Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bilinmeyen Fusarium oxysporum f.sp. Irkını Belirlemek İçin Kullanılan Üç Aşılama Tekniğinin Kontrastı. niveum Yalı -tır

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63181
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 3, 4,5, 6, 1
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

Karpuzun Fusarium solgunluğunu yönetmek, mevcut patojen ırkları hakkında bilgi gerektirir. Burada, patojenik mantar Fusarium oxysporum f. sp niveum'un (Fon) ırk tiplemesindeki etkinliklerini göstermek için kök daldırma, istila edilmiş çekirdek tohumlama ve modifiye tepsi daldırma aşılama yöntemlerini açıklıyoruz.

Abstract

Fusarium oxysporum f. sp. niveum'un (Fon) neden olduğu karpuzun Fusarium solgunluğu (Citrullus lanatus), güneydoğu ABD'de, özellikle Florida'da büyük bir üretim kısıtlaması olarak yeniden ortaya çıkmıştır. Irka özgü dirençli çeşitler gibi entegre haşere yönetimi stratejilerinin uygulanması, yetiştiricilerin tarlalarındaki patojenin çeşitliliği ve popülasyon yoğunluğu hakkında bilgi gerektirir. Patojen izolatlarını tanımlamak için moleküler tanı araçlarının geliştirilmesinde bazı ilerlemelere rağmen, ırk tayini genellikle biyotahlil yaklaşımları gerektirir.

Irk tiplemesi kök-daldırma aşılaması, istila edilmiş çekirdek tohumlama yöntemi ve dört karpuz diferansiyelinin her biri ile modifiye tepsi-daldırma yöntemi ile gerçekleştirildi (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). İzolatlara, aşılamadan beş hafta sonra hastalık insidansının hesaplanmasıyla bir ırk tanımı atanır. Belirli bir çeşit için bitkilerin% 33'ünden azı semptomatik ise, dirençli olarak kategorize edildiler. İnsidansı% 33'ten fazla olan çeşitler duyarlı olarak kabul edildi. Bu yazıda ırkı saptamak için üç farklı aşılama yöntemi, kök daldırma, istila edilmiş çekirdek ve modifiye tepsi-daldırma aşılaması, uygulamaları deneysel tasarıma göre değişmektedir.

Introduction

Fusarium oxysporum tür kompleksini (FOSC) oluşturan toprak kaynaklı mantarlar, çeşitli ürünlerde ciddi hastalıklara ve verim kaybına neden olabilen etkili hemibiyotrofik bitki patojenleridir1. F. oxysporum f. sp. niveum'un (Fon) neden olduğu karpuzun Fusarium solgunluğu, son birkaç on yılda dünya çapında kapsam, insidans ve şiddet bakımından artmaktadır 2,3. Fidelerde, Fusarium solgunluğunun belirtileri genellikle sönümlenmeye benzer. Eski bitkilerde, yeşillik gri, klorotik ve nekrotik hale gelir. Sonunda, bitkilerin solması tam bitki çöküşüne ve ölümüne kadar ilerler4. Doğrudan verim kaybı, semptomlar ve bitki ölümü nedeniyle meydana gelirken, yaprak gölgeliğinin ortadan kaldırılmasından kaynaklanan güneş hasarı nedeniyle dolaylı verim kaybı meydana gelebilir5. F. oxysporum'da cinsel üreme ve ilişkili üreme yapıları hiç gözlenmemiştir. Bununla birlikte, patojen iki tip aseksüel spor, mikro ve makrokonidi ve ayrıca toprakta uzun yıllar hayatta kalabilen klamidosporlar adı verilen daha büyük, uzun süreli hayatta kalma yapıları üretir6.

FOSC, gözlemlenen konakçı aralıklarına göre formae spesiyaliteleri olarak sınıflandırılır, genellikle bir veya birkaç konakçı türü1 ile sınırlıdır. Son zamanlarda yapılan araştırmalar, bu tür kompleksinin 15 farklı türün bir bileşimi olabileceğini göstermesine rağmen, karpuzu enfekte eden belirli türler şu anda bilinmemektedir7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), sadece Citrullus lanatus'u veya evcil karpuz 8,9'u enfekte eden suşların adıdır. Çoğu patojenik formae özelindeki F. oxysporum suşları, genetik bileşenleri ve konakçı bir türe karşı virülansı açısından belirli seviyelerde çeşitlilik gösterir. Örneğin, bir suş bir konağın tüm çeşitlerini enfekte edebilirken, bir diğeri sadece daha duyarlı çeşitleri enfekte edebilir. Bu tür varyasyonları açıklamak için, bu gruplar gayri resmi olarak evrimsel ilişkilere veya ortak fenotipik özelliklere dayanan ırklara ayrılır. Fon içinde, dört ırk (0, 1, 2 ve 3), bir dizi seçilmiş karpuz çeşidine karşı patojenitelerine dayanarak karakterize edilmiştir ve son zamanlarda10. sırada meydana gelen yarış 3'ün keşfi yapılmıştır.

Bu belirgin çeşitliliğe rağmen, sporların veya hiflerin morfolojileri Fon ırklarının ırkları arasında ayırt edilemez, bu da bir izolatın benzersiz ırkını tanımlamak için moleküler veya fenotipik testlerin gerekli olduğu anlamına gelir11. Moleküler araştırmalar bazı genetik farklılıklar tespit etmiştir. Örneğin, Ksilem (SIX) efektörlerinde salgılanan rolü, F. oxysporum'da yıllardır çalışılmıştır ve bu efektörlerin bazıları, yatay gen transferi12 sırasında değiştirilen kromozomlar üzerinde yer almaktadır. Örneğin, SIX6 Fon yarışları 0 ve 1'de bulunur, ancak yarış 213'te bulunmaz. ALTI efektör, sırasıyla 14,15,16,17 domates ve muzda Fusarium solgunluğuna neden olan F. oxysporum f. sp. lycopersici ve F. oxysporum f. sp. cubense'nin patojenitesinde rol oynamıştır. Ispanak üzerindeki Fusarium solgunluk patojeni olan F. oxysporum f. sp. spiniciae'nin suşları arasında SIX efektör profillerinin analizi, genetik ve fenotipik çeşitliliği doğru bir şekilde yansıtan sınıflandırmayı mümkün kılmıştır18. Bununla birlikte, Fon ırklarının virülans mekanizmaları arasındaki farklar şu anda tam olarak anlaşılamamıştır ve kullanımları üzerine geliştirilen moleküler analizler tutarsız ve yanlış sonuçlar göstermiştir19. Bu nedenle, enfeksiyon tahlillerinden elde edilen fenotipik sonuçlar şu anda izolatları sınıflandırmanın en iyi yoludur.

F. oxysporum başlangıçta konakçıları ksilem20'ye çıkmadan önce köklerden enfekte eder. Bu, belirli bir konakçı çeşidin köklerinin doğrudan aşılanmasını ırk tiplemesi yapmak için etkili bir yol haline getirir ve kök daldırma ve tepsi daldırma aşılama yöntemlerinin temelidir21. Bir konağı enfekte etmediğinde, F. oxysporum toprakta bulunur ve yıllarca uykuda kalabilir. Toprakta bir ilgi alanından duyarlı karpuz çeşitlerinin yetiştirilmesi, Fon varlığını test etmenin bir yoludur. Bu yöntemi, kasıtlı olarak Fon ile istila edilen toprakta bilinen farklı direnç seviyelerine sahip çeşitleri içerecek şekilde genişletmek, ırk tiplemesi yapmak için de iyi bir yoldur (Tablo 1) ve istila edilmiş çekirdek tohumlama yönteminin temelidir. Modifiye edilmiş tepsi daldırma yöntemi, birçok bitkinin ve tarla izolatının hızlı bir şekilde araştırılabildiği yüksek verimli bir yarış tiplemesine izin veren orijinal tepsi daldırma yönteminin bir varyasyonudur22. Hızlı ve başarılı bir ırk tipleme biyotahlilinin önemli faktörleri arasında, farklı patojen ırklarına karşı dirençteki farklılıkları belgeleyen çeşitlerin kullanılması, inokulumun enfeksiyon sırasında hem biyolojik olarak aktif hem de bol miktarda olmasını sağlamak, hem patojen hem de konakçı için elverişli bir ortamı korumak ve hastalığın şiddeti veya insidansı için tutarlı bir derecelendirme sistemi kullanmak sayılabilir. Bu yazıda yukarıda açıklanan ilkelere dayanarak fenotipik ırk tiplemesi için kök-dip23,24, istila edilmiş çekirdek tohumlama 25,26 ve modifiye tepsi-daldırma 22 yöntemleri açıklanmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kök daldırma yöntemi (RDM) ile ırkın belirlenmesi

  1. Deney ortamının hazırlanması
    1. Semptom ifadesi çevresel koşullara büyük ölçüde bağlı olduğundan, bitkileri kontrollü bir alanda tutun. Bağıl nemi, sıcaklığı, fotoperiyodu ve ışık yoğunluğunu izleyin (Şekil 1).
      1. Sıcaklığı 26-28 ° C'ye, bağıl nemi% 50-75'e ayarlayın ve yeterli bitki büyümesini ve sağlığını sağlamak için 16 saatlik bir fotoperiyot ayarlayın.
        NOT: Hipoksi, fide solması ve / veya tohum çürümesini önlemek için, aşırı su içmeyin veya fidelerin etrafında duran suya izin vermeyin.
      2. Fotosentetik büyümeyi desteklemek için her biri en az 1850 Lümen ışığa ve ışık bankası başına 2.800 K renk sıcaklığına sahip iki floresan tüp ışık kullanın.
      3. Alanı temiz tutun ve haşere hasarını ve tesadüfi enfeksiyonu önlemek için atık toprağın ve bitki kalıntılarının giderilmesi de dahil olmak üzere hijyenik uygulamalar kullanın.
    2. Dikim koşulları
      1. 8 x 16 hücreli (25 cm genişlik x 50 cm uzunluk) başlangıç düzlüklerini dikim ortamıyla doldurun ve toprağı hafifçe sıkıştırmak için aşağı dokunun (Şekil 2).
      2. Dört farklı çeşidin tohumlarını elde edin: Siyah Elmas / Şeker Bebek, Charleston Grisi / Allsweet / Dixielee, Calhoun Grisi ve PI-296341-FR.
      3. Tohumları, tepeleri (sivri uçlu) yukarı doğru uzunluklarına eşit bir derinliğe işaret edecek şekilde ekin. Tohumlar ekildikten sonra, gömülü tohumları içeren ortamı% 100 Fuller's Earth veya 0.3175-0.635 cm derinliğe alternatif başka bir bentonit kil ile örtün.
      4. Ayakta duran veya biriken su oluşturmadan ortamı nemlendirmek için daireleri buğulayın. Daha sonra, her 180 dakikada bir 20 sn buğulanarak veya yaklaşık 5 gün boyunca tohum çimlenene kadar günde bir kez elle sulayarak medyayı nemli tutun. Çimlenmeden sonra, günde bir kez ve fidelerin büyümesini desteklemek için gerektiği gibi sulayın.
    3. Medya hazırlama
      NOT: Her iki ortam da, yüzeyi kazıyarak spor hasadını sağlamak için ekstra granül agar ile sağlam hale getirilmiştir.
      1. Arıtılmış V8 suyu ortamı (V8)
        1. % 1 CaCO3 ila 400 mL damıtılmış su ile 100 mL arıtılmış V8 orijinal% 100 sebze suyu ekleyerek 500 mL arıtılmış V8 suyu ortamı (V8)27 hazırlayın.
        2. 7.5 g granül agar ekleyin.
        3. Malzemeleri iyice karıştırın, otoklav yapın ve steril Petri kaplarına dökmeden önce 50 ° C'ye kadar soğumaya bırakın.
      2. Çeyrek mukavemetli patates dekstroz agar ortamı (qPDA)
        1. 500 mL damıtılmış suya 4.5 g granül agar ekleyerek qPDA ortamını hazırlayın, 3.8 g patates dekstroz agar ekleyin.
        2. Malzemeleri iyice karıştırın, otoklav yapın ve steril Petri kaplarına 12-15 mL dökmeden önce 50 ° C'ye kadar soğumaya bırakın.
  2. Deneysel tedavilerin hazırlanması
    1. İnokulumu hazırlayın.
      1. Dikim sonrası beş gün (dpp), tercih edilen F. oxysporum izolatını içeren sızmış kağıt diskleri (1-1.25 cm çapında) bir V8 ve bir qPDA plakasına yerleştirin ve bunları sekiz gün boyunca bir inkübatörde (~ 28 ° C) saklayın28 (Şekil 3A).
      2. Mantar büyümesinin sekizinci gününde ve aşılamadan önceki gün (bakınız bölüm 1.3.2), V8 ve qPDA plakalarını inkübatörden bir biyogüvenlik kabinine aktarın.
      3. Her bir izolat için, her V8 ve qPDA kültür plakasına 6 mL sterilize deiyonize su dağıtın.
      4. Orta yüzey boyunca steril bir hücre yayıcıyı kazıyarak konidiayı yerinden çıkarın (Şekil 3B). Sıvı konidiyal süspansiyonu havuza alın ve steril 50 mL kültür tüpüne aktarın (Şekil 3C).
      5. 50 mL kültür tüpündeki toplam sıvı konidiyal süspansiyon hacmi yaklaşık 12 mL olana kadar bu işlemi tekrarlayın.
      6. Başka bir izolata geçmeden önce, çalışma alanını ve hücre yayıcıyı alkolle yüzeyden sterilize edin. Hücre yayıcıyı% ≥70 etanol içine batırdıktan sonra bir Bunsen brülöründen geçirerek sterilize edin.
      7. Sıvı konidiyal süspansiyonlar tüm izolatlar için kültür tüplerine aktarıldıktan sonra, spor sayılarını sayın. İlk olarak, bireysel bir 50 mL kültür tüpünü vorteksleyin ve bir hemasitometrenin her odasına 10 μL dağıtın. Ardından, daha önce tarif edildiği gibi hemasitometredeki spor sayısını hesaplayın29.
      8. Hesaplanan hacmi 106 +% 10 oranında başka bir steril kültür tüpüne aktararak nihai inokülum çözeltisini hazırlayın ve steril deiyonize su ekleyerek toplam hacmi 30 mL'ye getirin.
      9. Bu kültür tüplerini gece boyunca 8 ± 1 °C'de saklayın.
        NOT: Bu, yayınlanmamış verilerle belirtildiği gibi, konidiyal canlılık kaybı olmadan yapılabilir.
  3. Aşı
    1. Aşılamayı hazırlayın.
      1. Aşılama gününden önce, on üç günlük fideleri toprak taşıma kapasitesine sağlam bir şekilde sulayın.
      2. Kazıkları, test edilecek izolat, karpuz çeşidi ve aşılama tarihi de dahil olmak üzere ilgili bilgilerle önceden etiketleyin.
      3. Aşılanmış bitkileri almak için daha önce% 10 ağartıcı ile sterilize edilmiş ve iyi durulanmış 6 x 12 hücreli (20 cm genişlik x 40 cm uzunlukta) strafor düzlükleri yerleştirin.
      4. Gerekli tüm malzemeleri edat ( bkz.
    2. Bitki köklerini aşılayın.
      1. Aşılamaya başlamadan birkaç saat önce bitkileri sağlam bir şekilde sulayın. Sulamadan en az 2 saat sonra, plantletleri 8 x 16 hücreli strafor düzlüklerinden çıkarın ve yapışan dikim malzemesi partiküllerini çıkarmak için köklerini durulayın.
      2. Durulanmış bitkileri, kullanana kadar musluk suyuyla temiz kaplarda geçici olarak saklayın ve çeşitleri birbirinden ayrı tutun (Şekil 4A). Plantletleri altı kişilik gruplara ayırın ve kurumasını önlemek için fide gruplarını bir laboratuvar tepsisinde ıslak kağıt havlulara sarılmış halde tutun.
      3. 6 x 12 dizili strafor tepsinin her hücresinin dibine25-30 cm3 toprak yerleştirin ve toprağı gözle görülür şekilde nemli olana kadar ıslatmak için bir fışkırtma şişesi kullanın.
      4. Bitkileri aşılayın ve çeşitlere göre sırayla tekrar ekin, böylece Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey ve daha sonra PI 296341 01 FR soldan sağa ekilir.
      5. Sağlıklı kontrolden başlayarak, aynı çeşitte altı hasarsız fideden oluşan bir grubu, inokulumu içeren 50 mL tüplere yerleştirin. Sağlıklı kontrol durumunda, spor süspansiyonu yerine musluk suyu kullanın. Bitkileri en son pozitif kontrol (Fon ırkı 3) ile aşılayın.
      6. Tüpün içine girdikten sonra, bitki köklerinin inokuluma (musluk suyu) ulaştığından ve maruz kaldığından emin olun.
      7. Plantlet kökleri olan tüpleri 30 s boyunca suya batırılmış olarak vorteksleyin (Şekil 4B). Vorteksten sonra, 6 x 12 strafor düzlüğüne hücre başına tek bir plantlet yerleştirin. Aynı çeşidin bitkilerini tepsideki aynı sütuna yerleştirin.
      8. Yerleştirildikten sonra, eldivenli elleri 30 saniye boyunca% 0.7 oranında mevcut klor çözeltisi kovalarında tutarak sterilize edin, ardından 1 dakika boyunca musluk suyunda durulayın.
      9. Daha sonra, yerleştirilen plantletleri dikim ortamı ile örtün ve yavaşça ayarlayın. Bir şırınga veya pipet kullanarak, sıçramayı önlerken plantletleri plantlet başına 20 mL ile dikkatlice sulayın.
      10. Bir sonraki bitki setine geçmeden önce, klor çözeltisi ve musluk suyu durulama kullanarak eldivenli elleri tekrar sterilize edin.
      11. Tüm bitki yavruları yeniden ekildikten sonra, inokülum akışını önlemek için onları tekrar minimum düzeyde sulayın.
      12. Bitki yavrularını, ortalama sıcaklığı 27 °C olan kapalı, karanlık bir ortamda gece boyunca tutun. Ertesi gün, bitkileri seraya aktarın ve ortalama sıcaklığı 27 ° C'de tutun.
  4. Aşılanmış bitkilerin bakımı ve bakımı
    1. Fazla suyun taşmasını önlemek için, bitkiler stabilize olana kadar daireleri günde üç kez 4-5 gün boyunca hafifçe sulayın.
    2. Sulamanın yeterli ve eşit bir şekilde kaplanmasını sağlamak için tepsileri en az üç gün boyunca günde 2-3 kez kontrol edin.
    3. Daireleri döndürerek ve/veya gerektiğinde ek gölgelendirme/sulama sağlayarak güneş ışığı veya gölgelenme nedeniyle kurumaktan kaçınınız.
    4. 3 dpp'de, bitkileri litre su başına 3-6 mL oranında 20-20-20 hızlı salınımlı bir gübre (10 g / 3.78 L) ile gübreleyin.
    5. 3-4 hafta boyunca haftalık olarak gübreleyin.
    6. Bu adım boyunca aynı aydınlatma ve çevre koşullarını koruyun.

2. Infested çekirdek yöntemi (IKM) ile ırkın belirlenmesi

  1. Çekirdeklerin istilası
    1. İnokulumu hazırlayın.
      1. Depolanmış veya yeni toplanan bir numuneden, bir qPDA plakası üzerinde ilgilenilen bir F. oxysporum f. sp. niveum suşunu, büyümesinin plakanın yarısını kapladığı noktaya kadar izole edin ve kültürleyin.
        NOT: Bu, daha sonraki adımlarda tahılın önemli ölçüde istilası için gerekli olan aktif ve uygulanabilir olduğunu göstermektedir.
    2. Çekirdekleri hazırlayın.
      1. Bir ölçekte, yeterince büyük herhangi bir kapta 200 g çavdar (Secale spp.) meyvelerini (veya Maxie var. buğday (Triticum spp.) çekirdeklerini) ölçün ve bunları bir veya daha fazla 1 L cam Erlenmeyer şişesine dökün. En az 5 cm'ye kadar olan taneleri tamamen örtmek için şişelere steril musluk suyu ekleyin (Şekil 5A).
      2. Çekirdekleri 2 saat boyunca oda sıcaklığında (~ 24 °C) bekletin. Suyu şişelerden boşaltın; açıklığı tülbentle sarılmış bir parça pamuklu rulo ile takın; ve açıklığı alüminyum folyo sargı ile örtün (Şekil 5B).
    3. Çekirdekleri dekontamine edin. Tahıl suyu emdikten sonra, aşılamadan önce diğer istenmeyen mikropları öldürmek için iki farklı şekilde iki kez otoklav yapın.
      1. İlk defa, hazırlanan şişelerdeki tahılı yerçekimi döngüsünde (121.2 °C, 1.06 kg /cm2) 5 dakikalık kuruma süresi ile 1 saat boyunca otoklav yapın. Şişelerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
      2. İkinci kez otoklavlamadan önce, taneleri 0,5 μm filtreli küçük bir mantar yetiştirme torbasına aktarın. Havayı torbadan çıkarın ve ardından fazla plastiği torbanın etrafına katlayın.
      3. Torbayı plastik, otoklav güvenli bir kutuya yerleştirin. Kutuyu alüminyum folyo sargı ile örtün (Şekil 5C).
        NOT: Torbalardaki taneleri otoklavlarken metal bir kutu kullanmayın, çünkü bu torbaların erimesine neden olabilir.
      4. Kutuyu yerçekimi döngüsünde 5 dakikalık kuruma süresiyle 1 saat boyunca otoklavlayın, daha önce olduğu gibi aynı döngü.
        NOT: Torbalar iki kez otoklavlanırsa filtre ve bağlantı noktası tehlikeye girebileceğinden, torbayı ilki değil, yalnızca ikinci kez otoklav yapın. Torbaları otoklavdan çıkarmadan önce yavaşça ve tamamen soğumasını sağlayarak filtre üzerinde yoğuşmayı önleyin, çünkü büyüme torbası filtresi ıslanırsa tehlikeye girer.
    4. Çekirdekleri aşılayın.
      1. Kültür plakası ve torba ile bir biyogüvenlik kabininde çalışarak, steril #4 boyutlu mantar deliği ile kültür plakası üzerindeki aktif büyüme bölgesinden 6 mm çapında agar diskleri kesin. Çantayı açın. Sıkı bir steril teknik kullanarak, torbaya 5 agar diski yerleştirin. 35 mL steril musluk suyunu ölçmek ve torbaya eklemek için steril 50 mL dereceli bir silindir kullanın.
      2. Torbanın açıklığını biraz yuvarlayın ve ardından yüzeyi sterilize etmek için dışarıya% 70 etanol püskürtün.
        NOT: Filtreyi püskürtmeyin, çünkü nem de onu tehlikeye atacaktır.
      3. Köşeleri merkeze doğru katlayarak ve ardından filtrenin üzerinde iki kez katlayarak torbayı kapatın. Torbayı, torba kelepçeleri ve üretici tarafından sağlanan şeffaf vinil borularla sabitleyin.
        NOT: Kelepçeler yeniden kullanılabilir.
      4. Torbayı biyogüvenlik kabininden çıkarın.
    5. Büyüme için patojeni saklayın.
      1. Çantayı dik saklayın. Maksimum gaz değişimini sağlamak için filtrenin torbanın karşı tarafından çekildiğinden emin olun (Şekil 5D).
      2. Malzemeleri yaklaşık üç hafta boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Patojenin eşit büyümesini sağlamak için tahılları düzenli olarak yeniden dağıtın.
        NOT: Torbalar tekrar kullanılamaz.
  2. Karpuz fidelerinin istila edilmiş tahıl ile enfeksiyonu
    1. Daha önce tarif edildiği gibi kaynak karpuz tohumları.
    2. Deney gruplarını belirler.
      NOT: Gerekli patojenin tek suşu (suşları), ırk tanımlaması için test edilen izolatlardır. Bununla birlikte, negatif ve pozitif kontroller, enfeksiyonu olmayan veya belirli bir enfeksiyon seviyesi olmayan bitkilerle karşılaştırmalar yapmaya yardımcı olacaktır.
      1. Negatif bir kontrol hazırlamak için, daha önce belirtilen yönteme göre sterilize edilmiş, ancak aşılama yapılmamış buğday taneleri kullanın.
      2. Pozitif bir kontrol hazırlamak için, bilinmeyen izolatla karşılaştırmak için önceden sınıflandırılmış bir gerinimle aşılanmış buğday taneleri kullanın.
    3. Toprak ve tahılı birleştirin.
      1. 14 tanecik istila edilmiş çekirdeği büyük bir plastik torbaya ölçün (Şekil 5E). Gerekli karışım miktarını ölçmek için plastik saksıları (15 cm çap x 10 cm yüksekliğinde) saksı karışımı ile doldurun. Karışımı torbaya boşaltın. Torbada bir hava yastığı oluşturun ve kapatarak bükün veya kapatın.
      2. Torbayı birkaç kez ters çevirerek çekirdekleri ve toprağı karıştırın. Negatif bir kontrol için, aynı işlemi temiz çekirdeklere sahip farklı bir torbada gerçekleştirin. Pozitif bir kontrol için, aynı işlemi karşılaştırma suşu ile istila edilmiş çekirdeklerle farklı bir torbada gerçekleştirin.
      3. Dört yüzey sterilize edilmiş tencereyi istila edilmiş toprak karışımı ile doldurun. Negatif bir kontrol için, Fon ile kirlenmiş herhangi bir toprağı işlemeden önce bu karışımı saksılayın.
    4. Karpuz tohumlarını ekin.
      1. Her tencereye altı tohum ekin. Her tencerenin sadece bir çeşitten tohum içerdiğinden emin olun. Tohumları, ortaya çıkma sırasında uygun büyümeye izin vermek için tohumun tepe ucu yukarı bakacak şekilde konumlandırın (Şekil 6A).
      2. Bir sprey şişesi kullanarak, üst 0.3-0.6 cm toprağı suyla ıslatın. Tohum çimlenmesi için nemli bir ortam oluşturmak üzere her kabın altına ve üzerine şeffaf bir plastik tabak (15 cm çapında) yerleştirin (Şekil 6B).
    5. Büyüme koşullarını oluşturun.
      1. Tohumlar çimlenene kadar (yaklaşık 5 gün) akmadan bulanıklığı korumak için saksıları günde üç kez bir sprey şişesiyle sulayın.
        NOT: Kullanılan su miktarı bitki büyüklüğü ve saksı büyüklüğü ile artacaktır.
      2. Tohumlar çimlendikten sonra, üst tabağı tencerenin alt tarafına taşıyın.
      3. Optimum bitki büyümesi için bitkileri günlük olarak gerektiği gibi sulayın. Bitkileri, daha önce tarif edilenlere benzer aydınlatma koşulları ve 27 ° C (± 1 ° C) sıcaklık altında 16 saatlik bir fotoperiyoda maruz bırakın.

3. Modifiye tepsi daldırma yöntemi (MTDM) ile ırkın belirlenmesi

  1. Aşılamalar için malzemelerin hazırlanması
    1. Dikim koşullarını oluşturun.
      1. 48 hücreli (3,68 cm genişlik x 5,98 cm uzunluk x 4,69 cm derinlik) kesici uçları buharla pastörize kumla doldurun: turba: vermikülit (4:1:1) ve toprağı hafifçe sıkıştırmak için aşağı dokunun. Kesici uçları plastik tepsilere yerleştirin (27,9 cm genişlik x 53,3 cm uzunluk x 5,1 cm derinlik).
      2. Tohumları, tepeleri (proksimal uç) yukarı doğru uzunluklarına eşit bir derinliğe bakacak şekilde ekin.
      3. Tohumları daha önce açıklandığı gibi kaynaklayın.
      4. Daha sonra, her 180 dakikada bir 20 sn buğulanarak veya günde bir kez elle sulayarak medyayı nemli tutun.
      5. Çimlenmeden sonra (yaklaşık 5 gün), günde bir kez ve fidelerin büyümesini desteklemek için gerektiğinde su.
    2. Medyayı hazırlayın.
      1. 500 mL damıtılmış suya 5.625 g granül agar ekleyerek qPDA ortamını hazırlayın; 4.875 g patates dekstroz agar ekleyin. Malzemeleri iyice karıştırın, otoklav yapın ve steril Petri kaplarına dökmeden önce 50 ° C'ye kadar soğutun. Petri bulaşıklarını parafilm ile kapatın ve tabakları kullanana kadar buzdolabında (4 ° C) saklayın.
      2. Et suyu ortamı hazırlamak için, tartın ve 1 L'lik bir şişeye 24 g patates dekstrozu ekleyin. Şişeye damıtılmış su ekleyerek karışımı 1000 mL'ye getirin ve şişeyi sıcak bir tabağa yerleştirin ve eriyene kadar karıştırın. 100 mL et suyunu 250 mL Erlenmeyer şişelerine dağıtın. Şişeleri ve otoklavı kapatmak için tülbent kullanın.
    3. İnokulumu hazırlayın.
      1. Ekimden yedi gün önce, beş qPDA plakasını sızmış kağıt28 ile aşılayın ve bunları 14 saat / 10 saat karanlık döngü22'de sekiz gün boyunca inkübe edilmiş bir alanda saklayın.
      2. Yedinci günde, 100 mL patates dekstrozu içeren her250 mL Erlenmeyer şişesine iki adet 1 cm2 agar fişi aktarın. Erlenmeyer şişelerini 14 saat / 10 saat açık / karanlık döngüsünde 7 gün boyunca 200 rpm'de bir tezgah üstü çalkalayıcıya yerleştirin.
      3. Aşılama gününde (ekimden 14 gün sonra), inokulumu dört kat steril tülbentten geçirerek sporları toplayın.
      4. Daha önce tarif edildiği gibi bir hemositometre kullanarak şişelerdeki mikrokonidiyal konsantrasyonu belirleyin. 1 × 10 6 mL−1 nihai spor konsantrasyonu için doğru hacimdeki spor süspansiyonunu steril suya aktararak plastik bir küvette (40,6 cm genişlik x 67,3 cm uzunluk x16,8 cm derinlik) 7 L'lik bir inokülum süspansiyonu hazırlayın (Şekil 7A).
  2. Aşı
    1. Ekimden on dört gün sonra (en azından ilk gerçek yaprak aşaması), hücre eklerini fidelerle birlikte perdeli tepsilere (26,9 cm genişlik x 53,7 cm uzunluk x 6,28 cm derinlik) aktarın. Perdeli tepsileri fidelerle birlikte 7 L inokulum süspansiyonunu içeren plastik bir küvete yavaşça yerleştirin. Her tepsiyi birer birer aşılayın (Şekil 7B).
    2. Fidelerin 15 dakika boyunca rahatsız edilmeden inokülumda kalmasına izin verin. 15 dakika sonra, aşılanmış fideleri içeren hücre eklerini nazikçe deliksiz tepsilere (27,9 cm genişlik x 53,3 cm uzunluk x 5,1 cm derinlik) aktarın. Bu işlemi her tepsi için tekrarlayın.
    3. Deliksiz tepsileri sera tezgahına yerleştirin ve gerektiğinde sulayın. Kök daldırma biyotahlili için tarif edilenle aynı aydınlatma ve çevre koşullarını koruyun.

4. Hastalık derecesi

  1. Derecelendirme için zaman aralıklarını seçin.
    1. Kök daldırma ve modifiye tepsi daldırma yöntemleri için, plantletler aşılandıktan bir hafta sonra derecelendirmeye başlayın ve dört hafta daha haftalık olarak devam edin.
      NOT: Birleşik veri kümesi, bu süre zarfında beş gözlem kümesi içerecektir.
    2. Çekirdek yöntemini kullanırken, yalnızca fideler ortaya çıktığında derecelendirmelere başlayın ve toplam altı derecelendirme için haftalık olarak devam edin.
  2. İnsidansı gözlemleyin ve hesaplayın.
    1. Her derecelendirme sırasında, hastalığın ilerlemesini belgelemek için dijital görüntüler alın.
    2. Solgunluk ve bitki ölümü insidansını bildirin. Sağlıklı kontrole kıyasla semptomatik bitkilerin toplamını ve ölü bitki sayısını bu türdeki toplam bitki sayısına oranla alarak insidansı hesaplayın.
  3. Sonuçları analiz edin. Kontroller kullanılıyorsa çeşitler arasındaki ve deney grupları arasındaki enfeksiyon paternlerini karşılaştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu deneyler, yaygın olarak yetiştirilen çeşitlerin göreceli direncini tanımlamaya yardımcı olur (Tablo 1). Bu bilgiler daha sonra yerel Fon popülasyonlarına dayalı yönetim önerilerine rehberlik etmek için kullanılabilir. Başka bir deyişle, 0 veya 1 ırkının ticari bir alanda mevcut olduğu biliniyorsa, çiftçi Calhoun Grisi, Güneş Şekeri veya eşdeğeri gibi "dirençli" bir çeşit yetiştirmeye meyilli olabilir. Tüm yöntemleri kullanan biyotahlillerin sonuçları, fidelere Irk 1 izolatı ile enfekte olduğunda, Kara Elmas ve Charleston Grisi çeşitlerinin öldüğünü veya ciddi semptomlar gösterdiğini, Calhoun Grisi ve PI çeşitlerinin direnç gösterdiğini göstermektedir (Tablo 2 ve Şekil 8A).

Tüm yöntemler, fidelere bir Irk 3 izolatı bulaştığında, tüm çeşitlerden neredeyse tüm bitkilerin öldüğünü veya ciddi semptomlar gösterdiğini göstermiştir (Şekil 8B). Bu sonuçlar, her iki aşılama yöntemini kullanan biyotahlillerin Fon ırkları arasında nasıl başarılı bir şekilde ayrım yaptığını göstermektedir. Hastalıklı bitkilerin görünümü tüm yöntemler için aynı olmalıdır. Tek fark, çeşitlerin mekansal olarak nasıl gruplandırıldığıdır. Kök-daldırma ve modifiye dray-daldırma yöntemleri için çeşitler tepsinin sütunlarına göre düzenlenirken, çekirdek yönteminde çeşitler kendi kaplarında gruplandırılacaktır.

Figure 1
Şekil 1: RDM için deney alanı. Bağıl nem, sıcaklık, fotoperiyot ve ışık yoğunluğu gibi çevresel koşullara büyük ölçüde bağlı olan semptom değişkenliği nedeniyle, düzenlenmiş bir deney alanının korunması önemlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Başlangıç dairelerinin RDM için hazırlanması. 8 x 16 hücreli (25 cm genişlik x 50 cm uzunlukta) başlangıç düzlüklerini dikim ortamıyla doldurun ve toprağı hafifçe sıkıştırmak için aşağı dokunun. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: RDM için konidiyal süspansiyonun hazırlanması. (A) İzolasyon ve kültürleme. Depolanmış veya yeni toplanan bir numuneden, bir f. oxysporum f. sp. niveum suşunu, büyümesinin plakanın yarısını kapladığı noktaya kadar bir qPDA plakası üzerinde ilgilendiren bir F. oxysporum f. sp. niveum suşunu izole edin ve kültürleyin. Bu, daha sonraki adımlarda tahılın önemli ölçüde istilası için gerekli olan aktif ve uygulanabilir olduğunu göstermektedir. (B) Yerinden Çıkarma Conidia. Orta yüzey boyunca steril bir hücre yayıcıyı kazıyarak konidiayı yerinden çıkarın. (C) Süspansiyon biriktirme. Sıvı konidia süspansiyonunu havuzlayın ve steril bir 50 mL kültür tüpüne aktarın. Kısaltma: qPDA = dörtte bir mukavemetli patates dekstroz agar ortamı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: RDM için fidelerin organizasyonu ve girdabı . (A) Çeşitlerin ayrılması. Durulanmış bitkileri, çeşitleri ayrı tutarak, kullanıma kadar musluk suyuyla temiz kaplarda geçici olarak saklayın. (B) Fidelerin girdabı. 6 x 12 strafor düzlüklerinde hücre başına tek bir plantlet dikmek için 30 s suya batırılmış plantlet köklerine sahip tüpleri vorteksleyin. Aynı çeşitteki bitkiler tepsideki aynı sütuna yerleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: IKM için çekirdeklerin hazırlanması ve istilası . (A) Çavdar meyvelerinin emzirilmesi. Bir ölçekte, yeterince büyük herhangi bir kapta 200 g çavdar (Secale spp.) meyvelerini (veya Maxie var. buğday (Triticum spp.) çekirdeklerini) ölçün ve bunları bir veya daha fazla 1 L cam Erlenmeyer şişesine dökün. En az 5 cm'ye kadar olan taneleri tamamen örtmek için şişelere steril musluk suyu ekleyin. (B) Şişelerin boşaltılması. Şişelerdeki suyu boşaltın, açıklığı tülbentle sarılmış bir parça pamuklu rulo ile takın ve açıklığı alüminyum folyo sargı ile örtün. (C) Otoklav ayarı. Torbayı plastik, otoklav güvenli bir kutuya yerleştirin. Torbalardaki taneleri otoklavlarken metal bir kutu kullanmayın, çünkü bu torbaların erimesine neden olabilir. Kutuyu alüminyum folyo sargı ile örtün. (D) Torbaların depolanması. Çantayı dik saklayın. Maksimum gaz değişimini sağlamak için filtrenin torbanın karşı tarafından çekildiğinden emin olun. (E) 14 tanecik istila edilmiş çekirdeği büyük bir plastik torbaya ölçün. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Resim 6: Karpuz tohumlarının ekimi ve çimlenmesi. (A) Saksılara çeşit tohumları ekmek. Her tencereye altı tohum ekin. Her tencerenin sadece bir çeşitten tohum içerdiğinden emin olun. Tohumları, ortaya çıkma sırasında uygun büyümeye izin vermek için tohumun tepe ucu yukarı bakacak şekilde konumlandırın. (B) Tohum çimlenmesi. Bir sprey şişesi kullanarak, üst 0.3-0.6 cm toprağı suyla ıslatın. Tohum çimlenmesi için nemli bir ortam oluşturmak üzere her bir tencerenin altına ve üzerine şeffaf bir plastik tabak (15 cm çapında) yerleştirin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: MTDM için inokülum hazırlama ve fide aşılaması. (A) İnokulumun hazırlanması. Daha önce tarif edildiği gibi bir hemositometre kullanarak şişelerdeki mikrokonidiyal konsantrasyonu belirleyin. 1 × 10 6 mL−1'lik son bir spor konsantrasyonu için doğru spor süspansiyon hacmini steril suya aktararak plastik bir küvette (40,6 cm genişlik × 67,3 cm uzunluk ×16,8 cm derinlik) 7 L'lik bir inokülum süspansiyonu hazırlayın. (B) Fidelerin aşılanması. Ekimden on dört gün sonra (en azından ilk gerçek yaprak aşaması), fidelerle birlikte hücre eklerini perdeli tepsilere aktarın (26.9 cm genişlik × 53.7 cm uzunluk × 6.28 cm derinlik). Perdeli tepsileri fidelerle birlikte 7 L inokulum süspansiyonunu içeren plastik bir küvete yavaşça yerleştirin. Her tepsiyi birer birer aşılayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Irk tanımlama yöntemlerinin fenotipik sonuçları. (A) Yarış 1 sonuçları. (A) tüm yöntemleri kullanan biyotahlillerin sonuçları, fidelere Irk 1 izolatı ile enfekte olduğunda, Kara Elmas ve Charleston Grisi çeşitlerinin öldüğünü veya ciddi semptomlar gösterdiğini, Calhoun Grisi ve PI çeşitlerinin ise direnç gösterdiğini göstermektedir. (B) Yarış 3 sonuçları. Tüm yöntemler, fidelere bir Irk 3 izolatı bulaştığında, tüm çeşitlerden neredeyse tüm bitkilerin öldüğünü veya ciddi semptomlar gösterdiğini gösterdi. (Hastalıklı bitkilerin görünümü tüm yöntemler için aynı olmalıdır. Oklarla gösterilen dikim sırası (soldan sağa): Siyah Elmas (mavi ok), Charleston Grisi (mor ok), Calhoun Grisi (kahverengi ok), Bitki Tanıtımı 296341-FR (yeşil ok). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Çeşit Yarış 0 Yarış 1 Yarış 2 Yarış 3
Şeker Bebek, Siyah Elmas S S S S
Charleston Gri, Allsweet, Dixielee R S S S
Calhoun Grisi, Güneş Şekeri R R S S
PI-296341-FR R R R S

Tablo 1: Fusarium oxysporum f. sp. ırkı Niveum. Fusarium oxysporum f. sp. niveum ırkı, bir dizi karpuz diferansiyeline duyarlı veya dirençli reaksiyonlarla belirlenir. Her satırda listelenen çeşitler, bir izolatın ırkının değerlendirilmesi sırasında her bir direnç seviyesini temsil etmek için en çok kullanılanlardır. Bu tablo 4'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: S = duyarlı; R = dayanıklı.

Ayırmak Yöntem BD CH. G Cal G. Pİ Irk
S GİBİ S GİBİ S GİBİ S GİBİ
X Dıp 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X Çekirdek 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X MTD 6 0 6 0 0 6 0 6 1
Y Dıp 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y Çekirdek 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y MTD 6 0 6 0 6 0 6 0 3
S = semptomatik; AS = Asemptomatik

Tablo 2: Irkların tanımlanması. Bu tabloda kullanılan değerler, sağlıklı kontrole kıyasla semptomatik bitkilerin insidansını veya sayısını ve bu türdeki toplam bitki sayısına oranla ölü bitki sayısını yansıtır. Her hücredeki sayılar, gözlem periyodunun sonunda bildirilen insidansı yansıtır. Bir çeşidin, o çeşidin bitkilerinin en az 1/3'ü veya %33'ü semptomatik veya ölü olduğunda duyarlı kabul edilir. Patojenin ırkı daha sonra hangi çeşitlerin duyarlı kabul edildiğine bağlı olarak belirlenir. Başka bir deyişle, patojenin artan dirençle çeşitlere karşı nasıl performans gösterdiği, izolatın ırkını belirler. Bu sonuçlar gerçek bir denemeden değildir ve daha ziyade ırkların bu yöntemlerin sonuçlarından nasıl tanımlandığını ilettiği gösterilmiştir. Kısaltmalar: MTD = modifiye tepsi-damlama yöntemi; BD = Siyah Elmas; CH. G = Charleston Gri; Cal G. = Calhoun Grisi; PI = Bitki Tanıtımı 296341-FR; S = semptomatik; AS = asemptomatik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Irk tiplemenin üç yöntemi sunulmuştur. Bu yöntemlerin her biri, belirli sorular ve deneysel koşullar için en uygun olanıdır. İnfeste edilmiş çekirdek aşılama yöntemi (toprak istilası) belki de daha basit ve daha basittir, bu da onu patojenitenin değerlendirilmesi için özellikle yararlı kılmaktadır30. Basit ırk yazma için bu yöntemi kullanmak oldukça etkilidir. Bununla birlikte, belirli bir çeşidin direncini belirlemek için yöntemi uygulamak, her bitkinin aynı derecede enfeksiyon veya maruz kalma ile karşı karşıya kalmayabileceği ve ilgilenilen çeşitlerin direncini test etmek için eşit derecede yüksek hastalık seviyelerine ihtiyaç duyulabileceği göz önüne alındığında, zor olabilir. Bu böyledir, çünkü bu şekilde üretilen inokulum iyi ölçülmemiştir ve canlı propagüllerin oranı veya kök bölgesine ulaşan enfeksiyöz propagüllerin sayısı iyi düzenlenmemiştir31. Ek olarak, bu yöntem ekilen çekirdeklerin kök bölgesine yakınlığındaki tutarsızlıklarla sınırlıdır. Çok uzaksa, sporlar çimlenmeyebilir veya hifler köklere ulaşmak için yeterince gelişmeyebilir.

Kök-daldırma yöntemi 32,33 daha zahmetli ve zaman alıcıdır; Bununla birlikte, bitki ile etkileşime giren canlı propagules miktarı daha doğru bir şekilde ölçüldüğü için, konakçı direnci daha doğru bir şekilde tanımlanabilir ve direnç taramasını kolaylaştırır. Ayrıca, aynı ırk içindeki virülanstaki farklılıklar daha kolay tespit edilebilir. Bu yöntem, genel olarak, bitkilerin çekirdek yönteminden daha erken ve daha anlamlı bir şekilde semptomatik hale gelmesi gibi ek bir faydaya sahiptir. Konidia yerine inokülum süspansiyonunda klamidosporlar kullanan kök daldırma yönteminin bir varyantı bu faydadan yoksun olabilir6. Benzer şekilde, modifiye edilmiş tepsi daldırma yöntemi22 emek yoğundur, ancak birçok izolatın ve fidenin taranması gerektiğinde yüksek verimli fenotiplemeye izin verir.

Üç yöntem için paylaşılan faktörler arasında çeşit seçimi, yetiştirme koşulları ve hijyen gereksinimleri bulunmaktadır. Ticari olarak neyin mevcut olduğuna bağlı olarak, bazı çeşitler21,34 olarak değiştirilebilir. Sugar Baby ve Black Diamond, ırk 0 izolatlarını belirlemek için kullanılabilirken, Charleston Gray, Allsweet ve Dixielee, ırk 0'a dirençli ancak yarış 1'e duyarlı olarak tanımlanmıştır. Calhoun Grisi ve Güneş Şekeri, 0 ve 1 ırklarına karşı dirençlidir ve 2 ve 3 ırklarına karşı hassastır. Fon hastalığı gelişimi büyük ölçüde sıcaklığa bağlıdır. Deneysel koşulların bu değişkeni kontrol etmesini sağlamaya özen gösterilmelidir. Bir ekim ortamı seçerken, turba yosunu ve / veya alçı içeren ve iyi havalandırmaya izin veren genel ticari karışımlar tatmin edici olmalıdır. Dikim ortamının her iki yöntemde, özellikle kaynak torbadan çapraz kontaminasyonunu önlemek için önlemler alınmalıdır.

Tarif edilen yöntemlerden birini kullandıktan sonra, hastalık doğru ve tutarlı bir şekilde değerlendirilmelidir. Önceki araştırmacılar tipik olarak bitkilerin duyarlı veya dirençli35,36 olarak kategorize edildiği bir eşiğe karar vermişlerdir. Örneğin, belirli bir çeşidin bitkilerinin% 33'ünden azı semptomatik olsaydı, o zaman bu çeşitlilik, çeşidin duyarlı profiline göre tanımlanan izolatla dirençli olarak kategorize edilirdi. Eşik kümesi, araştırmacı ve ele almak istediği soru tarafından tanımlanır. Değerlendiriciler arasındaki değişkenlik ve bitkiler arasındaki aynı puanlayıcı tarafından yaygın olarak bildirilmiştir37,38. Kullanılan tohumun kalitesi, toprak kalitesi, inokulum yoğunluğu, izolatların depolanma yaşı ve puanlayıcı yanlılığı39,40 gibi faktörlerin tümü bu değişkenliğe katkıda bulunur8. Aşılama ve PI çeşidi yanıtlarındaki bu değişkenlik nedeniyle, çoklu deneysel replikasyonlara ihtiyaç vardır; İdeal olarak, çeşitlilik başına çoğaltma başına 6 bitki olmak üzere en az üç ancak beş çoğaltma önerilir.

Fon izolatları 41,42,43'ü tespit etmek için moleküler testler geliştirilmiş olsa da, F. oxysporum'un polifiletik doğası ve 44,45,46 tür kompleksinin coğrafi ve genomik değişkenliği nedeniyle sonuçlar tutarlı olmamıştır. Ayrıca, önceki araştırmalar Salgılanan Ksilem (ALTI) efektörlerinin tam virülansta önemini ortaya koymuş olsa da, Fon izolatlarının ırksal yapısını tanımlayan efektörlerin tam tamamlayıcısı henüz belirlenmemiştir13. Irk için moleküler tanı hala geliştirilmektedir, bunun için bu fenotipik teknikler, Fon ırkı tipleme 19,47'deki doğruluklarını ve faydalarını değerlendirmek için kritik öneme sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Dr. Ali ve Bitki Moleküler Tanı Laboratuvarı'nın yanı sıra liderliği ve desteği Fon programımızın kurulmasına yardımcı olan Georgia Üniversitesi'nden Dr. Pingsheng Ji'ye teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed - Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed - Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed - Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed - PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , University of Cukurova, Ziraat Fakultesi. Antalya, Turkey. 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Keinath, A. Integrated management for Fusarium wilt of watermelon. Land-Grant Press by Clemson Extension, LGP 1022. , Available from: http://lgpress.clemson.edu/publication/integrated-management-for-fusarium-wilt-of-watermelon (2019).
  6. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  7. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  8. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  9. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  10. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  11. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium laboratory manual. , John Wiley & Sons. (2008).
  12. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  13. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  14. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  15. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  16. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  17. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  18. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  19. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  20. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  21. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  22. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  23. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  24. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  25. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  26. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  27. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  28. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  29. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  30. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  31. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. Basic plant pathology methods. , CRC Press. (2017).
  32. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  33. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  34. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  35. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  36. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  37. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  38. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  39. Chiang, K. -S., Bock, C. H., Lee, I. -H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  40. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  41. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  42. Lin, Y. -H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  43. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  44. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  45. O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  46. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  47. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

Tags

Biyoloji Sayı 176
Bilinmeyen <em>Fusarium oxysporum</em> f.sp. Irkını Belirlemek İçin Kullanılan Üç Aşılama Tekniğinin Kontrastı. <em>niveum</em> Yalı -tır
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fulton, J. C., Cullen, M. A.,… More

Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter