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Developmental Biology

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए मुराइन रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव

Published: October 11, 2021 doi: 10.3791/63133
Automatic Translation
1,2, 1, 2,3,4, 1,2,4,5
1Department of Cell Biology, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Cardiology, University of Virginia School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, University of Virginia School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल सेल उपज, शुद्धता और व्यवहार्यता के लिए अनुकूलित मुराइन प्रसवोत्तर रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करता है। ये कोशिकाएं अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त हैं।

Abstract

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण में हालिया सुधारों ने आणविक और सेलुलर जीव विज्ञान के शोधकर्ताओं के ज्ञान को उन्नत किया है, जिसमें कई अध्ययनों ने संवहनी जीव विज्ञान में नए प्रतिमानों का खुलासा किया है। संवहनी विकास के मॉडल के लिए इन विधियों को लागू करने के लिए भ्रूण और प्रसवोत्तर ऊतकों से सेल अलगाव तकनीकों के अनुकूलन की आवश्यकता होती है। सेल उपज, व्यवहार्यता और शुद्धता सभी को अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण से सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए अधिकतम होने की आवश्यकता है। नवजात माउस रेटिना वैस्कुलराइजेशन मॉडल का उपयोग शोधकर्ताओं द्वारा संवहनी विकास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। शोधकर्ताओं ने इस मॉडल का उपयोग रक्त वाहिका गठन और परिपक्वता के दौरान एंजियोजेनेसिस और धमनी-शिरापरक भाग्य विनिर्देश के तंत्र की जांच करने के लिए किया है। रेटिना संवहनी विकास मॉडल का अध्ययन करने के लिए अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकों को लागू करने के लिए रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि के अनुकूलन की आवश्यकता होती है जो सेल उपज, व्यवहार्यता और शुद्धता को अधिकतम करती है। यह प्रोटोकॉल फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके मुराइन रेटिना ऊतक अलगाव, पाचन और शुद्धिकरण के लिए एक विधि का वर्णन करता है। परिणाम बताते हैं कि एफएसीएस-शुद्ध सीडी 31 + / सीडी 45- एंडोथेलियल सेल आबादी एंडोथेलियल सेल जीन अभिव्यक्ति के लिए अत्यधिक समृद्ध है और एफएसीएस के बाद 60 मिनट के लिए व्यवहार्यता में कोई बदलाव नहीं दिखाती है। इस पद्धति का उपयोग करके अलग किए गए एंडोथेलियल कोशिकाओं पर अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण के प्रतिनिधि परिणाम शामिल हैं, जिसमें थोक आरएनए अनुक्रमण और एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण शामिल हैं, यह दर्शाते हुए कि रेटिना एंडोथेलियल सेल अलगाव के लिए यह विधि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण अनुप्रयोगों के साथ संगत है। रेटिना एंडोथेलियल सेल अलगाव की यह विधि संवहनी विकास के नए तंत्र को प्रकट करने के लिए उन्नत अनुक्रमण तकनीकों की अनुमति देगी।

Introduction

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण के माध्यम से अनुक्रमण न्यूक्लिक एसिड की उच्च-थ्रूपुट क्षमता ने आणविक और सेलुलर जीव विज्ञान के शोधकर्ताओं के ज्ञान को बहुत उन्नत किया है। इन उन्नत तकनीकों में संपूर्ण ट्रांसस्क्रिप्टम आरएनए अनुक्रमण, एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) की पहचान करने के लिए लक्षित क्षेत्रों का डीएनए अनुक्रमण, क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (सीएचआईपी) अनुक्रमण में बाध्य प्रतिलेखन कारकों का डीएनए अनुक्रमण, या ट्रांसपोसेज-एक्सेसिबल क्रोमैटिन (एटीएसी) अनुक्रमण के लिए परख में खुले क्रोमैटिन क्षेत्र और एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण1 शामिल हैं। . संवहनी जीव विज्ञान में, इन प्रगति ने शोधकर्ताओं को विकास और रोग के जटिल तंत्र को स्पष्ट करने की अनुमति दी है, साथ ही अलग-अलग फेनोटाइप 2,3 की निरंतरता के साथ जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को अलग करने के साथ। भविष्य के प्रयोग संवहनी विकास के मूल्यांकन किए गए मॉडल के साथ अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को जोड़कर जटिल तंत्र को परिभाषित कर सकते हैं, लेकिन नमूना तैयार करने के तरीकों को उन्नत अनुक्रमण तकनीकों के साथ संगत होना चाहिए।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण की गुणवत्ता, सटीकता और प्रजनन क्षमता नमूना तैयार करने की विधि पर निर्भर करती है। कोशिकाओं के उप-समूह को अलग करते समय या ऊतकों से एकल-कोशिका निलंबन उत्पन्न करते समय, सेल संख्या, व्यवहार्यता और सेल आबादीकी शुद्धता को अधिकतम करने के लिए इष्टतम पाचन और शुद्धिकरण विधियां आवश्यक हैं। इसके लिए पाचन विधि में संतुलन की आवश्यकता होती है: ऊतक से कोशिकाओं को छोड़ने और डाउनस्ट्रीम दृष्टिकोण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए मजबूत पाचन आवश्यक है, लेकिन पाचन बहुत मजबूत होने पर सेल व्यवहार्यता नकारात्मक रूप से प्रभावित होगी 6,7. इसके अतिरिक्त, मजबूत परिणामों और डेटा के सटीक विश्लेषण के लिए सेल आबादी की शुद्धता आवश्यक है, जिसे एफएसीएस के माध्यम से पूरा किया जा सकता है। यह संवहनी विकास के स्थापित मॉडल के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को लागू करने के लिए सेल अलगाव विधियों को अनुकूलित करने के महत्व पर प्रकाश डालता है।

संवहनी विकास की जांच के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता वाला मॉडल मुराइन रेटिना संवहनी विकास मॉडल है। मुराइन रेटिना वास्कुलचर एक द्वि-आयामी सतही जाल में प्रसवोत्तर रूप से विकसित होता है, जिसमें प्रसवोत्तर दिन (पी) 3 में दिखाई देने वाली ऑप्टिक तंत्रिका से प्रारंभिक एंजियोजेनिक अंकुरण होता है, डंठल- और टिप-कोशिकाओं के साथ एंजियोजेनिक फ्रंट और पी 6 पर प्रारंभिक वाहिका परिपक्वता दिखाई देती है, और पी 9 8,9 के बाद दिखाई देने वाले संवहनी जाल की परिपक्वता होती है। प्रारंभिक संवहनी जाल के रीमॉडेलिंग के दौरान, एंडोथेलियल कोशिकाएं एक संचार नेटवर्क10,11 उत्पन्न करने के लिए विभिन्न वाहिकाओं में धमनी, केशिका और शिरापरक फेनोटाइप की ओर विनिर्देश से गुजरती हैं। इसलिए, यह विधि शोधकर्ताओं को विकास के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर एंजियोजेनिक संवहनी जाल गठन और एंडोथेलियल धमनी-शिरापरक विनिर्देश और परिपक्वता की कल्पना करने की अनुमति देतीहै। इसके अतिरिक्त, यह मॉडल एंजियोजेनेसिस और संवहनी जाल के विकास पर ट्रांसजेनिक हेरफेर के प्रभावों की जांच के लिए एक विधि प्रदान करता है, जिसे संवहनी विकास, धमनी-शिरापरक विकृतियों और ऑक्सीजन-प्रेरित नियोवैस्कुलराइजेशन 12,13,14,15,16 की जांच के लिए लागू किया गया है . मुराइन रेटिना संवहनी विकास मॉडल के साथ अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण को संयोजित करने के लिए, रेटिना ऊतक से एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल आवश्यक है।

यह प्रोटोकॉल सेल उपज, शुद्धता और व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए पी 6 पर चूहों से रेटिना ऊतक को पचाने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करता है। रेटिना ऊतक को पी 6 चूहों से अलग किया जाता है, 20 मिनट के लिए पचाया जाता है, सीडी 31 और सीडी 45 के लिए इम्यूनोस्टेन्ड किया जाता है, और लगभग 2.5 घंटे में एंडोथेलियल कोशिकाओं के एकल सेल निलंबन को अलग करने के लिए एफएसीएस के माध्यम से शुद्ध किया जाता है (चित्रा 1 ए)। इन एंडोथेलियल कोशिकाओं को 60 मिनट के बाद अलगाव17 के लिए उच्च व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए पाया गया, जिससे अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विधियों के लिए पुस्तकालय की तैयारी की अनुमति मिली। इसके अतिरिक्त, इस अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके दो अलग-अलग अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विधियों से एफएसीएस गेटिंग और गुणवत्ता नियंत्रण परिणामों के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रदान किए जाते हैं: पूरे ट्रांसस्क्रिप्टम आरएनए अनुक्रमण और एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण। यह विधि संवहनी विकास के नए तंत्र को स्पष्ट करने के लिए रेटिना वैस्कुलराइजेशन मॉडल के साथ संयोजन के रूप में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण का उपयोग करने की अनुमति देती है।

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Protocol

येल विश्वविद्यालय और वर्जीनिया विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों ने इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध सभी पशु प्रयोगों को मंजूरी दी।

1. रेटिना अलगाव के लिए माउस आंखें प्राप्त करें

  1. 1x बर्फ-ठंडा पीबीएस तैयार करें और 48-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 500 μL जोड़ें।
  2. अनुमोदित संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार प्रसवोत्तर दिन छह (पी 6) पर नवजात चूहों को इच्छामृत्यु करें। इस प्रयोग के लिए, लगभग 4-8 नवजात चूहों के कूड़े को श्वसन गिरफ्तारी के बाद कम से कम तीन मिनट के लिए आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन के माध्यम से पी 6 में इच्छामृत्यु दी जाती है, इसके बाद डिकैपिटेशन किया जाता है।
  3. प्रत्येक चूहे से आंखें हटा दें। विच्छेदन कैंची का उपयोग करके पलक के लंबवत काटकर आंख के ऊपर की त्वचा और झिल्ली को काट लें। फिर, आंख के ऊपर और नीचे धीरे से दबाने के लिए बल का उपयोग करें ताकि आंख सॉकेट से बाहर निकल जाए।
    1. सावधानी से आंख के नीचे बल के साथ चुटकी लें और ऑप्टिक तंत्रिका को काट लें जो आंख को संलग्न रख रही है। फिर, कटाई पूरी होने तक तैयार 1x बर्फ-ठंडे पीबीएस में 48-वेल प्लेट में प्रत्येक आंख रखें।
      नोट: एक ही कुएं में एक माउस से दोनों आंखों के साथ प्रति माउस एक अच्छी तरह से उपयोग करें।

