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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation

Published: October 11, 2021 doi: 10.3791/63133
Automatic Translation
1,2, 1, 2,3,4, 1,2,4,5
1Department of Cell Biology, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Cardiology, University of Virginia School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, University of Virginia School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von murinen postnatalen retinalen Endothelzellen, die für Zellertrag, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert sind. Diese Zellen eignen sich für Next-Generation-Sequenzierungsansätze.

Abstract

Jüngste Verbesserungen in der Next-Generation-Sequenzierung haben das Wissen der Forscher über Molekular- und Zellbiologie erweitert, wobei mehrere Studien neue Paradigmen in der vaskulären Biologie aufdecken. Die Anwendung dieser Methoden auf Modelle der vaskulären Entwicklung erfordert die Optimierung von Zellisolierungstechniken aus embryonalen und postnatalen Geweben. Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit müssen alle maximal sein, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse aus Sequenzierungsansätzen der nächsten Generation zu erhalten. Das retinale Vaskularisationsmodell der neonatalen Maus wird von Forschern verwendet, um Mechanismen der vaskulären Entwicklung zu untersuchen. Forscher haben dieses Modell verwendet, um Mechanismen der Angiogenese und der arteriell-venösen Schicksalsspezifikation während der Blutgefäßbildung und -reifung zu untersuchen. Die Anwendung von Next-Generation-Sequenzierungstechniken zur Untersuchung des retinalen vaskulären Entwicklungsmodells erfordert die Optimierung einer Methode zur Isolierung von retinalen Endothelzellen, die die Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit maximiert. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Verdauung und Reinigung von retinem retinalem Gewebe unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die FACS-gereinigte CD31+/CD45-Endothelzellpopulation für die Genexpression von Endothelzellen stark angereichert ist und keine Veränderung der Lebensfähigkeit für 60 Minuten nach FACS aufweist. Enthalten sind repräsentative Ergebnisse von Next-Generation-Sequenzierungsansätzen an Endothelzellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, einschließlich Bulk-RNA-Sequenzierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, die zeigen, dass diese Methode zur retinalen Endothelzellisolierung mit Next-Generation-Sequenzierungsanwendungen kompatibel ist. Diese Methode der retinalen Endothelzellisolierung wird fortschrittliche Sequenzierungstechniken ermöglichen, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzudecken.

Introduction

Die hohe Durchsatzkapazität der Sequenzierung von Nukleinsäuren über Next-Generation-Sequencing-Ansätze hat das Wissen der Forscher über Molekular- und Zellbiologie erheblich erweitert. Diese fortschrittlichen Techniken umfassen die Sequenzierung der gesamten Transkriptom-RNA, die DNA-Sequenzierung von Zielregionen zur Identifizierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), die DNA-Sequenzierung gebundener Transkriptionsfaktoren bei der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-Sequenzierung oder offene Chromatinregionen in der ATAC-Sequenzierung (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung1 . In der Gefäßbiologie haben diese Fortschritte es den Forschern ermöglicht, komplizierte Mechanismen der Entwicklung und Krankheit aufzuklären und Genexpressionsmuster entlang eines Kontinuums unterschiedlicher Phänotypen zu unterscheiden 2,3. Zukünftige Experimente können komplexe Mechanismen weiter definieren, indem sie die Sequenzierung der nächsten Generation mit evaluierten Modellen der vaskulären Entwicklung kombinieren, aber die Methoden zur Probenvorbereitung müssen mit den fortschrittlichen Sequenzierungstechniken kompatibel sein.

Die Qualität, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Next-Generation-Sequenzierungsansätzen hängt von der Methode der Probenvorbereitung ab. Bei der Isolierung einer Untergruppe von Zellen oder der Erzeugung einzelliger Suspensionen aus Geweben sind optimale Verdauungs- und Reinigungsmethoden unerlässlich, um die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Reinheit der Zellpopulation zu maximieren 4,5. Dies erfordert ein Gleichgewicht in der Verdauungsmethode: Eine starke Verdauung ist notwendig, um Zellen aus dem Gewebe zu befreien und genügend Zellen für nachgeschaltete Ansätze zu erhalten, aber die Zelllebensfähigkeit wird negativ beeinflusst, wenn die Verdauung zu stark ist 6,7. Darüber hinaus ist die Reinheit der Zellpopulation für robuste Ergebnisse und eine genaue Analyse der Daten erforderlich, die durch FACS erreicht werden kann. Dies unterstreicht die Bedeutung der Optimierung von Zellisolationsmethoden, um die Next-Generation-Sequenzierung auf etablierte Modelle der vaskulären Entwicklung anzuwenden.

Ein gut charakterisiertes Modell zur Untersuchung der vaskulären Entwicklung ist das murine retinale vaskuläre Entwicklungsmodell. Das murine retinale Gefäßsystem entwickelt sich postnatal in einem zweidimensionalen oberflächlichen Plexus mit anfänglichem angiogenem Sprießen aus dem Sehnerv, sichtbar am postnatalen Tag (P)3, angiogener Front mit Stiel- und Spitzenzellen und anfänglicher Gefäßreifung sichtbar bei P6 und Reifung des vaskulären Plexus sichtbar nach P9 8,9. Während des Umbaus des anfänglichen vaskulären Plexus werden Endothelzellen in verschiedenen Gefäßen in Richtung arterieller, kapillarer und venöser Phänotypen spezifiziert, um ein Kreislaufnetzwerkzu erzeugen 10,11. Daher ermöglicht diese Methode den Forschern, die angiogene Gefäßplexusbildung und die endotheliale arteriell-venöse Spezifikation und Reifung zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung sichtbar zu machen9. Darüber hinaus bietet dieses Modell eine Methode zur Untersuchung der Auswirkungen transgener Manipulation auf die Angiogenese und die Entwicklung des vaskulären Plexus, die zur Untersuchung von Gefäßentwicklung, arteriell-venösen Fehlbildungen und sauerstoffinduzierter Neovaskularisation eingesetzt wurde 12,13,14,15,16 . Um Next-Generation-Sequenzierungsansätze mit dem murinen retinalen vaskulären Entwicklungsmodell zu kombinieren, ist ein optimiertes Protokoll für die Isolierung von Endothelzellen aus Netzhautgewebe notwendig.

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Verdauung von Netzhautgewebe von Mäusen bei P6, um die Zellausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit zu maximieren. Netzhautgewebe wird aus P6-Mäusen isoliert, für 20 min verdaut, für CD31 und CD45 immungefärbt und durch FACS gereinigt, um eine Einzelzellsuspension von Endothelzellen in etwa 2,5 h zu isolieren (Abbildung 1A). Es wurde festgestellt, dass diese Endothelzellen 60 Minuten nach der Isolierung eine hohe Lebensfähigkeit aufrechterhalten17, was Bibliothekspräparate für Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation ermöglicht. Darüber hinaus werden repräsentative Ergebnisse für FACS-Gating- und Qualitätskontrollergebnisse aus zwei separaten Next-Generation-Sequenzierungsmethoden unter Verwendung dieses Isolationsprotokolls bereitgestellt: die gesamte Transkriptom-RNA-Sequenzierung und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht es, Next-Generation-Sequenzierungsansätze in Verbindung mit dem retinalen Vaskularisationsmodell zu verwenden, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzuklären.

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Protocol

Die Institutional Animal Care and Use Committees der Yale University und der University of Virginia genehmigten alle in diesem Protokoll aufgeführten Tierversuche.

1. Besorgen Sie sich Mausaugen für die Netzhautisolierung

  1. Bereiten Sie 1x eiskaltes PBS vor und geben Sie 500 μL in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte.
  2. Euthanasieren Sie neugeborene Mäuse am sechsten postnatalen Tag (P6) gemäß genehmigten institutionellen Richtlinien. Für dieses Experiment werden Würfe von etwa 4-8 neonatalen Mäusen bei P6 durch Isofluran-Inhalation für mindestens drei Minuten nach dem Atemstillstand eingeschläfert, gefolgt von einer Enthauptung.
  3. Entfernen Sie die Augen von jeder der Mäuse. Schneiden Sie die Haut und die Membran über dem Auge ab, indem Sie mit einer Sezierschere senkrecht zum Augenlid schneiden. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um sanft über und unter das Auge zu drücken, so dass sich das Auge aus der Augenhöhle bewegt.
    1. Kneifen Sie vorsichtig mit der Pinzette unter das Auge und schneiden Sie den Sehnerv, der das Auge befestigt hält. Legen Sie dann jedes Auge in die 48-Well-Platte in das vorbereitete 1x eiskalte PBS, bis die Ernte beendet ist.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine Vertiefung pro Maus, wobei sich beide Augen einer einzelnen Maus im selben Vertiefung befinden.

2. Netzhautgewebe der Maus isolieren

  1. Füllen Sie eine Petrischale, die mit einem Präparierpad auf der Unterseite ausgekleidet ist, mit 500 μL 1x eiskaltem PBS, um die Augen einzutauchen, und legen Sie sie unter ein Dissektionsmikroskop, das auf 4,0-fache Vergrößerung eingestellt ist.
    1. Hängen Sie die Augen mit einer Transferpipette mit breiter Spitze in das Präparierpad, um die Augen nicht zu beschädigen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Augen vollständig mit PBS bedeckt sind.
  2. Halten Sie den Sehnerv mit einer der Pinzetten zur Stabilisierung mit zwei feinen Dissektionszangen fest und stechen Sie mit der zweiten Pinzette ein Loch durch die Vorderkammer, wo sich Hornhaut und Sklera verbinden (Abbildung 1B). Reißen Sie das Loch in einem Kreis etwa 75% des Weges um die Hornhaut.
    1. Während Sie den Sehnerv noch mit einer der Pinzetten halten, verwenden Sie die zweite Pinzette, um die Sklera sanft vom Netzhautgewebe abzureißen.
    2. Verwenden Sie wie oben die zweite Pinzette, um den Glaskörper des Netzhautgewebes vorsichtig abzureißen.
    3. Entfernen Sie mit der zweiten Pinzette vorsichtig die Linsen- und Hyaloidplexusgefäße, die sich nicht gelöst haben, als der Glaskörper entfernt wurde. Um dies zu tun, greifen Sie mit einer offenen Pinzette in die Netzhaut, bis Sie fast die Netzhaut berühren, schließen Sie die Pinzette, um die Linsen- und Hyaloidplexusgefäße zu greifen, und ziehen Sie die Pinzette aus der Netzhaut heraus. Dies kann wiederholt werden, bis alle Gefäße entfernt sind.
      HINWEIS: Der Plexus hyaloideus ähnelt einer klaren, netzartigen Struktur.
  3. Füllen Sie 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μL 1x eiskaltem PBS und legen Sie die Netzhaut in die Röhrchen. Isolieren Sie alle Netzhäute von den Augen und legen Sie sie in eiskaltes PBS, bevor Sie fortfahren.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine Röhre pro Maus, wobei sich zwei Netzhäute derselben Maus eine Röhre teilen. Wenn Netzhautgewebe gerissen ist, übertragen Sie es in mehrere Stücke. Die Gesamtzeit der Netzhautgewebedissektion für einen Wurf von Mäusen sollte 15-60 Minuten dauern, beginnend mit der Euthanasie und endend mit der endgültigen Netzhautgewebeisolierung.

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über das Isolationsprotokoll. (A) Schematische Darstellung des Zeitplans für die Isolierung mit einer geschätzten Zeit für jeden Schritt: Isolierung von Netzhautgewebe, Verdauung, Antikörperfärbung, FACS und Zelllebensfähigkeitsfenster. (B) Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Isolierung von Netzhautgewebe aus dem Auge, mit nummerierten Dissektionsschritten: 1) Hornhaut durchstechen, 2) Hornhaut reißen, 3) Sklera reißen, 4) Sklera aus der Netzhaut entfernen, 5) Sklera und Bindegewebe aus der Netzhaut entfernen, 6) den Glaskörper und die Glaskörpergefäße von der Netzhaut entfernen. (C) Repräsentative Bilder von Netzhautgewebe während verschiedener Verdauungsschritte: Pre-digest, Post-digest, Pellet (schwarze Pfeile markieren Netzhautgewebe oder Zellpellet). Wiederveröffentlichung mit freundlicher Genehmigung von Chavkin et al. veröffentlicht in S. Karger AG, Basel17. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Netzhautgewebe zu einer einzelligen Suspension verdauen

  1. Bereiten Sie 500 μL Aufschlusslösung für jeweils zwei isolierte Netzhäute vor. Fügen Sie FBS und Kollagenase Typ II zu DMEM zu einer Endkonzentration von 10% FBS und 1 mg / ml Kollagenase Typ II hinzu. Die Lösung wird mit einem Wasserbad gemischt und auf 37 °C erwärmt.
  2. Entfernen Sie überschüssiges PBS aus den 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen durch vorsichtiges Pipettieren. Lassen Sie genügend PBS, um das Netzhautgewebe vollständig zu bedecken, etwa 100 μL in jedem Röhrchen.
  3. Geben Sie 500 μL der Verdauungslösung in jedes Röhrchen mit Netzhautgewebe (Abbildung 1C).
    1. Verwenden Sie einen P1000-Pipettierer und eine Pipettenspitze, um das Netzhautgewebe in der Verdauungslösung fünfmal auf und ab zu pipettieren.
  4. Die Aufschlussmischung in einem 37 °C warmen Wasserbad für 20 min inkubieren.
    1. Verwenden Sie einen P1000-Pipettierer und eine Pipettenspitze, um die Aufschlussmischung alle 5 Minuten auf und ab zu pipettieren. Nach der Inkubation hat sich das Netzhautgewebe in eine einzellige Suspension aufgelöst, so dass die Verdauungsmischung trüb sein sollte (Abbildung 1C).

4. Zellen zählen

  1. Stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 4 °C ein und legen Sie die Aufschlussmischröhrchen hinein. Pelletieren Sie die Aufschlussmischung durch Zentrifugieren bei 375 x g für 5 min.
  2. Die überstehende Verdauungslösung vorsichtig durch Pipettieren entfernen. Stören Sie das Zellpellet nicht (Abbildung 1C). Suspendieren Sie das Pellet in 500 μL eiskaltem 1x PBS durch vorsichtiges Auf- und Abmischen mit der Pipette.
  3. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter einem Mikroskop.
    HINWEIS: Die Zellzahl beträgt ungefähr 1 x 106 Zellen pro zwei Netzhäute.
  4. Stellen Sie sicher, dass die Zellen durch sanftes Mischen ordnungsgemäß resuspendiert werden, und aliquot dann 20 μL Zellsuspension in drei Röhrchen zur Kontrolle der Färbung (Röhrchen 1: IgG-Kontrolle, Röhrchen 2: CD31-Kontrolle und Röhrchen 3: CD45-Kontrolle), wie zuvor beschrieben und verwendet17,18.
  5. Stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 4 °C ein und legen Sie Röhrchen mit Zellen hinein. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 375 x g für 5 min.

5. Immunfärben Sie die Zellen mit Antikörpern

  1. Bereiten Sie 100 μL Färbepuffer pro zwei gefärbte Netzhäute plus vier Kontrollröhrchen vor. Fügen Sie FBS, HEPES und D-Glucose zu HBSS-Puffer auf eine Endkonzentration von 10% FBS, 10 mM HEPES und 1 mg / ml D-Glucose hinzu.
  2. Erhalten Sie fluoreszenzkonjugierte Antikörper gegen CD31 und CD45. Geben Sie die Antikörper in einer Verdünnung von 1:100 in den Färbepuffer (Röhrchen 1: Nur IgG-Antikörper, Röhrchen 2: nur CD31-Antikörper und Röhrchen 3: nur CD45-Antikörper). Fügen Sie 1 μL Antikörper pro 100 μL des Färbepuffers hinzu, um eine endgültige Antikörperkonzentration von 2 μg / ml zu erhalten.
  3. Entfernen Sie das PBS vorsichtig durch Pipettieren aus dem gewaschenen Zellpellet.
  4. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 μL Antikörperfärbelösung pro 0,5 x 106 Zellen.
    1. Inkubieren Sie die Einzelzellsuspension mit der Antikörperfärbelösung für 30 min auf Eis im Dunkeln. Klopfen Sie alle 10 Minuten auf die Röhrchen, um die Zellen vorsichtig zu mischen.

6. Vorbereitung auf fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

  1. Stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 4 °C ein und legen Sie die Röhrchen mit den Zellen hinein. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 375 x g für 5 min.
    1. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie diese Zellen in 500 μL 1x PBS zum Waschen.
  2. Stellen Sie eine Tischzentrifuge auf 4 °C ein und legen Sie die Röhrchen mit den Zellen hinein. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 375 x g für 5 min
  3. Bereiten Sie 1,5 ml FACS-Puffer vor (1% FBS in 1x PBS).
    1. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 μL FACS-Puffer durch vorsichtiges Mischen mit einem Pipettor.
  4. Geben Sie Propidiumiodid (PI) zu den Probenröhrchen, die den FACS-Puffer enthalten, bis zu einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml. PI wird als Lebensfähigkeitsmarker verwendet.
  5. Die Zellsuspensionen werden durch eine Schnappkappe des Zellsiebs in 5 ml Reagenzgläser überführt und kombiniert. Die Schnappkappe des Zellsiebs sollte einen 35-μm-Filter enthalten, und die Zellsuspensionen können direkt auf den Filter pipettiert werden.
    1. Halten Sie die FACS-Röhrchen im Dunkeln auf Eis und übertragen Sie sie in den Zellsortierer.

7. Einrichtung des FACS-Instruments

  1. Installieren Sie eine 100-μm-Düse in ein FACS-Gerät.
    HINWEIS: Diese Größendüse minimiert das Sammelvolumen und maximiert die isolierte Zelldichte.
  2. Bereiten Sie 250 μL 1x PBS in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen als Sammelröhrchen vor, das in das FACS-Gerät eingebaut wird.

8. Isolieren Sie lebensfähige Endothelzellen über FACS

  1. Schalten Sie das FACS-Instrument und den Computer ein. Klicken Sie auf das FACS-Softwaresymbol, um die FACS-Software auf dem Computer zu öffnen, um das FACS-Gerät auszuführen und zu bedienen. Führen Sie routinemäßige Qualitätskontrolltests durch.
  2. Legen Sie die kontrollgefärbten Proben in das FACS-Gerät, um die Achsen anzupassen. Beginnen Sie mit reinen IgG-Antikörperzellen, um FSC und SSC zu erzeugen und anzupassen, dann CD31-Antikörper nur, um CD31 zu erzeugen und anzupassen, und dann CD45-Antikörper nur, um CD45 zu erzeugen und anzupassen. Zeichnen Sie Daten aus Kontrollproben auf.
  3. Laden Sie gefärbte Probenzellen in das FACS-Gerät und führen Sie die Probe aus.
  4. Gattern Sie die Zellen basierend auf den Parametern Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung (FSC-A bzw. SSC-A) (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Die Parameter FSC-A und SSC-A werden verwendet, um Zellen basierend auf Größe, Dichte, Granularität, Oberflächeneigenschaften und Brechungsindex auszuwählen.
  5. Gate-Zellen mittels FSC-A und FSC-H, um Zelldubletten zu identifizieren und nur einzelne Zellen zu sammeln (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Die Parameter FSC-A und FSC-H werden verwendet, um einzelne Zellen nach dem Prinzip auszuwählen, dass Zelldubletten während der Vorwärtsstreuung Tröpfchen mit einem größeren Verhältnis von Fläche zu Höhe sind.
  6. Gate-Zellen mittels PI und SSC-A zur Identifizierung lebensfähiger Zellen (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Lebensfähige Zellen sind PI-negativ.
  7. Erstellen Sie ein CD31+/CD45-Gate mit Bedienelementen und Gate-Zellen von CD31 und CD45 (Abbildung 2A,B).
    1. Führen Sie ein Sammelröhrchen mit 250 μL FACS-Puffer ein.
    2. Sortieren Sie Zellen, die CD31-positiv/CD45-negativ sind, in das installierte Sammelrohr.
    3. Bewahren Sie die Sammelröhrchen zur weiteren Analyse auf Eis auf. In diesem Schritt1 können Proben für Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation verarbeitet werden.

9. Rentabilitätstest durchführen

  1. Mischen Sie 10 μL Zellen mit 10 μL 0,4% Trypanblau-Lösung, um die Zelllebensfähigkeit zu beurteilen.
  2. Zählen Sie lebensfähige Zellen, indem Sie die gefärbte Mischung auf einen Hämozytometerobjektträger pipettieren. Legen Sie den Objektträger unter ein Mikroskop, um genaue Lebensfähigkeitswerte zu erhalten. Zählen Sie blaue Zellen als nicht lebensfähig und zählen Sie klare Zellen als lebensfähig.
    1. Teilen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch die Gesamtzahl der Zelle, um die prozentuale Lebensfähigkeit zu berechnen.

10. Genexpressionstest durchführen

  1. Erhalten Sie 10.000-20.000 Zellen pro Probe und führen Sie eine RNA-Isolierung durch, um die Genexpression von retinalen retinalen Endothelzellen zu analysieren. Die RNA-Isolierung wird mit einem kommerziell erhältlichen Kit durchgeführt, das ethanolbasierte RNA-Fällung und dann Zentrifugations- und Membransäulen verwendet, um gereinigte RNA aus Zelllysat zu waschen und zu eluieren. In diesem Schritt1 können Proben für einige Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation verarbeitet werden.
  2. Wandeln Sie die RNA in cDNA um, indem Sie das Enzym der reversen Transkriptase und unterstützende Reagenzienverwenden 19.
  3. Quantifizierung mit einem DNA-bindenden Farbstoff und einer quantitativen PCR (qPCR)20. Laden Sie cDNA-Proben in eine 384-Well-qPCR-Platte mit Primern, um Gene von Interesse zu amplifizieren. Das Reaktionsvolumen sollte 10 μL betragen, einschließlich DNA-bindender Farbstoff, der zur Quantifizierung der Genamplifikation verwendet wird.
    1. Verwenden Sie CD31, VE-Cadherin, CD45 und β-Aktin-Vorwärts- und Rückwärtsprimer, um die Genexpression zu messen.
  4. Verwenden Sie das Beispiel für Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation1.

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Representative Results

Die Verdauung von Netzhautgewebe und die Immunfärbung für CD31 und CD45 führt zu einer identifizierbaren Population von CD31+/CD45-Endothelzellen nach Gating für Zellen, einzelne Zellen und Lebensfähigkeit (Abbildung 2A). Eine CD45-Immunfärbung ist erforderlich, um CD31+/CD45+-Zellen zu eliminieren, zu denen Blutplättchen und einige Leukozyten gehören21. Für jedes Experiment sollten Kontrollen durchgeführt werden, um die Antikörperspezifität und die Gating-Strategie zu zeigen (Abbildung 2B). Dieser Prozentsatz ist relativ niedrig, etwa 0,5%-1,0% aller Zellen in der verdauten Einzelzellsuspension.

Lebensfähigkeit und Reinheit können durch Quantifizierung der Propidiumiodidfärbung und Genexpressionsanalyse von RNA, die aus verschiedenen Populationen isoliert wurde, beurteilt werden. Unterschiedliche Verdauungszeiten beeinflussen den Zellertrag und den Prozentsatz der Lebensfähigkeit, wobei 20 Minuten Verdauungszeit zu einem optimalen Ertrag mit einem geringen Prozentsatz nicht lebensfähiger Endothelzellen führen (Abbildung 3A). Isolierte Endothelzellen blieben nach der Isolierung 60 Minuten lang lebensfähig, gemessen durch anschließende Propidiumiodid-Färbung (Abbildung 3B). Die Reinheit der Zellpopulation wurde durch qPCR-Analyse der Expression von Endothelzellgenen (CD31 und VE-Cadherin) im Vergleich zu Leukozyten-spezifischem CD45, normalisiert zu β-Aktin (ActB), beurteilt, was eine starke Anreicherung für Endothelzellgene in der CD31+/CD45-Population zeigte (Abbildung 3C).

Isolierte Endothelzellen aus diesem Protokoll können in Next-Generation-Sequenzierungstechniken verwendet werden. Die Reinigung von RNA aus den isolierten Endothelzellen, die Umwandlung und Amplifikation von cDNA durch Bibliothekspräparation und die Sequenzierung der cDNA-Bibliothek führten zu >16.000 Genen, die in neun unabhängigen Proben identifiziert wurden, wobei ein Abfall der Transkripte pro Million Lesevorgänge (TPM) in Genen unterhalb dieser Schwelle beobachtet wurde (Abbildung 4A). Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung isolierter retinaler Endothelzellen durch die 10x Genomics-Pipeline führte zu einem Median von 1.171 Genen pro Zelle, insgesamt 15.247 nachgewiesenen Genen und einem Median von 2.255 Unique Molecular Identifier (UMI) pro Zelle in 917 Zellen (Abbildung 4B).

Figure 2
Abbildung 2: Fluoreszierend aktivierte Zellsortierungs-Gating-Strategie. (A) Zellsortierung für CD31+/CD45- Endothelzellen durch FSC-A/SSC-A für Zellen, FSC-A/FSC-H für Einzelzellen, Propidiumiodid (PI) Negativität für Lebensfähigkeit und CD31+/CD45- für Endothelzellen. (B) Kontrollfärbung für PI, IgG-Kontrolle, CD31+-Kontrolle und CD45+-Kontrolle, um Antikörperspezifität und Gating-Strategie für jede Fluoreszenzanzeige zu zeigen. Wiederveröffentlichung mit freundlicher Genehmigung von Chavkin et al. veröffentlicht in S. Karger AG, Basel17. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Isolationslebensfähigkeit und Reinheit isolierter Endothelzellen. (A) Anzahl lebensfähiger und nicht lebensfähiger Endothelzellen, die nach verschiedenen Verdauungszeiten isoliert wurden, normalisiert auf die Anzahl der in jeder Isolierung verwendeten Mäuse. (B) Prozentsatz der nicht lebensfähigen Endothelzellen nach Isolierung durch FACS-Sortierung im Laufe der Zeit. (C) qPCR für endothelspezifische Gene (CD31, VE-Cadherin) und leukozytenspezifische CD45 in CD31-/CD45- (negativ), CD31+/CD45- (Endothelzelle) und CD31-/CD45+ (Leukozyten) Populationen (A.U. = Arbitrary Units). Alle Daten dargestellt durch Mittelwert mit Fehlerbalken der Standardabweichung, statistische Tests durch ANOVA post-hoc Tukey, p-Werte bezeichnet (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Wiederveröffentlichung mit freundlicher Genehmigung von Chavkin et al. veröffentlicht in S. Karger AG, Basel17. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Qualitätskontrolle von Next-Generation-Sequencing-Reads für RNA-Sequenzierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung nach Isolierung . (A) Transkripte pro Million Lesevorgänge (TPM) im Vergleich zu Genen, die nach Häufigkeit für neun unabhängige RNA-Sequenzierungsproben nach Bibliotheksvorbereitung und Illumina-Sequenzierung geordnet sind, wobei die durchschnittliche Anzahl der Sequenzen pro Gen rechts neben jeder Probe aufgeführt ist. (B) CellRanger-Bericht zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung von P6-Netzhaut-Endothelzellen nach Isolierung und Präparation unter Verwendung der 10x Genomics-Pipeline. Diese Analyse zeigt UMI-Zählungen (Unique Molecular Identifier), die rohe Sequenzausgaben für jeden Barcode darstellen, der eine einzelne sequenzierte Zelle darstellt. Wichtige Qualitätskontrollmessungen werden im unteren Teil der Abbildung angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen aus postnatalem murinem Netzhautgewebe, die für eine hohe Zellzahl, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert wurde. Die Zellreinheit wird durch FACS-Isolierung von Endothelzellpopulationen aus der verdauten Einzelzellsuspension durch CD31+/CD45-Immunfärbung erreicht. Die Qualität der Isolierung wird in Assays auf Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Färbung und Genexpression mittels qPCR für CD31, CD45 und VE-Cadherin quantifiziert (obwohl VE-Cadherin nicht für die Immunfärbung verwendet wurde). Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind die Netzhautgewebeisolierung und die Gewebeverdauung. Die Netzhautgewebeisolierung sollte schnell durchgeführt werden, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten und die Zellreinheit genau zu erhöhen. Die Gewebeverdauung sollte, wie beschrieben, durchgeführt werden, um die Zellausbeute und Zelllebensfähigkeit zu optimieren.

Änderungen an diesem Protokoll können vorgenommen werden, wenn diese Methode auf verschiedene Zeitpunkte, Mäuse mit transgenen Modifikationen oder verschiedene nachgeschaltete Anwendungen angewendet wird. Dies könnte besonders wichtig sein, wenn adultes Netzhautgewebe untersucht wird, da das Gewebe reifer sein kann als das P6-Netzhautgewebe und möglicherweise mehr Verdauungszeit benötigt, um reine und lebensfähige Endothelzellen zu isolieren. Die Isolierung von Netzhautgewebe und die Verdauungszeit müssen bei der Änderung des Protokolls optimiert werden. Eine geringe Zellausbeute kann frische Verdauungsenzyme, längere Verdauungszeiten oder neue Antikörper gegen FACS erfordern. Eine geringe Reinheit kann neue Antikörper für FACS erfordern. Eine geringe Lebensfähigkeit kann eine schnellere Netzhautgewebeisolierung, eine kürzere Verdauungszeit oder eine schnellere Zellsortierrate erfordern. Die folgenden Schritte zur Fehlerbehebung können zur Verbesserung der Zellausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit beitragen. Ein hoher Prozentsatz von Dubletten oder nicht lebensfähigen Zellen kann aus einer schlechten Verdauung resultieren. Eine nicht identifizierbare Population von CD31+/CD45-Endothelzellen kann aus einer schlechten Antikörperfärbung resultieren. Eine schlechte Lebensfähigkeit während der Sortierung oder nach der Isolierung kann durch eine zu harte Verdauung entstehen, aber eine schlechte Zellreinheit kann durch schwache Verdauung oder schlechte Antikörperfärbung entstehen. Eine schlechte RNA-Qualität führt zu weniger eindeutigen Genen in einem RNA-Sequenzierungsdatensatz, und eine schlechte Lebensfähigkeit führt zu weniger Zellen und Genen in einem Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdatensatz.

Es gibt mehrere Einschränkungen für diese Methode. Erstens führt diese Methode zu einer geringen Ausbeute an retinalen Endothelzellen, was die nachgeschalteten Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation einschränken kann. Die repräsentativen Ergebnisse, die durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung erhalten wurden, ergaben 917 Endothelzellen. Eine ähnliche Anzahl von Zellen wurde isoliert und in anderen Einzelzell-RNA-Sequenzierungsstudien verwendet, um die Entwicklung retinaler Endothelzellen zu untersuchen22; Höhere Ausbeuten könnten eine weitere Unterscheidung von Zellclustern offenbaren. Tiere und Würfe können gepoolt werden, um die Zellausbeute zu erhöhen und die für verschiedene Anwendungen erforderliche Probeneingabe zu erreichen. Darüber hinaus kann die Lebensfähigkeit von Endothelzellen nach der Isolierung andere nachgeschaltete Anwendungen einschränken. Es ist schwierig, das Fenster der Lebensfähigkeit zu verlängern, und nicht lebensfähige Zellen stören bestimmte Anwendungen, die intakte Zellmembranen erfordern. Anpassungen anderer Methoden in nachgelagerten Anwendungen können erforderlich sein, um diese Methode anwenden zu können.

Diese Methode zur retinalen Endothelzellisolierung ist eine Verbesserung gegenüber zuvor veröffentlichten Anwendungen, die CD31-Antikörper-konjugierte Magnetkügelchen zur Reinigung von Endothelzellen verwenden, da dieses Protokoll für Parameter optimiert ist, die notwendig sind, um eine reine und lebensfähige Zellpopulation zu erhalten, die den Erfolg von Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation verbessern wird22,23 . Hohe Lebensfähigkeit und Reinheit sind sowohl für die Sequenzierung der gesamten Transkriptom-RNA als auch für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung unerlässlich. Daher ist diese Methode eine signifikante Verbesserung bei der Anwendung von Next-Generation-Sequenzierungsmethoden auf das retinale Vaskularisationsmodell.

Die Verwendung dieses retinalen Endothelzellisolierungsprotokolls in Kombination mit Next-Generation-Sequenzierungsanwendungen und der damit verbundenen Computeranalyse hat das Potenzial, komplexe zugrunde liegende Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzudecken. Die Untersuchung der postnatalen retinalen Vaskularisation bei transgenen Mäusen ermöglichte die Untersuchung vieler Signalwege, die die Angiogenese und die Reifung der Blutgefäße beeinflussen (Hedgehog, VEGF, Wnt, Notch, TGF-β, BMP)24,25,26,27,28,29,30). Diese Studien haben gezeigt, dass Signalwege in Endothelzellen stark miteinander verbunden sind, um das Zellschicksal zu kontrollieren31,32,33. Die Verwendung dieser optimierten Methode zur retinalen Endothelzellisolierung aus sich entwickelndem postnatalem Netzhautgewebe in Kombination mit Next-Generation-Sequenzierungsmethoden und biocomputergestützten Ansätzen34,35,36,37 kann die Mechanismen miteinander verbundener Signalwege, die die vaskuläre Entwicklung regulieren, weiter aufklären.

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Disclosures

Die Autoren haben keine relevanten Angaben.

Acknowledgments

Vielen Dank an die Yale Flow Cytometry Facility, die University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, das Yale Center for Genomic Analysis und den University of Virginia Genome Analysis and Technology Core für ihre Bemühungen, ihr Fachwissen und ihre Beratung bei der Durchführung der vorgestellten Experimente. Diese Studie wurde durch NIH-Zuschüsse an N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) und K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Eppendorf safe-lock tubes USA Scientific 4036-3352
5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
60 mm Non TC-treated Culture Dish Corning 430589
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences 551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control BD Biosciences 553932
BD FACSChorus Software BD Biosciences FACSCHORUS
BD FACSMelody Cell Sorter BD Biosciences FACSMELODY
Collagenase Type II Sigma-Aldrich 234115
Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile Corning 3548
D-Glucose Gibco A2494001
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisher Scientific 12-711-9AM
Dissecting Pan Wax Carolina 629100
Dissection scissors Fine Science Tools 14085-08
Dissection Stereo Microscope M165 FC Leica M165FC
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-052
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190144
Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Sigma-Aldrich 22364120
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio 100-106
Fine dissection forceps Fine Science Tools 11250-00
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco 14175095
HEPES (1M) Gibco 15630130
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
Isoflurane, USP Covetrus 11695067772
Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath Fisher Scientific FSGPD20
Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated ThermoFisher 75002477
SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5120
Trypan Blue Solution ThermoFisher 15250061
V450 Rat Anti-Mouse CD45 BD Biosciences 560501
V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 560457

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Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation
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Chavkin, N. W., Cain, S., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (176), e63133, doi:10.3791/63133 (2021).

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