Het beheren van Fusarium-verwelking van watermeloen vereist kennis van de aanwezige pathogene rassen. Hier beschrijven we de worteldip, aangetaste kernel seeding en gemodificeerde tray-dip inentingsmethoden om hun werkzaamheid aan te tonen bij rastypering van de pathogene schimmel Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).
Fusarium verwelking van watermeloen (Citrullus lanatus), veroorzaakt door Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), is opnieuw opgedoken als een belangrijke productiebeperking in het zuidoosten van de VS, vooral in Florida. De inzet van geïntegreerde plaagbestrijdingsstrategieën, zoals rasspecifieke resistente cultivars, vereist informatie over de diversiteit en bevolkingsdichtheid van de ziekteverwekker op de velden van telers. Ondanks enige vooruitgang in de ontwikkeling van moleculaire diagnostische hulpmiddelen om pathogene isolaten te identificeren, vereist rasbepaling vaak bioassay-benaderingen.
Rastypering werd uitgevoerd door worteldipinenting, besmette kernelzaaimethode en de gemodificeerde tray-dip-methode met elk van de vier watermeloenverschillen (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Isolaten krijgen een rasaanduiding toegewezen door berekening van de ziekte-incidentie vijf weken na inenting. Als minder dan 33% van de planten voor een bepaalde cultivar symptomatisch was, werden ze gecategoriseerd als resistent. De cultivars met een incidentie van meer dan 33% werden als vatbaar beschouwd. Dit artikel beschrijft drie verschillende methoden van inenting om ras, worteldip, besmette kernel en gemodificeerde tray-dip inenting vast te stellen, waarvan de toepassingen variëren afhankelijk van het experimentele ontwerp.
De bodemschimmels die deel uitmaken van het Fusarium oxysporum species complex (FOSC) zijn impactvolle hemibiotrofe plantpathogenen die ernstige ziekten en opbrengstverlies kunnen veroorzaken in een breed scala van gewassen1. Fusarium verwelking van watermeloen, veroorzaakt door F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), is de afgelopen decennia over de hele wereld toegenomen in omvang, incidentie en ernst 2,3. Bij zaailingen lijken de symptomen van Fusarium-verwelking vaak op demping. Bij oudere planten wordt het gebladerte grijs, chlorotisch en necrotisch. Uiteindelijk gaat het verwelken van de planten over tot volledige instorting van de plant en de dood4. Direct opbrengstverlies treedt op als gevolg van de symptomen en plantensterfte, terwijl indirect opbrengstverlies kan optreden als gevolg van schade door de zon veroorzaakt door de eliminatie van het bladluifel5. Seksuele voortplanting en bijbehorende voortplantingsstructuren zijn nooit waargenomen in F. oxysporum. De ziekteverwekker produceert echter twee soorten aseksuele sporen, micro- en macroconidia, evenals grotere, langdurige overlevingsstructuren genaamd chlamydospores, die vele jaren in de bodem kunnen overleven6.
De FOSC wordt ingedeeld in formae speciales op basis van waargenomen gastheerbereiken, meestal beperkt tot één of enkele gastheersoorten1. Hoewel recent onderzoek heeft aangetoond dat dit soortencomplex een samenstelling van 15 verschillende soorten kan zijn, zijn de specifieke soorten die watermeloen infecteren momenteel onbekend7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) is de naam voor de groepen stammen die uitsluitend Citrullus lanatus of de gedomesticeerde watermeloeninfecteren 8,9. F. oxysporumstammen binnen de meeste pathogene formae speciales vertonen bepaalde niveaus van diversiteit met betrekking tot hun genetische componenten en virulentie ten opzichte van een gastheersoort. De ene stam kan bijvoorbeeld alle cultivars van een gastheer infecteren, terwijl een andere alleen de meer gevoelige cultivars kan infecteren. Om een dergelijke variatie te verklaren, worden deze groepen informeel ingedeeld in rassen op basis van evolutionaire relaties of gemeenschappelijke fenotypische kenmerken. Binnen Fon zijn vier rassen (0, 1, 2 en 3) gekarakteriseerd op basis van hun pathogeniciteit tegen een reeks geselecteerde watermeloencultivars, waarbij de ontdekking van ras 3 onlangs10 plaatsvond.
Ondanks deze schijnbare diversiteit zijn de morfologieën van sporen of koppeltekens niet te onderscheiden tussen de rassen van Fon-rassen, wat betekent dat moleculaire of fenotypische assays nodig zijn om het unieke ras van een isolaat te identificeren11. Moleculair onderzoek heeft enkele genetische verschillen geïdentificeerd. De rol van Uitgescheiden in Xylem (SIX) effectoren is bijvoorbeeld al jaren bestudeerd in F. oxysporum, en sommige van deze effectoren bevinden zich op de chromosomen die worden uitgewisseld tijdens horizontale genoverdracht12. SIX6 is bijvoorbeeld te vinden in Fon races 0 en 1, maar niet in race 213. ZES effectoren zijn betrokken bij de pathogeniciteit van F. oxysporum f. sp. lycopersici en F. oxysporum f. sp. cubense, die Fusarium-verwelking veroorzaken op tomaat en banaan, respectievelijk 14,15,16,17. De analyse van SIX-effectorprofielen tussen stammen van F. oxysporum f. sp. spiniciae, de Fusarium-verwelkingspathogeen op spinazie, heeft classificatie mogelijk gemaakt die de genetische en fenotypische diversiteit nauwkeurig weerspiegelt18. De verschillen tussen virulentiemechanismen van Fon-rassen zijn momenteel echter niet volledig begrepen en moleculaire assays die bij hun gebruik zijn ontwikkeld, hebben inconsistente en onnauwkeurige resultaten laten zien19. Daarom zijn fenotypische resultaten van infectietests momenteel de beste manier om isolaten te classificeren.
F. oxysporum infecteert aanvankelijk gastheren via de wortels voordat het zich een weg baant naar het xyleem20. Dit maakt directe inenting van de wortels van een bepaalde gastheercultivar een effectieve manier om rastypering uit te voeren en is de basis van de worteldip- en traydipinentingsmethoden21. Wanneer een gastheer niet wordt geïnfecteerd, bevindt F. oxysporum zich in de grond en kan het jarenlang inactief blijven. Het kweken van vatbare watermeloencultivars in grond uit een interessegebied is een manier om te testen op de aanwezigheid van Fon. Het uitbreiden van deze methode met cultivars van verschillende bekende niveaus van resistentie in grond die opzettelijk is aangetast met Fon is ook een goede manier om rastypering uit te voeren (tabel 1) en is de basis van de besmette kernelzaaimethode. De aangepaste tray-dip methode is een variant op de oorspronkelijke tray-dip methode die een high-throughput race-typering mogelijk maakt waarbij veel planten en veldisolaten snel kunnen worden onderzocht22. Belangrijke factoren van een snelle en succesvolle rastyperingsbioassay zijn onder meer het gebruik van cultivars die verschillen in resistentie tegen de verschillende pathogene rassen hebben gedocumenteerd, ervoor zorgen dat het entmateriaal zowel biologisch actief als overvloedig is tijdens infectie, het handhaven van een omgeving die zowel bevorderlijk is voor de ziekteverwekker als de gastheer, en het gebruik van een consistent beoordelingssysteem voor ernst of incidentie van ziekte. Dit artikel beschrijft de root-dip23,24, infested kernel seeding25,26 en gemodificeerde tray-dip22 methoden voor fenotypische race-typering op basis van de hierboven beschreven principes.
Er zijn drie methoden voor rastypering gepresenteerd. Elk van deze methoden is het meest geschikt voor specifieke vragen en experimentele omstandigheden. De infestatiemethode voor aangetaste pitten (bodeminfestatie) is misschien eenvoudiger en eenvoudiger, waardoor het vooral nuttig is voor de beoordeling van pathogeniciteit30. Het gebruik van deze methode voor eenvoudige race-typering is zeer effectief. Het toepassen van de methode om de resistentie van een specifieke cultivar te bepalen kan echt…
The authors have nothing to disclose.
We willen Dr. Ali en het Plant Molecular Diagnostic Laboratory bedanken, evenals Dr. Pingsheng Ji aan de Universiteit van Georgia, wiens leiderschap en ondersteuning hebben bijgedragen aan het opzetten van ons Fon-programma.
100% Fuller’s Earth | Sigma-Aldrich | F200-5KG | |
1 L glass Erlenmeyer Flask | PYREX | 4980-1L | |
15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
50 mL graduated cylinder | Lab Safety Supply | 41121805 | |
50 mL Eppendorf Conical Tubes | Fisher Scientific | 05-413-921 | |
Aluminum foil wrap | Reynolds Wrap | 720 | |
Bleach | Walmart | 587192290 | |
Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-391-301 | |
CaCO3 | sigma-Aldrich | 239216 | |
cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-11 | |
Cheesecloth | Lions Services, Inc | 8305-01-125-0725 | |
Clear plastic dishes | Visions Wave | 999RP6CLSS | ~15 cm diameter |
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | Sterile |
Ethanol | Fisher Chemical | A4094 | 100%, then combine with water to make 70% for use |
Flourescent Tube Lights | MaxLume | Model T5 | 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long |
granulated agar | VWR International | 90000-786 | |
Hand-held Spray Bottle | Ability One | 24122002 | ~0.95 L |
hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-55A | Two chamber hemacytometer |
Lab trays | Fisher Scientific | 15-236-2A | |
Large, sealable plastic bags | Ziploc | 430805 | 38 cm x 38 cm |
Mister / watering can | Bar5F | B10H22 | |
Mushroom Bag Clamp | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | |
Organic Rye Berries | Shroom Supply | 0.5 gallon or 25 lb bags | |
P1000 pipette and tips | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
Petri dishes | Fisherbrand | FB0875713 | Round, 100 mm diameter, 15 mm height |
Planting media | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
Plastic Pitcher | BrandTech | UX0600850 | 1 L or larger |
Plastic planting pots | Neo/SCI | 01-1177 | ~15 cm diameter and ~10 cm height |
Plastic, autoclave-safe bin | Thermo Scientific | UX0601022 | 3 L |
Quarter-strength potato dextrose agar media | Cole-Parmer | UX1420028 | Use powder in combination with recipe for QPDA |
Scientific Balance Scale, measuring in g | Ohaus | 30208458 | Any precise scale that can hold and measure 200g will work |
Size #4 cork bore | Cole-Parmer | NC9585352 | |
Small Mushroom grow bag | Shroom Supply | 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes | |
Soil trowel | Walmart | 563876946 | |
Styrofoam flats (6 x 12 cells) | Speedling | Model TR72A | |
Styrofoam flats (8 x 16 cells) | Speedling | Model TR128A | |
Syringe (5 or 10 mL) | fisher Scientific | 14-829-19C | |
Timer | Walmart | TM-01 | |
V8 Original 100% Vegetable Juice | Walmart | 564638212 | |
vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | |
Watermelon Seed – Black Diamond | Willhite Seed Inc | 17 | |
Watermelon Seed – Calhoun Gray | Holmes Seed Company | 4440 | |
Watermelon Seed – Charleston Gray | Bonnie Plants | 7.15339E+11 | |
Watermelon Seed – PI 296341-FR | Contact authors | Contact authors | |
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) | Alachua County Feed & Seed |