Summary
Detta protokoll beskriver en metod för isolering av murina postnatala retinala endotelceller optimerade för cellutbyte, renhet och livskraft. Dessa celler är lämpliga för nästa generations sekvenseringsmetoder.
Abstract
De senaste förbättringarna i nästa generations sekvensering har avancerat forskarnas kunskap om molekylär- och cellbiologi, med flera studier som avslöjar nya paradigmer inom vaskulär biologi. Att tillämpa dessa metoder på modeller av vaskulär utveckling kräver optimering av cellisoleringstekniker från embryonala och postnatala vävnader. Cellutbyte, viabilitet och renhet måste alla vara maximala för att få exakta och reproducerbara resultat från nästa generations sekvenseringsmetoder. Den neonatala musretinala vaskulariseringsmodellen används av forskare för att studera mekanismer för vaskulär utveckling. Forskare har använt denna modell för att undersöka mekanismer för angiogenes och arteriell-venös ödespecifikation under blodkärlsbildning och mognad. Att tillämpa nästa generations sekvenseringstekniker för att studera retinal vaskulär utvecklingsmodell kräver optimering av en metod för isolering av retinala endotelceller som maximerar cellutbyte, livskraft och renhet. Detta protokoll beskriver en metod för murin retinal vävnadsisolering, matsmältning och rening med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Resultaten indikerar att den FACS-renade CD31 + / CD45-endotelcellpopulationen är mycket berikad för endotelcellsgenuttryck och uppvisar ingen förändring i livskraft under 60 minuter efter FACS. Inkluderat är representativa resultat av nästa generations sekvenseringsmetoder på endotelceller isolerade med denna metod, inklusive bulk-RNA-sekvensering och encells RNA-sekvensering, vilket visar att denna metod för retinal endotelcellisolering är kompatibel med nästa generations sekvenseringsapplikationer. Denna metod för retinal endotelcellisolering möjliggör avancerade sekvenseringstekniker för att avslöja nya mekanismer för vaskulär utveckling.
Introduction
Den höga genomströmningskapaciteten för sekvensering av nukleinsyror via nästa generations sekvenseringsmetoder har i hög grad avancerat forskarnas kunskap om molekylär- och cellbiologi. Dessa avancerade tekniker inkluderar heltranskriptom RNA-sekvensering, DNA-sekvensering av riktade regioner för att identifiera Single Nucleotide Polymorphisms (SNP), DNA-sekvensering av bundna transkriptionsfaktorer i ChIP-sekvensering (ChIP) eller öppna kromatinregioner i analys för Transposas-Accessible Chromatin (ATAC) sekvensering och encells RNA-sekvensering1 . Inom vaskulärbiologi har dessa framsteg gjort det möjligt för forskare att belysa komplicerade mekanismer för utveckling och sjukdom, tillsammans med att särskilja genuttrycksmönster längs ett kontinuum av varierande fenotyper 2,3. Framtida experiment kan ytterligare definiera komplexa mekanismer genom att kombinera nästa generations sekvensering med utvärderade modeller för vaskulär utveckling, men metoderna för provberedning måste vara kompatibla med de avancerade sekvenseringsteknikerna.
Kvaliteten, noggrannheten och reproducerbarheten hos nästa generations sekvenseringsmetoder beror på metoden för provberedning. Vid isolering av en delmängd av celler eller generering av encellssuspensioner från vävnader är optimala matsmältnings- och reningsmetoder avgörande för att maximera cellantal, livskraft och renhet hos cellpopulationen 4,5. Detta kräver en balans i matsmältningsmetoden: stark matsmältning är nödvändig för att frigöra celler från vävnaden och få tillräckligt med celler för nedströms tillvägagångssätt, men cellviabiliteten kommer att påverkas negativt om matsmältningen är för stark 6,7. Dessutom är renhet hos cellpopulationen nödvändig för robusta resultat och korrekt analys av data, vilket kan uppnås genom FACS. Detta belyser vikten av att optimera cellisoleringsmetoder för att tillämpa nästa generations sekvensering på etablerade modeller för vaskulär utveckling.
En väl karakteriserad modell för att undersöka vaskulär utveckling är murin retinal vaskulär utvecklingsmodell. Murin retinal vaskulatur utvecklas postnatalt i en tvådimensionell ytlig plexus, med initial angiogen spridning från synnerven synlig vid postnatal dag (P)3, angiogen front med stjälk- och spetsceller och initial kärlmognad synlig vid P6 och mognad av vaskulär plexus synlig efter P9 8,9. Under ombyggnaden av den initiala vaskulära plexusen genomgår endotelceller specifikation mot arteriella, kapillära och venösa fenotyper i olika kärl för att generera ett cirkulationsnätverk10,11. Därför tillåter denna metod forskare att visualisera angiogen vaskulär plexusbildning och endotelial arteriell-venös specifikation och mognad vid olika tidpunkter under utveckling9. Dessutom tillhandahåller denna modell en metod för att undersöka effekterna av transgen manipulation på angiogenes och vaskulär plexusutveckling, som har tillämpats för undersökning av vaskulär utveckling, arteriell-venös missbildningar och syreinducerad neovaskularisering 12,13,14,15,16 . För att kombinera nästa generations sekvenseringsmetoder med murin retinal vaskulär utvecklingsmodell krävs ett optimerat protokoll för isolering av endotelceller från näthinnevävnad.
Detta protokoll beskriver en optimerad metod för att smälta näthinnevävnad från möss vid P6 för att maximera cellutbyte, renhet och livskraft. Retinal vävnad isoleras från P6-mus, smälts i 20 minuter, immunbesudlas för CD31 och CD45 och renas genom FACS för att isolera en enda cellsuspension av endotelceller på cirka 2,5 timmar (figur 1A). Dessa endotelceller visade sig upprätthålla hög livskraft i 60 minuter efter isolering17, vilket möjliggjorde biblioteksförberedelser för nästa generations sekvenseringsmetoder. Dessutom tillhandahålls representativa resultat för FACS-gating och kvalitetskontrollresultat från två separata nästa generations sekvenseringsmetoder som använder detta isoleringsprotokoll: hela transkriptom-RNA-sekvensering och encells RNA-sekvensering. Denna metod gör det möjligt att använda nästa generations sekvenseringsmetoder tillsammans med retinal vaskulariseringsmodellen för att belysa nya mekanismer för vaskulär utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De institutionella djurvårds- och användningskommittéerna vid Yale University och University of Virginia godkände alla djurförsök som anges i detta protokoll.
1. Skaffa musögon för retinal isolering
- Förbered 1x iskall PBS och tillsätt 500 μL till varje brunn på en 48-brunnsplatta.
- Avliva nyfödda möss efter förlossningen dag sex (P6) enligt godkända institutionella riktlinjer. För detta experiment avlivas kullar med cirka 4-8 nyfödda möss vid P6 via isofluraninandning i minst tre minuter efter andningsstoppet, följt av halshuggning.
- Ta bort ögonen från var och en av mössen. Skär bort huden och membranet över ögat genom att klippa vinkelrätt mot ögonlocket med dissektionssax. Använd sedan pincett för att trycka ner försiktigt över och under ögat så att ögat rör sig ut ur uttaget.
- Nyp försiktigt under ögat med tången och skär synnerven som håller ögat fäst. Placera sedan varje öga i 48-brunnsplattan i den beredda 1x iskalla PBS tills skörden är klar.
OBS: Använd en brunn per mus, med båda ögonen från en enda mus i samma brunn.
- Nyp försiktigt under ögat med tången och skär synnerven som håller ögat fäst. Placera sedan varje öga i 48-brunnsplattan i den beredda 1x iskalla PBS tills skörden är klar.
2. Isolera musens näthinnevävnad
- Fyll en petriskål, fodrad med en dissektionsdyna på botten, med 500 μL 1x iskall PBS för att sänka ögonen och placera den under ett dissektionsmikroskop inställt på 4,0x förstoring.
- Stäng av ögonen i dissektionsdynan med en överföringspipett med en bred spets för att inte skada ögonen.
OBS: Se till att ögonen är helt täckta med PBS.
- Stäng av ögonen i dissektionsdynan med en överföringspipett med en bred spets för att inte skada ögonen.
