La gestione dell’appassimento del Fusarium dell’anguria richiede la conoscenza delle razze patogene presenti. Qui, descriviamo il root-dip, la semina del kernel infestato e i metodi di inoculazione a immersione del vassoio modificati per dimostrare la loro efficacia nella tipizzazione della razza del fungo patogeno Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).
L’appassimento del fusarium dell’anguria (Citrullus lanatus), causato dal Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), è riemerso come un importante vincolo di produzione nel sud-est degli Stati Uniti, in particolare in Florida. L’implementazione di strategie di gestione integrata dei parassiti, come le cultivar resistenti specifiche per razza, richiede informazioni sulla diversità e la densità di popolazione dell’agente patogeno nei campi dei coltivatori. Nonostante alcuni progressi nello sviluppo di strumenti diagnostici molecolari per identificare gli isolati di patogeni, la determinazione della razza richiede spesso approcci di biodosaggio.
La tipizzazione della razza è stata condotta mediante inoculazione root-dip, metodo di semina del kernel infestato e metodo di immersione del vassoio modificato con ciascuno dei quattro differenziali di anguria (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Agli isolati viene assegnata una designazione di razza mediante il calcolo dell’incidenza della malattia cinque settimane dopo l’inoculazione. Se meno del 33% delle piante per una particolare cultivar erano sintomatiche, sono state classificate come resistenti. Quelle cultivar con incidenza superiore al 33% sono state considerate sensibili. Questo articolo descrive tre diversi metodi di inoculazione per accertare la razza, il root-dip, il kernel infestato e l’inoculazione a vassoio modificato, le cui applicazioni variano a seconda del disegno sperimentale.
I funghi terrestri che compongono il complesso di specie Fusarium oxysporum (FOSC) sono patogeni emibiotrofici di impatto che possono causare gravi malattie e perdita di resa in una vasta gamma di colture1. L’appassimento del fusarium dell’anguria, causato da F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), è aumentato in portata, incidenza e gravità in tutto il mondo negli ultimi decenni 2,3. Nelle piantine, i sintomi dell’appassimento di Fusarium spesso assomigliano allo smorzamento. Nelle piante più vecchie, il fogliame diventa grigio, clorotico e necrotico. Alla fine, l’avvizzimento delle piante progredisce fino al collasso completo delle piante e alla morte4. La perdita diretta di resa si verifica a causa dei sintomi e della morte delle piante, mentre la perdita di resa indiretta può verificarsi a causa dei danni del sole causati dall’eliminazione della chioma fogliare5. La riproduzione sessuale e le strutture riproduttive associate non sono mai state osservate in F. oxysporum. Tuttavia, l’agente patogeno produce due tipi di spore asessuate, micro e macroconidi, nonché strutture di sopravvivenza più grandi e a lungo termine chiamate clamidospore, che possono sopravvivere nel terreno per molti anni6.
Il FOSC è classificato in formae speciales in base agli intervalli di ospiti osservati, di solito limitati a una o poche specie ospiti1. Sebbene recenti ricerche abbiano indicato che questo complesso di specie può essere un composto di 15 specie diverse, le specie particolari che infettano l’anguria sono attualmente sconosciute7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) è il nome dei gruppi di ceppi che infettano esclusivamente il Citrullus lanatus o l’anguria addomesticata 8,9. I ceppi di F. oxysporum all’interno della maggior parte delle forme specialis patogene mostrano determinati livelli di diversità per quanto riguarda le loro componenti genetiche e la virulenza nei confronti di una specie ospite. Ad esempio, un ceppo può infettare tutte le cultivar di un ospite, mentre un altro può infettare solo le cultivar più sensibili. Per spiegare tale variazione, questi gruppi sono informalmente classificati in razze basate su relazioni evolutive o caratteristiche fenotipiche comuni. All’interno di Fon, quattro razze (0, 1, 2 e 3) sono state caratterizzate in base alla loro patogenicità rispetto a una serie di cultivar di anguria selezionate, con la scoperta della razza 3 che si è verificata recentemente10.
Nonostante questa apparente diversità, le morfologie delle spore o delle ife non sono distinguibili tra le razze delle razze Fon, il che significa che sono necessari saggi molecolari o fenotipici per identificare la razza unica di un isolato11. La ricerca molecolare ha identificato alcune differenze genetiche. Ad esempio, il ruolo degli effettori Secreted in Xylem (SIX) è stato studiato per anni in F. oxysporum e alcuni di questi effettori sono stati localizzati sui cromosomi scambiati durante il trasferimento genico orizzontale12. Ad esempio, SIX6 si trova nelle gare Fon 0 e 1 ma non in gara 213. SEI effettori sono stati implicati nella patogenicità di F. oxysporum f. sp. lycopersici e F. oxysporum f. sp. cubense, che causano l’appassimento di Fusarium su pomodoro e banana, rispettivamente 14,15,16,17. L’analisi dei profili effettori SIX tra ceppi di F. oxysporum f. sp. spiniciae, il patogeno appassito di Fusarium sugli spinaci, ha consentito una classificazione che riflette accuratamente la diversità genetica e fenotipica18. Tuttavia, le differenze tra i meccanismi di virulenza delle razze Fon non sono attualmente del tutto comprese, e i saggi molecolari sviluppati sul loro uso hanno mostrato risultati incoerenti e imprecisi19. Pertanto, i risultati fenotipici dei test di infezione sono attualmente il modo migliore per classificare gli isolati.
F. oxysporum inizialmente infetta gli ospiti attraverso le radici prima di farsi strada nello xilema20. Ciò rende l’inoculazione diretta delle radici di una determinata cultivar ospite un modo efficace per eseguire la tipizzazione della razza ed è alla base dei metodi di inoculazione root-dip e tray-dip21. Quando non infetta un ospite, F. oxysporum risiede nel terreno e può rimanere dormiente per anni. Coltivare cultivar di anguria sensibili nel terreno da un campo di interesse è un modo per testare la presenza di Fon. Espandere questo metodo per includere cultivar di diversi livelli noti di resistenza nel terreno che è deliberatamente infestato con Fon è anche un buon modo per eseguire la tipizzazione della razza (Tabella 1) ed è la base del metodo di semina del nocciolo infestato. Il metodo di immersione del vassoio modificato è una variante del metodo originale del vassoio-immersione che consente una tipizzazione della corsa ad alta produttività in cui molte piante e isolati di campo possono essere studiati rapidamente22. Fattori importanti di un biotest rapido e di successo includono l’uso di cultivar che hanno differenze documentate nella resistenza alle diverse razze patogene, assicurando che l’inoculo sia biologicamente attivo che abbondante durante l’infezione, mantenendo un ambiente favorevole sia per l’agente patogeno che per l’ospite e utilizzando un sistema di valutazione coerente per gravità o incidenza della malattia. Questo articolo descrive i metodi root-dip23,24, la semina del kernel infestata25,26 e i metodi di tray-dip22 modificati per la tipizzazione fenotipica della razza basata sui principi sopra descritti.
Sono stati presentati tre metodi di tipizzazione della razza. Ognuno di questi metodi è più adatto a particolari domande e condizioni sperimentali. Il metodo di inoculazione del kernel infestato (infestazione del suolo) è forse più semplice e diretto, rendendolo particolarmente utile per la valutazione della patogenicità30. L’uso di questo metodo per la semplice digitazione della razza è altamente efficace. Tuttavia, applicare il metodo per determinare la resistenza di una cultivar specifica…
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare il Dr. Ali e il Plant Molecular Diagnostic Laboratory, nonché il Dr. Pingsheng Ji dell’Università della Georgia, la cui leadership e supporto hanno contribuito a stabilire il nostro programma Fon.
100% Fuller’s Earth | Sigma-Aldrich | F200-5KG | |
1 L glass Erlenmeyer Flask | PYREX | 4980-1L | |
15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
50 mL graduated cylinder | Lab Safety Supply | 41121805 | |
50 mL Eppendorf Conical Tubes | Fisher Scientific | 05-413-921 | |
Aluminum foil wrap | Reynolds Wrap | 720 | |
Bleach | Walmart | 587192290 | |
Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-391-301 | |
CaCO3 | sigma-Aldrich | 239216 | |
cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-11 | |
Cheesecloth | Lions Services, Inc | 8305-01-125-0725 | |
Clear plastic dishes | Visions Wave | 999RP6CLSS | ~15 cm diameter |
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | Sterile |
Ethanol | Fisher Chemical | A4094 | 100%, then combine with water to make 70% for use |
Flourescent Tube Lights | MaxLume | Model T5 | 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long |
granulated agar | VWR International | 90000-786 | |
Hand-held Spray Bottle | Ability One | 24122002 | ~0.95 L |
hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-55A | Two chamber hemacytometer |
Lab trays | Fisher Scientific | 15-236-2A | |
Large, sealable plastic bags | Ziploc | 430805 | 38 cm x 38 cm |
Mister / watering can | Bar5F | B10H22 | |
Mushroom Bag Clamp | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | |
Organic Rye Berries | Shroom Supply | 0.5 gallon or 25 lb bags | |
P1000 pipette and tips | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
Petri dishes | Fisherbrand | FB0875713 | Round, 100 mm diameter, 15 mm height |
Planting media | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
Plastic Pitcher | BrandTech | UX0600850 | 1 L or larger |
Plastic planting pots | Neo/SCI | 01-1177 | ~15 cm diameter and ~10 cm height |
Plastic, autoclave-safe bin | Thermo Scientific | UX0601022 | 3 L |
Quarter-strength potato dextrose agar media | Cole-Parmer | UX1420028 | Use powder in combination with recipe for QPDA |
Scientific Balance Scale, measuring in g | Ohaus | 30208458 | Any precise scale that can hold and measure 200g will work |
Size #4 cork bore | Cole-Parmer | NC9585352 | |
Small Mushroom grow bag | Shroom Supply | 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes | |
Soil trowel | Walmart | 563876946 | |
Styrofoam flats (6 x 12 cells) | Speedling | Model TR72A | |
Styrofoam flats (8 x 16 cells) | Speedling | Model TR128A | |
Syringe (5 or 10 mL) | fisher Scientific | 14-829-19C | |
Timer | Walmart | TM-01 | |
V8 Original 100% Vegetable Juice | Walmart | 564638212 | |
vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | |
Watermelon Seed – Black Diamond | Willhite Seed Inc | 17 | |
Watermelon Seed – Calhoun Gray | Holmes Seed Company | 4440 | |
Watermelon Seed – Charleston Gray | Bonnie Plants | 7.15339E+11 | |
Watermelon Seed – PI 296341-FR | Contact authors | Contact authors | |
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) | Alachua County Feed & Seed |