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Developmental Biology

Aislamiento de células endoteliales retinianas murinas para secuenciación de próxima generación

Published: October 11, 2021 doi: 10.3791/63133
Automatic Translation
1,2, 1, 2,3,4, 1,2,4,5
1Department of Cell Biology, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Cardiology, University of Virginia School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, University of Virginia School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Summary

Este protocolo describe un método para el aislamiento de células endoteliales retinianas postnatales murinas optimizadas para el rendimiento, la pureza y la viabilidad celular. Estas células son adecuadas para los enfoques de secuenciación de próxima generación.

Abstract

Las mejoras recientes en la secuenciación de próxima generación han avanzado el conocimiento de los investigadores de la biología molecular y celular, con varios estudios que revelan nuevos paradigmas en biología vascular. La aplicación de estos métodos a modelos de desarrollo vascular requiere la optimización de técnicas de aislamiento celular a partir de tejidos embrionarios y postnatales. El rendimiento, la viabilidad y la pureza de la célula deben ser máximos para obtener resultados precisos y reproducibles de los enfoques de secuenciación de próxima generación. El modelo de vascularización retiniana neonatal de ratón es utilizado por los investigadores para estudiar los mecanismos del desarrollo vascular. Los investigadores han utilizado este modelo para investigar los mecanismos de la angiogénesis y la especificación del destino arterial-venoso durante la formación y maduración de los vasos sanguíneos. La aplicación de técnicas de secuenciación de próxima generación para estudiar el modelo de desarrollo vascular retiniano requiere la optimización de un método para el aislamiento de las células endoteliales de la retina que maximice el rendimiento, la viabilidad y la pureza celular. Este protocolo describe un método para el aislamiento, digestión y purificación del tejido retiniano murino mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los resultados indican que la población de células endoteliales CD31+/CD45- purificada por FACS está altamente enriquecida para la expresión génica de las células endoteliales y no presenta cambios en la viabilidad durante 60 minutos después del FACS. Se incluyen resultados representativos de enfoques de secuenciación de próxima generación en células endoteliales aisladas utilizando este método, incluida la secuenciación de ARN a granel y la secuenciación de ARN de células individuales, lo que demuestra que este método para el aislamiento de células endoteliales de la retina es compatible con las aplicaciones de secuenciación de próxima generación. Este método de aislamiento de células endoteliales retinianas permitirá técnicas avanzadas de secuenciación para revelar nuevos mecanismos de desarrollo vascular.

Introduction

La capacidad de alto rendimiento de la secuenciación de ácidos nucleicos a través de enfoques de secuenciación de próxima generación ha avanzado enormemente el conocimiento de los investigadores de biología molecular y celular. Estas técnicas avanzadas incluyen la secuenciación de ARN del transcriptoma completo, la secuenciación del ADN de regiones específicas para identificar polimorfismos de nucleótido único (SNP), la secuenciación del ADN de factores de transcripción unidos en la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) o regiones de cromatina abierta en el ensayo para la secuenciación de cromatina accesible por transposasa (ATAC) y la secuenciación de ARN unicelular1 . En biología vascular, estos avances han permitido a los investigadores dilucidar mecanismos complicados de desarrollo y enfermedad, junto con la distinción de patrones de expresión génica a lo largo de un continuo de fenotipos variables 2,3. Los experimentos futuros pueden definir aún más mecanismos complejos combinando la secuenciación de próxima generación con modelos evaluados de desarrollo vascular, pero los métodos para la preparación de muestras deben ser compatibles con las técnicas avanzadas de secuenciación.

La calidad, precisión y reproducibilidad de los enfoques de secuenciación de próxima generación dependen del método de preparación de la muestra. Al aislar un subconjunto de células o generar suspensiones unicelulares a partir de tejidos, los métodos óptimos de digestión y purificación son esenciales para maximizar el número celular, la viabilidad y la pureza de la población celular 4,5. Esto requiere un equilibrio en el método de digestión: la digestión fuerte es necesaria para liberar células del tejido y obtener suficientes células para los enfoques posteriores, pero la viabilidad celular se verá afectada negativamente si la digestión es demasiado fuerte 6,7. Además, la pureza de la población celular es necesaria para obtener resultados sólidos y un análisis preciso de los datos, que se puede lograr a través de FACS. Esto resalta la importancia de optimizar los métodos de aislamiento celular para aplicar la secuenciación de próxima generación a modelos establecidos de desarrollo vascular.

Un modelo bien caracterizado para investigar el desarrollo vascular es el modelo murino de desarrollo vascular retiniano. La vasculatura retiniana murina se desarrolla postnatalmente en un plexo superficial bidimensional, con brotación angiogénica inicial del nervio óptico visible en el día postnatal (P)3, frente angiogénico con células del tallo y de la punta y maduración inicial del vaso visible en P6, y maduración del plexo vascular visible después de P9 8,9. Durante la remodelación del plexo vascular inicial, las células endoteliales se especifican hacia fenotipos arteriales, capilares y venosos en diferentes vasos para generar una red circulatoria10,11. Por lo tanto, este método permite a los investigadores visualizar la formación del plexo vascular angiogénico y la especificación y maduración arterial-venosa endotelial en varios puntos de tiempo durante el desarrollo9. Además, este modelo proporciona un método para investigar los efectos de la manipulación transgénica sobre la angiogénesis y el desarrollo del plexo vascular, que se ha aplicado para la investigación del desarrollo vascular, malformaciones arteriales-venosas y neovascularización inducida por oxígeno 12,13,14,15,16 . Para combinar los enfoques de secuenciación de próxima generación con el modelo de desarrollo vascular retiniano murino, es necesario un protocolo optimizado para el aislamiento de las células endoteliales del tejido retiniano.

Este protocolo describe un método optimizado para digerir el tejido retiniano de ratones en P6 para maximizar el rendimiento celular, la pureza y la viabilidad. El tejido retiniano se aísla de ratones P6, se digiere durante 20 minutos, se inmunotiñe para CD31 y CD45 y se purifica a través de FACS para aislar una suspensión unicelular de células endoteliales en aproximadamente 2,5 h (Figura 1A). Se encontró que estas células endoteliales mantienen una alta viabilidad durante 60 minutos después del aislamiento17, lo que permite la preparación de la biblioteca para los métodos de secuenciación de próxima generación. Además, se proporcionan resultados representativos para la activación del sistema de control de control de calidad y el sistema de control de calidad de dos métodos separados de secuenciación de próxima generación que utilizan este protocolo de aislamiento: secuenciación de ARN del transcriptoma completo y secuenciación de ARN unicelular. Este método permite que los enfoques de secuenciación de próxima generación se utilicen junto con el modelo de vascularización retiniana para dilucidar nuevos mecanismos de desarrollo vascular.

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Protocol

Los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale y la Universidad de Virginia aprobaron todos los experimentos con animales enumerados en este protocolo.

1. Obtener ojos de ratón para aislamiento retiniano

  1. Prepare 1x PBS helado y agregue 500 μL a cada pocillo de una placa de 48 pocillos.
  2. Eutanasia de ratones neonatos en el sexto día postnatal (P6) de acuerdo con las directrices institucionales aprobadas. Para este experimento, camadas de aproximadamente 4-8 ratones neonatos son sacrificados en P6 a través de la inhalación de isoflurano durante al menos tres minutos después del paro respiratorio, seguido de la decapitación.
  3. Retire los ojos de cada uno de los ratones. Corte la piel y la membrana sobre el ojo cortando perpendicular al párpado con tijeras de disección. Luego, use fórceps para presionar suavemente hacia abajo por encima y por debajo del ojo para que el ojo salga de la cavidad.
    1. Pellizque cuidadosamente debajo del ojo con los fórceps y corte el nervio óptico que mantiene el ojo unido. Luego, coloque cada ojo en la placa de 48 pocillos en el PBS preparado 1x helado hasta que termine de cosechar.
      NOTA: Utilice un pocillo por ratón, con ambos ojos de un solo ratón en el mismo pozo.