- Använd två fina dissektionstångar, håll synnerven med en av tångarna för stabilisering, och med den andra pincetten genomborrar du ett hål genom den främre kammaren där hornhinnan och sclera ansluter (figur 1B). Riv hålet i en cirkel cirka 75% av vägen runt hornhinnan.
- Medan du fortfarande håller synnerven med en av tångarna, använd den andra tången för att försiktigt riva sclera av näthinnevävnaden.
- Som ovan, använd den andra tången för att försiktigt riva av näthinnans glaskropp.
- Återigen, med hjälp av den andra pincetten, ta försiktigt bort linsen och hyaloid plexuskärlen som inte lossnade när glaskroppen togs bort. För att göra detta, nå in i näthinnan med öppna pincett tills du nästan rör vid näthinnan, stäng pincetten för att ta tag i linsen och hyaloid plexuskärlen och dra ut pincetten från näthinnan. Detta kan upprepas tills alla kärl har tagits bort.
OBS: Hyaloid plexus liknar en tydlig, webbliknande struktur.
- Fyll 2 ml mikrocentrifugrör med 500 μL 1x iskall PBS och placera näthinnorna i rören. Isolera alla näthinnor från ögonen och placera dem i iskall PBS innan du går vidare.
OBS: Använd ett rör per mus, med två näthinnor från samma mus som delar ett rör. Om retinal vävnad rivs, överför den i flera bitar. Den totala tiden för retinal vävnadsdissektion för en kull möss bör ta 15-60 minuter, börja med eutanasi och sluta med slutlig retinal vävnadsisolering.
Bild 1: Översikt över isoleringsprotokollet. (A) Schematisk över isoleringstidslinjen med en uppskattad tid för varje steg: Isolering av näthinnevävnad, smältning, antikroppsfärgning, FACS och cellviabilitetsfönster. (B) Steg-för-steg-guide för isolering av näthinnevävnad från ögat, med numrerade dissektionssteg: 1) genomborra hornhinnan, 2) riva hornhinnan, 3) riva sclera, 4) ta bort sclera från näthinnan, 5) ytterligare ta bort sclera och anslutande vävnad från näthinnan, 6) ta bort glaskroppen och glaskroppen från näthinnan. (C) Representativa bilder av näthinnevävnad under olika matsmältningssteg: Pre-digest, Post-digest, Pellet (svarta pilar markerar retinal vävnad eller cellpellet). Återpublicerad med tillstånd från Chavkin m.fl. publicerad i S. Karger AG, Basel17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Smält retinal vävnad i en enda cellsuspension
- Förbered 500 μl matsmältningslösning för varannan isolerad näthinna. Tillsätt FBS och kollagenas typ II till DMEM till en slutlig koncentration av 10% FBS och 1 mg / ml kollagenas typ II. Blanda och värm lösningen till 37 °C med ett vattenbad.
- Ta bort överskott av PBS från 2 ml mikrocentrifugrören genom att försiktigt pipettera. Lämna tillräckligt med PBS för att helt täcka näthinnevävnaden, cirka 100 μL i varje rör.
- Tillsätt 500 μl av matsmältningslösningen till varje rör med näthinnevävnad (figur 1C).
- Använd en P1000-pipettor och pipettspets för att pipettera upp och ner i näthinnevävnaden i matsmältningslösningen fem gånger.
- Inkubera digestionsblandningen i ett 37 °C vattenbad i 20 minuter.
- Använd en P1000 pipettor och pipettspets för att pipettera matsmältningsblandningen upp och ner var 5: e minut. Efter inkubation har näthinnevävnaden lösts upp i en enda cellsuspension, så matsmältningsblandningen ska vara grumlig (figur 1C).
4. Räkna celler
- Ställ en bordscentrifug vid 4 °C och placera rötningsblandningsrören inuti. Pellera rötblandningen genom centrifugering vid 375 x g i 5 minuter.
- Ta försiktigt bort supernatanten matsmältningslösningen genom pipettering. Stör inte cellpelleten (figur 1C). Suspendera pelleten i 500 μl iskall 1x PBS genom att försiktigt blanda upp och ner med pipetten.
- Räkna cellerna med en hemocytometer under ett mikroskop.
OBS: Cellantalet är ungefär 1 x 106 celler per två näthinnor. - Se till att cellerna återsuspenderas ordentligt genom försiktig blandning och alikvotera sedan 20 μL cellsuspension i tre rör för kontrollfärgning (rör 1: IgG-kontroll, rör 2: CD31-kontroll och rör 3: CD45-kontroll), som beskrivits och använts tidigare17,18.
- Ställ en bordscentrifug vid 4 °C och placera rör som innehåller celler inuti. Pellera cellerna genom centrifugering vid 375 x g i 5 min.
5. Immunostaina cellerna med antikroppar
- Förbered 100 μL färgningsbuffert per två färgade näthinnor plus fyra kontrollrör. Tillsätt FBS, HEPES och D-glukos till HBSS-bufferten till en slutlig koncentration av 10% FBS, 10 mM HEPES och 1 mg / ml D-glukos.
- Erhålla fluorescerande konjugerade antikroppar mot CD31 och CD45. Tillsätt antikropparna vid en utspädning på 1:100 i färgningsbufferten (endast rör 1: Endast IgG-antikropp, endast rör 2: CD31-antikropp och endast rör 3: CD45-antikropp). Tillsätt 1 μl antikropp per 100 μl av färgningsbufferten för en slutlig antikroppskoncentration på 2 μg/ml.
- Ta försiktigt bort PBS från den tvättade cellpelleten genom pipettering.
- Återsuspendera pelleten i 100 μl antikroppsfärgningslösning per 0,5 x 106 celler.
- Inkubera encellssuspensionen med antikroppsfärgningslösningen i 30 minuter på is i mörker. Knacka på rören var 10: e minut för att försiktigt blanda cellerna.
6. Förbered dig för fluorescensaktiverad cellsortering
- Ställ in en bordscentrifug vid 4 °C och placera rören som innehåller celler inuti. Pelletsceller genom centrifugering vid 375 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera dessa celler i 500 μL 1x PBS för att tvätta.
- Ställ in en bordscentrifug vid 4 °C och placera rören som innehåller celler inuti. Pelletsceller genom centrifugering vid 375 x g i 5 min
- Förbered 1,5 ml FACS-buffert (1% FBS i 1x PBS).
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 300 μL FACS-buffert genom att försiktigt blanda med en pipettor.
- Tillsätt propidiumjodid (PI) till provrören som innehåller FACS-bufferten till en slutlig koncentration på 0,5 μg/ml. PI används som en viabilitetsmarkör.
- Överför och kombinera cellsuspensionerna i 5 ml provrör genom ett cellsillock. Cellsilens snäpplock ska innehålla ett 35 μm-filter och cellsuspensionerna kan pipetteras direkt på filtret.
- Håll FACS-rören på is i mörkret och överför dem till cellsorteraren.
7. Ställ in FACS-instrumentet
- Installera ett 100 μm munstycke i ett FACS-instrument.
OBS: Detta storleksmunstycke minimerar uppsamlingsvolymen och maximerar isolerad celltäthet. - Förbered 250 μL 1x PBS i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör som ett uppsamlingsrör som ska installeras i FACS-instrumentet.
8. Isolera livskraftiga endotelceller via FACS
- Slå på FACS-instrumentet och datorn. Klicka på FACS-programvaruikonen för att öppna FACS-programvaran på datorn för att köra och använda FACS-instrumentet. Utför rutinmässiga kvalitetskontrolltester.
- Ladda de kontrollfärgade proverna i FACS-instrumentet för att justera axlarna. Börja med IgG-antikroppsceller för att generera och justera FSC och SSC, sedan CD31-antikropp endast för att generera och justera CD31, och sedan CD45-antikropp endast för att generera och justera CD45. Registrera data från kontrollprover.
- Ladda färgade provceller i FACS-instrumentet och kör provet.
- Porta cellerna baserat på parametrar för framåtspridning och sidospridning (FSC-A respektive SSC-A) (figur 2A).
OBS: Parametrarna FSC-A och SSC-A används för att välja celler baserat på storlek, densitet, granularitet, ytegenskaper och brytningsindex. - Porta celler med FSC-A och FSC-H för att identifiera celldubbletter och endast samla in enstaka celler (figur 2A).
OBS: FSC-A- och FSC-H-parametrarna används för att välja enstaka celler baserat på principen att under framåtspridning kommer celldubblar att vara droppar som innehåller ett större förhållande mellan yta och höjd. - Porta celler med PI och SSC-A för att identifiera livskraftiga celler (figur 2A).
OBS: Livskraftiga celler kommer att vara PI-negativa. - Gör en CD31+/CD45- grind med kontroller och grindceller från CD31 och CD45 (bild 2A,B).
- Sätt i ett uppsamlingsrör med 250 μL FACS-buffert.
- Börja sortera celler som är CD31-positiva/CD45-negativa i det installerade uppsamlingsröret.
- Förvara uppsamlingsrören på is för vidare analys. Prover kan bearbetas för nästa generations sekvenseringsprogram i det här steget1.
9. Utför viabilitetsanalys
- Blanda 10 μl celler med 10 μl 0,4% trypanblå lösning för att bedöma cellviabiliteten.
- Räkna livskraftiga celler genom att pipettera den färgade blandningen på en hemocytometerglas. Placera bilden under ett mikroskop för exakta lönsamhetsräkningar. Räkna blå celler som icke-livskraftiga och räkna tydliga celler som livskraftiga.
- Dela det livskraftiga cellantalet med det totala cellantalet för att beräkna procentuell livskraft.
10. Utför genuttrycksanalys
- Erhålla 10 000-20 000 celler per prov och utför RNA-isolering för att analysera murin retinal endotelcellsgenuttryck. RNA-isolering utförs med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit som använder etanolbaserad RNA-utfällning och sedan centrifugerings- och membrankolonner för att tvätta och eluera renat RNA från celllysat. Prover kan bearbetas för vissa nästa generations sekvenseringsprogram i det här steget1.
- Konvertera RNA till cDNA med hjälp av omvänd transkriptasenzym och stödjande reagenser19.
- Kvantifiera med hjälp av ett DNA-bindande färgämne och en kvantitativ PCR (qPCR) maskin20. Ladda cDNA-prover i en 384-brunns qPCR-platta med primers för att förstärka gener av intresse. Reaktionsvolymen bör uppgå till 10 μl, inklusive DNA-bindande färgämne, som kommer att användas för att kvantifiera genförstärkning.
- Använd CD31, VE-Cadherin, CD45 och β-aktin framåt och bakåt primers för att mäta genuttryck.
- Använd exemplet för nästa generations sekvenseringsprogram1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Matsmältning av näthinnevävnad och immunfärgning för CD31 och CD45 resulterar i en identifierbar population av CD31+/CD45- endotelceller efter gating för celler, enstaka celler och viabilitet (figur 2A). CD45-immunfärgning krävs för att eliminera CD31 + / CD45 + -celler, som inkluderar blodplättar och vissa leukocyter21. Kontroller bör utföras för varje experiment för att visa antikroppsspecificitet och vägleda grindstrategi (figur 2B). Denna procentandel är relativt låg, cirka 0,5% -1,0% av alla celler i den smälta encellssuspensionen.
Viabilitet och renhet kan bedömas genom kvantifiering av propidiumjodidfärgning och genuttrycksanalys av RNA isolerat från olika populationer. Varierande matsmältningstid påverkar cellutbytet och viabilitetsprocenten, med 20 minuters matsmältningstid vilket resulterar i optimalt utbyte med en låg andel icke-livskraftiga endotelceller (figur 3A). Isolerade endotelceller förblev livskraftiga i 60 minuter efter isolering, mätt genom efterföljande propidiumjodidfärgning (figur 3B). Cellpopulationens renhet bedömdes genom qPCR-analys av uttrycket av endotelcellgener (CD31 och VE-Cadherin) jämfört med leukocytspecifik CD45 normaliserad till β-aktin (ActB), vilket visar stark anrikning för endotelcellgener i CD31+/CD45-populationen (figur 3C).