2. माउस रेटिना ऊतक को अलग करें

  1. आंखों को डुबोने के लिए 1x बर्फ-ठंडे पीबीएस के 500 μL के साथ नीचे एक विच्छेदन पैड के साथ पंक्तिबद्ध पेट्री डिश भरें और इसे 4.0x आवर्धन पर सेट किए गए विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत रखें।
    1. एक विस्तृत टिप के साथ ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके विच्छेदन पैड में आंखों को निलंबित करें ताकि आंखों को नुकसान न हो।
      नोट: सुनिश्चित करें कि आंखें पूरी तरह से पीबीएस से ढकी हुई हैं।
  2. दो महीन विच्छेदन बलों का उपयोग करके, स्थिरीकरण के लिए एक बल के साथ ऑप्टिक तंत्रिका को पकड़ें, और दूसरे बल के साथ पूर्ववर्ती कक्ष के माध्यम से एक छेद छेद करें जहां कॉर्निया और श्वेतपटल जुड़ते हैं (चित्रा 1 बी)। कॉर्निया के चारों ओर लगभग 75% रास्ते में छेद को एक सर्कल में फाड़ दें।
    1. अभी भी ऑप्टिक तंत्रिका को एक बल के साथ पकड़ते हुए, रेटिना ऊतक से श्वेतपटल को धीरे से फाड़ने के लिए दूसरे बल का उपयोग करें।
    2. जैसा कि ऊपर बताया गया है, रेटिना ऊतक के विट्रियस शरीर को धीरे से फाड़ने के लिए दूसरे बल का उपयोग करें।
    3. फिर, दूसरे बल का उपयोग करके, धीरे से लेंस और हाइलोइड प्लेक्सस वाहिकाओं को हटा दें जो विट्रियस बॉडी को हटाने पर बंद नहीं हुए थे। ऐसा करने के लिए, रेटिना को लगभग छूने तक खुले बल के साथ रेटिना में पहुंचें, लेंस और हाइलोइड प्लेक्सस वाहिकाओं को पकड़ने के लिए बल को बंद करें, और रेटिना से बल को बाहर खींचें। यह तब तक दोहराया जा सकता है जब तक कि सभी जहाजों को हटा नहीं दिया जाता है।
      नोट: हाइलोइड प्लेक्सस एक स्पष्ट, वेब जैसी संरचना जैसा दिखता है।
  3. 1x बर्फ-ठंडे पीबीएस के 500 μL के साथ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को भरें और रेटिना को ट्यूबों में रखें। आंखों से सभी रेटिना को अलग करें और आगे बढ़ने से पहले उन्हें बर्फ-ठंडे पीबीएस में रखें।
    नोट: प्रति माउस एक ट्यूब का उपयोग करें, जिसमें एक ही माउस से दो रेटिना एक ट्यूब साझा करते हैं। यदि रेटिना ऊतक फट गया है, तो इसे कई टुकड़ों में स्थानांतरित करें। चूहों के कूड़े के लिए रेटिना ऊतक विच्छेदन का कुल समय 15-60 मिनट लगना चाहिए, इच्छामृत्यु से शुरू होता है और अंतिम रेटिना ऊतक अलगाव के साथ समाप्त होता है।

Figure 1
(ए) प्रत्येक चरण के लिए अनुमानित समय के साथ अलगाव समयरेखा का योजनाबद्ध: रेटिना ऊतक का अलगाव, डाइजेस्ट, एंटीबॉडी धुंधला, एफएसीएस और सेल व्यवहार्यता विंडो। (बी) आंख से रेटिना ऊतक के अलगाव के लिए चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका, क्रमांकित विच्छेदन चरणों के साथ: 1) कॉर्निया को छेदना, 2) आंसू कॉर्निया, 3) आंसू श्वेतपटल, 4) रेटिना से श्वेतपटल को हटाना, 5) रेटिना से स्क्लेरा को हटाना और ऊतक को जोड़ना, 6) रेटिना से विट्रियस शरीर और विट्रियस वाहिकाओं को हटाना। (सी) विभिन्न पाचन चरणों के दौरान रेटिना ऊतक की प्रतिनिधि छवियां: प्री-डाइजेस्ट, पोस्ट-डाइजेस्ट, पेलेट (काले तीर रेटिना ऊतक या सेल पेलेट को उजागर करते हैं)। चावकिन एट अल की अनुमति के साथ पुनः प्रकाशित एस कार्गर एजी, बेसल17 में प्रकाशित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. रेटिना ऊतक को एकल कोशिका निलंबन में पचाना

  1. प्रत्येक दो रेटिना अलग किए जाने के लिए 500 μL पाचन समाधान तैयार करें। 10% एफबीएस और 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज टाइप II की अंतिम एकाग्रता के लिए डीएमईएम में एफबीएस और कोलेजनेज टाइप II जोड़ें। पानी के स्नान का उपयोग करके घोल को 37 डिग्री सेल्सियस तक मिलाएं और गर्म करें।
  2. सावधानीपूर्वक पाइपिंग करके 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों से अतिरिक्त पीबीएस हटा दें। रेटिना ऊतक को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस छोड़ दें, प्रत्येक ट्यूब में लगभग 100 μL।
  3. रेटिना ऊतक के साथ प्रत्येक ट्यूब में पाचन समाधान के 500 μL जोड़ें (चित्रा 1 सी)।
    1. पाचन समाधान में रेटिना ऊतक को पांच बार ऊपर और नीचे करने के लिए पी 1000 पिपेटर और पिपेट टिप का उपयोग करें।
  4. पाचन मिश्रण को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें।
    1. हर 5 मिनट में पाचन मिश्रण को ऊपर और नीचे करने के लिए पी 1000 पिपेटर और पिपेट टिप का उपयोग करें। इनक्यूबेशन के बाद, रेटिना ऊतक एक एकल कोशिका निलंबन में घुल गया है, इसलिए पाचन मिश्रण बादल होना चाहिए (चित्रा 1 सी)।

