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Biochemistry

इन विट्रो विश्लेषणात्मक, पुल-डाउन और चैपरोनिंग परख का उपयोग करके हिस्टोन चैपरोन का लक्षण वर्णन

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63218
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1, 1,4, 1,5, 1, 1
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल उन तरीकों की एक बैटरी का वर्णन करता है जिसमें हिस्टोन चैपरोन ऑलिगोमेराइजेशन और स्थिरता का अध्ययन करने के लिए विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, हिस्टोन चैपरोन-हिस्टोन इंटरैक्शन को उजागर करने के लिए पुल-डाउन परख, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के स्टोइकोमेट्री का विश्लेषण करने के लिए एयूसी, और विट्रो में एक कथित हिस्टोन चैपरोन को कार्यात्मक रूप से चिह्नित करने के लिए हिस्टोन चैपरोनिंग परख शामिल है।

Abstract

हिस्टोन प्रोटीन यूकेरियोटिक क्रोमैटिन बनाने के लिए डीएनए के साथ जुड़ते हैं। क्रोमैटिन की मूल इकाई एक न्यूक्लियोसोम है, जो एक हिस्टोन ऑक्टामर से बना होता है जिसमें डीएनए द्वारा लपेटे गए कोर हिस्टोन एच 2 ए, एच 2 बी, एच 3 और एच 4 की दो प्रतियां होती हैं। ऑक्टेमर एक एच 2 ए / एच 2 बी डिमर की दो प्रतियों और एच 3 / एच 4 टेट्रामर की एक एकल प्रति से बना है। अत्यधिक चार्ज किए गए कोर हिस्टोन सेलुलर साइटोप्लाज्म और नाभिक में कई प्रोटीनों के साथ गैर-विशिष्ट बातचीत के लिए प्रवण होते हैं। हिस्टोन चैपरोन प्रोटीन का एक विविध वर्ग बनाते हैं जो साइटोप्लाज्म से नाभिक में हिस्टोन को शटल करते हैं और डीएनए पर उनके जमाव में सहायता करते हैं, इस प्रकार न्यूक्लियोसोम असेंबली प्रक्रिया में सहायता करते हैं। कुछ हिस्टोन चैपरोन या तो H2A / H2B या H3 / H4 के लिए विशिष्ट हैं, और कुछ दोनों के लिए चैपरोन के रूप में कार्य करते हैं। यह प्रोटोकॉल बताता है कि इन विट्रो प्रयोगशाला तकनीकों जैसे कि पुल-डाउन परख, विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी, विश्लेषणात्मक अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन और हिस्टोन चैपरोनिंग परख का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है कि कोई प्रोटीन हिस्टोन चैपरोन के रूप में कार्यात्मक है या नहीं।

Introduction

डीएनए और हिस्टोन प्रोटीन से बने न्यूक्लियोसोम क्रोमैटिन की संरचनात्मक इकाई बनाते हैं और कई महत्वपूर्ण सेलुलर घटनाओं को नियंत्रित करते हैं। न्यूक्लियोसोम को गतिशील रूप से पुनर्स्थापित किया जाता है और डीएनए को प्रतिकृति, प्रतिलेखन और अनुवाद 1,2 जैसी विभिन्न प्रक्रियाओं के लिए सुलभ बनाने के लिए फिर से तैयार किया जाता है। हिस्टोन जो अत्यधिक बुनियादी हैं, वे या तो सेलुलर परिवेश में अम्लीय प्रोटीन के साथ बातचीत करते हैं या एकत्रीकरण से गुजरते हैं, इस प्रकार विभिन्न सेलुलर दोष 3,4,5 होते हैं। हिस्टोन चैपरोन नामक समर्पित प्रोटीन का एक समूह साइटोप्लाज्म से नाभिक तक हिस्टोन के परिवहन में सहायता करता है और असामान्य हिस्टोन-डीएनए एकत्रीकरण घटनाओं को रोकता है। मौलिक रूप से, अधिकांश हिस्टोन चैपरोन शारीरिक आयनिक शक्ति पर डीएनए पर हिस्टोन को स्टोर और स्थानांतरित करते हैं, जिससे न्यूक्लियोसोम 8,9 के गठन में सहायता मिलती है। कुछ हिस्टोन चैपरोन में हिस्टोन ऑलिगोमर्स एच 2 ए / एच 2 बी या एच 3 / एच 410 के लिए एक निश्चित प्राथमिकता है।

हिस्टोन चैपरोन को डीएनए संश्लेषण11 पर निर्भर या स्वतंत्र न्यूक्लियोसोम को इकट्ठा करने की उनकी क्षमता के आधार पर विशेषता है। उदाहरण के लिए, क्रोमैटिन असेंबली फैक्टर -1 (सीएएफ -1) निर्भर है जबकि हिस्टोन नियामक ए (हीरा) डीएनए संश्लेषण12,13 से स्वतंत्र है। इसी तरह, हिस्टोन चैपरोन का न्यूक्लियोप्लाज्मिन परिवार शुक्राणु क्रोमैटिन डीकंडेनसेशन और न्यूक्लियोसोम असेंबली14 में शामिल है। न्यूक्लियोसोम असेंबली प्रोटीन (एनएपी) परिवार के सदस्य विट्रो में न्यूक्लियोसोम जैसी संरचनाओं के गठन की सुविधा प्रदान करते हैं और साइटोप्लाज्म और न्यूक्लियस15 के बीच हिस्टोन के शटलिंग में शामिल होते हैं। न्यूक्लियोप्लाज्मिन और एनएपी परिवार प्रोटीन दोनों कार्यात्मक हिस्टोन चैपरोन हैं लेकिन किसी भी संरचनात्मक विशेषताओं को साझा नहीं करते हैं। अनिवार्य रूप से, कोई भी एकल संरचनात्मक विशेषता एक प्रोटीन को हिस्टोन चैपरोन16 के रूप में वर्गीकृत करने की अनुमति नहीं देती है। संरचनात्मक अध्ययनों के साथ कार्यात्मक और बायोफिज़िकल परख का उपयोग हिस्टोन चैपरोन को चिह्नित करने में सबसे अच्छा काम करता है।

यह काम एक प्रोटीन को हिस्टोन चैपरोन के रूप में चिह्नित करने के लिए जैव रासायनिक और बायोफिज़िकल तरीकों का वर्णन करता है जो न्यूक्लियोसोम असेंबली में सहायता करता है। सबसे पहले, हिस्टोन चैपरोन की ऑलिगोमेरिक स्थिति और स्थिरता का विश्लेषण करने के लिए विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी की गई थी। इसके बाद, ड्राइविंग बलों और हिस्टोन चैपरोन-हिस्टोन इंटरैक्शन की प्रतिस्पर्धी प्रकृति को निर्धारित करने के लिए एक पुल-डाउन परख का प्रदर्शन किया गया था। हालांकि, प्रोटीन के आकार और इसके परिसरों के कारण विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके इन इंटरैक्शन के हाइड्रोडायनामिक मापदंडों की सटीक गणना नहीं की जा सकी जो कॉलम के माध्यम से उनके प्रवास को प्रभावित करते हैं। इसलिए, विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग किया गया था, जो इन-सॉल्यूशन मैक्रोमोलेक्यूलर गुण प्रदान करता है जिसमें सटीक आणविक भार, बातचीत का स्टोइकोमेट्री और जैविक अणुओं का आकार शामिल है। पिछले अध्ययनों ने बड़े पैमाने पर इन विट्रो हिस्टोन चैपरोनिंग परख का उपयोग किया है ताकि एचएससीएस 116 17, डीएमएसीएफ18, एससीआरटीटी106 पी 19, एचएसएनपीएम1 20 जैसे हिस्टोन चैपरोन को कार्यात्मक रूप से चिह्नित किया जा सके। हिस्टोन चैपरोनिंग परख का उपयोग प्रोटीन को कार्यात्मक रूप से हिस्टोन चैपरोन के रूप में चिह्नित करने के लिए भी किया गया था।

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Protocol

1. हिस्टोन चैपरोन की ऑलिगोमेरिक स्थिति और स्थिरता को स्पष्ट करने के लिए विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी

  1. हिस्टोन चैपरोन की ओलिगोमेरिक स्थिति का विश्लेषण
    1. 24 एमएल विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) कॉलम को 1.2 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) के साथ बराबर करें, यानी, 28.8 एमएल डिगैस्ड एसईसी बफर [ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.5 का 20 एमएम), एमएम एनएसीएल का 300, और β-मर्काप्टोएथेनॉल (β-एमई)] का 1 एमएम 4 डिग्री सेल्सियस पर ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: कॉलम प्रकार, बफर संरचना और बफर पीएच को रुचि के प्रोटीन के आधार पर चुना जा सकता है। नमूना इंजेक्शन की मात्रा 24 एमएल कॉलम के लिए 500 μL से अधिक नहीं होनी चाहिए। इसके अलावा, कॉलम दबाव को 5 एमपीए से नीचे बनाए रखने की आवश्यकता है।
    2. एक उच्च सांद्रता प्रोटीन स्टॉक समाधान से, डिगैस्ड एसईसी बफर में 0.5 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन नमूने का 500 μL तैयार करें और इसे 500 μL इंजेक्शन लूप का उपयोग करके पूर्व-समतुल्य स्तंभ में इंजेक्ट करें। क्रोमैटोग्राफी को 4 डिग्री सेल्सियस पर एसईसी बफर के साथ 0.2-0.3 एमएल / मिनट की आइसोक्रेटिक प्रवाह दर पर आगे बढ़ने की अनुमति दें।
    3. 280 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापकर प्रोटीन के क्षालन प्रोफाइल की निगरानी करें। सुगंधित अवशेषों की कमी वाले प्रोटीन से निपटने के दौरान, 214 एनएम पर अवशोषण को मापें।
    4. मानक अंशांकन वक्र21 का उपयोग करके केडीए में इसके अनुमानित आणविक भार की गणना करने के लिए प्रोटीन के क्षालन मात्रा का उपयोग करें।
      नोट: अंशांकन वक्र को उनके संबंधित आणविक भार (लॉग एमआर) के लॉग के खिलाफ ज्ञात आणविक भार प्रोटीन की अवधारण मात्रा को प्लॉट करके तैयार किया जाता है, जिसे एक ही कॉलम का उपयोग करके तैयार किया जाता है।
  2. हिस्टोन चैपरोन की थर्मल स्थिरता का विश्लेषण
    1. अलग-अलग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में डिगैस्ड एसईसी बफर (1.1.1 में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन नमूने के 500 μL) लें और प्रत्येक ट्यूब को 20 डिग्री सेल्सियस और 90 डिग्री सेल्सियस (20 डिग्री सेल्सियस, 40 डिग्री सेल्सियस, 60 डिग्री सेल्सियस, और 90 डिग्री सेल्सियस) के बीच एक विशेष तापमान पर पानी के स्नान में 10 मिनट के लिए गर्म करें।
    2. इसके बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,200 x g पर गर्मी-उपचारित नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें, एक माइक्रोपिपेट के साथ सुपरनैटेंट एकत्र करें, और विश्लेषणात्मक कॉलम में 500 μL इंजेक्शन लूप का उपयोग करके प्रत्येक नमूने को व्यक्तिगत रूप से इंजेक्ट करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर एसईसी बफर के साथ पूर्व-समतुल्य।
    3. क्रोमैटोग्राफी को 4 डिग्री सेल्सियस पर एसईसी बफर के साथ 0.2-0.3 एमएल / मिनट की आइसोक्रेटिक प्रवाह दर पर आगे बढ़ने की अनुमति दें।
    4. क्षालन चोटियों की स्थिति और ऊंचाई का निरीक्षण करें और विभिन्न नमूनों के लिए अतिरिक्त चोटियों की उपस्थिति की तलाश करें।
  3. हिस्टोन चैपरोन की रासायनिक स्थिरता का विश्लेषण
    1. हिस्टोन चैपरोन की नमक स्थिरता की जांच करने के लिए, ट्राइस बफर [ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.5) के 20 एमएम) में तैयार 0.5 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन नमूने के 500 μL को इनक्यूबेट करें, और β-एमई के 1 mM को NaCl (300 mM, 600 mM, 1 M, 1.5 M, और 2 M) की बढ़ती सांद्रता के साथ पूरक किया जाए। नमूनों को 16,200 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को बनाए रखें।
    2. इसके बाद, प्रोटीन के नमूनों को अलग-अलग एनएसीएल सांद्रता में अलग-अलग लोड करें, विश्लेषणात्मक कॉलम में 500 μL इंजेक्शन लूप का उपयोग करके संबंधित बफर के 1.2 सीवी (28.8 एमएल) के साथ पूर्व-समतुल्य होते हैं जिसमें 4 डिग्री सेल्सियस पर एनएसीएल सांद्रता बढ़ जाती है।
    3. क्रोमैटोग्राफी को 4 डिग्री सेल्सियस पर संबंधित बफर के 1 सीवी (24 एमएल) के साथ 0.2-0.3 एमएल / मिनट की आइसोक्रेटिक प्रवाह दर पर आगे बढ़ने की अनुमति दें।
    4. क्षालन चोटियों की स्थिति और ऊंचाई का निरीक्षण करें और विभिन्न नमूनों के लिए अतिरिक्त चोटियों की उपस्थिति की तलाश करें।
    5. इसी तरह, यूरिया स्थिरता विश्लेषण के लिए, कमरे के तापमान पर 16 घंटे के लिए अलग-अलग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में यूरिया सांद्रता (1 एम, 2 एम, 3 एम, 4 एम, और 5 एम) में बढ़ती यूरिया सांद्रता (1 एम, 2 एम, 3 एम, 4 एम, और 5 एम) में तैयार ट्राइस बफर [ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.5) के 20 β एमएम] में तैयार 0.5 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीन नमूने के 500 μL को इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 16,200 x g पर नमूने सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को बनाए रखें।
    6. इसके बाद, यूरिया-उपचारित प्रोटीन नमूनों को व्यक्तिगत रूप से 500 μL इंजेक्शन लूप का उपयोग करके विश्लेषणात्मक कॉलम में लोड करें, जिसमें कमरे के तापमान पर विभिन्न यूरिया सांद्रता वाले संबंधित बफर के 1.2 सीवी (28.8 एमएल) के साथ पूर्व-समतुल्य है।
    7. क्रोमैटोग्राफी को कमरे के तापमान पर संबंधित बफर के 1 सीवी (24 एमएल) के साथ 0.2-0.3 एमएल / मिनट की आइसोक्रेटिक प्रवाह दर पर आगे बढ़ने दें।
      सावधानी: कम तापमान पर यूरिया युक्त बफर के साथ प्रयोग न करें क्योंकि यूरिया स्तंभ को क्रिस्टलीकृत और नुकसान पहुंचाता है।
    8. क्षालन चोटियों की स्थिति और ऊंचाई का निरीक्षण करें और विभिन्न नमूनों के लिए अतिरिक्त चोटियों की उपस्थिति की तलाश करें।

2. हिस्टोन ऑलिगोमर्स और हिस्टोन चैपरोन के बीच जटिल गठन में योगदान देने वाले इंटरैक्शन के प्रकार को समझने के लिए नमक ढाल-आधारित पुल-डाउन परख

  1. पुल-डाउन परख की प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, 40 μL Ni-NTA राल को एक स्पिन कॉलम में डालें और बाँझ डबल-डिस्टिल्ड पानी से धोएं। इसके बाद, राल को 100 सीवी (4 एमएल) संतुलन बफर [ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.5) के 20 एमएम), एनएसीएल के 300 एमएम, इमिडाज़ोल के 10 एमएम, बीएसए के 10 μg/mL और 1 mM β-ME] के साथ बराबर करें ( सामग्री तालिका देखें)।
    नोट: पुल-डाउन को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में भी किया जा सकता है।
  2. हिस्टोन एच 2 ए / एच 2 बी डिमर या एच 3 / एच 4 टेट्रामर के 20 μM के साथ हिस-टैग किए गए हिस्टोन चैपरोन के 5 μM को मिलाकर नमूना तैयार करें। नमूने को 1 घंटे के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    ध्यान दें: एच 2 ए / एच 2 बी डिमर और एच 3 / एच 4 टेट्रामर पुनः संयोजक मानव हिस्टोन21 से तैयार किए जाते हैं, और विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (एयूसी) द्वारा अनुमानित आणविक द्रव्यमान के आधार पर ओलिगोमर्स की अखंडता की पुष्टि की जाती है। नीचे उल्लिखित सभी प्रयोगों के लिए एक ही हिस्टोन ऑलिगोमर्स का उपयोग किया गया है।
  3. चरण 2.1 से नी-एनटीए राल के साथ अलग-अलग पूर्व-समतुल्य स्पिन कॉलम में नमूने लोड करें, प्रत्येक को एक विशेष नमक एकाग्रता के लिए लेबल किया गया है, और कॉलम को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 1 मिनट के लिए 1000 x g पर स्तंभों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. इसके बाद, कॉलम को 100 सीवी (4 एमएल) वॉश बफर [ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.5 का 20 एमएम), इमिडाज़ोल के 50 एमएम, ट्वीन -20 के 0.2% और β-एमई के 1 एमएम] के साथ धोएं, जिसमें विभिन्न नमक सांद्रता (यानी, 300 एमएम, 500 एमएम, 600 एमएम, 700 एमएम, 800 एमएम, 900 एमएम और 1 एमएम, 900 एमएम और 1 एम एनएसीएल) होते हैं। प्रत्येक स्तंभ को एक विशेष नमक एकाग्रता वाले बफर के साथ धोएं।
  5. नमक धोने के चरण के बाद, 100 μL क्षालन बफर [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), NaCl के 300 mM, imidazole के 300 mM और β-ME के 1 mM] का उपयोग करके विभिन्न स्तंभों से प्रोटीन का उपयोग करें।
  6. इसके बाद, इल्यूटेड नमूनों को 18% एसडीएस-पेज22 के अधीन करें और कूमासी ब्रिलियंट ब्लू आर 250 के साथ धुंधला होने के बाद जेल की कल्पना करें ( सामग्री की तालिका देखें)। वैकल्पिक रूप से, आप नी-एनटीए राल से बाध्य प्रोटीन को एल्यूट करने के बजाय सीधे एसडीएस-पेज जेल पर राल लोड कर सकते हैं।
    नोट: रुचि के प्रोटीन के आधार पर संतुलन, धोने और क्षालन बफर रचनाओं और पीएच को संशोधित किया जा सकता है।

3. एच 2 ए / एच 2 बी या एच 3 / एच 4 के लिए हिस्टोन चैपरोन की प्राथमिकता की पहचान करने के लिए प्रतिस्पर्धी पुल-डाउन परख

  1. चरण 2.1 में वर्णित स्पिन कॉलम तैयार करें
  2. हिस्टोन चैपरोन के 5 μM को 20 μM H2A/H2B डिमर के साथ 300 μL संतुलन बफर (चरण 2.1 में तैयार) में बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रतिक्रिया में हिस्टोन ऑलिगोमर से हिस्टोन चैपरोन का अनुपात ज्ञात बाध्यकारी स्टोइकोमेट्री डेटा के आधार पर चुना जा सकता है; यदि कोई जानकारी उपलब्ध नहीं है तो पांच गुना अतिरिक्त हिस्टोन का उपयोग करें।
  3. किसी भी अवक्षेप को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,200 x g पर हिस्टोन चैपरोन-एच 2 ए / एच 2 बी कॉम्प्लेक्स को सेंट्रीफ्यूज करें। इसके बाद, नमूने को स्पिन कॉलम पर लोड करें जो संतुलन बफर (चरण 2.1 में तैयार) के साथ पूर्व-समतुल्य है और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. अतिरिक्त H2A/H2B डिमर को हटाने के लिए कॉलम को 100 CV (4 mL) वॉश बफर [Tris-HCl (pH 7.5 का 20 mM), NaCl का 300 mM, इमिडाज़ोल का 50 mM, ट्वीन -20 का 0.2% और β-ME के 1 mM] के साथ धोएं। इसके बाद, हिस्टोन चैपरोन-एच 2 ए / एच 2 बी कॉम्प्लेक्स को एच 3 / एच 4 टेट्रामर के 20-60 μM के साथ मिलाएं और बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. किसी भी अनबाउंड एच 3 / एच 4 टेट्रामर को हटाने के लिए वॉश बफर (चरण 3.4 में तैयार) के 100 सीवी (4 एमएल) के साथ कॉलम को फिर से धोएं और क्षालन बफर (चरण 2.5 में तैयार) का उपयोग करके नमूने को हटा दें। नमूनों को 18% एसडीएस-पेज पर अधीन करें और कूमासी ब्रिलियंट ब्लू आर 250 के साथ धुंधला होने के बाद कल्पना करें।
    नोट: परख को उलट दिया जा सकता है, जिसमें सबसे पहले, एच 3 / एच 4 टेट्रामर को चैपरोन के साथ मिलाया जा सकता है, कॉम्प्लेक्स को नी-एनटीए मोतियों से बांधने की अनुमति दी जाती है, और फिर कॉम्प्लेक्स को एच 2 ए / एच 2 बी डिमर की अलग-अलग सांद्रता के साथ इनक्यूबेट किया जा सकता है।

4. विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन - अवसादन वेग (एयूसी-एसवी) प्रयोग हिस्टोन चैपरोन और हिस्टोन के बीच बाध्यकारी स्टोइकोमेट्री का विश्लेषण करने के लिए

  1. AUC के लिए नमूना तैयारी
    1. पुनर्गठित हिस्टोन एच 2 ए / एच 2 बी डिमर, एच 3 / एच 4 टेट्रामर, और हिस्टोन चैपरोन को 7 केडीए कट-ऑफ डायलिसिस ट्यूबिंग23 के माध्यम से अलग से डायलिसिस बफर [20 एमएम ट्राइस (पीएच 7.5), एनएसीएल के 300 एमएम और β-एमई के 1 एमएम] के खिलाफ अलग से डायलाइज़ करें ( सामग्री की तालिका देखें)। बफर बेमेल के कारण पृष्ठभूमि त्रुटि को कम करने के लिए, डायलिसिस बफर के खिलाफ बड़े पैमाने पर डायलिसिस करें, अधिमानतः 24 घंटे की अवधि में तीन बार।
      नोट: प्रोटीन नमूनों के प्रारंभिक ओडी280 में 0.3-0.5 के अंतिम ओडी280 को प्राप्त करने के लिए दो से तीन गुना अधिक मूल्य होना चाहिए। यह अनिवार्य रूप से कमजोर पड़ने के प्रभावों को समाप्त करने के लिए किया जाता है।
    2. एच 2 ए / एच 2 बी डिमर, एच 3 / एच 4 टेट्रामर, और हिस्टोन चैपरोन को व्यक्तिगत रूप से डायलिसिस बफर के साथ शुद्ध करें, विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (जैसा कि चरण 1 में उल्लेख किया गया है)। बाद में आगे कमजोर पड़ने की तैयारी करने और एयूसी सेल में संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए बफर को रन से सहेजें।
  2. AUC के लिए नमूना लोडिंग
    1. चरण 4.1.1 से डायलिसिस बफर का उपयोग करके शुद्ध प्रोटीन को 450 μL की अंतिम मात्रा में मिलाएं ताकि0.3-0.6 के OD 280 तक पहुंचा जा सके। हिस्टोन चैपरोन को अलग-अलग प्रतिक्रिया ट्यूबों में जटिल गठन के लिए एच 2 ए / एच 2 बी डिमर या एच 3 / एच 4 टेट्रामर के साथ मिलाएं। प्रोटीन मिश्रण को 2-3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, अवसादन डेटा विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में हस्तक्षेप ऑप्टिकल स्कैनिंग सिस्टम के साथ प्राप्त किया जा सकता है। अलग से, शुद्ध प्रोटीन को मिलाने के लिए, हिस्टोन चैपरोन एकाग्रता को ठीक करें और सटीक स्टोइकोमेट्री प्राप्त करने के लिए हिस्टोन ऑलिगोमर्स की बढ़ती सांद्रता के साथ इसे इनक्यूबेट करें।
    2. विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज के अवशोषण डिटेक्टर का उपयोग करके एयूसी-एसवी प्रयोग के लिए डबल सेक्टर सेंटरपीस और क्वार्ट्ज खिड़कियों के साथ सेल को इकट्ठा करें जैसा कि पहले विस्तार से वर्णितहै।
    3. सेल के दो क्षेत्रों (नमूना और संदर्भ क्षेत्रों, क्रमशः) में नमूना समाधान के 400 μL और डायलिसिस बफर के 420 μL भरें।
      नोट: नमूने के मेनिस्कस के ऊपर संदर्भ मेनिस्कस रखने के लिए संदर्भ क्षेत्र में बफर की एक बड़ी मात्रा का उपयोग किया जाता है। हालांकि, ऑप्टिकल हस्तक्षेप प्रणाली का उपयोग करते समय, दो क्षेत्रों को समान मात्रा से भरें।
    4. कोशिकाओं का वजन और सटीक संतुलन करें और उन्हें चार-स्थान टाइटेनियम रोटर में लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें)। कोशिकाओं और रोटर के निचले भाग में प्रदान किए गए निशान का उपयोग करके कोशिकाओं को संरेखित करें। सेंट्रीफ्यूज में रोटर लोड करें, ढक्कन बंद करें और एक वैक्यूम विकसित करने की अनुमति दें जब तक कि दबाव एचजी के 15 माइक्रोन से कम न हो जाए और रोटर तापमान 20 डिग्री सेल्सियस तक स्थिर हो जाए (आमतौर पर 2-2.5 घंटे लगता है)।
      नोट: एयूसी ऑपरेटिंग मापदंडों में प्रयोगात्मक तापमान, रोटर की गति, स्कैन के बीच का अंतराल और एकत्र किए जाने वाले स्कैन की संख्या शामिल है। एसवी प्रयोगों के मामले में, प्रोटीन के आणविक द्रव्यमान के अनुसार स्कैन अंतराल दिया जाता है; छोटे प्रोटीन को स्कैन के बीच बड़े समय अंतराल की आवश्यकता होती है। रोटर की गति भी प्रोटीन के अपेक्षित आणविक द्रव्यमान के अनुसार निर्धारित की जाती है, और प्रयोग 20 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित किया जाता है। अवशोषण डेटा की निगरानी 280 एनएम पर की जाती है।
    5. सटीक स्टोइकोमेट्री प्राप्त करने के लिए, हिस्टोन चैपरोन एकाग्रता को स्थिर रखें और संतृप्ति प्राप्त करने के लिए हिस्टोन ऑलिगोमर्स की बढ़ती सांद्रता के साथ इनक्यूबेट करें।
  3. AUC डेटा विश्लेषण
    1. डेटा विश्लेषण पहले वर्णित25 के रूप में करें। संक्षेप में, कार्यक्रम SEDNTERP26 का उपयोग करके बफर घटकों के लिए घनत्व और चिपचिपाहट की गणना करें (सामग्री की तालिका देखें)। इसी तरह, इसकी अमीनो एसिड संरचना के आधार पर प्रोटीन की आंशिक विशिष्ट मात्रा की गणना करें, एसईडीएनटीआरपी का भी उपयोग करें।
    2. एयूसी मशीन से डेटा को प्रोग्राम SEDFIT27 में लोड करें और मेनिस्कस (लाल रेखा), सेल बॉटम (नीली रेखा), और डेटा विश्लेषण सीमाओं (हरी रेखाओं) को परिभाषित करें। एक मॉडल के रूप में निरंतर सी (एस) वितरण चुनें।
    3. इसके बाद, अधिकतम 100 तक रिज़ॉल्यूशन सेट करें; सेट अवसादन गुणांक (एस), एस मिन: 0 और एस अधिकतम: 10-15; प्रारंभ में घर्षण अनुपात को 1.2 पर सेट करें और डेटा से अनुपात प्राप्त करने के लिए तैरने का विकल्प चुनें; 1 सिग्मा नियमितीकरण के लिए आत्मविश्वास स्तर (एफ-अनुपात; जो नियमितीकरण के परिमाण को निर्धारित करता है) को 0.68 पर सेट करें; SEDNTERP से प्राप्त आंशिक विशिष्ट मात्रा, बफर घनत्व और बफर चिपचिपाहट मान सेट करें।
    4. लैम समीकरण27 को हल करने के लिए सॉफ़्टवेयर को अनुमति देने के लिए रन दबाएँ। यदि कोई महत्वपूर्ण डेटा बेमेल है तो पैरामीटर समायोजित करें। पैरामीटर समायोजित करने के बाद, सभी मापदंडों को परिशोधित करने के लिए FIT दबाएँ. रूट-माध्य-वर्ग विचलन (आरएमएसडी) मान के आधार पर फिट की गुणवत्ता का आकलन करें, जो 0.01 सिग्नल इकाइयों से कम होना चाहिए।
    5. विकल्प चुनकर चोटियों के आणविक द्रव्यमान का अनुमान लगाएं: मुख्य टूलबार के प्रदर्शन फ़ंक्शन में पीक "एमडब्ल्यू इन सी (एस)" दिखाएं, जो अणु / कॉम्प्लेक्स के 'एस' के बारे में जानकारी प्रदान करेगा।

5. हिस्टोन चैपरोनिंग फ़ंक्शन की पुष्टि करने के लिए प्लास्मिड सुपरकॉइलिंग परख

  1. न्यूक्लियोसोम असेंबली प्रतिक्रिया
    1. एक असेंबली बफर में हिस्टोन चैपरोन (1-6 μM) की बढ़ती सांद्रता के साथ H3/H4 टेट्रामर के 2 μM और H2A/H2B डिमर के 4 μM को मिलाएं [Tris HCl (pH 7.5 का 20 mM), DTT का 1 mM, MgCl2 का 1 mM, BSA का 0.1 mg/mL, और NaCl का 100 mM] मिश्रण को 30 मिनट के लिए 4 °C पर इनक्यूबेट करें।
    2. इसके साथ ही, एक अलग प्रतिक्रिया में, 50 μL की अंतिम मात्रा में असेंबली बफर में 1 μg टोपोइसोमेरेस I एंजाइम ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ नकारात्मक सुपरकोइल्ड पीयूसी 19 प्लास्मिड के 500 एनजी को पूर्वउपचारित करें और 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: टोपोइसोमेरेस आई एक एकल-फंसे हुए निक उत्पन्न करके सुपरकोइल्ड डबल-फंसे प्लास्मिड डीएनए को आराम देता है। यूकेरियोटिक मूल का एक टोपोइसोमेरेज आई एंजाइम, जैसे कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गेहूं के रोगाणु टोपोइसोमेरेस आई या पुनः संयोजक रूप से व्यक्त ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर टोपोइसोमेरेस आई का उपयोग किया जा सकता है।
    3. इसके बाद, एच 3 / एच 4 टेट्रामर, एच 2 ए / एच 2 बी डिमर, हिस्टोन चैपरोन मिश्रण (चरण 5.1.1 से), शिथिल प्लास्मिड डीएनए प्रतिक्रिया मिश्रण (चरण 5.1.2 से), और 90 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर आगे इनक्यूबेट करें।
      नोट: परख के लिए दो नियंत्रण प्रतिक्रियाएं सेट करें; एक में हिस्टोन चैपरोन और आराम से प्लास्मिड डीएनए (लेकिन हिस्टोन नहीं) होता है और दूसरे में हिस्टोन ऑलिगोमर्स और आराम से प्लास्मिड डीएनए होता है (लेकिन हिस्टोन चैपरोन नहीं)।
    4. 2x स्टॉप बफर (40 mM EDTA, 2% SDS, और 0.4 mg/mL प्रोटीन K) के 100 μL जोड़कर असेंबली प्रतिक्रिया को रोकें और 30 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: स्टॉप बफर बाउंड हिस्टोन के विकृतीकरण और प्रोटियोलिसिस द्वारा प्लास्मिड डीएनए को डीप्रोटीनाइज करता है।
  2. फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षा
    1. चरण 5.1.4 से प्रतिक्रिया मिश्रण वाले ट्यूब में ट्राइस-संतृप्त फिनोल की समान मात्रा जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं, इसके बाद कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 16,200 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें।
    2. धीरे से एक माइक्रोपिपेट के साथ प्लास्मिड डीएनए वाले ऊपरी जलीय चरण को इकट्ठा करें और क्लोरोफॉर्म की समान मात्रा के साथ मिलाएं। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 16,200 x g पर मिश्रण और सेंट्रीफ्यूज का भंवर।
      नोट: जलीय और कार्बनिक चरणों के बीच एक फजी इंटरफ़ेस से बचने के लिए इस चरण में आइसोमिल अल्कोहल को शामिल किया जा सकता है।
    3. इसके बाद, ऊपरी जलीय चरण एकत्र करें, 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच 5.5) की 1/10 वीं मात्रा और बर्फ-ठंडे इथेनॉल के 2.5 वॉल्यूम जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। ट्यूब को 3-4 बार मोड़कर घोल को अच्छी तरह से मिलाएं और प्लास्मिड डीएनए की पूर्ण वर्षा के लिए मिश्रण को 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
    4. चरण 5.2.3 से 16200 x g पर 10 मिनट के लिए नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें और धीरे से सुपरनैटेंट को छोड़ दें। ट्यूबों को कमरे के तापमान पर खुला रखें जब तक कि इथेनॉल की मात्रा का पता न लग जाए, जिससे ट्यूब में अवक्षेपित प्लास्मिड डीएनए रह जाए।
  3. प्लास्मिड सुपरकोइलिंग प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन करें।
    1. बाँझ डबल-आसुत पानी में चरण 5.2.4 से अवक्षेपित प्लास्मिड डीएनए को भंग करें।
    2. 1x Tris-एसीटेट-EDTA (TAE) बफर (40 mM Tris, 20 mM एसिटिक एसिड, और EDTA के 1 mM) में 1% अगारोस जेल पर नमूनों को हल करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. जेल को एथिडियम ब्रोमाइड की 0.2-0.5 μg / mL सांद्रता के साथ दाग दें और जेल पर डीएनए बैंड की कल्पना करने के लिए यूवी के तहत निरीक्षण करें।

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Representative Results

एराबिडोप्सिस थैलियाना से प्रोटीन एफकेबीपी 53 के पुनः संयोजक एन-टर्मिनल न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन को विश्लेषणात्मक एसईसी के अधीन किया गया था। क्षालन शिखर की मात्रा को इसकी ओलिगोमेरिक स्थिति की पहचान करने के लिए मानक वक्र के खिलाफ प्लॉट किया गया था। विश्लेषणात्मक एसईसी परिणामों से पता चला है कि डोमेन समाधान में एक पेंटामर के रूप में मौजूद है, जिसमें 58 केडीए (चित्रा 1 ए, बी) का अनुमानित आणविक द्रव्यमान है। इसके अलावा, न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन का विश्लेषण विश्लेषणात्मक एसईसी के साथ मिलकर थर्मल और रासायनिक स्थिरता के लिए किया गया था। 90 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी-उपचार के अधीन न्यूक्लियोप्लाज्मिन नमूने ने 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गए नमूनों की तुलना में क्षालन मात्रा और चरम ऊंचाई में कोई स्पष्ट बदलाव नहीं दिखाया, यह सुझाव देते हुए कि डोमेन अत्यधिक थर्मोस्टेबल है (चित्रा 1 सी)। इसी तरह, न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन ने एनएसीएल (चित्रा 1 डी) के 2 एम तक नमक स्थिरता और 4 एम (चित्रा 1 ई) तक यूरिया स्थिरता प्रदर्शित की। हालांकि, न्यूक्लियोप्लाज्मिन पेंटामर उच्च यूरिया सांद्रता में विघटित होने लगा।

ग्रेडिएंट सॉल्ट वॉश का उपयोग करके हिस्टोन चैपरोन (एटीएफकेबीपी 53 के न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन) और हिस्टोन ऑलिगोमर्स एच 2 ए / एच 2 बी डिमर और एच 3 / एच 4 टेट्रामर के बीच जटिल गठन में योगदान देने वाले इंटरैक्शन के प्रकार को निर्धारित करने के लिए एक पुल-डाउन परख का प्रदर्शन किया गया था। एच 2 बी डिमर के साथ न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन की बातचीत 0.4 एम एनएसीएल (चित्रा 2 ए) की नमक एकाग्रता तक स्थिर थी। इसकी तुलना में, H3/H4 के साथ संबंध 0.7 M NaCl (चित्रा 2B) तक यथोचित रूप से स्थिर था। उच्च नमक एकाग्रता का सामना करने के लिए चैपरोन-हिस्टोन कॉम्प्लेक्स की क्षमता कॉम्प्लेक्स को स्थिर करने में हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन की भूमिका का सुझाव देती है। एच 3 / एच 4 के साथ चैपरोन कॉम्प्लेक्स उच्च नमक सांद्रता में भी स्थिर है, जो जटिल गठन में हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन की एक प्रमुख भूमिका का सुझाव देता है। उच्च नमक सांद्रता में एच 2 ए / एच 2 बी-चैपरोन कॉम्प्लेक्स की कम स्थिरता जटिल गठन में इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का खुलासा करती है। एक अन्य प्रयोग में, पुल-डाउन परख का उपयोग यह जांचने के लिए किया गया था कि क्या चैपरोन एच 2 ए / एच 2 बी डिमर या एच 3 / एच 4 टेट्रामर पसंद करता है। परिणामों से पता चला है कि चैपरोन एच 2 ए / एच 2 बी डिमर और एच 3 / एच 4 टेट्रामर को एक साथ बांधता है और जिस क्रम में उन्हें चैपरोन में जोड़ा जाता है (चित्रा 2 सी, डी)। इससे संकेत मिलता है कि चैपरोन के पास हिस्टोन ऑलिगोमर्स के साथ इसकी बातचीत के लिए अलग-अलग साइटें हैं।

एयूसी-एसवी प्रयोग (चित्रा 3) हिस्टोन ऑलिगोमर्स और चैपरोन के बीच बातचीत के स्टोइकोमेट्री का अध्ययन करने के लिए किए गए थे। एयूसी-एसवी डेटा विश्लेषण ने एच 2 ए / एच 2 बी के साथ कॉम्प्लेक्स में एटीएफकेबीपी 53 न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन के लिए 5.40 एस का अवसादन गुणांक (एस) मूल्य प्रदान किया जो 104 केडीए के आणविक द्रव्यमान के अनुरूप था। एच 3 /एच 4 के साथ न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन के परिसर ने 129 केडीए के अनुरूप 7.35 एस का अवसादन गुणांक मूल्य दिया। परिसरों के अनुमानित आणविक द्रव्यमान से पता चलता है कि पेंटामेरिक न्यूक्लियोप्लाज्मिन 1: 1 स्टोइकोमेट्री में एच 2 ए / एच 2 बी डिमर और एच 3 / एच 4 टेट्रामर दोनों के साथ जटिल बनाता है।

यह दिखाना आवश्यक है कि प्रोटीन हिस्टोन ऑलिगोमर्स को डीएनए पर जमा कर सकता है ताकि यह पुष्टि की जा सके कि यह एक हिस्टोन चैपरोन है। इस अंत में, एक प्लास्मिड सुपरकॉइलिंग परख को अपनाया गया था (चित्रा 4)। शिथिल गोलाकार प्लास्मिड को एनएपी परिवार के पुनः संयोजक पौधे हिस्टोन चैपरोन - एटीएनआरपी 1 और एटीएनआरपी 228 के साथ हिस्टोन ऑलिगोमर्स एच 2 ए / एच 2 बी और एच 3 / एच 4 के साथ इनक्यूबेट किया गया था। चैपरोन की उपस्थिति ने सुपरकोइल्ड प्लास्मिड की मात्रा में वृद्धि की, यह सुझाव देते हुए कि यह न्यूक्लियोसोम बनाने के लिए डीएनए पर हिस्टोन जमा कर सकता है, जिससे डीएनए सुपरकॉइलिंग हो सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: एटीएफबीपी 53 के न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन की ओलिगोमेरिक स्थिति और स्थिरता। (ए) एटीएफकेबीपी 53 न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन का विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी प्रोफाइल। (बी) ज्ञात आणविक द्रव्यमान के गोलाकार प्रोटीन का उपयोग करके प्राप्त अंशांकन वक्र। नीले बिंदु ज्ञात प्रोटीन के आणविक द्रव्यमान का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि लाल बिंदु एटीएफकेबीपी 53 न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन का प्रतिनिधित्व करता है। (440 केडीए - फेरिटिन, 158 केडीए-एल्डोलस, 75 केडीए-कॉन एल्ब्यूमिन, 44 केडीए-ओवलबुमिन, 6.5 केडीए-एप्रोटिनिन)। (सी) विभिन्न तापमानों पर गर्मी उपचार के अधीन 0.5 मिलीग्राम /एमएल एटीएफकेबीपी 53 न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन के 500 μL का विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राम: 20 डिग्री सेल्सियस (हरा), 40 डिग्री सेल्सियस (नारंगी), 60 डिग्री सेल्सियस (काला), 90 डिग्री सेल्सियस (हल्का नीला)। (डी) विभिन्न एनएसीएल सांद्रता वाले बफर में 0.5 मिलीग्राम /एमएल एटीएफकेबीपी 53 न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन के 500 μL का विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राम: 0.3 एम (बैंगनी), 0.6 एम (लाल), 1.0 एम (हल्का नीला), 1.5 मीटर (हरा), 2.0 एम (काला)। (ई) विभिन्न यूरिया सांद्रता वाले बफर में एटीएफकेबीपी 53 न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन का विश्लेषणात्मक आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राम: 0 एम (नियंत्रण; हल्का नीला), 1.0 एम (गुलाबी), 2.0 एम (काला), 3.0 मीटर (गहरा नीला), 4.0 मीटर (हरा), 5.0 मीटर (भूरा)। न्यूक्लियोप्लाज्मिन पेंटामर थर्मल और रासायनिक तनाव स्थितियों के लिए उच्च स्थिरता दिखाता है। यह आंकड़ा संदर्भ21 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: हिस्टोन ऑलिगोमर्स के साथ एटीएफकेबीपी 53 के न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन की बातचीत के लिए पुल-डाउन परख। परख से क्षालन अंशों की 18% एसडीएस-पेज छवियां यहां प्रस्तुत की गई हैं। (ए) 20 μM H2A/H2B डिमर और (B) 20 μM H3/H4 टेट्रामर के लिए 5 μM ATFKBP53 न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन के साथ पुल-डाउन परख का उपयोग 0.3 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, और 1.0 M. 5 μM ATFKBP53 FKBP53 की सीमा में NaCl की बढ़ती सांद्रता में किया गया था। प्रतिस्पर्धी बाइंडिंग प्रयोग के लिए, (C) 5 μM ATFKBP53 न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन और 20 μM H3/H4 टेट्रामर के मिश्रण को 20-60 μM H2A/H2B डिमर की सीमा के साथ इनक्यूबेट किया गया है और (D) 5 μM ATFKBP53 न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन और 20-60 μM H2A/H2B डिमर के मिश्रण का उपयोग किया गया है। लेबल ATFKBP53 ATFKBP53 के न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन से मेल खाता है। क्षालन अंश न्यूक्लियोप्लाज्मिन के लिए हिस्टोन ऑलिगोमर्स दोनों के एक साथ बंधन दिखाते हैं। यह आंकड़ा संदर्भ21 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन - अवसादन वेग (एयूसी-एसवी) हिस्टोन ऑलिगोमर्स का प्रयोग, एटीएफकेबीपी 53 का न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन और उनके परिसर। एयूसी दूरी वितरण बनाम। अवसादन गुणांक (एस) प्लॉट। प्राप्त अवसादन गुणांक (एस) मान और आणविक द्रव्यमान भी प्रदान किए जाते हैं। लेबल ATFKBP53 ATFKBP53 के न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन से मेल खाता है। अनुमानित आणविक द्रव्यमान हिस्टोन ऑलिगोमर्स एच 2 ए / एच 2 बी डिमर और एच 3 / एच 4 टेट्रामर के साथ एटीएफकेबीपी 53 न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन के लिए 1: 1 स्टोइकोमेट्री को प्रकट करते हैं। एयूसी-एसवी प्रयोगों के लिए 0.3-0.5 के ओडी280 वाले सभी प्रोटीन नमूनों में से 450 μL का उपयोग किया गया था। यह आंकड़ा संदर्भ21 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्लास्मिड सुपरकॉइलिंग परख। हिस्टोन चैपरोन एटीएनआरपी 1 और एटीएनआरपी 2 के लिए प्लास्मिड सुपरकोइलिंग परख। प्रयोग के लिए 500 एनजी पीयूसी 19 प्लास्मिड डीएनए को टोपोइसोमेरेस आई के 1 μg के साथ इलाज किया गया था। 4 μM AtNRP1, 4 μM AtNRP2, और 4 μM H2A/H2B डिमर और 2 μM H3/H4 टेट्रामर का मिश्रण नियंत्रण के रूप में था जो पूर्वउपचारित pUC19 DNA के साथ इनक्यूबेट किए जाने पर कोई सुपरकॉइलिंग गतिविधि नहीं दिखाता है। डिमर के 4 μM H2A/H2B और टेट्रामर के 2 μM H3/H4 और ATNRP1 और ATNRP2 के 4 μM के मिश्रण वाली लेन पूर्वउपचारित pUC19 DNA के साथ इनक्यूबेशन पर सुपरकोइल्ड DNA के गठन को दर्शाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह काम एक कथित हिस्टोन चैपरोन के जैव रासायनिक और बायोफिज़िकल लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल के एक व्यापक सेट को प्रदर्शित और मान्य करता है। इसमें, प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए पुनः संयोजक रूप से व्यक्त और शुद्ध एनएपी परिवार प्रोटीन, एटीएनआरपी 1 और एटीएनआरपी 2, और एटीएफकेबीपी 53 के एन-टर्मिनल न्यूक्लियोप्लाज्मिन डोमेन का उपयोग किया गया था। प्रयोगों के एक ही सेट का उपयोग किसी भी जीव से पहले से अज्ञात हिस्टोन चैपरोन की कार्यात्मक विशेषताओं को चित्रित करने के लिए किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल अनुभाग के पहले भाग में एक हिस्टोन चैपरोन की ऑलिगोमेरिक स्थिति और स्थिरता की जांच शामिल है। कई रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि हिस्टोन चैपरोन अपने ऑलिगोमेरिक अवस्था में काफी विविधता प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, मानव सीएएफ -1 एक मोनोमर29 के रूप में मौजूद है। एनएपी परिवार के सदस्य डिमर या टेट्रामर 29,30,31 के रूप में मौजूद हैं। न्यूक्लियोप्लाज्मिन पेंटामेरिक और अक्सर डेकामेरिक ओलिगोमेरिक अवस्थाओंको प्रकट करते हैं 32,33। एक विश्लेषणात्मक एसईसी प्रयोग हिस्टोन चैपरोन की ऑलिगोमेरिक स्थिति निर्धारित कर सकता है, और एयूसी-एसवी प्रयोग इसकी पुष्टि कर सकते हैं। हिस्टोन चैपरोन में से कई को विभिन्न थर्मल और रासायनिक तनाव स्थितियों33,34 के तहत अत्यधिक स्थिर माना जाता है। हिस्टोन चैपरोन की थर्मल और रासायनिक स्थिरता विशेषताओं को विश्लेषणात्मक एसईसी के साथ संयोजन में भी खोजा जा सकता है। इसके अलावा, गोलाकार डाइक्रोइजम स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग रासायनिक एजेंट के बढ़ते तापमान या उच्च सांद्रता के अधीन होने पर चैपरोन की द्वितीयक संरचना में परिवर्तन के गहन विश्लेषण के लिए प्रभावी ढंग से किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल अनुभाग के दूसरे भाग में पुल-डाउन परख शामिल हैं जो मौलिक इंटरैक्शन की जांच कर सकते हैं जो एक चैपरोन के हिस्टोन ऑलिगोमर वरीयता की पहचान करने के लिए नमक-ढाल दृष्टिकोण और प्रतिस्पर्धी पुल-डाउन परख का उपयोग करके चैपरोन के साथ हिस्टोन ऑलिगोमर्स के जुड़ाव की सहायता करते हैं। यदि कॉम्प्लेक्स नमक एकाग्रता में मामूली वृद्धि के साथ अलग हो जाता है, तो यह कॉम्प्लेक्स को स्थिर करने में इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के एक बड़े योगदान का सुझाव देगा। उच्च नमक में एक बरकरार परिसर कॉम्प्लेक्स35 को स्थिर करने में हाइड्रोफोबिसिटी के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का सुझाव देगा। प्रतिस्पर्धी पुल-डाउन परख को एक विशिष्ट हिस्टोन ऑलिगोमर वर्ग के लिए हिस्टोन चैपरोन की विशिष्टता या वरीयता निर्धारित करने के लिए आसानी से नियोजित किया जा सकता है। हिस्टोन ऑलिगोमर्स के प्रति उनकी प्राथमिकता के आधार पर, हिस्टोन चैपरोन को तीन श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है जैसे कि एच 2 ए / एच 2 बी चैपरोन, एच 3 / एच 4 चैपरोन, और एच 2 ए / एच 2 बी-एच 3 / एच 4 चैपरोन10,36। इसके अलावा, यदि आवश्यक हो, तो आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) का उपयोग किसी दिए गए चैपरोन की हिस्टोन ऑलिगोमर विशिष्टता और उनकी बातचीत की थर्मोडायनामिक विशेषताओं को समझने के लिए किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल अनुभाग के तीसरे भाग में हिस्टोन चैपरोन और हिस्टोन ऑलिगोमर्स के बीच इंटरैक्शन स्टोइकोमेट्री की जांच शामिल है। सामान्य तौर पर, हिस्टोन चैपरोन के विभिन्न परिवार एच 2 ए / एच 2 बी या / और एच 3 / एच 421,28,37,38 के साथ उनके संबंध के स्टोइकोमेट्री के लिए काफी भिन्न होते हैं। एयूसी-एसवी प्रयोग एक प्रोटीन या उसके परिसर के अवसादन गुणांक (एस) और आणविक द्रव्यमान प्राप्त करने में सहायता करता है, जो जटिल गठन में स्टोइकोमेट्री का सटीक अनुमान लगाने में बहुत उपयोगी हो जाता है। वैकल्पिक रूप से, आईटीसी का उपयोग स्टोइकोमेट्री की जांच के लिए भी किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल अनुभाग का चौथा भाग हिस्टोन चैपरोन के न्यूक्लियोसोम असेंबली फ़ंक्शन की जांच करने पर केंद्रित है। हिस्टोन चैपरोन न्यूक्लियोसोम असेंबली में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जो प्रतिकृति, प्रतिलेखन और डीएनए मरम्मत जैसी महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करताहै। प्लास्मिड सुपरकोइलिंग परख जो आमतौर पर हिस्टोन चैपरोन की हिस्टोन चैपरोनिंग गतिविधि के इन विट्रो मूल्यांकन के लिए नियोजित होती है, इस खंड में विस्तृत है।

यह ध्यान दिया जा सकता है कि सभी हिस्टोन चैपरोन पूरी तरह से संरचित नहीं हैं। कुछ को आंतरिक रूप से अव्यवस्थितक्षेत्रों 40,41 के लिए जाना जाता है। इसलिए, थर्मल और रासायनिक स्थिरता परख ऐसे प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं हो सकते हैं। इसके अलावा, विभिन्न जीवों के हिस्टोन चैपरोन में हिस्टोन से जुड़ने के लिए अलग-अलग ओलिगोमेरिक अवस्थाएं और अंतर क्षमताएं होती हैं। इसलिए, यह प्रोटोकॉल एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु हो सकता है लेकिन आवश्यकतानुसार संशोधन ों को शामिल करेगा।

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Disclosures

हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की गई।

Acknowledgments

दिलीप वासुदेवन को विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड, भारत सरकार [सीआरजी/2018/000695/पीएस] और जैव प्रौद्योगिकी विभाग, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, भारत सरकार [बीटी/आईएनएफ/22/एसपी33046/2019] से अतिरिक्त अनुदान के साथ-साथ इंस्टीट्यूट ऑफ लाइफ साइंसेज, भुवनेश्वर से इंट्राम्यूरल समर्थन को बहुत स्वीकार किया जाता है। हम सुश्री सुदेशना सेन और सुश्री अन्नपूर्णा साहू को हिस्टोन तैयारी में उनकी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। हमारे सहयोगियों डॉ चिन्मयी महापात्र, श्री मानस कुमार जगदेव और डॉ शेख नौसाद हुसैन के साथ चर्चा को भी स्वीकार किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250

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References

  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 20, Unit20.12 (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

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बायोकैमिस्ट्री अंक 178 हिस्टोन चैपरोन न्यूक्लियोसोम असेंबली क्रोमैटिन न्यूक्लियोप्लाज्मिन एनएपी प्लास्मिड सुपरकॉइलिंग विश्लेषणात्मक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन
<em>इन विट्रो</em> विश्लेषणात्मक, पुल-डाउन और चैपरोनिंग परख का उपयोग करके हिस्टोन चैपरोन का लक्षण वर्णन
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Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).

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