2. Aislar el tejido retiniano del ratón

  1. Llene una placa de Petri, forrada con una almohadilla de disección en la parte inferior, con 500 μL de PBS helado 1x para sumergir los ojos y colóquela bajo un microscopio de disección ajustado a un aumento de 4.0x.
    1. Suspenda los ojos en la almohadilla de disección con una pipeta de transferencia con una punta ancha para no dañar los ojos.
      NOTA: Asegúrese de que los ojos estén completamente cubiertos con PBS.
  2. Usando dos pinzas de disección finas, sostenga el nervio óptico con uno de los fórceps para la estabilización, y con el segundo fórceps perfore un orificio a través de la cámara anterior donde se conectan la córnea y la esclerótica (Figura 1B). Rasgue el agujero en un círculo alrededor del 75% del camino alrededor de la córnea.
    1. Mientras aún sostiene el nervio óptico con uno de los fórceps, use el segundo fórceps para arrancar suavemente la esclerótica del tejido retiniano.
    2. Como se mencionó anteriormente, use los segundos fórceps para arrancar suavemente el cuerpo vítreo del tejido retiniano.
    3. Nuevamente, usando el segundo fórceps, retire suavemente el cristalino y los vasos del plexo hialoide que no se desprendieron cuando se retiró el cuerpo vítreo. Para hacer esto, busque la retina con fórceps abiertos hasta casi tocar la retina, cierre las pinzas para agarrar la lente y los vasos del plexo hialoide, y saque las pinzas de la retina. Esto se puede repetir hasta que se retiren todos los vasos.
      NOTA: El plexo hialoideo se asemeja a una estructura clara, similar a una red.
  3. Llene 2 ml de tubos de microcentrífuga con 500 μL de 1x PBS helado y coloque las retinas en los tubos. Aísle todas las retinas de los ojos y colóquelas en PBS helado antes de continuar.
    NOTA: Utilice un tubo por ratón, con dos retinas del mismo ratón compartiendo un tubo. Si el tejido de la retina está desgarrado, transfiéralo en varias piezas. El tiempo total de disección del tejido retiniano para una camada de ratones debe tomar de 15 a 60 minutos, comenzando con la eutanasia y terminando con el aislamiento final del tejido retiniano.

Figure 1
Figura 1: Descripción general del protocolo de aislamiento. (A) Esquema de la línea de tiempo de aislamiento con un tiempo estimado para cada paso: Aislamiento del tejido retiniano, digesto, tinción de anticuerpos, FACS y ventana de viabilidad celular. (B) Guía paso a paso para el aislamiento del tejido retiniano del ojo, con pasos de disección numerados: 1) perforar la córnea, 2) lárnea lagrimal, 3) esclerótica lagrimal, 4) eliminar la esclerótica de la retina, 5) eliminar aún más la esclerótica y el tejido de conexión de la retina, 6) eliminar el cuerpo vítreo y los vasos vítreos de la retina. (C) Imágenes representativas del tejido retiniano durante varios pasos de digestión: Pre-digestión, Post-digestión, Pellet (las flechas negras resaltan el tejido retiniano o la gránula celular). Republicado con permiso de Chavkin et al. publicado en S. Karger AG, Basilea17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Digerir el tejido retiniano en una suspensión de una sola célula

  1. Preparar una solución de digestión de 500 μL por cada dos retinas aisladas. Agregue FBS y colagenasa tipo II a DMEM a una concentración final de 10% FBS y 1 mg / ml de colagenasa tipo II. Mezclar y calentar la solución a 37 °C al baño maría.
  2. Elimine el exceso de PBS de los tubos de microcentrífuga de 2 ml pipeteando cuidadosamente. Deje suficiente PBS para cubrir completamente el tejido retiniano, aproximadamente 100 μL en cada tubo.
  3. Añadir 500 μL de la solución digestiva a cada tubo con tejido retiniano (Figura 1C).
    1. Use una pipeta P1000 y una punta de pipeta para pipetear hacia arriba y hacia abajo del tejido retiniano en la solución de digestión cinco veces.
  4. Incubar la mezcla de digestión en un baño maría a 37 °C durante 20 min.
    1. Utilice una pipeta P1000 y una punta de pipeta para pipetear la mezcla de digestión hacia arriba y hacia abajo cada 5 minutos. Después de la incubación, el tejido retiniano se ha disuelto en una suspensión de una sola célula, por lo que la mezcla de digestión debe estar turbia (Figura 1C).

4. Cuenta celdas

  1. Coloque una centrífuga de mesa a 4 °C y coloque los tubos de mezcla de digestión en su interior. Granular la mezcla de digestión por centrifugación a 375 x g durante 5 min.
  2. Retire con cuidado la solución de digestión sobrenadante mediante pipeteo. No perturbe el pellet celular (Figura 1C). Vuelva a suspender el pellet en 500 μL de 1x PBS helado mezclando suavemente hacia arriba y hacia abajo con la pipeta.
  3. Cuente las células con un hemocitómetro bajo un microscopio.
    NOTA: Los recuentos celulares son aproximadamente 1 x 106 células por dos retinas.
  4. Asegúrese de que las células se resuspendan correctamente mediante una mezcla suave, y luego alícuota 20 μL de suspensión celular en tres tubos para la tinción de control (tubo 1: control de IgG, tubo 2: control de CD31 y tubo 3: control de CD45), como se describió y utilizó anteriormente17,18.
  5. Coloque una centrífuga de sobremesa a 4 °C y coloque los tubos que contengan células en su interior. Granular las células por centrifugación a 375 x g durante 5 min.

5. Inmunoteñir las células con anticuerpos

  1. Preparar 100 μL de tampón de tinción por cada dos retinas teñidas más cuatro tubos de control. Agregue FBS, HEPES y D-glucosa al tampón HBSS a una concentración final de 10% FBS, 10 mM HEPES y 1 mg / ml D-glucosa.
  2. Obtener anticuerpos conjugados fluorescentes contra CD31 y CD45. Agregue los anticuerpos en una dilución 1:100 en el tampón de tinción (tubo 1: solo anticuerpo IgG, tubo 2: solo anticuerpo CD31 y tubo 3: solo anticuerpo CD45). Añadir 1 μL de anticuerpo por 100 μL del tampón de tinción para una concentración final de anticuerpos de 2 μg/ml.
  3. Retire con cuidado el PBS del pellet de celda lavada mediante pipeteo.
  4. Resuspender el pellet en 100 μL de solución de tinción de anticuerpos por 0,5 x 106 células.
    1. Incubar la suspensión unicelular con la solución de tinción de anticuerpos durante 30 minutos sobre hielo en la oscuridad. Golpee los tubos cada 10 minutos para mezclar suavemente las células.

6. Prepárese para la clasificación celular activada por fluorescencia

  1. Coloque una centrífuga de sobremesa a 4 °C y coloque los tubos que contienen células en su interior. Células de pellet por centrifugación a 375 x g durante 5 min.
    1. Retire el sobrenadante y resuspenda estas células en 500 μL de 1x PBS para lavar.
  2. Coloque una centrífuga de sobremesa a 4 °C y coloque los tubos que contienen células en su interior. Células de pellet por centrifugación a 375 x g durante 5 min
  3. Preparar 1,5 ml de buffer FACS (1% FBS en 1x PBS).
    1. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 300 μL de tampón FACS mezclando suavemente con un pipete.
  4. Añadir yoduro de propidio (PI) a los tubos de muestra que contienen el tampón FACS hasta una concentración final de 0,5 μg/ml. PI se utiliza como marcador de viabilidad.
  5. Transfiera y combine las suspensiones celulares en tubos de ensayo de 5 ml a través de una tapa de presión del filtro celular. La tapa del filtro de la celda debe contener un filtro de 35 μm, y las suspensiones de la celda se pueden pipetear directamente sobre el filtro.
    1. Mantenga los tubos FACS en hielo en la oscuridad y transfiéralos al clasificador de celdas.

7. Configurar el instrumento FACS

  1. Instale una boquilla de 100 μm en un instrumento FACS.
    NOTA: Esta boquilla de tamaño minimiza el volumen de recolección y maximiza la densidad celular aislada.
  2. Preparar 250 μL de 1x PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml como tubo de recolección para instalarlo en el instrumento FACS.

8. Aislar células endoteliales viables a través de FACS

  1. Encienda el instrumento FACS y el ordenador. Haga clic en el icono del software FACS para abrir el software FACS en la computadora para ejecutar y operar el instrumento FACS. Realizar pruebas rutinarias de control de calidad.
  2. Cargue las muestras teñidas por control en el instrumento FACS para ajustar los ejes. Comience con células de anticuerpos IgG solo para generar y ajustar FSC y SSC, luego con anticuerpos CD31 solo para generar y ajustar CD31, y luego con anticuerpos CD45 solo para generar y ajustar CD45. Registre datos de muestras de control.
  3. Cargue las células de muestra teñidas en el instrumento FACS y ejecute la muestra.
  4. Gatee las celdas según los parámetros de dispersión directa y dispersión lateral (FSC-A y SSC-A, respectivamente) (Figura 2A).
    NOTA: Los parámetros FSC-A y SSC-A se utilizan para seleccionar celdas en función del tamaño, la densidad, la granularidad, las propiedades de la superficie y el índice de refracción.
  5. Celdas de puerta por FSC-A y FSC-H para identificar dobletes celulares y recolectar solo celdas individuales (Figura 2A).
    NOTA: Los parámetros FSC-A y FSC-H se utilizan para seleccionar celdas individuales basándose en el principio de que durante la dispersión hacia adelante, los dobletes de celda serán gotas que contienen una mayor relación área-altura.
  6. Celdas de compuerta por PI y SSC-A para identificar celdas viables (Figura 2A).
    NOTA: Las células viables serán PI-negativas.
  7. Haga una puerta CD31+/CD45- con controles y celdas de puerta por CD31 y CD45 (Figura 2A,B).
    1. Insertar un tubo de recogida con 250 μL de tampón FACS.
    2. Comience a clasificar las células que son CD31-positivo/CD45-negativo en el tubo de recolección instalado.
    3. Mantenga los tubos de recolección en hielo para su posterior análisis. Las muestras se pueden procesar para aplicaciones de secuenciación de próxima generación en este paso1.

9. Realizar ensayo de viabilidad

  1. Mezclar 10 μL de células con 10 μL de solución de azul de tripano al 0,4% para evaluar la viabilidad celular.
  2. Cuente las células viables pipeteando la mezcla teñida en un portaobjetos del hemocitómetro. Coloque el portaobjetos bajo un microscopio para obtener recuentos de viabilidad precisos. Cuente las celdas azules como no viables y cuente las celdas claras como viables.
    1. Divida el recuento de células viables por el recuento total de células para calcular el porcentaje de viabilidad.

10. Realizar ensayo de expresión génica

  1. Obtener 10.000-20.000 células por muestra y realizar el aislamiento de ARN para analizar la expresión génica de las células endoteliales de la retina murina. El aislamiento de ARN se realiza utilizando un kit disponible comercialmente que utiliza precipitación de ARN a base de etanol, y luego centrifugación y columnas de membrana para lavar y eluyer el ARN purificado del lisado celular. Las muestras se pueden procesar para algunas aplicaciones de secuenciación de próxima generación en este paso1.
  2. Convertir el ARN en ADNc utilizando la enzima transcriptasa inversa y reactivos de soporte19.
  3. Cuantificar utilizando un colorante de unión al ADN y una máquina de PCR cuantitativa (qPCR)20. Cargue muestras de ADNc en una placa de qPCR de 384 pocillos con cebadores para amplificar genes de interés. El volumen de reacción debe ascender a 10 μL, incluido el colorante de unión al ADN, que se utilizará para cuantificar la amplificación de genes.
    1. Use CD31, VE-Cadherin, CD45 y cebadores directos e inversos de β-actina para medir la expresión génica.
  4. Usar el ejemplo para aplicaciones de secuenciación de próxima generación1.

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Representative Results

La digestión del tejido retiniano y la inmunotinción para CD31 y CD45 dan como resultado una población identificable de células endoteliales CD31 + / CD45- después de la activación de células, células individuales y viabilidad (Figura 2A). La inmunotinción CD45 es necesaria para eliminar las células CD31+/CD45+, que incluyen plaquetas y algunos leucocitos21. Se deben realizar controles para cada experimento para mostrar la especificidad de anticuerpos y guiar la estrategia de activación (Figura 2B). Este porcentaje es relativamente bajo, alrededor del 0,5% -1,0% de todas las células en la suspensión unicelular digerida.

La viabilidad y pureza pueden evaluarse mediante la cuantificación de la tinción de yoduro de propidio y el análisis de la expresión génica del ARN aislado de diferentes poblaciones. El tiempo de digestión variable afecta el rendimiento celular y el porcentaje de viabilidad, con un tiempo de digestión de 20 minutos que resulta en un rendimiento óptimo con un bajo porcentaje de células endoteliales no viables (Figura 3A). Las células endoteliales aisladas permanecieron viables durante 60 minutos después del aislamiento, según lo medido por la tinción posterior de yoduro de propidio (Figura 3B). La pureza de la población celular se evaluó mediante el análisis por qPCR de la expresión de genes de células endoteliales (CD31 y VE-Cadherin) en comparación con CD45 específico de leucocitos normalizado a β-actina (ActB), mostrando un fuerte enriquecimiento de genes de células endoteliales en la población CD31+/CD45- (Figura 3C).

Las células endoteliales aisladas de este protocolo se pueden utilizar en técnicas de secuenciación de próxima generación. La purificación del ARN de las células endoteliales aisladas, la conversión y amplificación del ADNc a través de la preparación de la biblioteca y la secuenciación de la biblioteca de ADNc dieron como resultado > 16,000 genes identificados en nueve muestras independientes, con una caída en las transcripciones por millón de lecturas (TPM) observada en genes por debajo de este umbral (Figura 4A). La secuenciación de ARN unicelular de células endoteliales retinianas aisladas a través de la tubería 10x Genómica dio como resultado una mediana de 1.171 genes por célula, 15.247 genes totales detectados y una mediana de 2.255 recuentos de identificadores moleculares únicos (UMI) por célula en 917 células (Figura 4B).

Figure 2
Figura 2: Estrategia de activación de la clasificación celular activada fluorescente. (A) Clasificación celular para células endoteliales CD31+/CD45- por FSC-A/SSC-A para células, FSC-A/FSC-H para células individuales, negatividad de yoduro de propidio (PI) para viabilidad y CD31+/CD45- para células endoteliales. (B) Tinción de control para PI, control de IgG, control de CD31+ y control de CD45+ para mostrar la especificidad de anticuerpos y la estrategia de activación para cada lectura fluorescente. Republicado con permiso de Chavkin et al. publicado en S. Karger AG, Basilea17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Viabilidad de aislamiento y pureza de células endoteliales aisladas. (A) Número de células endoteliales viables y no viables aisladas después de varios tiempos de digestión normalizados al número de ratones utilizados en cada aislamiento. (B) Porcentaje de células endoteliales no viables después del aislamiento por clasificación FACS a lo largo del tiempo. (C) qPCR para genes endoteliales específicos (CD31, VE-Cadherin) y CD45 específicos de leucocitos en poblaciones CD31-/CD45- (Negativa), CD31+/CD45- (Célula Endotelial) y CD31-/CD45+ (Leucocitos) (U.A. = Unidades Arbitrarias). Todos los datos representados por media con barras de error de desviación estándar, pruebas estadísticas por ANOVA post-hoc Tukey, valores de p denotados (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Republicado con permiso de Chavkin et al. publicado en S. Karger AG, Basilea17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Control de calidad de las lecturas de secuenciación de próxima generación para la secuenciación de ARN y la secuenciación de ARN unicelular después del aislamiento. (A) Transcripciones por millón de lecturas (TPM) graficadas versus genes clasificados por abundancia para nueve muestras independientes de secuenciación de ARN después de la preparación de la biblioteca y la secuenciación de Illumina, con el número promedio de secuencias por gen enumerado a la derecha de cada muestra. (B) Informe CellRanger para la secuenciación de ARN unicelular de células endoteliales retinianas P6 después del aislamiento y la preparación utilizando la tubería 10x Genomics. Este análisis muestra los recuentos de identificadores moleculares únicos (UMI) que representan salidas de secuencias sin procesar para cada código de barras que representa una celda secuenciada individual. Las mediciones clave de control de calidad aparecen en la parte inferior de la figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe un método para el aislamiento de células endoteliales del tejido retiniano murino postnatal que se ha optimizado para un alto número de células, pureza y viabilidad. La pureza celular se obtiene mediante el aislamiento FACS de poblaciones de células endoteliales de la suspensión unicelular digerida mediante inmunotinción CD31+/CD45-. La calidad del aislamiento se cuantifica en ensayos de viabilidad mediante tinción con azul de tripano y expresión génica por qPCR para CD31, CD45 y VE-cadherina (aunque VE-Cadherin no se utilizó para la inmunotinción). Los pasos críticos en este protocolo son el aislamiento del tejido retiniano y la digestión de tejidos. El aislamiento del tejido retiniano debe realizarse rápidamente para mantener la viabilidad celular y aumentar con precisión la pureza celular. La digestión de tejidos debe realizarse, como se describe, para optimizar el rendimiento celular y la viabilidad celular.

Se pueden realizar modificaciones a este protocolo al aplicar este método a diferentes puntos de tiempo, ratones con modificaciones transgénicas o diferentes aplicaciones posteriores. Esto podría ser especialmente importante cuando se investiga tejido retiniano adulto, ya que el tejido puede ser más maduro que el tejido retiniano P6 y puede requerir más tiempo de digestión para aislar las células endoteliales puras y viables. El aislamiento del tejido retiniano y el tiempo de digestión deben optimizarse al modificar el protocolo. El bajo rendimiento celular puede requerir enzimas de digestión frescas, un tiempo de digestión más largo o nuevos anticuerpos para el FACS. La baja pureza puede requerir nuevos anticuerpos para el FACS. La baja viabilidad puede requerir un aislamiento más rápido del tejido retiniano, un tiempo de digestión más corto o una tasa de clasificación celular más rápida. Los siguientes pasos de solución de problemas pueden ayudar a mejorar el rendimiento, la pureza y la viabilidad de las células. Un alto porcentaje de dobletes o células no viables puede ser el resultado de una mala digestión. Una población no identificable de células endoteliales CD31+/CD45- puede ser el resultado de una tinción deficiente de anticuerpos. La mala viabilidad durante la clasificación o después del aislamiento puede ser el resultado de una digestión demasiado dura, pero la mala pureza celular puede ser el resultado de una digestión débil o una tinción deficiente de anticuerpos. La mala calidad del ARN producirá menos genes únicos en un conjunto de datos de secuenciación de ARN, y la mala viabilidad producirá menos células y genes en un conjunto de datos de secuenciación de ARN de una sola célula.

Hay varias limitaciones para este método. En primer lugar, este método da como resultado un bajo rendimiento de células endoteliales retinianas, lo que puede limitar las aplicaciones de secuenciación de próxima generación aguas abajo. Los resultados representativos obtenidos a través de la secuenciación de ARN unicelular produjeron 917 células endoteliales. Un número similar de células han sido aisladas y utilizadas en otros estudios de secuenciación de ARN unicelular para investigar el desarrollo de células endotelialesretinianas 22; Los rendimientos más altos podrían revelar una mayor distinción de los grupos de células. Los animales y las camadas se pueden agrupar para aumentar el rendimiento celular para alcanzar la entrada de muestra requerida para diversas aplicaciones. Además, la viabilidad de las células endoteliales después del aislamiento puede limitar otras aplicaciones posteriores. Es difícil extender la ventana de viabilidad, y las células no viables interrumpirán ciertas aplicaciones que requieren membranas celulares intactas. Es posible que sea necesario realizar ajustes de otros métodos en aplicaciones posteriores para utilizar este método.

Este método para el aislamiento de células endoteliales de la retina es una mejora con respecto a las aplicaciones publicadas anteriormente que utilizan perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos CD31 para purificar las células endoteliales, ya que este protocolo está optimizado para los parámetros necesarios para obtener una población celular pura y viable que mejorará el éxito de las aplicaciones de secuenciación de próxima generación22,23 . Los altos grados de viabilidad y pureza son esenciales tanto para la secuenciación del ARN del transcriptoma completo como para la secuenciación del ARN unicelular. Por lo tanto, este método es una mejora significativa cuando se aplican métodos de secuenciación de próxima generación al modelo de vascularización retiniana.

El uso de este protocolo de aislamiento de células endoteliales de la retina, en combinación con aplicaciones de secuenciación de próxima generación y análisis computacional asociado, tiene el potencial de revelar complejos mecanismos subyacentes del desarrollo vascular. El estudio de la vascularización retiniana postnatal en ratones transgénicos ha permitido la investigación de muchas vías de señalización que afectan la angiogénesis y la maduración de los vasos sanguíneos (Hedgehog, VEGF, Wnt, Notch, TGF-β, BMP)24,25,26,27,28,29,30. Estos estudios han revelado que las vías de señalización están altamente interconectadas en las células endoteliales para controlar el destino celular31,32,33. El uso de este método optimizado para el aislamiento de células endoteliales retinianas a partir del desarrollo de tejido retiniano postnatal, en combinación con métodos de secuenciación de próxima generación y enfoques biocomputacionales34,35,36,37, puede dilucidar aún más los mecanismos de las vías de señalización interconectadas que regulan el desarrollo vascular.

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Disclosures

Los autores no tienen divulgaciones relevantes.

Acknowledgments

Gracias a Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis y University of Virginia Genome Analysis and Technology Core por su esfuerzo, experiencia y asesoramiento para contribuir a los experimentos presentados. Este estudio fue financiado por subvenciones de los NIH a N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) y K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Eppendorf safe-lock tubes USA Scientific 4036-3352
5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
60 mm Non TC-treated Culture Dish Corning 430589
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences 551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control BD Biosciences 553932
BD FACSChorus Software BD Biosciences FACSCHORUS
BD FACSMelody Cell Sorter BD Biosciences FACSMELODY
Collagenase Type II Sigma-Aldrich 234115
Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile Corning 3548
D-Glucose Gibco A2494001
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisher Scientific 12-711-9AM
Dissecting Pan Wax Carolina 629100
Dissection scissors Fine Science Tools 14085-08
Dissection Stereo Microscope M165 FC Leica M165FC
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-052
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190144
Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Sigma-Aldrich 22364120
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio 100-106
Fine dissection forceps Fine Science Tools 11250-00
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco 14175095
HEPES (1M) Gibco 15630130
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
Isoflurane, USP Covetrus 11695067772
Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath Fisher Scientific FSGPD20
Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated ThermoFisher 75002477
SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5120
Trypan Blue Solution ThermoFisher 15250061
V450 Rat Anti-Mouse CD45 BD Biosciences 560501
V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 560457

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References

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Developmental Biology Número 176 célula endotelial desarrollo vascular vascularización retiniana murina secuenciación de próxima generación aislamiento celular primario viabilidad pureza
Aislamiento de células endoteliales retinianas murinas para secuenciación de próxima generación
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Chavkin, N. W., Cain, S., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (176), e63133, doi:10.3791/63133 (2021).

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