4. कोशिकाओं की गिनती

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज सेट करें और पाचन मिश्रण ट्यूबों को अंदर रखें। 5 मिनट के लिए 375 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पाचन मिश्रण को छर्रों से हटा दें।
  2. पाइपिंग द्वारा सतह पर तैरने वाले पाचन समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें। सेल पेलेट को परेशान न करें (चित्रा 1 सी)। पिपेट के साथ धीरे-धीरे ऊपर और नीचे मिलाकर 500 μL बर्फ-ठंडा 1x PBS में गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. माइक्रोस्कोप के तहत हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: सेल की गिनती प्रति दो रेटिना लगभग 1 x 106 कोशिकाएं हैं।
  4. सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को कोमल मिश्रण द्वारा ठीक से पुन: निलंबित किया जाता है, और फिर नियंत्रण धुंधलापन (ट्यूब 1: आईजीजी नियंत्रण, ट्यूब 2: सीडी 31 नियंत्रण, और ट्यूब 3: सीडी 45 नियंत्रण) के लिए तीन ट्यूबों में सेल निलंबन के 20 μL को एलिकोट करें, जैसा कि पहले वर्णित और उपयोग किया गया था।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज सेट करें और अंदर कोशिकाओं वाले ट्यूब रखें। 5 मिनट के लिए 375 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को छर्रों।

5. एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इम्यूनोस्टेन करें

  1. दो रेटिना दाग और चार नियंत्रण ट्यूबों के लिए 100 μL धुंधला बफर तैयार करें। एचबीएसएस बफर में एफबीएस, एचईपीईएस और डी-ग्लूकोज को 10% एफबीएस, 10 एमएम एचईपीईएस और 1 मिलीग्राम / एमएल डी-ग्लूकोज की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
  2. CD31 और CD45 के खिलाफ फ्लोरोसेंटली संयुग्मित एंटीबॉडी प्राप्त करें। स्टेनिंग बफर में 1: 100 कमजोर पड़ने पर एंटीबॉडी जोड़ें (ट्यूब 1: आईजीजी एंटीबॉडी केवल, ट्यूब 2: सीडी 31 एंटीबॉडी केवल, और ट्यूब 3: सीडी 45 एंटीबॉडी केवल)। 2 μg / mL की अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता के लिए धुंधला बफर के प्रति 100 μL एंटीबॉडी जोड़ें।
  3. पाइपिंग द्वारा धोए गए सेल पेलेट से पीबीएस को सावधानीपूर्वक हटा दें।
  4. पेलेट को प्रति 0.5 x 106 कोशिकाओं में एंटीबॉडी धुंधला समाधान के 100 μL में पुन: निलंबित करें।
    1. अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए एंटीबॉडी धुंधला समाधान के साथ एकल-सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को धीरे से मिलाने के लिए हर 10 मिनट में ट्यूबों को टैप करें।

6. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के लिए तैयार करें

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज सेट करें और कोशिकाओं वाले ट्यूबों को अंदर रखें। 5 मिनट के लिए 375 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पेलेट कोशिकाएं।
    1. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और इन कोशिकाओं को धोने के लिए 1x PBS के 500 μL में पुन: निलंबित करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज सेट करें और कोशिकाओं वाले ट्यूबों को अंदर रखें। 5 मिनट के लिए 375 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पेलेट कोशिकाएं
  3. एफएसीएस बफर के 1.5 एमएल (1x PBS में 1% FBS) तैयार करें।
    1. सतह पर तैरने वाले को हटा दें और सेल पेलेट को एफएसीएस बफर के 300 μL में धीरे से एक पाइपेटर के साथ मिलाकर पुन: निलंबित करें।
  4. एफएसीएस बफर युक्त नमूना ट्यूबों में प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) को 0.5 μg / mL की अंतिम सांद्रता में जोड़ें। पीआई का उपयोग व्यवहार्यता मार्कर के रूप में किया जाता है।
  5. सेल स्ट्रेनर स्नैप कैप के माध्यम से सेल सस्पेंशन को 5 एमएल टेस्ट ट्यूबों में स्थानांतरित और संयोजित करें। सेल स्ट्रेनर स्नैप कैप में 35 μm फ़िल्टर होना चाहिए, और सेल सस्पेंशन को सीधे फ़िल्टर पर पाइप किया जा सकता है।
    1. एफएसीएस ट्यूबों को अंधेरे में बर्फ पर रखें और उन्हें सेल सॉर्टर में स्थानांतरित करें।

7. FACS उपकरण स्थापित करें

  1. एक FACS उपकरण में एक 100 μm nozzle स्थापित करें।
    नोट: यह आकार नोजल संग्रह मात्रा को कम करता है और पृथक सेल घनत्व को अधिकतम करता है।
  2. एफएसीएस उपकरण में स्थापित होने के लिए एक संग्रह ट्यूब के रूप में 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1x PBS के 250 μL तैयार करें।

8. एफएसीएस के माध्यम से व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करें

  1. FACS उपकरण और कंप्यूटर चालू करें। FACS उपकरण को चलाने और संचालित करने के लिए कंप्यूटर पर FACS सॉफ़्टवेयर खोलने के लिए FACS सॉफ़्टवेयर आइकन पर क्लिक करें। नियमित गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण करें।
  2. अक्षों को समायोजित करने के लिए नियंत्रण-दाग वाले नमूनों को एफएसीएस उपकरण में लोड करें। एफएससी और एसएससी उत्पन्न करने और समायोजित करने के लिए आईजीजी एंटीबॉडी केवल कोशिकाओं से शुरू करें, फिर सीडी 31-एंटीबॉडी केवल सीडी 31 उत्पन्न करने और समायोजित करने के लिए, और फिर सीडी 45-एंटीबॉडी केवल सीडी 45 उत्पन्न करने और समायोजित करने के लिए। नियंत्रण नमूने से डेटा रिकॉर्ड करें।
  3. एफएसीएस उपकरण में सना नमूना कोशिकाओं को लोड करें और नमूना चलाएं।
  4. कोशिकाओं को फॉरवर्ड-स्कैटर और साइड-स्कैटर (एफएससी-ए और एसएससी-ए, क्रमशः) मापदंडों के आधार पर गेट करें (चित्रा 2 ए)।
    नोट: एफएससी-ए और एसएससी-ए मापदंडों का उपयोग आकार, घनत्व, ग्रैन्यूलैरिटी, सतह गुणों और अपवर्तक सूचकांक के आधार पर कोशिकाओं का चयन करने के लिए किया जाता है।
  5. सेल डबल्स की पहचान करने और केवल एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एफएससी-ए और एफएससी-एच द्वारा गेट सेल (चित्रा 2 ए)।
    नोट: एफएससी-ए और एफएससी-एच मापदंडों का उपयोग इस सिद्धांत के आधार पर एकल कोशिकाओं का चयन करने के लिए किया जाता है कि आगे के प्रकीर्णन के दौरान, सेल डबल्स अधिक क्षेत्र-से-ऊंचाई अनुपात वाली बूंदें होंगी।
  6. व्यवहार्य कोशिकाओं की पहचान करने के लिए पीआई और एसएससी-ए द्वारा गेट सेल (चित्रा 2 ए)।
    नोट: व्यवहार्य कोशिकाएं पीआई-नकारात्मक होंगी।
  7. CD31 और CD45 (चित्र 2A, B) द्वारा नियंत्रण और गेट कक्षों के साथ CD31+/CD45- गेट बनाएँ।
    1. FACS बफर के 250 μL के साथ एक संग्रह ट्यूब डालें।
    2. CD31-positive/CD45-नकारात्मक कक्षों को स्थापित संग्रह ट्यूब में सॉर्ट करना प्रारंभ करें.
    3. आगे के विश्लेषण के लिए संग्रह ट्यूबों को बर्फ पर रखें। इस चरण 1 पर अगली पीढ़ी के अनुक्रमण अनुप्रयोगों के लिए नमूने संसाधित किए जासकते हैं।

9. व्यवहार्यता परख करें

  1. सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए 0.4% ट्रिपैन ब्लू समाधान के 10 μL के साथ 10 μL कोशिकाओं को मिलाएं।
  2. हेमोसाइटोमीटर स्लाइड पर दाग वाले मिश्रण को पाइप करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। सटीक व्यवहार्यता गणना के लिए एक माइक्रोस्कोप के नीचे स्लाइड रखें। नीली कोशिकाओं को गैर-व्यवहार्य के रूप में गिनती करें और स्पष्ट कोशिकाओं को व्यवहार्य के रूप में गिनते हैं।
    1. प्रतिशत व्यवहार्यता की गणना करने के लिए व्यवहार्य सेल गिनती को कुल सेल गिनती से विभाजित करें।

10. जीन अभिव्यक्ति परख करें

  1. प्रति नमूना 10,000-20,000 कोशिकाएं प्राप्त करें और म्यूरिन रेटिना एंडोथेलियल सेल जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए आरएनए अलगाव करें। आरएनए अलगाव एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके किया जाता है जो इथेनॉल-आधारित आरएनए वर्षा का उपयोग करता है, और फिर सेल लाइसेट से शुद्ध आरएनए को धोने और हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन और झिल्ली कॉलम। इस चरण1 पर कुछ अगली पीढ़ी के अनुक्रमण अनुप्रयोगों के लिए नमूने संसाधित किए जा सकते हैं।
  2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज एंजाइम और सहायक अभिकर्मकों का उपयोग करके आरएनए को सीडीएनएमें परिवर्तित करें।
  3. डीएनए बाइंडिंग डाई और मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर) मशीन20 का उपयोग करके मात्रा निर्धारित करें। रुचि के जीन को बढ़ाने के लिए प्राइमरों के साथ 384-वेल क्यूपीसीआर प्लेट में सीडीएनए नमूने लोड करें। प्रतिक्रिया की मात्रा डीएनए बाइंडिंग डाई सहित कुल 10 μL होनी चाहिए, जिसका उपयोग जीन प्रवर्धन को मापने के लिए किया जाएगा।
    1. जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए सीडी 31, वीई-कैडरिन, सीडी 45, और β-एक्टिन फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरों का उपयोग करें।
  4. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण अनुप्रयोगों के लिए नमूने का उपयोग करें1.

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Representative Results

सीडी 31 और सीडी 45 के लिए रेटिना ऊतक और इम्यूनोस्टेनिंग के पाचन के परिणामस्वरूप कोशिकाओं, एकल कोशिकाओं और व्यवहार्यता के लिए गेटिंग के बाद सीडी 31 + / सीडी 45- एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान योग्य आबादी होती है (चित्रा 2 ए)। सीडी 31 + / सीडी 45 + कोशिकाओं को खत्म करने के लिए सीडी 45 इम्यूनोस्टेनिंग की आवश्यकता होती है, जिसमें प्लेटलेट्स और कुछ ल्यूकोसाइट्स21 शामिल हैं। एंटीबॉडी विशिष्टता दिखाने और गेटिंग रणनीति (चित्रा 2 बी) का मार्गदर्शन करने के लिए प्रत्येक प्रयोग के लिए नियंत्रण किया जाना चाहिए। यह प्रतिशत अपेक्षाकृत कम है, पचने वाले एकल-कोशिका निलंबन में सभी कोशिकाओं का लगभग 0.5% -1.0%।

व्यवहार्यता और शुद्धता का मूल्यांकन विभिन्न आबादी से अलग किए गए आरएनए के प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधलापन और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के परिमाणीकरण के माध्यम से किया जा सकता है। अलग-अलग पाचन समय सेल उपज और व्यवहार्यता प्रतिशत को प्रभावित करता है, जिसमें 20 मिनट का पाचन समय होता है जिसके परिणामस्वरूप गैर-व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं के कम प्रतिशत के साथ इष्टतम उपज होती है (चित्रा 3 ए)। पृथक एंडोथेलियल कोशिकाएं अलगाव के बाद 60 मिनट तक व्यवहार्य रहीं, जैसा कि बाद में प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला (चित्रा 3 बी) द्वारा मापा गया था। ल्यूकोसाइट-विशिष्ट सीडी 45 की तुलना में एंडोथेलियल सेल जीन (सीडी 31 और वीई-कैडरिन) की अभिव्यक्ति के क्यूपीसीआर विश्लेषण द्वारा सेल जनसंख्या शुद्धता का आकलन β किया गया था, जो सीडी 31 + / सीडी 45- आबादी (चित्रा 3 सी) में एंडोथेलियल सेल जीन के लिए मजबूत संवर्धन दिखाता है।

इस प्रोटोकॉल से पृथक एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीकों में किया जा सकता है। पृथक एंडोथेलियल कोशिकाओं से आरएनए को शुद्ध करना, लाइब्रेरी तैयार करने के माध्यम से सीडीएनए को परिवर्तित और विस्तारित करना, और सीडीएनए लाइब्रेरी को अनुक्रमित करने के परिणामस्वरूप नौ स्वतंत्र नमूनों में >16,000 जीन की पहचान की गई, जिसमें इस सीमा से नीचे के जीन में देखे गए प्रति मिलियन रीड (टीपीएम) प्रतिलेख में गिरावट देखी गई (चित्रा 4 ए)। 10x जीनोमिक्स पाइपलाइन के माध्यम से पृथक रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं के एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण के परिणामस्वरूप प्रति सेल 1,171 जीन, 15,247 कुल जीन का पता चला, और 917 कोशिकाओं में प्रति सेल 2,255 अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (यूएमआई) गणना का औसत हुआ (चित्रा 4 बी)।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरोसेंट एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग गेटिंग रणनीति। (ए) सीडी 31 + / सीडी 45 के लिए सेल सॉर्टिंग - कोशिकाओं के लिए एफएससी-ए / एसएससी-ए द्वारा एंडोथेलियल कोशिकाएं, एकल कोशिकाओं के लिए एफएससी-ए / एफएससी-एच, व्यवहार्यता के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) नकारात्मकता, और एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए सीडी 31 + / सीडी 45। (बी) प्रत्येक फ्लोरोसेंट रीडआउट के लिए एंटीबॉडी विशिष्टता और गेटिंग रणनीति दिखाने के लिए पीआई, आईजीजी नियंत्रण, सीडी 31 + नियंत्रण और सीडी 45 + नियंत्रण के लिए नियंत्रण धुंधलापन। चावकिन एट अल की अनुमति के साथ पुनः प्रकाशित एस कार्गर एजी, बेसल17 में प्रकाशित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पृथक एंडोथेलियल कोशिकाओं की अलगाव व्यवहार्यता और शुद्धता। (ए) विभिन्न पाचन समय के बाद अलग किए गए व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक अलगाव में उपयोग किए जाने वाले चूहों की संख्या के लिए सामान्यीकृत हो गई। (बी) समय के साथ एफएसीएस छंटाई द्वारा अलगाव के बाद गैर-व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं का प्रतिशत। (ग) सीडी31-/सीडी45- (नकारात्मक), सीडी31+/सीडी45- (एंडोथेलियल सेल), और सीडी31-/सीडी45+ (ल्यूकोसाइट) आबादी (एयू = मनमानी इकाइयों) में एंडोथेलियल-विशिष्ट जीन (सीडी31, वीई-कैडरिन) और ल्यूकोसाइट-विशिष्ट सीडी45 के लिए क्यूपीसीआर। मानक विचलन की त्रुटि सलाखों के साथ माध्य द्वारा दर्शाए गए सभी डेटा, एनोवा पोस्ट-हॉक ट्यूकी द्वारा सांख्यिकीय परीक्षण, पी-मान निरूपित (* पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001, **** पी < 0.0001)। चावकिन एट अल की अनुमति के साथ पुनः प्रकाशित एस कार्गर एजी, बेसल17 में प्रकाशित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का गुणवत्ता नियंत्रण अलगाव के बाद आरएनए अनुक्रमण और एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण के लिए पढ़ता है। (A) लाइब्रेरी तैयारी और इलुमिना अनुक्रमण के बाद नौ स्वतंत्र आरएनए अनुक्रमण नमूनों के लिए बहुतायत द्वारा रैंक किए गए जीन बनाम प्रतिलेख, प्रत्येक नमूने के दाईं ओर सूचीबद्ध प्रति जीन अनुक्रमों की औसत संख्या के साथ। (बी) 10 एक्स जीनोमिक्स पाइपलाइन का उपयोग करके अलगाव और तैयारी के बाद पी 6 रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं के एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए सेलरेंजर रिपोर्ट। यह विश्लेषण अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (यूएमआई) गणना दिखाता है जो प्रत्येक बारकोड के लिए कच्चे अनुक्रम आउटपुट का प्रतिनिधित्व करता है जो एक व्यक्तिगत अनुक्रमित सेल का प्रतिनिधित्व करता है। मुख्य गुणवत्ता नियंत्रण माप आंकड़े के निचले हिस्से में दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल प्रसवोत्तर मुराइन रेटिना ऊतक से एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन करता है जिसे उच्च सेल संख्या, शुद्धता और व्यवहार्यता के लिए अनुकूलित किया गया है। कोशिका शुद्धता सीडी 31 + / सीडी 45- इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा पचने वाले एकल-सेल निलंबन से एंडोथेलियल सेल आबादी के एफएसीएस अलगाव द्वारा प्राप्त की जाती है। सीडी 31, सीडी 45 और वीई-कैडरिन के लिए क्यूपीसीआर द्वारा ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग और जीन अभिव्यक्ति द्वारा व्यवहार्यता के लिए अलगाव की गुणवत्ता की मात्रा निर्धारित की जाती है (हालांकि वीई-कैडरिन का उपयोग इम्यूनोस्टेनिंग के लिए नहीं किया गया था)। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम रेटिना ऊतक अलगाव और ऊतक पाचन हैं। सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने और सेल शुद्धता बढ़ाने के लिए रेटिना ऊतक अलगाव जल्दी से किया जाना चाहिए। ऊतक पाचन किया जाना चाहिए, जैसा कि वर्णित है, सेल उपज और सेल व्यवहार्यता को अनुकूलित करने के लिए।

इस पद्धति को विभिन्न समय बिंदुओं, ट्रांसजेनिक संशोधनों के साथ चूहों, या विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों पर लागू करते समय इस प्रोटोकॉल में संशोधन किए जा सकते हैं। वयस्क रेटिना ऊतक की जांच करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है, क्योंकि ऊतक पी 6 रेटिना ऊतक की तुलना में अधिक परिपक्व हो सकता है और शुद्ध और व्यवहार्य एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए अधिक पाचन समय की आवश्यकता हो सकती है। प्रोटोकॉल को संशोधित करते समय रेटिना ऊतक और पाचन समय का अलगाव अनुकूलित किया जाना चाहिए। कम सेल उपज को ताजा पाचन एंजाइम, लंबे समय तक पाचन समय, या एफएसीएस के लिए नए एंटीबॉडी की आवश्यकता हो सकती है। कम शुद्धता को एफएसीएस के लिए नए एंटीबॉडी की आवश्यकता हो सकती है। कम व्यवहार्यता के लिए तेजी से रेटिना ऊतक अलगाव, कम पाचन समय, या तेज सेल सॉर्टिंग दर की आवश्यकता हो सकती है। निम्नलिखित समस्या निवारण कदम सेल उपज, शुद्धता और व्यवहार्यता में सुधार करने में मदद कर सकते हैं। डबल्स या गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत खराब पाचन के परिणामस्वरूप हो सकता है। सीडी 31 + / सीडी 45- एंडोथेलियल कोशिकाओं की एक गैर-पहचान योग्य आबादी खराब एंटीबॉडी धुंधला होने के परिणामस्वरूप हो सकती है। छंटाई के दौरान या अलगाव के बाद खराब व्यवहार्यता पाचन के परिणामस्वरूप हो सकती है जो बहुत कठोर है, लेकिन खराब कोशिका शुद्धता कमजोर पाचन या खराब एंटीबॉडी धुंधला होने के परिणामस्वरूप हो सकती है। खराब आरएनए गुणवत्ता एक आरएनए अनुक्रमण डेटासेट में कम अद्वितीय जीन उत्पन्न करेगी, और खराब व्यवहार्यता एक एकल सेल आरएनए अनुक्रमण डेटासेट में कम कोशिकाओं और जीनों का उत्पादन करेगी।

इस विधि की कई सीमाएँ हैं। सबसे पहले, इस विधि के परिणामस्वरूप रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं की कम उपज होती है, जो डाउनस्ट्रीम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण अनुप्रयोगों को सीमित कर सकती है। एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण के माध्यम से प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों ने 917 एंडोथेलियल कोशिकाओं का उत्पादन किया। रेटिना एंडोथेलियल सेल विकास की जांच के लिए अन्य एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण अध्ययनों में समान संख्या में कोशिकाओं को अलग और उपयोग कियागया है; उच्च पैदावार सेल समूहों के आगे के अंतर को प्रकट कर सकती है। विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक नमूना इनपुट तक पहुंचने के लिए सेल उपज बढ़ाने के लिए जानवरों और कूड़े को पूल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, अलगाव के बाद एंडोथेलियल कोशिकाओं की व्यवहार्यता अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को सीमित कर सकती है। व्यवहार्यता की खिड़की का विस्तार करना मुश्किल है, और गैर-व्यवहार्य कोशिकाएं कुछ अनुप्रयोगों को बाधित करेंगी जिन्हें बरकरार कोशिका झिल्ली की आवश्यकता होती है। इस विधि का उपयोग करने के लिए डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में अन्य विधियों के समायोजन की आवश्यकता हो सकती है।

रेटिना एंडोथेलियल सेल अलगाव के लिए यह विधि पहले प्रकाशित अनुप्रयोगों पर एक सुधार है जो एंडोथेलियल कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए सीडी 31 एंटीबॉडी-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों का उपयोग करते हैं, जिसमें इस प्रोटोकॉल को शुद्ध और व्यवहार्य सेल आबादी प्राप्त करने के लिए आवश्यक मापदंडों के लिए अनुकूलित किया जाता है जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण अनुप्रयोगों की सफलता में सुधार करेगा22,23 . व्यवहार्यता और शुद्धता की उच्च डिग्री पूरे ट्रांसस्क्रिप्टम आरएनए अनुक्रमण और एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण दोनों के लिए आवश्यक हैं। इसलिए, रेटिना वैस्कुलराइजेशन मॉडल के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विधियों को लागू करते समय यह विधि एक महत्वपूर्ण सुधार है।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण अनुप्रयोगों और संबंधित कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के संयोजन में इस रेटिना एंडोथेलियल सेल अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग, संवहनी विकास के जटिल अंतर्निहित तंत्र को प्रकट करने की क्षमता रखता है। ट्रांसजेनिक चूहों में प्रसवोत्तर रेटिना वैस्कुलराइजेशन का अध्ययन करने से एंजियोजेनेसिस और रक्त वाहिका परिपक्वता (हेजहोग, वीईजीएफ, डब्ल्यूएनटी, नॉच, टीजीएफ-β, बीएमपी) 24,25,26,27,28,29,30 को प्रभावित करने वाले कई सिग्नलिंग मार्गों की जांच को सक्षम किया गया है। इन अध्ययनों से पता चला है कि सेल भाग्य31,32,33 को नियंत्रित करने के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं में सिग्नलिंग मार्ग अत्यधिक परस्पर जुड़े हुए हैं। प्रसवोत्तर रेटिना ऊतक के विकास से रेटिना एंडोथेलियल सेल अलगाव के लिए इस अनुकूलित विधि का उपयोग, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विधियों और बायोकम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण34,35,36,37 के संयोजन में, संवहनी विकास को विनियमित करने वाले परस्पर सिग्नलिंग मार्गों के तंत्र को और स्पष्ट कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रासंगिक प्रकटीकरण नहीं है।

Acknowledgments

प्रस्तुत प्रयोगों में योगदान देने में उनके प्रयास, विशेषज्ञता और सलाह के लिए येल फ्लो साइटोमेट्री सुविधा, वर्जीनिया फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा विश्वविद्यालय, जीनोमिक विश्लेषण के लिए येल सेंटर और वर्जीनिया जीनोम विश्लेषण और प्रौद्योगिकी कोर विश्वविद्यालय के लिए धन्यवाद। इस अध्ययन को एनआईएच अनुदान द्वारा एनडब्ल्यूसी (टी 32 एचएल007224, टी 32 एचएल007284), एससी (टी 32 एचएल 007284), केडब्ल्यू (आर01 एचएल 142650), और केएच (आर01 एचएल 146056, आर01 डीके 118728, यूएच 3 ईबी025765) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Eppendorf safe-lock tubes USA Scientific 4036-3352
5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
60 mm Non TC-treated Culture Dish Corning 430589
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences 551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control BD Biosciences 553932
BD FACSChorus Software BD Biosciences FACSCHORUS
BD FACSMelody Cell Sorter BD Biosciences FACSMELODY
Collagenase Type II Sigma-Aldrich 234115
Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile Corning 3548
D-Glucose Gibco A2494001
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisher Scientific 12-711-9AM
Dissecting Pan Wax Carolina 629100
Dissection scissors Fine Science Tools 14085-08
Dissection Stereo Microscope M165 FC Leica M165FC
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-052
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190144
Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Sigma-Aldrich 22364120
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio 100-106
Fine dissection forceps Fine Science Tools 11250-00
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco 14175095
HEPES (1M) Gibco 15630130
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
Isoflurane, USP Covetrus 11695067772
Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath Fisher Scientific FSGPD20
Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated ThermoFisher 75002477
SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5120
Trypan Blue Solution ThermoFisher 15250061
V450 Rat Anti-Mouse CD45 BD Biosciences 560501
V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 560457

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References

  1. Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
  2. Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
  3. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
  4. Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
  5. Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
  6. Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  7. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
  8. Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
  9. Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
  10. dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
  11. Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
  12. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  13. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  14. Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
  15. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
  16. Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
  17. Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
  18. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
  19. Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
  21. Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
  22. Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
  23. Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
  24. Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
  25. Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
  26. Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
  27. Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
  28. Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
  29. Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
  30. Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
  31. Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
  32. Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
  33. Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
  34. Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).
  35. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  36. Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
  37. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 176 एंडोथेलियल सेल संवहनी विकास मुराइन रेटिना वैस्कुलराइजेशन अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्राथमिक सेल अलगाव व्यवहार्यता शुद्धता
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए मुराइन रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव
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Chavkin, N. W., Cain, S., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (176), e63133, doi:10.3791/63133 (2021).

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