resultado se puede lograr modelando la plantilla con partículas funcionalizadas químicamente11.
Figura 1: Geometrías de canales microfluídicos y proceso de modelado. (A) Esquema de una sección de vista lateral del canal microfluídico durante el modelado de partículas coloidales. La suspensión líquida se evapora dentro del canal microfluídico, y las corrientes convectivas transportan partículas suspendidas hacia la interfaz aire-líquido. Las partículas se acumulan así y forman la zona de acumulación. La bomba de la jeringa tira de la suspensión líquida, lo que hace que retroceda, y las partículas individuales quedan atrapadas durante la recesión líquida en la plantilla. La flecha representa la dirección en la que se mueve la suspensión. (B) Esquema de la geometría del canal utilizada para modelar partículas coloidales en la plantilla PDMS. El canal tiene 23 mm de largo y 17 mm de ancho y consta de tres secciones: una central de 7 mm de ancho y dos laterales de 5 mm de ancho. La plantilla está en el piso del canal, dentro de la sección central. La sección transversal muestra que la sección central del canal microfluídico, donde la suspensión líquida está confinada durante todo el proceso de modelado, es la parte menos profunda del canal y tiene 500 μm de altura, mientras que las dos secciones laterales tienen 1 mm de altura. (C) Esquema de la geometría del canal recto utilizada para modelar bacterias. El dispositivo microfluídico consiste en un canal recto de 20 mm de largo, 3 mm de ancho y 500 μm de alto. La sección rectangular de este dispositivo microfluídico, que se muestra en la sección transversal, simplifica el proceso de llenado del canal con medio. La imagen SEM muestra una pequeña porción de la plantilla PDMS con trampas microfabricadas de 2 μm de largo, 1 μm de ancho y 500 nm de profundidad. Barra de escala = 2 μm. Abreviaturas: PDMS = polidimetilsiloxano; SEM = microscopía electrónica de barrido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de la plataforma para el montaje secuencial asistido por capilaridad en un canal microfluídico. (A) Incubadora de cajas. La incubadora de cajas mantiene una temperatura uniforme y constante (aquí, 30 °C) dentro del canal microfluídico. (B) Jeringa cargada con suspensión líquida. La jeringa se controla mediante una bomba de jeringa (no se muestra) y se utiliza para controlar el movimiento del líquido durante el proceso de modelado. (C) Placa de vidrio calentada. La placa de vidrio calentada se coloca debajo del canal microfluídico y garantiza una temperatura uniforme (aquí, 30 ° C) a través de la plantilla, lo cual es fundamental para evitar la condensación en las cercanías de la interfaz aire-líquido. (D) Chip microfluídico cargado con una suspensión líquida. El piso del chip microfluídico soporta las trampas en las que las bacterias y los coloides se modelan durante el proceso de modelado. (E) Microscopio. La placa de vidrio calentada y el chip microfluídico se colocan en una etapa de microscopio, lo que garantiza un acceso óptico completo durante el proceso de modelado y todos los pasos siguientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema de los pasos involucrados en el patrón bacteriano y coloidal. Cada panel muestra una vista interna del canal microfluídico y solo incluye una pequeña parte de la plantilla PDMS. (A) Modelado de bacterias a través del ensamblaje asistido por capilaridad. (I) La suspensión bacteriana se evapora dentro del canal microfluídico, haciendo que las corrientes convectivas transporten bacterias suspendidas a la interfaz aire-líquido, formando así la zona de acumulación. Mientras tanto, la suspensión es tirada por la bomba de la jeringa y retrocede en la plantilla. La flecha representa la dirección en la que se mueve la suspensión bacteriana. La suspensión en retroceso se extiende a través de la plantilla, y las células individuales se depositan en las trampas microfabricadas. (II) Las bacterias depositadas se exponen al aire hasta que el canal se enjuaga con medio fresco. El proceso de deposición termina cuando la suspensión líquida llega al final de la plantilla. (III) El canal microfluídico se enjuaga con medio fresco (es decir, LB). La flecha representa la dirección en la que se enjuaga el medio fresco. (B) Modelado de partículas coloidales a través de ensamblaje secuencial asistido por capilaridad. (I) La suspensión coloidal retrocede en la plantilla mientras se evapora, y las partículas se acumulan en la interfaz aire-líquido, formando la zona de acumulación. Las partículas individuales se depositan en las trampas microfabricadas en la plantilla. La flecha representa