Isolerade endotelceller från detta protokoll kan användas i nästa generations sekvenseringstekniker. Rening av RNA från de isolerade endotelcellerna, omvandling och förstärkning av cDNA genom biblioteksberedning och sekvensering av cDNA-biblioteket resulterade i > 16 000 gener identifierade i nio oberoende prover, med en minskning av transkript per miljon läsningar (TPM) observerad i gener under denna tröskel (Figur 4A). Encells RNA-sekvensering av isolerade retinala endotelceller genom 10x Genomics-rörledningen resulterade i en median på 1 171 gener per cell, 15 247 totala gener detekterade och en median på 2 255 unika molekylära identifierare (UMI) per cell i 917 celler (Figur 4B).
Figur 2: Fluorescerande aktiverad cellsorteringsstrategi. (A) Cellsortering för CD31+/CD45- endotelceller av FSC-A/SSC-A för celler, FSC-A/FSC-H för enstaka celler, Propidiumjodid (PI) negativitet för viabilitet och CD31+/CD45- för endotelceller. (B) Kontrollera färgning för PI, IgG-kontroll, CD31 + -kontroll och CD45 + -kontroll för att visa antikroppsspecificitet och grindstrategi för varje fluorescerande avläsning. Återpublicerad med tillstånd från Chavkin m.fl. publicerad i S. Karger AG, Basel17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Isoleringsviabilitet och renhet hos isolerade endotelceller. (A) Antal livskraftiga och icke-livskraftiga endotelceller isolerade efter olika matsmältningstider normaliserade till antalet möss som används i varje isolering. (B) Procentandel icke-viabla endotelceller efter isolering genom FACS-sortering över tid. (C) qPCR för endotelspecifika gener (CD31, VE-Cadherin) och leukocytspecifik CD45 i CD31-/CD45- (negativ), CD31+/CD45- (endotelcell) och CD31-/CD45+ (leukocyt) populationer (A.U. = godtyckliga enheter). Alla data representeras av medelvärde med felstaplar av standardavvikelse, statistiska tester av ANOVA post-hoc Tukey, p-värden betecknade (* p < 0,05, ** p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Återpublicerad med tillstånd från Chavkin m.fl. publicerad i S. Karger AG, Basel17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kvalitetskontroll av nästa generations sekvenseringsavläsningar för RNA-sekvensering och encells RNA-sekvensering efter isolering . (A) Transkript per miljon läsningar (TPM) plottade kontra gener rangordnade efter överflöd för nio oberoende RNA-sekvenseringsprover efter biblioteksberedning och Illumina-sekvensering, med det genomsnittliga antalet sekvenser per gen listad till höger om varje prov. (B) CellRanger-rapport för encells RNA-sekvensering av P6-retinala endotelceller efter isolering och beredning med hjälp av 10x Genomics-rörledningen. Den här analysen visar UMI-räkningar (Unique Molecular Identifier) som representerar råsekvensutdata för varje streckkod som representerar en enskild sekvenserad cell. Viktiga kvalitetskontrollmätningar visas i den nedre delen av figuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för isolering av endotelceller från postnatal murin retinal vävnad som har optimerats för högt cellantal, renhet och livskraft. Cellrenhet erhålls genom FACS-isolering av endotelcellpopulationer från den smälta encellssuspensionen genom CD31 + / CD45- immunfärgning. Kvaliteten på isoleringen kvantifieras i analyser för viabilitet genom Trypan blå färgning och genuttryck av qPCR för CD31, CD45 och VE-Cadherin (även om VE-Cadherin inte användes för immunfärgning). De kritiska stegen i detta protokoll är retinal vävnadsisolering och vävnadssmältning. Retinal vävnadsisolering bör utföras snabbt för att upprätthålla cellviabilitet och exakt för att öka cellrenheten. Vävnadsförtunning bör utföras, som beskrivits, för att optimera cellutbytet och cellviabiliteten.
Ändringar av detta protokoll kan göras när denna metod tillämpas på olika tidpunkter, möss med transgena modifieringar eller olika nedströmsapplikationer. Detta kan vara särskilt viktigt när man undersöker vuxen näthinnevävnad, eftersom vävnaden kan vara mer mogen än P6-näthinnevävnaden och kan kräva mer matsmältningstid för att isolera rena och livskraftiga endotelceller. Isolering av näthinnevävnad och matsmältningstid måste optimeras vid modifiering av protokollet. Lågt cellutbyte kan kräva färska matsmältningsenzymer, längre matsmältningstid eller nya antikroppar mot FACS. Låg renhet kan kräva nya antikroppar för FACS. Låg livskraft kan kräva snabbare isolering av näthinnevävnad, en kortare matsmältningstid eller en snabbare cellsorteringshastighet. Följande felsökningssteg kan hjälpa till att förbättra cellutbytet, renheten och livskraften. En hög andel dubbletter eller icke-livskraftiga celler kan bero på dålig matsmältning. En icke-identifierbar population av CD31+/CD45-endotelceller kan bero på dålig antikroppsfärgning. Dålig livskraft under sortering eller efter isolering kan bero på matsmältningen som är för hård, men dålig cellrenhet kan bero på svag matsmältning eller dålig antikroppsfärgning. Dålig RNA-kvalitet kommer att ge färre unika gener i en RNA-sekvenseringsdataset, och dålig livskraft kommer att ge färre celler och gener i en enda cell-RNA-sekvenseringsdataset.
Det finns flera begränsningar för denna metod. För det första resulterar denna metod i ett lågt utbyte av retinala endotelceller, vilket kan begränsa nästa generations sekvenseringsapplikationer nedströms. De representativa resultaten erhållna genom encells RNA-sekvensering gav 917 endotelceller. Ett liknande antal celler har isolerats och använts i andra encelliga RNA-sekvenseringsstudier för att undersöka retinal endotelcellsutveckling22; högre utbyten kan avslöja ytterligare skillnad mellan cellkluster. Djur och kullar kan poolas för att öka cellutbytet för att nå den provinmatning som krävs för olika applikationer. Dessutom kan livskraften hos endotelceller efter isolering begränsa andra nedströmsapplikationer. Det är svårt att förlänga viabilitetsfönstret, och icke-livskraftiga celler kommer att störa vissa applikationer som kräver intakta cellmembran. Justeringar av andra metoder i nedströmstillämpningar kan krävas för att använda denna metod.
Denna metod för retinal endotelcellisolering är en förbättring jämfört med tidigare publicerade applikationer som använder CD31-antikroppskonjugerade magnetiska pärlor för att rena endotelceller genom att detta protokoll är optimerat för parametrar som är nödvändiga för att erhålla en ren och livskraftig cellpopulation som kommer att förbättra framgången för nästa generations sekvenseringsapplikationer22,23 . Höga grader av livskraft och renhet är avgörande för både hela transkriptom-RNA-sekvensering och encells RNA-sekvensering. Därför är denna metod en signifikant förbättring vid tillämpning av nästa generations sekvenseringsmetoder på retinal vaskulariseringsmodellen.
Användningen av detta retinala endotelcellisoleringsprotokoll, i kombination med nästa generations sekvenseringsapplikationer och tillhörande beräkningsanalys, har potential att avslöja komplexa underliggande mekanismer för vaskulär utveckling. Att studera postnatal retinal vaskularisering hos transgena möss har möjliggjort undersökning av många signalvägar som påverkar angiogenes och blodkärlsmognad (Hedgehog, VEGF, Wnt, Notch, TGF-β, BMP)24,25,26,27,28,29,30. Dessa studier har visat att signalvägar är mycket sammankopplade i endotelceller för att kontrollera cellödet31,32,33. Användningen av denna optimerade metod för retinal endotelcellisolering från att utveckla postnatal retinal vävnad, i kombination med nästa generations sekvenseringsmetoder och biodatormetoder 34,35,36,37, kan ytterligare belysa mekanismerna för sammankopplade signalvägar som reglerar vaskulär utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga relevanta upplysningar.
Acknowledgments
Tack till Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis och University of Virginia Genome Analysis and Technology Core för deras ansträngning, expertis och råd för att bidra till de presenterade experimenten. Denna studie finansierades av NIH-bidrag till N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) och K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
References
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M.
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al.
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J.
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
