Håndtering af Fusarium vilje af vandmelon kræver viden om de tilstedeværende patogenløb. Her beskriver vi roddyp, inficeret kernesåning og modificerede tray-dip-podningsmetoder for at demonstrere deres effektivitet ved race-typning af den patogene svamp Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).
Fusarium vilje af vandmelon (Citrullus lanatus), forårsaget af Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), er genopstået som en stor produktionsbegrænsning i det sydøstlige USA, især i Florida. Indførelse af integrerede skadedyrsbekæmpelsesstrategier, såsom racespecifikke resistente sorter, kræver oplysninger om patogenets mangfoldighed og befolkningstæthed på avlernes marker. På trods af visse fremskridt med at udvikle molekylære diagnostiske værktøjer til identifikation af patogenisolater kræver racebestemmelse ofte bioassay-tilgange.
Race typing blev udført ved rod-dip podning, inficeret kerne såning metode, og den modificerede bakke-dip metode med hver af de fire vandmelon forskelle (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Isolater tildeles en racebetegnelse ved beregning af sygdomsforekomst fem uger efter podning. Hvis mindre end 33% af planterne for en bestemt sort var symptomatiske, blev de kategoriseret som resistente. De sorter med en forekomst på over 33 % blev betragtet som modtagelige. Dette papir beskriver tre forskellige metoder til podning for at fastslå race, roddip, inficeret kerne og modificeret bakke-dip-podning, hvis anvendelser varierer alt efter det eksperimentelle design.
De jordbårne svampe, der udgør Fusarium oxysporum artskomplekset (FOSC), er virkningsfulde hemibiotrofe plantepatogener, der kan forårsage alvorlig sygdom og udbyttetab i en bred vifte af afgrøder1. Fusarium vilje af vandmelon, forårsaget af F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), har været stigende i omfang, forekomst og sværhedsgrad over hele verden i de sidste årtier 2,3. I frøplanter ligner symptomerne på Fusarium-vilje ofte dæmpning. I ældre planter bliver løvet gråt, klorotisk og nekrotisk. Til sidst udvikler planternes visning sig til fuld plantekollaps og død4. Direkte udbyttetab opstår på grund af symptomerne og plantedøden, mens indirekte udbyttetab kan forekomme på grund af solskader forårsaget af eliminering af bladbaldakinen5. Seksuel reproduktion og tilhørende reproduktive strukturer er aldrig blevet observeret i F. oxysporum. Patogenet producerer imidlertid to typer aseksuelle sporer, mikro- og makrokonidier, samt større, langsigtede overlevelsesstrukturer kaldet chlamydosporer, som kan overleve i jorden i mange år6.
FOSC er klassificeret i formae speciales baseret på observerede værtsområder, normalt begrænset til en eller nogle få værtsarter1. Selvom nyere forskning har vist, at dette artskompleks kan være en sammensætning af 15 forskellige arter, er de særlige arter, der inficerer vandmelon, i øjeblikket ukendte7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) er navnet på de grupper af stammer, der udelukkende inficerer Citrullus lanatus eller den domesticerede vandmelon 8,9. F. oxysporumstammer inden for de fleste patogene formae speciales viser visse niveauer af mangfoldighed med hensyn til deres genetiske komponenter og virulens over for en værtsart. For eksempel kan en stamme inficere alle sorter af en vært, mens en anden kun kan inficere de mere modtagelige sorter. For at tage højde for en sådan variation klassificeres disse grupper uformelt i racer baseret på evolutionære relationer eller fælles fænotypiske egenskaber. Inden for Fon er fire racer (0, 1, 2 og 3) blevet karakteriseret ud fra deres patogenicitet mod et sæt udvalgte vandmelonsorter, hvor opdagelsen af race 3 for nylig fandt sted10.
På trods af denne tilsyneladende mangfoldighed kan morfologierne af sporer eller hyfer ikke skelnes mellem racerne i Fon-racer, hvilket betyder, at molekylære eller fænotypiske assays er nødvendige for at identificere et isolats unikke race11. Molekylær forskning har identificeret nogle genetiske forskelle. For eksempel er rollen som udskilt i Xylem (SIX) effektorer blevet undersøgt i årevis i F. oxysporum, og nogle af disse effektorer er blevet placeret på kromosomerne udvekslet under vandret genoverførsel12. For eksempel findes SIX6 i Fon-løb 0 og 1, men ikke i løb 213. SEKS effektorer har været impliceret i patogeniciteten af F. oxysporum f. sp. lycopersici og F. oxysporum f. sp. cubense, som forårsager Fusarium vilje på henholdsvis tomat og banan, henholdsvis 14,15,16,17. Analysen af SIX effektorprofiler blandt stammer af F. oxysporum f. sp. spiniciae, Fusarium wilt patogen på spinat, har muliggjort klassificering, der nøjagtigt afspejler genetisk og fænotypisk mangfoldighed18. Imidlertid er forskellene mellem virulensmekanismer i Fon-racer i øjeblikket ikke helt forstået, og molekylære assays udviklet ved deres anvendelse har vist inkonsekvente og unøjagtige resultater19. Derfor er fænotypiske resultater fra infektionsassays i øjeblikket den bedste måde at klassificere isolater på.
F. oxysporum inficerer oprindeligt værter gennem rødderne, før de gør sin vej op ad xylem20. Dette gør direkte podning af rødderne af en given værtskultivar til en effektiv måde at udføre race-typing på og er grundlaget for root-dip og tray-dippodningsmetoderne 21. Når man ikke inficerer en vært, bor F. oxysporum i jorden og kan forblive sovende i årevis. Voksende modtagelige vandmelonsorter i jord fra et interesseområde er en måde at teste for tilstedeværelsen af Fon. Udvidelse af denne metode til at omfatte sorter af forskellige kendte resistensniveauer i jord, der bevidst er inficeret med Fon, er også en god måde at udføre race-typing (tabel 1) og er grundlaget for den inficerede kernesåningsmetode. Den modificerede tray-dip-metode er en variation af den oprindelige tray-dip-metode, der giver mulighed for en race-typing med høj gennemstrømning, hvor mange planter og markisolater hurtigt kan undersøges22. Vigtige faktorer for et hurtigt og vellykket racetypebioassay omfatter anvendelse af sorter, der har dokumenteret forskelle i resistens over for de forskellige patogenracer, sikring af, at inokulumet er både biologisk aktivt og rigeligt under infektion, opretholdelse af et miljø, der både er befordrende for patogenet og værten, og ved hjælp af et konsekvent klassificeringssystem for sværhedsgrad eller forekomst af sygdom. Dette papir beskriver root-dip23,24, inficeret kernesåning25,26 og modificerede tray-dip22 metoder til fænotypisk race-typing baseret på de ovenfor beskrevne principper.
Tre metoder til race typing er blevet præsenteret. Hver af disse metoder er bedst egnet til bestemte spørgsmål og eksperimentelle forhold. Den angrebne kernepodningsmetode (jordangreb) er måske enklere og mere ligetil, hvilket gør den særlig nyttig til vurdering af patogenicitet30. Brug af denne metode til simpel race-typing er yderst effektiv. Det kan imidlertid være en udfordring at anvende metoden til at bestemme resistensen af en bestemt sort, da hver plante muligvis ikke står over for…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende Dr. Ali og Plant Molecular Diagnostic Laboratory samt Dr. Pingsheng Ji ved University of Georgia, hvis ledelse og støtte hjalp med at etablere vores Fon-program.
100% Fuller’s Earth | Sigma-Aldrich | F200-5KG | |
1 L glass Erlenmeyer Flask | PYREX | 4980-1L | |
15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
50 mL graduated cylinder | Lab Safety Supply | 41121805 | |
50 mL Eppendorf Conical Tubes | Fisher Scientific | 05-413-921 | |
Aluminum foil wrap | Reynolds Wrap | 720 | |
Bleach | Walmart | 587192290 | |
Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-391-301 | |
CaCO3 | sigma-Aldrich | 239216 | |
cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-11 | |
Cheesecloth | Lions Services, Inc | 8305-01-125-0725 | |
Clear plastic dishes | Visions Wave | 999RP6CLSS | ~15 cm diameter |
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | Sterile |
Ethanol | Fisher Chemical | A4094 | 100%, then combine with water to make 70% for use |
Flourescent Tube Lights | MaxLume | Model T5 | 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long |
granulated agar | VWR International | 90000-786 | |
Hand-held Spray Bottle | Ability One | 24122002 | ~0.95 L |
hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-55A | Two chamber hemacytometer |
Lab trays | Fisher Scientific | 15-236-2A | |
Large, sealable plastic bags | Ziploc | 430805 | 38 cm x 38 cm |
Mister / watering can | Bar5F | B10H22 | |
Mushroom Bag Clamp | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | |
Organic Rye Berries | Shroom Supply | 0.5 gallon or 25 lb bags | |
P1000 pipette and tips | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
Petri dishes | Fisherbrand | FB0875713 | Round, 100 mm diameter, 15 mm height |
Planting media | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
Plastic Pitcher | BrandTech | UX0600850 | 1 L or larger |
Plastic planting pots | Neo/SCI | 01-1177 | ~15 cm diameter and ~10 cm height |
Plastic, autoclave-safe bin | Thermo Scientific | UX0601022 | 3 L |
Quarter-strength potato dextrose agar media | Cole-Parmer | UX1420028 | Use powder in combination with recipe for QPDA |
Scientific Balance Scale, measuring in g | Ohaus | 30208458 | Any precise scale that can hold and measure 200g will work |
Size #4 cork bore | Cole-Parmer | NC9585352 | |
Small Mushroom grow bag | Shroom Supply | 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes | |
Soil trowel | Walmart | 563876946 | |
Styrofoam flats (6 x 12 cells) | Speedling | Model TR72A | |
Styrofoam flats (8 x 16 cells) | Speedling | Model TR128A | |
Syringe (5 or 10 mL) | fisher Scientific | 14-829-19C | |
Timer | Walmart | TM-01 | |
V8 Original 100% Vegetable Juice | Walmart | 564638212 | |
vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | |
Watermelon Seed – Black Diamond | Willhite Seed Inc | 17 | |
Watermelon Seed – Calhoun Gray | Holmes Seed Company | 4440 | |
Watermelon Seed – Charleston Gray | Bonnie Plants | 7.15339E+11 | |
Watermelon Seed – PI 296341-FR | Contact authors | Contact authors | |
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) | Alachua County Feed & Seed |