la dirección en la que se mueve la suspensión coloidal. (II) El proceso de deposición se completa cuando la suspensión líquida llega al final de la plantilla. (III) Una segunda deposición se ejecuta en la misma dirección que la primera deposición para colocar una segunda partícula en cada trampa en la plantilla. (IV) Una vez que termina la segunda deposición, la plantilla se modela con dímeros de una partícula verde y una roja. Abreviaturas: PDMS = polidimetilsiloxano; LB = Caldo de lisogenia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Plantilla PDMS modelada con células de E. coli (cepa MG1655 prpsM-GFP). (A) Imagen SEM de células individuales de E. coli atrapadas en trampas de 2 μm de largo, 1 μm de ancho y 500 nm de profundidad. Las células quedaron atrapadas después de una sola deposición. Barra de escala = 2 μm. (B) Imágenes de epifluorescencia de una pequeña porción de la plantilla PDMS (aproximadamente 80 μm x 80 μm) con células atrapadas de E. coli después de que el canal microfluídico se llena con medio de cultivo (caldo de lisogenia) a una velocidad inicial de 1,3 mm / min, que luego se aumenta a 10 mm / min. Las células atrapadas crecen y se dividen varias veces durante 4 h, eventualmente fusionándose con células de trampas vecinas y cubriendo la superficie. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: PDMS = polidimetilsiloxano; GFP = proteína fluorescente verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cúmulos coloidales ensamblados a través del ensamblaje secuencial de partículas asistidas por capilaridad en la plataforma microfluídica (geometría del primer canal). Imagen de microscopía de epifluorescencia de (A) 15 dímeros ensamblados a partir de partículas de poliestireno con 2 μm de diámetro con dos deposiciones secuenciales. (B) Dímeros (n = 15) ensamblados a partir de partículas de poliestireno con 1 μm de diámetro con dos deposiciones secuenciales. (C) Trímeros (n = 15) ensamblados a partir de partículas de poliestireno con 1 μm de diámetro con tres deposiciones secuenciales. (D) Trampas (n = 15) con partículas modeladas en los extremos de cada trampa ejecutando dos deposiciones secuenciales en direcciones opuestas. La distancia entre las partículas en una trampa es de 2 μm. Barras de escala = 4 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La plataforma microfluídica descrita aquí permite el modelado de objetos de tamaño micro, como coloides y bacterias, en arreglos espaciales prescritos en un sustrato PDMS. El control total sobre las condiciones ambientales que ofrece la microfluídica y la capacidad de modelar células con precisión micrométrica otorgada por la tecnología sCAPA lo convierten en una plataforma muy prometedora para futuros estudios de fisiología y ecología.
En los experimentos presentados en este trabajo, el maestro de silicio se realizó utilizando la fotorresistente reportada en la Tabla de Materiales. Sin embargo, se podría utilizar cualquier fotorresistente adecuado para producir características en el rango de tamaño descrito y utilizable con moldeo PDMS. Lo mismo se aplica a la resina de impresión 3D utilizada para preparar el molde de microcanales. Se podría utilizar cualquier resina capaz de producir características de la dimensión descrita y compatible con el moldeo PDMS.
En este protocolo, almacenar los chips microfluídicos a 70 °C durante 5 días optimiza la hidrofilicidad superficial (ángulo de contacto que cae entre 30 y 60°) cuando se agrega Tween 20 a la suspensión bacteriana o coloidal. Este procedimiento garantiza la mejor reproducibilidad para el ángulo de contacto en retroceso en estas condiciones experimentales; sin embargo, otros tiempos y temperaturas de almacenamiento también pueden funcionar.
Se han presentado dos aplicaciones de esta técnica microfluídica: 1) patrón bacteriano que involucra deposiciones individuales de células bacterianas en las trampas sobre el sustrato PDMS, y 2) patrón coloidal que involucra deposiciones secuenciales de coloides, obteniendo matrices coloidales de diferentes composiciones. Esta plataforma ha sido totalmente optimizada para garantizar altos rendimientos de deposición bacteriana, con miles de células modeladas en la plantilla PDMS. La combinación de ensamblaje asistido por capilaridad y microfluídica garantiza una resolución de una sola célula y un flujo estable de nutrientes durante varias horas, con acceso óptico completo durante todo el proceso. Las células modeladas son capaces de reanudar el crecimiento una vez que el canal microfluídico se enjuaga con medio fresco, aunque la viabilidad de las células modeladas aún debe optimizarse.
Actualmente, la principal limitación de esta técnica es la falta de crecimiento de células modeladas en el 54,5% de los experimentos dentro de una ventana de 7 h. Este aspecto puede estar relacionado con la especie bacteriana específica y debe investigarse más a fondo para determinar la causa raíz del estrés que impide que las células vuelvan a crecer. La exposición al aire y la fuerza ejercida por el menisco durante el proceso de modelado pueden estar entre los principales contribuyentes al estrés bacteriano. Se pueden implementar varias soluciones posibles para reducir tales fuentes de estrés, incluido el uso de trampas más profundas para reducir la fuerza aplicada a las células por el menisco durante el proceso de modelado. Una opción adicional para reducir el estrés asociado con la exposición al aire sería disminuir la temperatura de la placa de vidrio calentada. Una temperatura de 30 ° C asegura una tasa de evaporación suficiente de la suspensión líquida durante el proceso de modelado y reduciría el calor al que están expuestas las bacterias después de que se modelan en la plantilla antes de que se enjuague el medio.
Una vez completamente optimizada, prevemos que esta plataforma se utilizará en una variedad de estudios biológicos que involucran análisis cuantitativos de una sola célula. La naturaleza de alto rendimiento de la técnica permite el modelado de miles de células, proporcionando grandes estadísticas dentro de la misma arena experimental. El acceso óptico completo permite rastrear el comportamiento, el crecimiento y las actividades moleculares de un gran número de microorganismos individuales a lo largo del tiempo, proporcionando así grandes ventajas en el estudio de la heterogeneidad fenotípica en condiciones ambientales homogéneas. La naturaleza microfluídica de esta plataforma garantiza un control total sobre las condiciones ambientales, como la composición de los medios, el caudal y la temperatura, solo por nombrar algunos.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen el apoyo de la subvención SNSF PRIMA 179834 (a E.S.), una subvención de investigación ETH ETH-15 17-1 (R. S.) y un Premio al Investigador de la Fundación Gordon y Betty Moore sobre Simbiosis Microbiana Acuática (subvención GBMF9197) (R. S.). Los autores agradecen al Dr. Miguel Ángel Fernández-Rodríguez (Universidad de Granada, España) por las imágenes SEM de bacterias y por las discusiones perspicaces. Los autores agradecen a la Dra. Jen Nguyen (Universidad de Columbia Británica, Canadá), a la Dra. Laura Álvarez (ETH Zürich, Suiza), Cameron Boggon (ETH Zürich, Suiza) y al Dr. Fabio Grillo por las perspicaces discusiones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcatel AMS 200SE I-Speeder | Alcatel Micro Machining System | deep reactive ion exchange system | |
| Alconox | detergent | ||
| AZ400K developer | MicroChemicals | AZ400K | |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to flush fresh Lysogeny broth into the microfluidic channel |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to ensure a uniform and constant temperature in the channel | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | used to replace the overnight media with fresh minimal media |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| Fluorescent PS particles of diameter 0.98 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi267 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 1.08 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi182 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.07 µm (green) | microParticles GmbH | PS-FluoGreen-Fi183 | |
| Fluorescent PS particles of diameter 2.08 µm (red) | microParticles GmbH | PS-FluoRed-Fi180 | |
| Gigabatch 310 M | PVA TePla | used to plasma treat a 10 cm silicon wafer | |
| H401-T-CONTROLLER | Okolab | controller of the heated glass plate | |
| H601-NIKON-TS2R-GLASS | Okolab | heated glass plate | |
| Heidelberg DWL 2000 | Heidelberg Instruments | UV direct laser writer | |
| Insulin syringes, U 100, with luer | Codan Medical ApS | CODA621640 | 1 mL syringe used to withdraw the liquid suspension during the patterning process |
| Klayout | Opensource | used to design the features on the silicon master | |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244610 | Lysogeny broth flushed into the microfluidic channel |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| MOPS (10x) | Teknova | M2101 | diluted tenfold with milliQ water and used to replace the overnight medium |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | microscope | |
| openSCAD | Opensource | used to design the mold | |
| OPTIspin SB20 | ATM group | 51-0002-01-00 | spin developer |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma treat the template and microchannel to bond them |
| Positive photoresist AZ1505 | MicroChemicals | AZ1505 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | added to MOPS 1x |
| Prusa curing and Washing machine CW1S | Prusa | used to ensure all polymer is cured and uncured polymer is removed from the mold | |
| Prusa Resin - Tough | Prusa Research a.s. | UV photosensitive 405nm liquid resin for 3D printing | |
| Prusa SL1 3d printer | Prusa | used to print the mold | |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weight PDMS mixture |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N/Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask and the substrate, and expose the substrate | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | chromium etchant | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | 448931 | used to silianize the 3D printed mold |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P1379 | used to ensure an optimal receding contact angle during the patterning process |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | profilometer | |
| VTC-100 Vacuum Spin Coater | MTI corporation | vacuum spin coater |
References
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