Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersøgelse af hjertemetabolisme i det isolerede perfunderede musehjerte med hyperpolariseret [1-13 C] pyruvat og 13C / 31P NMR spektroskopi

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/63188
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

Vi beskriver en eksperimentel opsætning til administration af hyperpolariserede 13C-mærkede metabolitter i kontinuerlig perfusionstilstand til et isoleret perfuseret musehjerte. En dedikeret 13C-NMR-erhvervelsesmetode muliggjorde kvantificering af metabolisk enzymaktivitet i realtid, og en multiparametrisk 31P-NMR-analyse muliggjorde bestemmelse af vævets ATP-indhold og pH.

Abstract

Metabolisme er grundlaget for vigtige processer i cellulært liv. Karakterisering af, hvordan metaboliske netværk fungerer i levende væv, giver afgørende information til forståelse af sygdomsmekanismen og design af behandlinger. I dette arbejde beskriver vi procedurer og metoder til at studere metabolisk aktivitet i cellen i et retrograd perfuseret musehjerte i realtid. Hjertet blev isoleret in situ i forbindelse med hjertestop for at minimere myokardieiskæmi og blev perfuseret inde i et kernemagnetisk resonans (NMR) spektrometer. Mens der var i spektrometeret og under kontinuerlig perfusion, blev hyperpolariseret [1-13 C] pyruvat administreret til hjertet, og de efterfølgende hyperpolariserede [1-13 C] lactat og [13C] bicarbonatproduktionshastigheder tjente til i realtid at bestemme hastighederne for lactat dehydrogenase og pyruvat dehydrogenase produktion. Denne metaboliske aktivitet af hyperpolariseret [1-13C] pyruvat blev kvantificeret med NMR-spektroskopi på en modelfri måde ved hjælp af produktets selektive tilgang til erhvervelse af mættende excitationer. 31 P-spektroskopi blev anvendt mellem de hyperpolariserede erhvervelser for at overvåge hjerteenergetik og pH. Dette system er unikt nyttigt til at studere metabolisk aktivitet i det sunde og syge musehjerte.

Introduction

Ændringer i hjertemetabolisme er forbundet med en række kardiomyopatier og danner ofte grundlaget for de underliggende patofysiologiske mekanismer1. Der er imidlertid mange hindringer for at studere metabolisme i levende væv, da de fleste biokemiske assays kræver homogenisering af vævs- og cellelysen og / eller radioaktiv sporing. Derfor er der et presserende behov for nye værktøjer til at undersøge myokardiemetabolisme i levende væv. Magnetisk resonans (MR) af hyperpolariserede 13C-mærkede substrater muliggør realtidsmålinger af metabolisme i levende væv2 uden brug af ioniserende stråling ved at øge MR-signal-støj-forholdet (SNR) for det eller de mærkede steder med flere størrelsesordener3. Her beskriver vi et eksperimentelt setup, en erhvervelsestilgang og en analytisk tilgang til at studere den hurtige metabolisme i det isolerede musehjerte og parallelt præsentere indikatorer for generel vævsenergi og surhedsgrad. Hjertets pH er en værdifuld indikator, da syre-basebalancen forstyrres i de tidlige stadier af hjertesygdomme og tilstande som myokardieiskæmi, maladaptiv hypertrofi og hjertesvigt6.

Hyperpolariseret [1-13 C] lactat og [13 C] bicarbonatproduktion fra hyperpolariseret [1-13C] pyruvat hjælper med at bestemme produktionshastighederne for lactat dehydrogenase (LDH) og pyruvat dehydrogenase (PDH). De fleste af de tidligere undersøgelser udført ved hjælp af hyperpolariserede substrater i det isolerede gnaverhjerte brugte enten komplekse kinetiske modeller til at udlede den enzymatiske aktivitet af LDH og PDH eller rapporterede signalintensitetsforholdene for det hyperpolariserede produkt til et substrat uden at beregne de faktiske enzymaktivitetshastigheder 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Her brugte vi produktselektiv mættende excitationsmetode 15, som muliggør overvågning af enzymaktiviteten på en modelfri måde15,16. På denne måde blev de absolutte enzymatiske hastigheder (dvs. antallet af mol produkt produceret pr. Tidsenhed) bestemt. 31 P-spektroskopi blev brugt til at observere signalerne fra uorganisk phosphat (Pi), phosphocreatin (PCr) og adenosintrifosfat (ATP). En multiparametrisk analyse blev brugt til at karakterisere hjertets pH-fordeling, som det fremgår af det heterogene kemiske skift i vævets Pi-signal.

Det retrograd perfunderede musehjerte (Langendorff-hjerte)17,18,19 er en ex vivo-model for det intakte bankende hjerte. I denne model bevares hjertets levedygtighed og pH i mindst 80 min20, og det har vist potentiale for genopretning efter en langvarig iskæmisk skade21,22. Ikke desto mindre kan utilsigtet variabilitet under mikrokirurgi føre til variation i vævets levedygtighed på tværs af hjerter. Tidligere undersøgelser har rapporteret om forringelsen af dette hjerte over tid19; For eksempel er der observeret en reduktion i kontraktil funktion på 5% -10% pr. Time18. Adenosintrifosfat (ATP) signalet har tidligere vist sig at rapportere om myokardieens energetiske status og levedygtighed23. Her bemærkede vi, at det perfunderede hjerte lejlighedsvis kan vise utilsigtet variation i levedygtighedsniveauer, som det fremgår af ATP-indholdet, på trods af at vi havde en uafbrudt perfusion og iltforsyning. Vi demonstrerer her, at normalisering af LDH- og PDH-satserne til ATP-indholdet i hjertet reducerer variationen mellem hjertet i disse hastigheder.

I den følgende protokol beskriver vi den kirurgiske procedure, der anvendes til hjertekanylering, isolering og deraf følgende perfusion i NMR-spektrometeret. Det skal bemærkes, at andre kirurgiske tilgange, der sigter mod at isolere og perfusere musehjertet, er blevet beskrevet før24,25.

De metoder, der anvendes til at indsamle data relateret til enzymatiske hastigheder i det bankende hjerte (ved hjælp af 13 C-spektroskopi og hyperpolariseret [1-13C] pyruvat) og hjertets levedygtighed og surhed (ved hjælp af 31P NMR-spektroskopi) beskrives også. Endelig forklares de analytiske metoder til bestemmelse af metaboliske enzymaktiviteter og vævets levedygtighed og surhedsgrad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den fælles etiske komité (IACUC) ved Det Hebraiske Universitet og Hadassah Medical Center godkendte undersøgelsesprotokollen for dyrevelfærd (MD-19-15827-1).

1. Krebs-Henseleit buffer forberedelse

  1. En dag før eksperimentet skal du forberede en modificeret version af Krebs-Henseleit-bufferen (KHB)26. Indledningsvis opløses 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM pyruvat, 1,2 mMMgSO4, 25 mM NaHCO3 og 1,2 mM KH 2 PO4 i dobbeltdestilleret H2O.
  2. Boble denne blanding med 95% / 5% O 2 / CO 2 i 20 minutter, og tilsæt derefter 1,2 mM CaCl2.
  3. Bufferens pH-værdi justeres til 7,4 med HCl eller NaOH.
  4. På forsøgsdagen tilsættes 10 mM glucose og 72 E/L insulin til KHB fremstillet i trin 1.2.
    BEMÆRK: Insulin tilsættes til perfusionsbufferen som beskrevet i Kolwicz et al.26's arbejde og i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der rapporterer, at insulin øger kontraktilfunktionen27 og intensiteten af det hyperpolariserede [13C] bicarbonatsignal 28.

2. Forberedelse af perfusionssystem

  1. Opbevar et reservoir på 200 ml KHB i et vandbad ved 40 °C, og boble med 95%/5%O2/CO2 ved en strømningshastighed på 4 l/min i 1 time før hjerteperfusion. Hold bufferen kontinuerligt boblende med denne gasblanding under hele eksperimentet.
    1. Først indstilles vandbadet til 40 °C. Indsæt KHB-reservoiret. Brug en peristaltisk pumpe (se materialetabellen) og forlængerrør af medicinsk kvalitet til at recirkulere KHB mellem bufferbeholderen og 10 mm NMR-røret med en konstant strømningshastighed på 7,5 ml/min.
    2. Tilslut tre platinhærdede silikonerør (3 mm id) til pumpen (et indstrømningsrør og to udstrømningsrør til KH-bufferen). Indsæt udstrømnings- og tilstrømningsledningerne i den opvarmede KH-buffer. Indsæt derefter iltledningen i den opvarmede KH-buffer.
    3. Brug tynde polyetheretherketonlinjer (PEEK, se materialetabel) til bufferen og det hyperpolariserede middel til at strømme til og fra NMR-røret inden for spektrometerets boring.
  2. Sørg for, at temperaturen holdes på 37-37,5 °C. Følg nedenstående trin.
  3. Indstrømningsledningen (fra bufferbeholderen til NMR-røret) pakkes ind med et varmebånd, der er indstillet til 42 °C.
  4. NMR-røret opvarmes inde i spektrometeret med en varm luftstrøm, der reguleres af spektrometeret.
  5. Brug en NMR-kompatibel temperatursensor (se Materialetabel) til at måle temperaturen inde i NMR-røret. Temperaturen justeres til 37-37,5 °C.

3. Kalibrering og klargøring af NMR-spektrometeret til anskaffelse

  1. På forsøgsdagen indsættes en 13C standardprøve, der indeholder 1,4-dioxan (materialetabel), i spektrometeret og indstilles og matches NMR-sonden til 13C. Derefter opnås et spektrum, der viser det termiske ligevægtssignal på 1,4-dioxan med en nutationsvinkel på 90°.
  2. Udskift nu 13C-standardprøven med en 31 P-standardprøve (materialetabel), der indeholder 105 mM ATP i D2O. Indstil og match NMR-sonden til 31P.
    BEMÆRK: Et spektrum, der viser de termiske ligevægtsfosfatsignaler, opnås med en nutationsvinkel på 50°.
  3. Indsæt indstrømningsledningen, udstrømningsledningen og temperatursonden i et 10 mm NMR-rør, og indsæt derefter røret i magnetboringen. Indstil varmebåndet til 42 °C.
  4. Der anskaffes et 31 P NMR-spektrum af den cirkulerende KH-buffer, der skal anvendes i dette eksperiment i 30minutter, med en nutationsvinkel på 50° og en TR på 1,1 s (1.640 anskaffelser).

4. Dyreforberedelse, kirurgisk procedure og perfusion af hjertet i NMR-røret

  1. Bedøv en mandlig HSD:ICR (CD-1) mus med 3,3% isofluran i rumluft (materialetabel) ved 340 ml/min i 5 minutter ved hjælp af et gasbedøvelsessystem (materialetabel) i et induktionskammer.
  2. Brug nanasal anæstesi til vedligeholdelse af generel anæstesi med 2,9% isofluran.
    BEMÆRK: Der udvises omhu for at minimere smerte og ubehag for dyret.
  3. Fastgør dyrets lemmer med tape, sørg for en negativ pedal smerterefleks, og injicer derefter 300 IE natriumheparin intraperitonealt.
  4. Fugt musens brystvæg og mave grundigt med 70% alkohol for at sikre renlighed og undgå hårforurening eller obstruktion under det kirurgiske indgreb.
  5. På 1 min efter heparininjektionen skæres huden og musklerne i bukhulen med en lille saks.
  6. Placer den lille buede kæbe hæmostatlåsende mygklemme mellem xiphoidprocessen og brysthuden for at løfte brystet og udsætte membranen. Punktering og skær membranens højre lap.
  7. Skær brystet over midterlinjen, træk dig tilbage til siderne, og fjern derefter.
  8. Injicer hjertets venstre ventrikel med 200 IE natriumheparin for at forhindre blodkoagulation. Derefter injiceres 0,1 ml iskold 0,5 mol/l KCl for at opnå hjertestop, som tidligere beskrevet25. Hjertestop er afgørende for at kunne kannulere hjertet.
  9. Identificer thymus, og fjern den ved hjælp af en saks for at udsætte aorta. Fjern resterende ribbenburvæv.
  10. Identificer aortabuen, og brug buede tang til at placere en løs knude med en 3-0 silkesutur (materialebord) omkring den stigende aorta. Injicer 3 ml KHB i venstre ventrikel for at fjerne blodpropper fra aorta.
  11. Brug buede tang til at trække hjertet ringere tilbage for bedre visualisering af den stigende aorta.
  12. Udfør kanylering in situ med et 22 G intravenøst kateter (materialetabel). Påfør cyanoacrylatklæbemiddel i det kanylerede område, og udfør derefter dobbelt suturbinding. Injicer yderligere KH-buffer i hjertet, og kontroller, at det strømmer gennem kanylerøret.
  13. Fjern den buede tang. Afbryd forbindelsen mellem hjertet og de omgivende indvolde, og perfuser det retrograd med iskold KHB (4 °C) gennem det intravenøse kateter.
  14. Tilslut hjertet til perfusionssystemets indstrømningslinje via det intravenøse kateter. Efter initiering af perfusion med varm buffer (37-37,5 °C) ved 7,5 ml/min begynder hjertet at slå spontant.
  15. Fastgør NMR-røret med det bankende hjerte, udstrømningslinjer og temperatursonde, og indsæt i spektrometerets boring, og sørg for, at hjertet er i midten af NMR-sonden.

5. Erhvervelse af data for hjerteenergi og pH

  1. Erhverv 31P spektre i ca. 1 time med en flipvinkel på 50 ° og en TR på 1, 1 s.

6. DNP spin polarisering og opløsning

  1. Forbered en 28,5 mg formulering af [1-13C]pyruvat. Denne formulering består af 11,1 mM til 14,0 mM OX063 radikal i den rene syre.
  2. Forbered 4 ml opløsningsmedium. Opløsningsmediet består af TRIS-phosphatbuffer, som indeholder 11,2 mMNaH2PO4, 38,8 mMNa2HPO4, 33 mM TRIS og 2 mM HCI. Denne mediumsammensætning justeres således, at ved tilsætning af 28,5 mg [1-13C]pyruvinsyreformulering til 4 ml af denne buffer (i opløsningsfasen) vil pH i den resulterende opløsning være 7,4.
  3. Udfør spinpolarisering og hurtig opløsning i en opløsning-DNP (dDNP) spinpolarisationsenhed i henhold til producentens anvisninger (materialetabel). Der anvendes mikrobølgebestråling med en frekvens på 94,110 GHz til polarisering af [1-13C]pyruvinsyreformuleringen ved 1,45 K til 1,55 K i ca. 1,5 timer.
  4. Bland hurtigt 4 ml hyperpolariseret medium fra dDNP-enheden med en godt iltet opløsning, der supplerer det hyperpolariserede opløsningsmedium for at opnå en sammensætning, der nøje matcher perfusionsmediet.
    BEMÆRK: Det endelige volumen af mediet, der gennemborer hjertet under de hyperpolariserede injektioner med 14 mM hyperpolariseret [1-13C]pyruvat, er 26 ml. Den endelige sammensætning af det injicerede substrat (efter blanding) indeholder 4,7 mM KCl, 1,2 mMMgSO4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM glucose,1,2mM CaCl2 og72 E / L insulin.
  5. Administrer det hyperpolariserede [1-13C] pyruvatholdige medium til det isolerede hjerte ved hjælp af en kontinuerlig flowopsætning29.
    BEMÆRK: Dette gøres for at sikre, at hjerteperfusionen ikke forstyrres på noget tidspunkt under eksperimentet, og at det hyperpolariserede medium administreres med en kendt hastighed og i en kendt varighed.

7. Hyperpolariseret 13C spektroskopi

  1. Få hyperpolariserede 13 C-data ved hjælp af produktselektive satuerings-excitationsimpulser 15 ved at anvende 2,5 ms kardinalsinus (Sinc) pulser, som tidligere beskrevet15,16. Selektivt exciteres [1-13 C] lactat og [13C] bicarbonat fortløbende med 6 s intervaller for at opnå et 12 s interval for hver metabolit.
  2. For [1-13 C] laktatdetektion centreres den selektive Sinc-puls ved [1-13 C] pyruvathydratfrekvensen (179,4 ppm), hvilket resulterer i signalintensitetsforhold (lac) på 0,113 for C 1-signalerne fra [1-13 C] pyruvat til [1-13C] lactat.
  3. Til [13 C] bicarbonatdetektion centreres den selektive Sinc-puls ved 157,7 ppm, hvilket er 214 Hz down-field af [13C] bicarbonatsignalet (161,1 ppm); dette resulterer i et signalintensitetsforhold (bic) på 0,139 forC1-signaletpå [1-13 C]pyruvat til [13C]bicarbonat.

8. Bestemmelse af vævets vådvægt og volumen

  1. Ved afslutningen af eksperimentet skal du løsne hjertet fra perfusionssystemet og tørre det forsigtigt med silkepapir. Derefter vejer hjertet for at opnå vævets våde vægt.
  2. Bestem hjertets volumen ved hjælp af en densitetsfaktor på 1,05 g/cm3, som tidligere bestemt for musehjertet30.

9. Kvantificering af ATP-indhold

  1. Integrer γ-ATP-signalet fra en enkelt erhvervelse af ATP-standardprøven og en 30 minutters erhvervelse (TR på 1,1 s og 1.640 erhvervelser) af det isolerede hjerte.
  2. Kvantificer ATP-indholdet i hjertet ved at sammenligne integralet af hjertets γ-ATP-signal med standarden (materialetabel), hvor sidstnævnte har en kendt koncentration (105 mM), og korriger for antallet af erhvervelser og afslapningseffekter.

10. Løsning af hjertets Pi-signal

BEMÆRK: For at evaluere vævets pH er det først nødvendigt at dekonvolere hjertets Pi-signal fra det samlede Pi-signal (Pit). Dette gøres ved at udelade signalet fra KHB Pi (PiKH) fra Pit.

  1. I et 31P-spektrum af KHB, der viser et enkelt Pi-signal (PiKH, figur 1A), skal du tilpasse PiKH-signalet til en Lorentzian-funktion ved hjælp af Excel (materialetabel).
  2. Det volumen, der er synligt for NMR-sonden (Vp, 1,375 ml), indeholder mere KHB, når prøveglasset ikke indeholder hjertet. For at korrigere for denne påfyldningseffekt beregnes det svækkede buffersignal (Pib) ved hjælp af eq. 1A.
    Equation 1Eq. 1A
    hvor Vh er hjertets volumen som bestemt i trin 8.
  3. Træk dette signal fra Pit i henhold til eq. 1B for at opnå Pi-signalet, der udelukkende stammer fra det perfunderede hjerte (Pih, figur 1B).
    Equation 2Eq. 1B

11. Multiparametrisk pH-analyse

  1. Udfør omdannelsen af Pih-signalets kemiske forskydningsfordeling til pH med henvisning til PCr's kemiske forskydning ved hjælp af eq. 231.
    Equation 3Eq. 2
    hvor Δδ er den kemiske skiftforskel, er pKa 6,72, δ fri base er 5,69, og δ fri syre er 3,27, som tidligere beskrevet31.
  2. Korriger den resulterende pH-fordelingskurve for ikke-lineariteten mellem Pih kemisk forskydningsskala og pH-skalaen ifølge Lutz et al.32. En typisk pH-fordeling som følge af denne beregning er vist i figur 1C.
  3. Analyser vævets pH-fordeling med en multiparametrisk tilgang ved hjælp af syv statistiske parametre efter Lutz et al.'s arbejde. 32. Fire af disse parametre præsenteres her, da de synes at være de mest beskrivende for vævets pH: 1) global maksimal pH; 2) vægtet gennemsnitlig pH-værdi 3) vægtet median pH; og 4) skævhed i pH-plottet (figur 1C).

12. Beregning af LDH- og PDH-aktiviteterne

BEMÆRK: Produktionshastighederne for de hyperpolariserede metabolitter [1-13 C]lactat og [13C]bicarbonat anvendes til at beregne henholdsvis LDH- og PDH-aktiviteterne. I produktets selektive mættende excitationsmetode15 detekteres kun nyligt syntetiserede hyperpolariserede metabolitter ved hver selektiv excitation.

  1. Brug det hyperpolariserede [1-13C]pyruvatsignal som reference til at bestemme det tilsvarende metabolitproduktionsniveau.
    1. Under perfusionen med det hyperpolariserede medium øges [1-13 C]pyruvatkoncentrationen i NMR-røret (wash-in), plateauer derefter (ved en maksimal koncentration på 14mM) og falder derefter (udvaskning).
    2. For at identificere de tidspunkter, hvor pyruvatkoncentrationen nåede et konstant niveau (plateau), korrigeres [1-13C]pyruvatsignalet for signalhenfald som følge afT1-afslapning og RF-pulsering ved hjælp af den effektive afslapningskonstant, Teff.
    3. For hver injektion defineres Teff baseret på dens evne til at korrigere [1-13C]pyruvathenfaldskurven for at vise denne strømningsdynamik (Eq.3).
      Equation 4Eq. 3
      hvor Equation 5 er [1-13 C]pyruvatsignalet, der blev erhvervet under [13C]bicarbonaterhvervelsen. Den gennemsnitlige Teff i eksperimenterne beskrevet heri viste sig at være 35,8 s ± 2,3 s (n = 5 hjerter).
    4. Vælg de datapunkter, hvor koncentrationen ligger inden for 10% af det maksimalt korrigerede [1-13C] pyruvatsignal til yderligere analyse.
  2. Der anvendes tilsvarende data for produktionen af [1-13 C]lactat og [13C]bicarbonat for de tidspunkter, der er valgt i trin 12.1, til beregning af metabolitproduktionshastighederne ved anvendelse af eq. 4A og eq. 4B, forudsat at metabolitsignalets SNR er større end 2 (tærskel for analyse). Et typisk eksempel på et sådant udvalg af tidspunkter er vist i figur 2B (fremhævet tidsvindue).
  3. Beregn produktionshastighederne for hvert af de valgte datapunkter ved hjælp af eq. 4A og eq. 4B:
    Equation 17Eq. 4A
    Equation 6Eq. 4B
    hvor Equation 7 og er produktionshastighederne for henholdsvis [1-13 C]lactat eller [13 C]bicarbonat på hvert tidspunkt. og er faktorer, der repræsenterer den relative excitation af henholdsvis [1-13 C]pyruvat og Equation 8 Equation 10 produkterne [1-13 C]lactat eller [13C]bicarbonat. Equation 9 Disse faktorer blev tidligere bestemt til henholdsvis 0,113 og 0,13929. Vp er det volumen, der detekteres af NMR-sonden (1,375 ml), TR angiver tidsintervallet mellem to på hinanden følgende produktselektive mættende excitationer (12 s for hvert produkt) Equation 11 og er signalerne for henholdsvis [1-13 C] lactat og [13 C] bicarbonat, og og er signalerne fra [1-13 C] pyruvat, der blev erhvervet under [1-13 C] lactat og Equation 14 Equation 13 Equation 12 [13 C]bicarbonat excitationer, henholdsvis. [Pyr] er [1-13 C]pyruvatkoncentrationen, som var 14mM under plateaufasen.
    1. Bestem hastigheden for hvert punkt og derefter gennemsnittet pr. Hyperpolariseret injektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De 31P-spektre, der er registreret fra et musehjerte, der er perfunderet med KHB, og fra bufferen alene, er vist i figur 1A. Signalerne fra α-, β- og γ-ATP, PCr og Pi blev observeret i hjertet. Pi-signalet var sammensat af to hovedkomponenter: i det højere felt (venstre side af signalet) skyldtes Pi-signalet for det meste KHB ved en pH på 7,4; i det nederste felt (højre side af signalet) var Pi-signalet bredere og mindre homogent på grund af det mere sure miljø. Sidstnævnte mønster stammer fra hjertevævet. Hjertevævets Pi-signal ekstraheres ved at trække KHB's Pi-signal (figur 1B) og konverteres derefter fra ppm-skalaen til pH-skalaen (figur 1C). PH-værdien undersøges ved hjælp af en multiparametrisk analyse af vævets Pi-signal ved at beregne det vægtede gennemsnit, vægtede median, globale maksimum og skævhed (figur 1C).

Figure 1
Figur 1: Typiske 31 P-spektre, sondringen mellem KHB's og hjertets Pi-signal, omdannelse fra det kemiske skift til pH-akser og de statistiske parametre for pH-fordelingen . (A) Det øverste panel viser et typisk 31P NMR-spektrum opnået fra et musehjerte perfuseret med KHB i spektrometeret. mens det nederste panel viser et spektrum opnået fra KHB alene. Det stregmarkerede spektralområde vises forstørret i panel B. Forkortelser: Pi = uorganisk fosfat; PCr = phosphocreatin; ATP = adenosintrifosfat; ADP = adenosindiphosphat. (B) Det oprindelige spektrum er vist i sort (Pit); den stiplede kurve viser kun Pi-signalet fra bufferen (Pib). Sidstnævnte blev opnået ved at montere en Lorentzian linjeform med centrum ved den tilsvarende KHB-komponent i Pit-signalet og justere for mængden af KHB i sonden efter hjerteindsættelsen (ifølge eq. 1A). Pi-signalet, der tilskrives hjertet (Pih), vises med orange, og dette opnås ved at trække Pi b-signalet fra Pi t-signalet (ifølge Eq. 1B). (C) Omdannelse af Pih-signalets kemiske forskydningsfordeling vist i (B) til en pH-fordeling og multiparametrisk pH-analyse. Ikke-lineariteten mellem det kemiske skift og pH-skalaerne blev korrigeret som tidligere beskrevet32. Resultaterne af den multiparametriske pH-analyse er markeret med de lodrette linjer. For denne specifikke fordeling angives værdierne for de statistiske parametre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Med den hyperpolariserede produktselektive tiltrækningsmetode for mættende excitationer15 er det muligt at udføre absolut kvantificering af LDH- og PDH-enzymaktiviteterne. Figur 2 opsummerer de erhvervelses- og forarbejdningstrin, der kræves til denne bestemmelse. Tabel 1 viser ATP-indholdet og LDH- og PDH-satserne i fem forskellige hjerter. Normalisering af LDH- og PDH-aktiviteterne til ATP-indholdet i hvert hjerte reducerede variabiliteten i LDH- og PDH-målingerne på tværs af gruppen, som det kan ses i enzymaktivitetskolonnerne i tabel 1, som udtrykkes i enheder af nmol/s/μmol ATP.

Figure 2
Figur 2: Hyperpolariseret 13 C MRS-behandling og analyse af [1-13C]pyruvatmetabolisme. (A) Repræsentative 13 C NMR-spektre opnået med produktselektiv mættende excitationsmetode under en injektion af 14 mM hyperpolariseret [1-13C]pyruvat i det perfunderede musehjerte. Signaltildeling: 1 = [1-13 C]lactat (183,2ppm); 2 = [1-13C]pyruvat (171 ppm); 3 = [13C]bicarbonat (161,1 ppm); * = urenheder hidrørende fra [1-13C]pyruvatformuleringen33. (B) Tidsforløbet for de hyperpolariserede signalintensiteter, der vises i A. De integrerede intensiteter af [1-13C]pyruvat (grå) blev justeret forT1-henfaldog RF-pulsering meden Teff-tidskonstant på 32 s (sort), og dette gav den forventede strømningsdynamik for substratet (wash-in, plateau, wash-out). Yderligere analyse blev udført på datapunkterne inden for tidsvinduet, hvor det justerede [1-13 C]pyruvatsignal viste en konstant og maksimal [1-13C]pyruvatkoncentration i NMR-røret (fremhævet med lyseblåt). Produktionshastighederne for LDH og PDH (Equation 18 og ) for de valgte tidspunkter blev beregnet i henhold til eq. 4A og eq. 4B og Equation 19derefter gennemsnitligt. Middelværdierne for denne injektion (Equation 1 og Equation 1 ) er angivet i enheder af nmol/s. Til visningsformål blev det justerede [1-13 C] pyruvat, [1-13 C] lactat og [13 C] bicarbonat ganget med henholdsvis 0,143, 10 og 80 i forhold til [1-13C] pyruvatsignalet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Hjerte nr. ATP (μmol) LDH-sats (nmol/s) PDH-sats (nmol/s) LDH-sats (nmol/s/μmol ATP) PDH-hastighed (nmol/s/μmol ATP)
1 0.49 7.61 0.59 15.4 1.19
2 0.25 3.66 0.32 14.42 1.26
3 0.51 6.01 0.66 11.81 1.3
4 0.53 9.27 1.09 17.34 2.04
5 0.64 9.38 0.6 14.77 0.94
Gennemsnit (SD) 0.49 (0.13) 7.19 (2.15) 0.65 (0.25) 14.75 (1.78) 1.35 (0.37)
SD % gennemsnit 26.00% 30.00% 38.30% 12.10% 27.50%

Tabel 1: ATP-indhold og LDH- og PDH-satser i fem hjerter. Forkortelser: SD = Standardafvigelse; SD % Gennemsnit = procentdelen af standardafvigelsen fra gennemsnittet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi demonstrerer et eksperimentelt setup, der er designet til at undersøge hyperpolariseret [1-13C]pyruvatmetabolisme, vævsenergi og pH i en isoleret musehjertemodel.

De kritiske trin i protokollen er som følger: 1) sikring af, at bufferens pH er 7,4; 2) sikring af, at alle bufferens komponenter er inkluderet 3) undgå blodpropper i hjertekarrene ved heparininjektioner; 4) undgå iskæmisk skade på hjertet ved at reducere metabolisk aktivitet (KCl-injektion og iskold buffer); 5) undgå indføring af luftbobler i hjertet på ethvert tidspunkt af proceduren; 6) validering af vellykket kanylering af aorta ved vævets farve, som skifter fra mørkerød til lyserød; 7) Sørg for, at perfusionen er kontinuerlig, når hjertet flyttes til varm buffer; 8) nøje overvågning af temperaturen inde i NMR-røret i spektrometeret ved siden af hjertet og holde den på 37 °C 9) kontrol af magnetfeltets homogenitet under hele målingen; og 10) ved hjælp af nøjagtig og opdateret kalibrering for RF-impulserne.

Ændringer og fejlfinding af teknikken
Vi bemærker et par ændringer, der blev foretaget i denne undersøgelse: 1) initiering af perfusion med iskold KHB efter operationen blev anvendt til at beskytte hjertet; og 2) valideringen af bufferens pH blev udført hele vejen igennem for at sikre, at denne parameter var under kontrol og ikke var en kilde til variation i resultaterne. Dette blev gjort i de forskellige trin i forberedelse og eksperimentering ved hjælp af en pH-meter, pH-indikatorstrimler og Pi-signalet på 31P-spektret.

Kilder til variabilitet og hvordan man korrigerer for dem
Musens hjerte blev valgt til at passe ind i et 10 mm NMR-rør. Dette lille hjerte giver imidlertid lave signaler, og den delikate kirurgiske procedure til isolering og perfusering af hjertet er udfordrende. Samlet set fører dette til variabel vævslevedygtighed og metabolisk aktivitet. For at tage højde for denne variabilitet normaliserede vi stofskiftet for LDH og PDH til ATP-indholdet (dvs. mol / s / ATP). En lignende anvendelse af ATP-indholdet som reference blev tidligere rapporteret i xenograft brysttumorskiver29. Denne type normalisering er gavnlig, fordi den giver mulighed for sammenligning med resultaterne fra andre forskere og med andre forhold. Derudover kan man ved at anvende en konverteringsfaktor fra ATP-mængden til vævsmassen udlede den enzymatiske aktivitet pr. vævsvægt (for det væv, hvor metabolisme forekommer).

Ud over variabiliteten mellem forskellige isolerede hjertepræparater (dvs. fra forskellige dyr) viste vævets Pi (Pih) kemiske skift en ikke-homogen fordeling i denne undersøgelse. Lutz et al.32 demonstrerede en lignende ikke-homogen fordeling i xenograft tumorer, og denne fordeling blev analyseret ved hjælp af en multiparametrisk tilgang. I dette arbejde blev denne metode implementeret i det perfunderede musehjerte. Vi bemærker, at det er sandsynligt, at Pih-signalet overvejende rapporterer om den intracellulære pH, som tidligere angivet16.

Usikkerhed
En underliggende antagelse i kvantificeringen af og er, at den hyperpolariserede [1-13C]pyruvatopløsning fylder hele det volumen, der detekteres af Equation 18 NMR-sonden (Vp, Eq. 4A og Equation 19 Eq. 4B). Den hyperpolariserede [1-13C] pyruvatopløsning strømmer gennem hjertets kranspulsårer for at fylde de ekstracellulære og intracellulære rum. Derfor antages hjertevolumenet at være fyldt med den hyperpolariserede opløsning i samme omfang som resten af Vp.

Ved anvendelse af den hyperpolariserede produktselektive mættende excitationsmetode15,29 kan den enzymatiske aktivitet kvantificeres uafhængigt af eventuelle variationer i metabolitternesT1 og reversibiliteten af den enzymatiske reaktion. Denne bestemmelse er robust og immun over for variationer iT1- og excitationsprofiler og er sandsynligvis mere reproducerbar på tværs af laboratorier sammenlignet med arealet under kurveanalyserne, som afhænger af de specifikke erhvervelsesbetingelser og opsætning i hvert laboratorium.

Undersøgelse af [1-13C] pyruvatmetabolisme, som er ved krydset mellem aerob og anaerob metabolisme, er af stor værdi for at studere hypoxi, iskæmi, reperfusionsskade, sult og ændring i hjertemetabolisme, såsom i diabetisk kardiomyopati. Hyperpolariserede 13C-mærkede pyruvatanaloger er blevet testet klinisk 34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, og derfor er resultaterne af sådanne undersøgelser sandsynligvis translationelle. Vigtigst af alt muliggør vores tilgang kvantificering af enzymaktivitet i cellen i hele organet.

Den isolerede gnaverhjerteforberedelse og de procedurer og metoder, der er involveret i denne forskning, vil bidrage til at fremme forståelsen af effekten af en række stressorer på hjertefunktion, energetisk og stofskifte, da de målte parametre i denne model udelukkende tilskrives hjertet. I modsætning til rottehjertet er musehjertet velegnet til at studere transgene modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der er ingen afsløringer.

Acknowledgments

Dette projekt modtog finansiering fra Israel Science Foundation under tilskudsaftale nr. 1379/18; Jabotinsky-stipendiet fra det israelske ministerium for videnskab og teknologi til anvendt og ingeniørvidenskab til direkte ph.d.-studerende nr. 3-15892 for D.S.; og Den Europæiske Unions Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equipped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff's isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury - A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O'Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model - ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Tags

Biologi udgave 194 Metabolisme metabolisk billeddannelse billeddannelsesmiddel magnetisk resonansspektroskopi lactat dehydrogenase pyruvat dehydrogenase [1-13C] pyruvat pH uorganisk phosphat
Undersøgelse af hjertemetabolisme i det isolerede perfunderede musehjerte med hyperpolariseret [1-13 C] pyruvat og <sup>13</sup>C / <sup>31</sup>P <sup></sup>NMR spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain,… More

Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter