Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering af murine retinale endotelceller til næste generations sekventering

Published: October 11, 2021 doi: 10.3791/63133
Automatic Translation
1,2, 1, 2,3,4, 1,2,4,5
1Department of Cell Biology, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Cardiology, University of Virginia School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, University of Virginia School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver en metode til isolering af murine postnatal retinale endotelceller optimeret til celleudbytte, renhed og levedygtighed. Disse celler er velegnede til næste generations sekventeringsmetoder.

Abstract

Nylige forbedringer i næste generations sekventering har avanceret forskernes viden om molekylær og cellulær biologi, hvor flere undersøgelser afslører nye paradigmer inden for vaskulær biologi. Anvendelse af disse metoder til modeller for vaskulær udvikling kræver optimering af celleisoleringsteknikker fra embryonale og postnatale væv. Celleudbytte, levedygtighed og renhed skal alle være maksimale for at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater fra næste generations sekventeringsmetoder. Den neonatale mus retinale vaskulariseringsmodel bruges af forskere til at studere mekanismer for vaskulær udvikling. Forskere har brugt denne model til at undersøge mekanismer for angiogenese og arteriel-venøs skæbnespecifikation under dannelse og modning af blodkar. Anvendelse af næste generations sekventeringsteknikker til at studere den retinale vaskulære udviklingsmodel kræver optimering af en metode til isolering af retinale endotelceller, der maksimerer celleudbytte, levedygtighed og renhed. Denne protokol beskriver en metode til murine retinal vævsisolering, fordøjelse og oprensning ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Resultaterne indikerer, at den FACS-oprensede CD31 + / CD45- endotelcellepopulation er stærkt beriget til endotelcellegenekspression og udviser ingen ændring i levedygtighed i 60 minutter efter FACS. Inkluderet er repræsentative resultater af næste generations sekventeringsmetoder på endotelceller isoleret ved hjælp af denne metode, herunder bulk RNA-sekventering og enkeltcelle RNA-sekventering, hvilket viser, at denne metode til retinal endotelcelleisolering er kompatibel med næste generations sekventeringsapplikationer. Denne metode til retinal endotelcelleisolering vil give mulighed for avancerede sekventeringsteknikker til at afsløre nye mekanismer for vaskulær udvikling.

Introduction

Den høje kapacitetskapacitet af sekventering af nukleinsyrer via næste generations sekventeringsmetoder har i høj grad avanceret forskernes viden om molekylær og cellulær biologi. Disse avancerede teknikker omfatter hele transkriptom RNA-sekventering, DNA-sekventering af målrettede regioner til identifikation af enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er), DNA-sekventering af bundne transkriptionsfaktorer i kromatinimmunoprecipitation (ChIP) sekventering eller åbne kromatinregioner i Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) sekventering og enkeltcelle RNA-sekventering1 . I vaskulær biologi har disse fremskridt gjort det muligt for forskere at belyse komplicerede udviklings- og sygdomsmekanismer sammen med at skelne genekspressionsmønstre langs et kontinuum af forskellige fænotyper 2,3. Fremtidige eksperimenter kan yderligere definere komplekse mekanismer ved at kombinere næste generations sekventering med evaluerede modeller for vaskulær udvikling, men metoderne til prøveforberedelse skal være kompatible med de avancerede sekventeringsteknikker.

Kvaliteten, nøjagtigheden og reproducerbarheden af næste generations sekventeringsmetoder afhænger af metoden til prøveforberedelse. Ved isolering af en delmængde af celler eller generering af enkeltcellesuspensioner fra væv er optimale fordøjelses- og oprensningsmetoder afgørende for at maksimere celleantal, levedygtighed og renhed af cellepopulationen 4,5. Dette kræver en balance i fordøjelsesmetoden: stærk fordøjelse er nødvendig for at frigive celler fra vævet og opnå nok celler til nedstrøms tilgange, men cellelevedygtigheden vil blive negativt påvirket, hvis fordøjelsen er for stærk 6,7. Derudover er renheden af cellepopulationen nødvendig for robuste resultater og nøjagtig analyse af data, som kan opnås gennem FACS. Dette fremhæver vigtigheden af at optimere celleisoleringsmetoder til at anvende næste generations sekventering på etablerede modeller for vaskulær udvikling.

En velkarakteriseret model til undersøgelse af vaskulær udvikling er murine retinal vaskulær udviklingsmodel. Murine retinal vaskulatur udvikler sig postnatalt i en todimensionel overfladisk plexus, med indledende angiogen spiring fra synsnerven synlig ved postnatal dag (P)3, angiogen front med stilk- og spidsceller og indledende karmodning synlig ved P6 og modning af vaskulær plexus synlig efter P9 8,9. Under ombygningen af den indledende vaskulære plexus gennemgår endotelceller specifikation mod arterielle, kapillære og venøse fænotyper i forskellige kar for at generere et kredsløbsnetværk10,11. Derfor giver denne metode forskere mulighed for at visualisere angiogen vaskulær plexusdannelse og endotelarteriel-venøs specifikation og modning på forskellige tidspunkter under udvikling9. Derudover giver denne model en metode til at undersøge virkningerne af transgen manipulation på angiogenese og vaskulær plexusudvikling, som er blevet anvendt til undersøgelse af vaskulær udvikling, arterielle-venøse misdannelser og oxygeninduceret neovaskularisering 12,13,14,15,16 . For at kombinere næste generations sekventeringsmetoder med murine retinal vaskulær udviklingsmodel er en optimeret protokol til isolering af endotelceller fra retinalt væv nødvendig.

Denne protokol beskriver en optimeret metode til fordøjelse af retinalt væv fra mus ved P6 for at maksimere celleudbytte, renhed og levedygtighed. Retinalt væv isoleres fra P6-mus, fordøjes i 20 minutter, immunfarves til CD31 og CD45 og renses gennem FACS for at isolere en enkeltcellesuspension af endotelceller på ca. 2,5 timer (figur 1A). Disse endotelceller viste sig at opretholde høj levedygtighed i 60 minutter efter isolering17, hvilket gjorde det muligt at forberede biblioteket til næste generations sekventeringsmetoder. Derudover leveres repræsentative resultater for FACS-gating- og kvalitetskontrolresultater fra to separate næste generations sekventeringsmetoder ved hjælp af denne isolationsprotokol: hele transkriptom-RNA-sekventering og enkeltcellet RNA-sekventering. Denne metode gør det muligt at anvende næste generations sekventeringsmetoder sammen med den retinale vaskulariseringsmodel for at belyse nye mekanismer for vaskulær udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg ved Yale University og University of Virginia godkendte alle dyreforsøg, der er anført i denne protokol.

1. Få museøjne til retinal isolering

  1. Forbered 1x iskold PBS og tilsæt 500 μL til hver brønd på en 48-brøndsplade.
  2. Afliv neonatale mus på postnatal dag seks (P6) i henhold til godkendte institutionelle retningslinjer. Til dette forsøg aflives kuld på ca. 4-8 neonatale mus ved P6 via isofluraninindånding i mindst tre minutter efter åndedrætsstoppet efterfulgt af halshugning.
  3. Fjern øjnene fra hver af musene. Skær huden og membranen væk over øjet ved at skære vinkelret på øjenlåget ved hjælp af dissektionssaks. Brug derefter tang til at trykke forsigtigt ned over og under øjet, så øjet bevæger sig ud af stikkontakten.
    1. Klem forsigtigt under øjet med tangen og skær synsnerven, der holder øjet fast. Placer derefter hvert øje i 48-brøndspladen i den tilberedte 1x iskolde PBS, indtil høsten er færdig.
      BEMÆRK: Brug en brønd pr. mus, med begge øjne fra en enkelt mus i samme brønd.

2. Isoler musens retinale væv

  1. Fyld en petriskål, foret med en dissektionspude i bunden, med 500 μL 1x iskold PBS for at nedsænke øjnene og placere den under et dissektionsmikroskop indstillet til 4,0x forstørrelse.
    1. Hæng øjnene i dissektionspuden ved hjælp af en overførselspipette med en bred spids for ikke at beskadige øjnene.
      BEMÆRK: Sørg for, at øjnene er helt dækket af PBS.
  2. Brug to fine dissektionstang til at holde synsnerven med en af tangene til stabilisering, og med den anden tang gennemborer et hul gennem det forreste kammer, hvor hornhinden og sclera forbinder (figur 1B). Riv hullet i en cirkel omkring 75% af vejen rundt om hornhinden.
    1. Mens du stadig holder synsnerven med en af tangen, skal du bruge den anden tang til forsigtigt at rive sclera af nethinden.
    2. Som ovenfor skal du bruge den anden tang til forsigtigt at rive glaslegemet af nethindevævet.
    3. Igen, ved hjælp af den anden tang, fjern forsigtigt linsen og hyaloid plexus karrene, der ikke kom ud, da glaslegemet blev fjernet. For at gøre dette skal du nå ind i nethinden med åben tang, indtil du næsten rører nethinden, lukke tangen for at få fat i linse- og hyaloid plexusbeholderne og trække tangene ud af nethinden. Dette kan gentages, indtil alle fartøjer er fjernet.
      BEMÆRK: Hyaloid plexus ligner en klar, weblignende struktur.
  3. Fyld 2 ml mikrocentrifugerør med 500 μL 1x iskold PBS og læg nethinden i rørene. Isoler alle nethinder fra øjnene og læg dem i iskold PBS, inden du går videre.
    BEMÆRK: Brug et rør pr. mus, med to nethinder fra den samme mus, der deler et rør. Hvis retinalt væv er revet, skal du overføre det i flere stykker. Den samlede tid for nethindevævsdissektion for et kuld mus bør tage 15-60 minutter, begyndende med eutanasi og slutter med endelig nethindevævsisolering.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over isolationsprotokollen. (A) Skematisk over isolationstidslinjen med en estimeret tid for hvert trin: Isolering af retinalvæv, fordøjelse, antistoffarvning, FACS og cellelevedygtighedsvindue. (B) Trin-for-trin guide til isolering af nethindevæv fra øjet med nummererede dissektionstrin: 1) gennembore hornhinde, 2) tåre hornhinde, 3) tåre sclera, 4) fjerne sclera fra nethinden, 5) yderligere fjerne sclera og forbindelsesvæv fra nethinden, 6) fjerne glaslegemet og glaslegemet fra nethinden. (C) Repræsentative billeder af nethindevæv under forskellige fordøjelsestrin: Pre-digest, Post-digest, Pellet (sorte pile fremhæver retinal væv eller cellepellet). Genudgivet med tilladelse fra Chavkin et al. offentliggjort i S. Karger AG, Basel17. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Fordøje retinalt væv i en enkeltcellesuspension

  1. Der fremstilles 500 μL fordøjelsesopløsning for hver to isolerede nethinder. Fbs og kollagenase type II tilsættes DMEM til en endelig koncentration på 10% FBS og 1 mg/ml kollagenase type II. Opløsningen blandes og opvarmes til 37 °C ved hjælp af et vandbad.
  2. Fjern overskydende PBS fra 2 ml mikrocentrifugerørene ved forsigtigt at pipette. Efterlad nok PBS til helt at dække nethindevævet, ca. 100 μL i hvert rør.
  3. Der tilsættes 500 μL fordøjelsesopløsning til hvert rør med nethindevæv (figur 1C).
    1. Brug en P1000-pipettor og pipettespids til at pipettere op og ned i nethindevævet i fordøjelsesopløsningen fem gange.
  4. Fordøjelsesblandingen inkuberes i et 37 °C vandbad i 20 min.
    1. Brug en P1000 pipetter og pipettespids til at pipettere fordøjelsesblandingen op og ned hvert 5. minut. Efter inkubation er retinalvævet opløst i en enkeltcellesuspension, så fordøjelsesblandingen skal være overskyet (figur 1C).

4. Tæl celler

  1. Sæt en bordpladecentrifuge ved 4 °C, og anbring fordøjelsesblandingsrørene indeni. Pellet fordøjelsesblandingen ved centrifugering ved 375 x g i 5 min.
  2. Fjern forsigtigt den supernatante fordøjelsesopløsning ved pipettering. Forstyr ikke cellepelleten (figur 1C). Ophæng pelleten igen i 500 μL iskold 1x PBS ved forsigtigt at blande op og ned med pipetten.
  3. Tæl cellerne med et hæmocytometer under et mikroskop.
    BEMÆRK: Celletal er ca. 1 x 106 celler pr. To nethinder.
  4. Sørg for, at cellerne er korrekt ressuspenderet ved skånsom blanding, og derefter aliquot 20 μL cellesuspension i tre rør til kontrolfarvning (rør 1: IgG-kontrol, rør 2: CD31-kontrol og rør 3: CD45-kontrol), som beskrevet og brugt tidligere17,18.
  5. Sæt en bordpladecentrifuge ved 4 °C, og anbring rør indeholdende celler indeni. Pellet cellerne ved centrifugering ved 375 x g i 5 min.

5. Immunostain cellerne med antistoffer

  1. Forbered 100 μL farvningsbuffer pr. to nethindefarvede plus fire kontrolrør. Tilsæt FBS, HEPES og D-glucose til HBSS-buffer til en endelig koncentration på 10% FBS, 10 mM HEPES og 1 mg / ml D-glucose.
  2. Der opnås fluorescerende konjugerede antistoffer mod CD31 og CD45. Antistofferne tilsættes ved en fortynding på 1:100 i farvningsbufferen (kun rør 1: Kun IgG-antistof, kun rør 2: Kun CD31-antistof og kun rør 3: CD45-antistof). Der tilsættes 1 μL antistof pr. 100 μL farvningsbuffer for en endelig antistofkoncentration på 2 μg/ml.
  3. Fjern forsigtigt PBS fra den vaskede cellepellet ved pipettering.
  4. Pelleten gensuspenderes i 100 μL antistoffarvningsopløsning pr. 0,5 x 106 celler.
    1. Inkuber enkeltcellesuspensionen med antistoffarvningsopløsningen i 30 minutter på is i mørke. Tryk på rørene hvert 10. minut for forsigtigt at blande cellerne.

6. Forbered dig på fluorescensaktiveret cellesortering

  1. Sæt en bordpladecentrifuge ved 4 °C, og anbring rørene med celler indeni. Pelletceller ved centrifugering ved 375 x g i 5 min.
    1. Supernatanten fjernes, og disse celler gensuspenderes i 500 μL 1x PBS for at vaske.
  2. Sæt en bordpladecentrifuge ved 4 °C, og anbring rørene med celler indeni. Pelletceller ved centrifugering ved 375 x g i 5 min
  3. Forbered 1,5 ml FACS-buffer (1% FBS i 1x PBS).
    1. Supernatanten fjernes, og cellepelleten genindtages i 300 μL FACS-buffer ved forsigtigt at blande med en pipettor.
  4. Propidiumiodid (PI) tilsættes til prøverørene indeholdende FACS-bufferen til en slutkoncentration på 0,5 μg/ml. PI bruges som en levedygtighedsmarkør.
  5. Overfør og kombiner cellesuspensionerne i 5 ml reagensglas gennem en celle si snap cap. Cellesi-snaphætten skal indeholde et 35 μm filter, og cellesuspensionerne kan pipetteres direkte på filteret.
    1. Opbevar FACS-rørene på is i mørke og overfør dem til cellesortereren.

7. Opret FACS-instrumentet

  1. Installer en 100 μm dyse i et FACS-instrument.
    BEMÆRK: Denne størrelsesdyse minimerer opsamlingsvolumen og maksimerer isoleret celletæthed.
  2. Forbered 250 μL 1x PBS i et 1,5 ml mikrocentrifugerør som et opsamlingsrør, der skal installeres i FACS-instrumentet.

8. Isoler levedygtige endotelceller via FACS

  1. Tænd for FACS-instrumentet og computeren. Klik på FACS-softwareikonet for at åbne FACS-softwaren på computeren for at køre og betjene FACS-instrumentet. Udfør rutinemæssige kvalitetskontroltest.
  2. Læg de kontrolfarvede prøver i FACS-instrumentet for at justere akserne. Start med IgG-antistofceller kun for at generere og justere FSC og SSC, derefter kun CD31-antistof for at generere og justere CD31 og derefter kun CD45-antistof for at generere og justere CD45. Optag data fra kontroleksempler.
  3. Læg farvede prøveceller i FACS-instrumentet, og kør prøven.
  4. Gate cellerne baseret på forward-scatter og side-scatter (henholdsvis FSC-A og SSC-A) parametre (figur 2A).
    BEMÆRK: Parametrene FSC-A og SSC-A bruges til at vælge celler baseret på størrelse, densitet, granularitet, overfladeegenskaber og brydningsindeks.
  5. Portceller af FSC-A og FSC-H for at identificere celledubletter og kun indsamle enkeltceller (figur 2A).
    BEMÆRK: FSC-A og FSC-H parametrene bruges til at vælge enkeltceller baseret på princippet om, at celledubletter under fremadgående spredning vil være dråber, der indeholder et større forhold mellem areal og højde.
  6. Portceller af PI og SSC-A for at identificere levedygtige celler (figur 2A).
    BEMÆRK: Levedygtige celler vil være PI-negative.
  7. Lav en CD31+/CD45-gate med kontrolelementer og portceller efter CD31 og CD45 (figur 2A,B).
    1. Indsæt et opsamlingsrør med 250 μL FACS-buffer.
    2. Begynd at sortere celler, der er CD31-positive/CD45-negative, i det installerede opsamlingsrør.
    3. Opbevar opsamlingsrørene på is for yderligere analyse. Prøver kan behandles til næste generations sekventeringsapplikationer på dette trin1.

9. Udfør levedygtighedsanalyse

  1. Bland 10 μL celler med 10 μL 0,4% trypanblå opløsning for at vurdere cellens levedygtighed.
  2. Tæl levedygtige celler ved at pipettere den farvede blanding på et hæmocytometerglas. Placer diaset under et mikroskop for nøjagtige levedygtighedstællinger. Tæl blå celler som ikke-levedygtige, og tæl klare celler som levedygtige.
    1. Divider det levedygtige celleantal med det samlede celleantal for at beregne procentvis levedygtighed.

10. Udfør genekspressionsassay

  1. Få 10.000-20.000 celler pr. prøve og udfør RNA-isolering for at analysere murin retinal endotelcellegenekspression. RNA-isolering udføres ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit, der bruger ethanolbaseret RNA-udfældning og derefter centrifugering og membrankolonner til at vaske og fortynde renset RNA fra cellelysat. Prøver kan behandles til nogle næste generations sekventeringsapplikationer på dette trin1.
  2. Konverter RNA'et til cDNA ved hjælp af omvendt transkriptaseenzym og understøttende reagenser19.
  3. Kvantificer ved hjælp af et DNA-bindende farvestof og en kvantitativ PCR-maskine (qPCR)20. Indlæs cDNA-prøver i en 384-brønds qPCR-plade med primere for at forstærke gener af interesse. Reaktionsvolumen skal være total til 10 μL, inklusive DNA-bindende farvestof, som vil blive brugt til at kvantificere genamplifikation.
    1. Brug CD31, VE-Cadherin, CD45 og β-actin fremad og omvendt primere til at måle genekspression.
  4. Brug eksemplet til næste generations sekventeringsprogrammer1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fordøjelse af retinalt væv og immunostaining for CD31 og CD45 resulterer i en identificerbar population af CD31 + / CD45- endotelceller efter gating for celler, enkeltceller og levedygtighed (figur 2A). CD45 immunostaining er nødvendig for at eliminere CD31 + / CD45+ celler, som omfatter blodplader og nogle leukocytter21. Der bør udføres kontroller for hvert forsøg for at vise antistofspecificitet og vejledende strategi (figur 2B). Denne procentdel er relativt lav, omkring 0,5% -1,0% af alle celler i den fordøjede enkeltcellesuspension.

Levedygtighed og renhed kan vurderes gennem kvantificering af propidiumiodidfarvning og genekspressionsanalyse af RNA isoleret fra forskellige populationer. Varierende fordøjelsestid påvirker celleudbyttet og levedygtighedsprocenten, med 20 minutters fordøjelsestid, hvilket resulterer i optimalt udbytte med en lav procentdel af ikke-levedygtige endotelceller (figur 3A). Isolerede endotelceller forblev levedygtige i 60 minutter efter isolering, målt ved efterfølgende propidiumiodidfarvning (figur 3B). Cellepopulationsrenhed blev vurderet ved qPCR-analyse af ekspressionen af endotelcellegener (CD31 og VE-Cadherin) sammenlignet med leukocytspecifik CD45 normaliseret til β-actin (ActB), hvilket viser stærk berigelse for endotelcellegener i CD31+/CD45-populationen (figur 3C).

Isolerede endotelceller fra denne protokol kan bruges i næste generations sekventeringsteknikker. Rensning af RNA fra de isolerede endotelceller, konvertering og forstærkning af cDNA gennem biblioteksforberedelse og sekventering af cDNA-biblioteket resulterede i >16.000 gener identificeret i ni uafhængige prøver med et fald i transkripter pr. Million læsninger (TPM) observeret i gener under denne tærskel (figur 4A). Enkeltcellet RNA-sekventering af isolerede retinale endotelceller gennem 10x Genomics-rørledningen resulterede i en median på 1.171 gener pr. celle, 15.247 samlede gener detekteret og en median på 2.255 unikke molekylære identifikatortal (UMI) pr. celle i 917 celler (figur 4B).

Figure 2
Figur 2: Fluorescerende aktiveret cellesorteringsstrategi. (A) Cellesortering for CD31+/CD45- endotelceller af FSC-A/SSC-A for celler, FSC-A/FSC-H for enkeltceller, Propidiumiodid (PI) negativitet for levedygtighed og CD31+/CD45- for endotelceller. (B) Kontroller farvning til PI, IgG-kontrol, CD31+ kontrol og CD45+ kontrol for at vise antistofspecificitet og gatingstrategi for hver fluorescerende udlæsning. Genudgivet med tilladelse fra Chavkin et al. offentliggjort i S. Karger AG, Basel17. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Isolationslevedygtighed og renhed af isolerede endotelceller. (A) Antal levedygtige og ikke-levedygtige endotelceller isoleret efter forskellige fordøjelsestider normaliseret til antallet af mus, der anvendes i hver isolation. (B) Procentdel af ikke-levedygtige endotelceller efter isolering ved FACS-sortering over tid. (C) qPCR for endotelspecifikke gener (CD31, VE-Cadherin) og leukocytspecifik CD45 i CD31-/CD45- (negativ), CD31+/CD45- (endotelcelle) og CD31-/CD45+ (leukocyt) populationer (A.U. = vilkårlige enheder). Alle data repræsenteret ved gennemsnit med fejllinjer med standardafvigelse, statistiske tests af ANOVA post-hoc Tukey, p-værdier betegnet (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Genudgivet med tilladelse fra Chavkin et al. offentliggjort i S. Karger AG, Basel17. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Kvalitetskontrol af næste generations sekventeringslæsninger til RNA-sekventering og enkeltcelle-RNA-sekventering efter isolering . (A) Transskriptioner pr. million læsninger (TPM) plottet versus gener rangeret efter overflod for ni uafhængige RNA-sekventeringsprøver efter biblioteksforberedelse og Illumina-sekventering, med det gennemsnitlige antal sekvenser pr. gen angivet til højre for hver prøve. (B) CellRanger-rapport for enkeltcellet RNA-sekventering af P6-retinale endotelceller efter isolering og forberedelse ved hjælp af 10x Genomics-rørledningen. Denne analyse viser UMI-tal (Unique Molecular Identifier), der repræsenterer rå sekvensoutput for hver stregkode, der repræsenterer en individuel sekventeret celle. Vigtige kvalitetskontrolmålinger vises i den nederste del af figuren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en metode til isolering af endotelceller fra postnatal murin retinal væv, der er optimeret til højt celleantal, renhed og levedygtighed. Cellerenhed opnås ved FACS-isolering af endotelcellepopulationer fra den fordøjede enkeltcellesuspension ved CD31+/CD45- immunostaining. Kvaliteten af isolering kvantificeres i assays for levedygtighed ved trypanblåfarvning og genekspression ved qPCR for CD31, CD45 og VE-Cadherin (selvom VE-Cadherin ikke blev anvendt til immunostaining). De kritiske trin i denne protokol er retinal vævsisolering og vævsfordøjelse. Retinal vævsisolering bør udføres hurtigt for at opretholde cellens levedygtighed og nøjagtigt for at øge cellerenheden. Vævsfordøjelse bør udføres som beskrevet for at optimere celleudbyttet og cellelevedygtigheden.

Ændringer af denne protokol kan foretages, når denne metode anvendes på forskellige tidspunkter, mus med transgene modifikationer eller forskellige downstream-applikationer. Dette kan især være vigtigt, når man undersøger voksent retinalt væv, da vævet kan være mere modent end P6 retinalvævet og kan kræve mere fordøjelsestid for at isolere rene og levedygtige endotelceller. Isolering af retinal væv og fordøjelsestid skal optimeres ved ændring af protokollen. Lavt celleudbytte kan kræve friske fordøjelsesenzymer, længere fordøjelsestid eller nye antistoffer til FACS. Lav renhed kan kræve nye antistoffer til FACS. Lav levedygtighed kan kræve hurtigere nethindevævsisolering, en kortere fordøjelsestid eller en hurtigere cellesorteringshastighed. Følgende fejlfindingstrin kan hjælpe med at forbedre celleudbyttet, renheden og levedygtigheden. En høj procentdel af dubletter eller ikke-levedygtige celler kan skyldes dårlig fordøjelse. En ikke-identificerbar population af CD31+/CD45- endotelceller kan skyldes dårlig antistoffarvning. Dårlig levedygtighed under sortering eller efter isolering kan skyldes fordøjelse, der er for hård, men dårlig cellerenhed kan skyldes svag fordøjelse eller dårlig antistoffarvning. Dårlig RNA-kvalitet vil give færre unikke gener i et RNA-sekventeringsdatasæt, og dårlig levedygtighed vil give færre celler og gener i et enkeltcellet RNA-sekventeringsdatasæt.

Der er flere begrænsninger for denne metode. For det første resulterer denne metode i et lavt udbytte af retinale endotelceller, hvilket kan begrænse downstream-næste generations sekventeringsapplikationer. De repræsentative resultater opnået gennem enkeltcellet RNA-sekventering gav 917 endotelceller. Et tilsvarende antal celler er blevet isoleret og anvendt i andre enkeltcellede RNA-sekventeringsundersøgelser til undersøgelse af udviklingen af retinale endotelceller22; højere udbytter kunne afsløre yderligere sondring mellem celleklynger. Dyr og kuld kan samles for at øge celleudbyttet for at nå det prøveinput, der kræves til forskellige applikationer. Derudover kan endotelcellernes levedygtighed efter isolering begrænse andre downstream-applikationer. Det er vanskeligt at udvide levedygtighedsvinduet, og ikke-levedygtige celler vil forstyrre visse applikationer, der kræver intakte cellemembraner. Det kan være nødvendigt at justere andre metoder i downstream-applikationer for at anvende denne metode.

Denne metode til retinal endotelcelleisolering er en forbedring i forhold til tidligere offentliggjorte applikationer, der bruger CD31-antistofkonjugerede magnetiske perler til at rense endotelceller, idet denne protokol er optimeret til parametre, der er nødvendige for at opnå en ren og levedygtig cellepopulation, der vil forbedre succesen med næste generations sekventeringsapplikationer22,23 . Høje grader af levedygtighed og renhed er afgørende for både hele transkriptom-RNA-sekventering og enkeltcelle-RNA-sekventering. Derfor er denne metode en betydelig forbedring ved anvendelse af næste generations sekventeringsmetoder til retinal vaskulariseringsmodellen.

Brugen af denne retinale endotelcelleisoleringsprotokol i kombination med næste generations sekventeringsapplikationer og tilhørende beregningsanalyse har potentialet til at afsløre komplekse underliggende mekanismer for vaskulær udvikling. Undersøgelse af postnatal retinal vaskularisering hos transgene mus har muliggjort undersøgelsen af mange signalveje, der påvirker angiogenese og blodkarmodning (Hedgehog, VEGF, Wnt, Notch, TGF-β, BMP)24,25,26,27,28,29,30. Disse undersøgelser har afsløret, at signalveje er stærkt sammenkoblet i endotelceller for at kontrollere celleskæbne31,32,33. Brugen af denne optimerede metode til retinal endotelcelleisolering fra udvikling af postnatalt retinalt væv i kombination med næste generations sekventeringsmetoder og biocomputational tilgange34,35,36,37 kan yderligere belyse mekanismerne for sammenkoblede signalveje, der regulerer vaskulær udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen relevante oplysninger.

Acknowledgments

Tak til Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis og University of Virginia Genome Analysis and Technology Core for deres indsats, ekspertise og rådgivning i at bidrage til de præsenterede eksperimenter. Denne undersøgelse blev finansieret af NIH-tilskud til N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) og K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Eppendorf safe-lock tubes USA Scientific 4036-3352
5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
60 mm Non TC-treated Culture Dish Corning 430589
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences 551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control BD Biosciences 553932
BD FACSChorus Software BD Biosciences FACSCHORUS
BD FACSMelody Cell Sorter BD Biosciences FACSMELODY
Collagenase Type II Sigma-Aldrich 234115
Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile Corning 3548
D-Glucose Gibco A2494001
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisher Scientific 12-711-9AM
Dissecting Pan Wax Carolina 629100
Dissection scissors Fine Science Tools 14085-08
Dissection Stereo Microscope M165 FC Leica M165FC
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-052
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190144
Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Sigma-Aldrich 22364120
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio 100-106
Fine dissection forceps Fine Science Tools 11250-00
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco 14175095
HEPES (1M) Gibco 15630130
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
Isoflurane, USP Covetrus 11695067772
Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath Fisher Scientific FSGPD20
Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated ThermoFisher 75002477
SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5120
Trypan Blue Solution ThermoFisher 15250061
V450 Rat Anti-Mouse CD45 BD Biosciences 560501
V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 560457

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
  2. Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
  3. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
  4. Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
  5. Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
  6. Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  7. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
  8. Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
  9. Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
  10. dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
  11. Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
  12. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  13. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  14. Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
  15. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
  16. Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
  17. Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
  18. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
  19. Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
  21. Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
  22. Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
  23. Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
  24. Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
  25. Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
  26. Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
  27. Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
  28. Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
  29. Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
  30. Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
  31. Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
  32. Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
  33. Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
  34. Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).
  35. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  36. Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
  37. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 176 endotelcelle vaskulær udvikling murin retinal vaskularisering næste generations sekventering primær celleisolering levedygtighed renhed
Isolering af murine retinale endotelceller til næste generations sekventering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chavkin, N. W., Cain, S., Walsh, K., … More

Chavkin, N. W., Cain, S., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (176), e63133, doi:10.3791/63133 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter