El manejo del marchitamiento por Fusarium de la sandía requiere el conocimiento de las razas de patógenos presentes. Aquí, describimos los métodos de inoculación de inmersión de raíz, semilla de grano infestado y inoculación de inmersión en bandeja modificados para demostrar su eficacia en la tipificación racial del hongo patógeno Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).
El marchitamiento por Fusarium de sandía (Citrullus lanatus), causado por Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), ha resurgido como una importante restricción de producción en el sureste de los Estados Unidos, especialmente en Florida. El despliegue de estrategias integradas de manejo de plagas, como los cultivares resistentes específicos de la raza, requiere información sobre la diversidad y la densidad de población del patógeno en los campos de los cultivadores. A pesar de algunos avances en el desarrollo de herramientas de diagnóstico molecular para identificar aislados de patógenos, la determinación de la raza a menudo requiere enfoques de bioensayo.
La tipificación de la raza se llevó a cabo mediante inoculación por inmersión de raíz, método de siembra de grano infestado y el método modificado de inmersión en bandeja con cada uno de los cuatro diferenciales de sandía (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). A los aislados se les asigna una designación de raza mediante el cálculo de la incidencia de la enfermedad cinco semanas después de la inoculación. Si menos del 33% de las plantas de un cultivar en particular eran sintomáticas, se clasificaban como resistentes. Aquellos cultivares con incidencia superior al 33% fueron considerados susceptibles. Este artículo describe tres métodos diferentes de inoculación para determinar la raza, la inmersión de la raíz, el núcleo infestado y la inoculación modificada de la inmersión en bandeja, cuyas aplicaciones varían según el diseño experimental.
Los hongos transmitidos por el suelo que componen el complejo de especies de Fusarium oxysporum (FOSC) son patógenos hemibiotróficos de plantas impactantes que pueden causar enfermedades graves y pérdida de rendimiento en una amplia gama de cultivos1. El marchitamiento por Fusarium de la sandía, causado por F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), ha aumentado en alcance, incidencia y gravedad en todo el mundo en las últimas décadas 2,3. En las plántulas, los síntomas del marchitamiento por Fusarium a menudo se asemejan a la amortiguación. En las plantas más viejas, el follaje se vuelve gris, clorótico y necrótico. Eventualmente, el marchitamiento de las plantas progresa hasta el colapso total de la planta y la muerte4. La pérdida directa de rendimiento se produce debido a los síntomas y la muerte de la planta, mientras que la pérdida indirecta de rendimiento puede ocurrir debido al daño solar causado por la eliminación del dosel foliar5. La reproducción sexual y las estructuras reproductivas asociadas nunca se han observado en F. oxysporum. Sin embargo, el patógeno produce dos tipos de esporas asexuales, micro y macroconidios, así como estructuras de supervivencia más grandes a largo plazo llamadas clamidosporas, que pueden sobrevivir en el suelo durante muchos años6.
El FOSC se clasifica en formae speciales en función de los rangos de huéspedes observados, generalmente limitados a una o unas pocas especies huésped1. Aunque investigaciones recientes han indicado que este complejo de especies puede ser un compuesto de 15 especies diferentes, las especies particulares que infectan la sandía son actualmente desconocidas7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) es el nombre de los grupos de cepas que infectan exclusivamente a Citrullus lanatus o a la sandía domesticada 8,9. Las cepas de F. oxysporum dentro de la mayoría de las formas especiales patógenas muestran ciertos niveles de diversidad con respecto a sus componentes genéticos y virulencia hacia una especie huésped. Por ejemplo, una cepa puede infectar a todos los cultivares de un huésped, mientras que otra solo puede infectar a los cultivares más susceptibles. Para dar cuenta de tal variación, estos grupos se clasifican informalmente en razas basadas en relaciones evolutivas o características fenotípicas comunes. Dentro de Fon, se han caracterizado cuatro razas (0, 1, 2 y 3) en función de su patogenicidad contra un conjunto de cultivares de sandía seleccionados, con el descubrimiento de la raza 3 ocurriendo recientemente10.
A pesar de esta aparente diversidad, las morfologías de las esporas o hifas no son distinguibles entre las razas de las razas Fon, lo que significa que se necesitan ensayos moleculares o fenotípicos para identificar la raza única de un aislado11. La investigación molecular ha identificado algunas diferencias genéticas. Por ejemplo, el papel de Secreted en los efectores del xilema (SIX) se ha estudiado durante años en F. oxysporum, y algunos de estos efectores se han localizado en los cromosomas intercambiados durante la transferencia horizontalde genes 12. Por ejemplo, SIX6 se encuentra en las carreras Fon 0 y 1, pero no en la carrera 213. SEIS efectores han sido implicados en la patogenicidad de F. oxysporum f. sp. lycopersici y F. oxysporum f. sp. cubense, que causan marchitamiento por Fusarium en tomate y plátano, respectivamente 14,15,16,17. El análisis de seis perfiles efectores entre cepas de F. oxysporum f. sp. spiniciae, el patógeno del marchitamiento por Fusarium en espinacas, ha permitido una clasificación que refleja con precisión la diversidad genética y fenotípica18. Sin embargo, las diferencias entre los mecanismos de virulencia de las razas Fon actualmente no se comprenden completamente, y los ensayos moleculares desarrollados sobre su uso han mostrado resultados inconsistentes e inexactos19. Por lo tanto, los resultados fenotípicos de los ensayos de infección son actualmente la mejor manera de clasificar los aislados.
F. oxysporum inicialmente infecta a los huéspedes a través de las raíces antes de abrirse camino hacia el xilema20. Esto hace que la inoculación directa de las raíces de un cultivar huésped dado sea una forma efectiva de realizar la tipificación de la raza y es la base de los métodos de inoculación de inmersión de raíz y inmersión en bandeja21. Cuando no infecta a un huésped, F. oxysporum reside en el suelo y puede permanecer inactivo durante años. Cultivar cultivares de sandía susceptibles en el suelo de un campo de interés es una forma de probar la presencia de Fon. Ampliar este método para incluir cultivares de diferentes niveles conocidos de resistencia en suelos que están infestados deliberadamente con Fon también es una buena manera de realizar la tipificación de razas (Tabla 1) y es la base del método de siembra de granos infestados. El método modificado de inmersión en bandeja es una variación del método original de inmersión en bandeja que permite una tipificación de carrera de alto rendimiento donde muchas plantas y aislados de campo se pueden investigar rápidamente22. Los factores importantes de un bioensayo rápido y exitoso de tipificación de razas incluyen el uso de cultivares que han documentado diferencias en la resistencia a las diferentes razas de patógenos, asegurando que el inóculo sea biológicamente activo y abundante durante la infección, manteniendo un ambiente que sea propicio para el patógeno y el huésped, y utilizando un sistema de calificación consistente para la gravedad o incidencia de la enfermedad. Este artículo describe los métodosroot-dip 23,24, infested kernel seeding25,26 y modified tray-dip22 métodos para la tipificación fenotípica de razas basados en los principios descritos anteriormente.
Se han presentado tres métodos de tipificación de razas. Cada uno de estos métodos se adapta mejor a preguntas particulares y condiciones experimentales. El método de inoculación del grano infestado (infestación del suelo) es quizás más simple y directo, por lo que es especialmente útil para la evaluación de la patogenicidad30. El uso de este método para escribir carreras simples es altamente efectivo. Sin embargo, aplicar el método para determinar la resistencia de un cultivar especí…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría reconocer al Dr. Ali y al Laboratorio de Diagnóstico Molecular de Plantas, así como al Dr. Pingsheng Ji de la Universidad de Georgia, cuyo liderazgo y apoyo ayudaron a establecer nuestro programa Fon.
100% Fuller’s Earth | Sigma-Aldrich | F200-5KG | |
1 L glass Erlenmeyer Flask | PYREX | 4980-1L | |
15 mL falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
50 mL graduated cylinder | Lab Safety Supply | 41121805 | |
50 mL Eppendorf Conical Tubes | Fisher Scientific | 05-413-921 | |
Aluminum foil wrap | Reynolds Wrap | 720 | |
Bleach | Walmart | 587192290 | |
Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-391-301 | |
CaCO3 | sigma-Aldrich | 239216 | |
cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-11 | |
Cheesecloth | Lions Services, Inc | 8305-01-125-0725 | |
Clear plastic dishes | Visions Wave | 999RP6CLSS | ~15 cm diameter |
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | Sterile |
Ethanol | Fisher Chemical | A4094 | 100%, then combine with water to make 70% for use |
Flourescent Tube Lights | MaxLume | Model T5 | 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long |
granulated agar | VWR International | 90000-786 | |
Hand-held Spray Bottle | Ability One | 24122002 | ~0.95 L |
hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-55A | Two chamber hemacytometer |
Lab trays | Fisher Scientific | 15-236-2A | |
Large, sealable plastic bags | Ziploc | 430805 | 38 cm x 38 cm |
Mister / watering can | Bar5F | B10H22 | |
Mushroom Bag Clamp | Shroom Supply | 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag | |
Nitrile Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597D | |
Organic Rye Berries | Shroom Supply | 0.5 gallon or 25 lb bags | |
P1000 pipette and tips | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
Petri dishes | Fisherbrand | FB0875713 | Round, 100 mm diameter, 15 mm height |
Planting media | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
Plastic Pitcher | BrandTech | UX0600850 | 1 L or larger |
Plastic planting pots | Neo/SCI | 01-1177 | ~15 cm diameter and ~10 cm height |
Plastic, autoclave-safe bin | Thermo Scientific | UX0601022 | 3 L |
Quarter-strength potato dextrose agar media | Cole-Parmer | UX1420028 | Use powder in combination with recipe for QPDA |
Scientific Balance Scale, measuring in g | Ohaus | 30208458 | Any precise scale that can hold and measure 200g will work |
Size #4 cork bore | Cole-Parmer | NC9585352 | |
Small Mushroom grow bag | Shroom Supply | 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes | |
Soil trowel | Walmart | 563876946 | |
Styrofoam flats (6 x 12 cells) | Speedling | Model TR72A | |
Styrofoam flats (8 x 16 cells) | Speedling | Model TR128A | |
Syringe (5 or 10 mL) | fisher Scientific | 14-829-19C | |
Timer | Walmart | TM-01 | |
V8 Original 100% Vegetable Juice | Walmart | 564638212 | |
vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | |
Watermelon Seed – Black Diamond | Willhite Seed Inc | 17 | |
Watermelon Seed – Calhoun Gray | Holmes Seed Company | 4440 | |
Watermelon Seed – Charleston Gray | Bonnie Plants | 7.15339E+11 | |
Watermelon Seed – PI 296341-FR | Contact authors | Contact authors | |
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) | Alachua County Feed & Seed |