Gerenciar o murmúrio fusarium de melancia requer o conhecimento das raças patógenas presentes. Aqui, descrevemos os métodos de inoculação de root-dip, infestado de kernel e métodos modificados de inoculação de mergulho de bandeja para demonstrar sua eficácia na digitação racial do fungo patogênico Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).
Fusarium murcha de melancia (Citrullus lanatus), causada por Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), ressurgiu como uma grande restrição de produção no sudeste dos EUA, especialmente na Flórida. A implantação de estratégias integradas de manejo de pragas, como cultivares resistentes à raça, requer informações sobre a diversidade e densidade populacional do patógeno nos campos dos produtores. Apesar de alguns progressos no desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico molecular para identificar isolados de patógenos, a determinação racial muitas vezes requer abordagens de bioensação.
A digitação de raça foi conduzida por inoculação de mergulho radicular, método de semeadura infestada de kernel, e o método modificado de mergulho de bandeja com cada um dos quatro diferenciais de melancia (Diamante Negro, Cinza Charleston, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Os isolados recebem uma designação de raça por cálculo da incidência da doença cinco semanas após a inoculação. Se menos de 33% das plantas para uma cultivar específica fossem sintomáticas, elas eram categorizadas como resistentes. As cultivares com incidência superior a 33% foram consideradas suscetíveis. Este artigo descreve três métodos diferentes de inoculação para determinar raça, mergulho radicular, núcleo infestado e inoculação modificada de mergulho de bandeja, cujas aplicações variam de acordo com o design experimental.
Os fungos soilborne que compõem o complexo de espécies de oxisporo fusarium oxysporum (FOSC) são patógenos hemibiotrópicos impactantes que podem causar doenças graves e perda de rendimento em uma variedade diversificada de culturas1. O murche fusarium de melancia, causado por F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), vem aumentando em escopo, incidência e gravidade em todo o mundo nas últimas décadas 2,3. Nas mudas, os sintomas do murche fusarium muitas vezes se assemelham a amortecimento. Em plantas mais antigas, a folhagem se torna cinza, clorolítica e necrótica. Eventualmente, a murcha das plantas progride para o colapso total da planta e a morte4. A perda direta de rendimento ocorre devido aos sintomas e morte da planta, enquanto a perda indireta de rendimento pode ocorrer devido aos danos solares causados pela eliminação do dossel foliar5. A reprodução sexual e as estruturas reprodutivas associadas nunca foram observadas em F. oxysporum. No entanto, o patógeno produz dois tipos de esporos assexuados, micro e macroconidia, bem como estruturas de sobrevivência maiores e de longo prazo chamadas clamídesporos, que podem sobreviver no solo por muitos anos6.
O FOSC é classificado em especial formae com base em faixas de hospedeiras observadas, geralmente limitadas a uma ou algumas espécieshospedeiras 1. Embora pesquisas recentes tenham indicado que este complexo de espécies pode ser um composto de 15 espécies diferentes, as espécies particulares que infectam a melancia são atualmente desconhecidas7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) é o nome dos grupos de cepas que infectam exclusivamente Citrullus lanatus ou a melancia domesticada 8,9. As cepas de f. oxysporum dentro da maioria das especialidades de forma patogênica mostram certos níveis de diversidade em relação aos seus componentes genéticos e virulência em relação a uma espécie hospedeira. Por exemplo, uma cepa pode infectar todas as cultivares de um hospedeiro, enquanto outra só pode infectar as cultivares mais suscetíveis. Para explicar essa variação, esses grupos são informalmente classificados em raças baseadas em relações evolutivas ou características fenotípicas comuns. Dentro de Fon, quatro raças (0, 1, 2 e 3) foram caracterizadas com base em sua patogenicidade contra um conjunto de cultivares de melancia selecionadas, com a descoberta da raça 3 ocorrendo recentemente10.
Apesar dessa aparente diversidade, as morfologias dos esporos ou hifas não são distinguíveis entre as raças das raças Fon, o que significa que ensaios moleculares ou fenotípicos são necessários para identificar a raça única de um isolado11. Pesquisas moleculares identificaram algumas diferenças genéticas. Por exemplo, o papel dos efeitos Secreted in Xylem (SIX) tem sido estudado há anos em F. oxysporum, e alguns desses efeitos foram localizados nos cromossomos trocados durante a transferência horizontal de genes12. Por exemplo, SIX6 é encontrado nas corridas 0 e 1 fon, mas não na corrida 213. Seis efeitos foram implicados na patogenicidade de F. oxysporum f. sp. lycopersici e F. oxysporum f. sp. cubense, que causam murcha fusarium no tomate e banana, respectivamente 14,15,16,17. A análise de perfis de efeitos SEIS entre cepas de F. oxysporum f. sp. spiniciae, o patógeno murcho fusarium no espinafre, permitiu uma classificação que reflete com precisão a diversidade genética e fenotípica18. No entanto, as diferenças entre os mecanismos de virulência das raças Fon não são atualmente totalmente compreendidas, e os ensaios moleculares desenvolvidos após seu uso mostraram resultados inconsistentes e imprecisos19. Portanto, os resultados fenotípicos dos ensaios de infecção são atualmente a melhor maneira de classificar isolados.
F. oxysporum inicialmente infecta hospedeiros através das raízes antes de subir o xilema20. Isso torna a inoculação direta das raízes de uma determinada cultivar hospedeira uma maneira eficaz de realizar a digitação racial e é a base dos métodos de inoculação de mergulho de raiz e de mergulho de bandeja21. Quando não infecta um hospedeiro, F. oxysporum reside no solo e pode permanecer adormecido por anos. Cultivares de melancia suscetíveis no solo de um campo de interesse é uma maneira de testar a presença de Fon. Expandir este método para incluir cultivares de diferentes níveis conhecidos de resistência no solo que é deliberadamente infestado com Fon também é uma boa maneira de realizar a digitação racial (Tabela 1) e é a base do método infestado de sementes de kernel. O método modificado de mergulho de bandeja é uma variação do método original de mergulho de bandeja que permite uma digitação de corrida de alto rendimento onde muitas plantas e isolados de campo podem ser investigados rapidamente22. Fatores importantes de um bioensaio de digitação rápida e bem-sucedida incluem o uso de cultivares que documentaram diferenças na resistência às diferentes raças de patógenos, garantindo que o inóculo seja biologicamente ativo e abundante durante a infecção, mantendo um ambiente propício para o patógeno e hospedeiro, e usando um sistema de classificação consistente para gravidade ou incidência da doença. Este artigo descreve o mergulho raiz23,24, semeamento infestadode 25,26, e métodos modificados de mergulho de bandeja22 para digitação de raça fenotípica com base nos princípios descritos acima.
Três métodos de digitação racial foram apresentados. Cada um desses métodos é mais adequado para questões particulares e condições experimentais. O método de inoculação de kernel infestado (infestação do solo) é talvez mais simples e simples, tornando-o especialmente útil para a avaliação da patogenicidade30. Usar este método para digitação de raça simples é altamente eficaz. No entanto, a aplicação do método para determinar a resistência de uma cultivar específica pode…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de reconhecer o Dr. Ali e o Laboratório de Diagnóstico Molecular vegetal, bem como o Dr. Pingsheng Ji da Universidade da Geórgia, cuja liderança e apoio ajudaram a estabelecer nosso programa Fon.
100% Fuller’s Earth | Sigma-Aldrich | F200-5KG | |
1 L glass Erlenmeyer Flask | PYREX | 4980-1L | |
15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
50 mL graduated cylinder | Lab Safety Supply | 41121805 | |
50 mL Eppendorf Conical Tubes | Fisher Scientific | 05-413-921 | |
Aluminum foil wrap | Reynolds Wrap | 720 | |
Bleach | Walmart | 587192290 | |
Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-391-301 | |
CaCO3 | sigma-Aldrich | 239216 | |
cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-11 | |
Cheesecloth | Lions Services, Inc | 8305-01-125-0725 | |
Clear plastic dishes | Visions Wave | 999RP6CLSS | ~15 cm diameter |
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | Sterile |
Ethanol | Fisher Chemical | A4094 | 100%, then combine with water to make 70% for use |
Flourescent Tube Lights | MaxLume | Model T5 | 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long |
granulated agar | VWR International | 90000-786 | |
Hand-held Spray Bottle | Ability One | 24122002 | ~0.95 L |
hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-55A | Two chamber hemacytometer |
Lab trays | Fisher Scientific | 15-236-2A | |
Large, sealable plastic bags | Ziploc | 430805 | 38 cm x 38 cm |
Mister / watering can | Bar5F | B10H22 | |
Mushroom Bag Clamp | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | |
Organic Rye Berries | Shroom Supply | 0.5 gallon or 25 lb bags | |
P1000 pipette and tips | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
Petri dishes | Fisherbrand | FB0875713 | Round, 100 mm diameter, 15 mm height |
Planting media | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
Plastic Pitcher | BrandTech | UX0600850 | 1 L or larger |
Plastic planting pots | Neo/SCI | 01-1177 | ~15 cm diameter and ~10 cm height |
Plastic, autoclave-safe bin | Thermo Scientific | UX0601022 | 3 L |
Quarter-strength potato dextrose agar media | Cole-Parmer | UX1420028 | Use powder in combination with recipe for QPDA |
Scientific Balance Scale, measuring in g | Ohaus | 30208458 | Any precise scale that can hold and measure 200g will work |
Size #4 cork bore | Cole-Parmer | NC9585352 | |
Small Mushroom grow bag | Shroom Supply | 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes | |
Soil trowel | Walmart | 563876946 | |
Styrofoam flats (6 x 12 cells) | Speedling | Model TR72A | |
Styrofoam flats (8 x 16 cells) | Speedling | Model TR128A | |
Syringe (5 or 10 mL) | fisher Scientific | 14-829-19C | |
Timer | Walmart | TM-01 | |
V8 Original 100% Vegetable Juice | Walmart | 564638212 | |
vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | |
Watermelon Seed – Black Diamond | Willhite Seed Inc | 17 | |
Watermelon Seed – Calhoun Gray | Holmes Seed Company | 4440 | |
Watermelon Seed – Charleston Gray | Bonnie Plants | 7.15339E+11 | |
Watermelon Seed – PI 296341-FR | Contact authors | Contact authors | |
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) | Alachua County Feed & Seed |