Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro Karakterisering av Histone Chaperones med hjälp av analytiska, pull-down och chaperoning analyser

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63218
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1, 1,4, 1,5, 1, 1
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver ett batteri av metoder som inkluderar analytisk storleksuteslutningskromatografi för att studera histon chaperon oligomerisering och stabilitet, pull-down-analys för att avslöja histon chaperone-histoninteraktioner, AUC för att analysera stökiometrin hos proteinkomplexen och histon chaperoning-analys för att funktionellt karakterisera en förmodad histon chaperon in vitro.

Abstract

Histonproteiner associerar med DNA för att bilda det eukaryota kromatinet. Den grundläggande enheten för kromatin är en nukleosom, som består av en histonoktamer bestående av två kopior av kärnhistonerna H2A, H2B, H3 och H4, lindade runt av DNA. Oktameren består av två kopior av en H2A/H2B-dimer och en enda kopia av en H3/H4-tetramer. De högt laddade kärnhistonerna är benägna att icke-specifika interaktioner med flera proteiner i den cellulära cytoplasman och kärnan. Histon chaperoner bildar en mångsidig klass av proteiner som transporterar histoner från cytoplasman till kärnan och hjälper deras avsättning på DNA, vilket hjälper nukleosommonteringsprocessen. Vissa histon chaperoner är specifika för antingen H2A / H2B eller H3 / H4, och vissa fungerar som chaperoner för båda. Detta protokoll beskriver hur in vitro-laboratorietekniker som pull-down-analyser, analytisk storleksuteslutningskromatografi, analytisk ultracentrifugering och histon chaperon-analys kan användas tillsammans för att bekräfta om ett givet protein är funktionellt som en histon chaperon.

Introduction

Nukleosomer som består av DNA- och histonproteiner bildar den strukturella enheten av kromatin och reglerar flera kritiska cellulära händelser. Nukleosomer omplaceras och omformas dynamiskt för att göra DNA tillgängligt för olika processer såsom replikation, transkription och översättning 1,2. Histoner som är mycket basiska tenderar antingen att interagera med sura proteiner i den cellulära miljön eller genomgå aggregering, vilket leder till olika cellulära defekter 3,4,5. En grupp dedikerade proteiner som kallas histon chaperoner hjälper till att transportera histoner från cytoplasman till kärnan och förhindrar avvikande histon-DNA-aggregeringshändelser 6,7. I grund och botten lagrar och överför de flesta histon chaperoner till DNA vid fysiologisk jonstyrka, vilket hjälper till att bilda nukleosomer 8,9. Vissa histon chaperoner har en bestämd preferens för histon oligomererna H2A / H2B eller H3 / H410.

Histon chaperoner kännetecknas baserat på deras förmåga att montera nukleosomer som är beroende eller oberoende av DNA-syntes11. Till exempel är kromatinmonteringsfaktor-1 (CAF-1) beroende medan histonregulator A (HIRA) är oberoende av DNA-syntes12,13. På liknande sätt är nukleoplasminfamiljen av histon chaperoner involverad i spermiekromatindekondensation och nukleosommontering14. Familjemedlemmarna med nukleosommonteringsprotein (NAP) underlättar bildandet av nukleosomliknande strukturer in vitro och är involverade i shuttling av histoner mellan cytoplasma och kärna15. Nukleoplasminer och NAP-familjeproteiner är båda funktionella histon chaperoner men delar inga strukturella egenskaper. I huvudsak tillåter ingen enskild strukturell egenskap klassificeringen av ett protein som en histon chaperon16. Användningen av funktionella och biofysiska analyser tillsammans med strukturella studier fungerar bäst för att karakterisera histon chaperoner.

Detta arbete beskriver biokemiska och biofysiska metoder för att karakterisera ett protein som en histon chaperon som hjälper nukleosommontering. Först utfördes analytisk storleksuteslutningskromatografi för att analysera den oligomera statusen och stabiliteten hos histon chaperoner. Därefter utfördes en pull-down-analys för att bestämma drivkrafterna och den konkurrenskraftiga karaktären hos histon chaperone-histoninteraktioner. De hydrodynamiska parametrarna för dessa interaktioner kunde emellertid inte beräknas exakt med hjälp av analytisk storleksuteslutningskromatografi på grund av proteinets form och dess komplex som påverkar deras migration genom kolonnen. Därför användes analytisk ultracentrifugering, vilket ger makromolekylära egenskaper i lösning som innefattar exakt molekylvikt, stökiometri av interaktion och formen av de biologiska molekylerna. Tidigare studier har i stor utsträckning använt in vitro histon chaperoning analys för att funktionellt karakterisera histon chaperoner såsom yScS11617, DmACF 18, ScRTT106p19, HsNPM120. Histone chaperoning analys användes också för att funktionellt karakterisera proteinerna som histon chaperoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Analytisk storleksuteslutningskromatografi för att belysa den oligomera statusen och stabiliteten hos histonchaperoner

  1. Analys av den oligomera statusen hos histon chaperoner
    1. Balansera en 24 ml analytisk storleksuteslutningskromatografikolonn (SEC) med 1,2 kolonnvolym (CV), dvs. 28,8 ml avgasad SEC-buffert [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl och 1 mM β-merkaptoetanol (β-ME)] vid 4 °C (se materialtabell).
      OBS: Kolonntyp, buffertsammansättning och buffert-pH kan väljas baserat på proteinet av intresse. Provinjektionsvolymen bör inte överstiga 500 μl för en 24 ml kolonn. Kolonntrycket måste också bibehållas under 5 MPa.
    2. Bereda 500 μl 0,5 mg/ml proteinprov från en proteinstamlösning med högre koncentration i avgasad SEC-buffert och injicera det i den förutjämnade kolonnen med hjälp av en 500 μl injektionsslinga. Låt kromatografikörningen fortsätta med en isokratisk flödeshastighet på 0,2–0,3 ml/min med SEC-bufferten vid 4 °C.
    3. Övervaka proteinets elueringsprofil genom att mäta absorbansen vid en våglängd på 280 nm. När du hanterar proteiner som saknar aromatiska rester, mät absorbansen vid 214 nm.
    4. Använd proteinets elueringsvolym för att beräkna dess ungefärliga molekylvikt i kDa med hjälp av standardkalibreringskurvan21.
      OBS: Kalibreringskurvan framställs genom att plotta retentionsvolymen för kända molekylviktsproteiner mot loggen för deras respektive molekylvikter (log Mr), eluerade med samma kolonn.
  2. Analys av den termiska stabiliteten hos histon chaperones
    1. Ta 500 μl 0,5 mg/ml av det proteinprov som beretts i avgasad SEC-buffert (samma som används i 1.1.1) i enskilda mikrocentrifugrör och värm varje rör till en viss temperatur mellan 20 °C och 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C och 90 °C) i 10 minuter i ett vattenbad.
    2. Därefter centrifugera de värmebehandlade proverna vid 16 200 x g i 10 minuter vid 4 °C, samla supernatanten med en mikropipett och injicera varje prov individuellt med hjälp av en 500 μl injektionsslinga i analyskolonnen, förbalanserad med SEC-bufferten vid 4 °C.
    3. Låt kromatografikörningen fortsätta med en isokratisk flödeshastighet på 0,2–0,3 ml/min med SEC-bufferten vid 4 °C.
    4. Observera elueringstopparnas position och höjd och leta efter utseendet på ytterligare toppar för de olika proverna.
  3. Analys av den kemiska stabiliteten hos histon chaperoner
    1. För att undersöka saltstabiliteten hos histon chaperoner, inkubera 500 μl 0,5 mg / ml proteinprov framställt i en Tris-buffert [20 mM Tris-HCl (pH 7,5) och 1 mM β-ME] kompletterat med ökande koncentrationer av NaCl (300 mM, 600 mM, 1 M, 1,5 M och 2 M) i separata mikrocentrifugrör i 30 minuter vid 4 ° C. Centrifugera proverna vid 16 200 x g i 10 min vid 4 °C och behåll supernatanten.
    2. Ladda sedan proteinproverna i olika NaCl-koncentrationer individuellt med hjälp av en 500 μL injektionsslinga i analyskolonnen som är förutjämnad med 1,2 CV (28,8 ml) av respektive buffert som innehåller ökande NaCl-koncentrationer vid 4 °C.
    3. Låt kromatografikörningen fortsätta med en isokratisk flödeshastighet på 0,2–0,3 ml/min med 1 CV (24 ml) av respektive buffert vid 4 °C.
    4. Observera positionen och höjden på elueringstopparna och leta efter utseendet på ytterligare toppar för de olika proverna.
    5. För ureastabilitetsanalys inkubera på liknande sätt 500 μl 0,5 mg/ml proteinprov framställt i en Tris-buffert [20 mM Tris-HCl (pH 7,5) och 1 mM β-ME] kompletterat med ökande ureakoncentrationer (1 M, 2 M, 3 M, 4 M och 5 M) i separata mikrocentrifugrör i 16 timmar vid rumstemperatur. Centrifugera proverna vid 16 200 x g i 10 minuter vid rumstemperatur och behåll supernatanten.
    6. Ladda sedan de ureabehandlade proteinproverna individuellt med hjälp av en 500 μL injektionsslinga i analyskolonnen som är förutjämnad med 1,2 CV (28,8 ml) av motsvarande buffert innehållande olika ureakoncentrationer vid rumstemperatur.
    7. Låt kromatografikörningen fortsätta med en isokratisk flödeshastighet på 0,2-0,3 ml/min med 1 CV (24 ml) av respektive buffert vid rumstemperatur.
      VARNING: Utför inte experimenten med buffert som innehåller urea vid en lägre temperatur eftersom urea tenderar att kristallisera och skada kolonnen.
    8. Observera elueringstopparnas position och höjd och leta efter utseendet på ytterligare toppar för de olika proverna.

2. Saltgradientbaserade pull-down-analyser för att förstå vilken typ av interaktioner som bidrar till den komplexa bildningen mellan histonoligomerer och en histonchaperon

  1. För varje reaktion av pull-down-analys, pipettera 40 μL Ni-NTA-harts i en spinnkolonn och tvätta med sterilt dubbeldestillerat vatten. Därefter jämställer du hartset med 100 CV (4 ml) jämviktsbuffert [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 10 μg/ml BSA och 1 mM β-ME] (se materialtabell).
    OBS: Neddragning kan också utföras i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  2. Bered provet genom att blanda 5 μM av den His-märkta histonchaperonen med antingen 20 μM histon H2A/H2B dimer eller H3/H4-tetramer i jämviktsbufferten. Inkubera provet på is i 1 timme.
    OBS: H2A/H2B-dimer- och H3/H4-tetramerer framställs av rekombinanta humana histoner21, och oligomerernas integritet bekräftas baserat på de uppskattade molekylmassorna genom analytisk ultracentrifugering (AUC). Samma histonoligomerer har använts för alla experiment som nämns nedan.
  3. Ladda proverna i separata förutjämnade spinnkolonner med Ni-NTA-harts från steg 2.1, var och en märkt för en viss saltkoncentration, och håll kolonnerna i 30 minuter vid 4 °C. Centrifugera kolonnerna vid 1000 x g i 1 min.
  4. Tvätta sedan kolonnerna med 100 CV (4 ml) tvättbuffert [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM imidazol, 0,2% Tween-20 och 1 mM β-ME] som innehåller olika saltkoncentrationer (dvs. 300 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM och 1 M NaCl). Tvätta varje kolumn med en buffert med en viss saltkoncentration.
  5. Efter salttvättsteget eluerar du proteinet från de olika kolonnerna med användning av 100 μl elueringsbuffert [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 300 mM imidazol och 1 mM β-ME].
  6. Därefter utsätta de eluterade proverna för 18% SDS-PAGE22 och visualisera gelén efter färgning med Coomassie Brilliant Blue R250 (se Materialtabell). Alternativt kan du direkt ladda hartset på SDS-PAGE-gelén istället för att eluera det bundna proteinet från Ni-NTA-hartset.
    OBS: Jämvikts-, tvätt- och elueringsbuffertkompositioner och pH kan modifieras beroende på proteinet av intresse.

3. Konkurrenskraftig pull-down-analys för att identifiera preferensen för en histon chaperon för H2A / H2B eller H3 / H4

  1. Förbered spinnkolumnen enligt beskrivningen i steg 2.1
  2. Inkubera 5 μM av histonchaperonen med 20 μM H2A/H2B-dimerer i 300 μl jämviktsbuffert (beredd i steg 2.1) i 30 minuter på is.
    OBS: Förhållandet mellan histonoligomer och histonchaperon i reaktionen kan väljas baserat på kända bindande stökiometridata; Använd femfaldigt överskott av histon om ingen information finns tillgänglig.
  3. Centrifugera histon chaperon-H2A/H2B-komplexet vid 16 200 x g i 5 minuter vid 4 °C för att avlägsna eventuell fällning. Ladda sedan provet på spinnkolonnen som är förbalanserad med jämviktsbuffert (beredd i steg 2.1) och inkubera i 30 minuter vid 4 °C.
  4. Tvätta kolonnen med 100 CV (4 ml) tvättbuffert [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 50 mM imidazol, 0,2 % Tween-20 och 1 mM β-ME] för att avlägsna överskott av H2A/H2B dimer. Blanda sedan histon chaperone-H2A / H2B-komplexet med 20-60 μM H3 / H4-tetramer och inkubera i 30 minuter på is.
  5. Tvätta om kolonnen med 100 CV (4 ml) tvättbuffert (beredd i steg 3.4) för att avlägsna obunden H3/H4-tetramer och eluera provet med hjälp av elueringsbuffert (beredd i steg 2.5). Utsätt de eluterade proverna för 18% SDS-PAGE och visualisera efter färgning med Coomassie Brilliant Blue R250.
    OBS: Analysen kan vändas där först H3 / H4-tetrameren kan blandas med chaperonen, komplexet får binda till Ni-NTA-pärlor och komplexet inkuberas sedan med varierande koncentrationer av H2A / H2B-dimer.

4. Analytiska experiment med ultracentrifugering - sedimenteringshastighet (AUC-SV) för att analysera bindningsstökiometrin mellan histonchaperoner och histoner

  1. Provberedning för AUC
    1. Dialysera den rekonstituerade histonen H2A/H2B-dimeren, H3/H4-tetramern och histonchaperonen separat genom en 7 kDa cut-off dialysslang23, mot en dialysbuffert [20 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl och 1 mM β-ME] (se materialförteckning). För att minimera bakgrundsfel på grund av buffertmatchning, utför dialys i stor utsträckning mot dialysbufferten, helst tre gånger under en period av 24 timmar.
      OBS: Den ursprungliga OD 280 av proteinproverna bör ha ett två till en tre gånger högre värde för att uppnå en slutlig OD280 på 0,3-0,5. Detta görs i huvudsak för att upphäva effekterna av utspädning.
    2. Rena H2A/H2B dimer, H3/H4-tetramer och histonchaperonen individuellt med dialysbufferten med hjälp av analytisk storleksuteslutningskromatografi (som nämns i steg 1). Spara bufferten från körningen för att förbereda ytterligare utspädningar senare och för att använda som referens i AUC-cellen.
  2. Exempel på inläsning för AUC
    1. Blanda de renade proteinerna i en slutlig volym på 450 μl med dialysbuffert från steg 4.1.1 för att nå en OD280 på 0,3-0,6. Blanda histonchaperonen med H2A/H2B-dimeren eller H3/H4-tetrameren för komplex bildning i separata reaktionsrör. Inkubera proteinblandningarna i 2-3 h.
      OBS: Alternativt kan sedimenteringsdata erhållas med ett interferensoptiskt skanningssystem i den analytiska ultracentrifugen. Separat, för att blanda renade proteiner, fixera histon chaperonkoncentrationen och inkubera den med ökande koncentrationer av histonoligomererna för att erhålla exakt stökiometri.
    2. Montera cellen med ett dubbelt sektormittstycke och kvartsfönster för AUC-SV-experimentet med hjälp av en absorbansdetektor för den analytiska ultracentrifugen som beskrivits tidigare i detalj24.
    3. Fyll 400 μl av provlösningen och 420 μl dialysbuffert i cellens två sektorer (prov- respektive referenssektorer).
      OBS: En större volym buffert används i referenssektorn för att hålla referensmenisken ovanför provets menisk. Men när du använder ett optiskt störningssystem, fyll de två sektorerna med samma volym.
    4. Väg och balansera cellerna noggrant och ladda dem i en titanrotor med fyra platser (se materialtabell). Rikta in cellerna med hjälp av märkena längst ner på cellerna och rotorn. Ladda rotorn i centrifugen, stäng locket och låt utveckla ett vakuum tills trycket sjunker till mindre än 15 mikron Hg och rotortemperaturen stabiliseras till 20 ° C (tar vanligtvis 2-2,5 timmar).
      OBS: AUC-driftsparametrar inkluderar experimentell temperatur, rotorhastighet, intervallet mellan skanningar och antalet skanningar som ska samlas in. Vid SV-experiment ges skanningsintervallet enligt proteinets molekylmassa; Mindre proteiner kräver större tidsintervall mellan skanningarna. Rotorhastigheten ställs också in efter proteinets förväntade molekylmassa, och experimentet utförs vid 20 °C. Absorbansdata övervakas vid 280 nm.
    5. För att erhålla den exakta stökiometrin, håll histon chaperonkoncentrationen konstant och inkubera med ökande koncentrationer av histonoligomerer för att uppnå mättnad.
  3. AUC-dataanalys
    1. Utför dataanalysen som tidigare beskrivits25. Kortfattat beräkna densiteten och viskositeten för buffertkomponenterna med hjälp av programmet SEDNTERP26 (se Materialförteckning). På liknande sätt beräkna den partiella specifika volymen av proteinet baserat på dess aminosyrakomposition, även med användning av SEDNTERP.
    2. Ladda data från AUC-maskinen i programmet SEDFIT27 och definiera menisken (röd linje), cellbotten (blå linje) och dataanalysgränser (gröna linjer). Välj kontinuerlig C(s)-distribution som modell.
    3. Ställ sedan in upplösning maximalt upp till 100; inställd sedimenteringskoefficient (s), s min: 0 och s max: 10-15; ställ in friktionsförhållandet till 1,2 initialt och välj att flyta för att härleda förhållandet från data; ställa in konfidensnivå (F-förhållande; som bestämmer storleken på regularisering) till 0,68 för 1 sigma-regularisering; ställa in partiella specifika volym-, buffertdensitets- och buffertviskositetsvärden som erhållits från SEDNTERP.
    4. Tryck på RUN så att programvaran kan lösa Lamm ekvation27. Justera parametrarna om det finns ett betydande datamatchningsfel. När du har justerat parametrarna trycker du på FIT för att förfina alla parametrar. Bedöm kvaliteten på passformen baserat på RMSD-värdet (root-mean-square deviation), som bör vara mindre än 0,01 signalenheter.
    5. Uppskatta topparnas molekylmassor genom att välja alternativet: visa topp "Mw i c(s)" i displayfunktionen i huvudverktygsfältet, vilket ger information om molekylens/komplexets "s".

5. Plasmid supercoiling analys för att bekräfta histon chaperoning funktion

  1. Nukleosommontering reaktion
    1. Blanda 2 μM H3/H4-tetramer och 4 μM H2A/H2B-dimerer med ökande koncentrationer av histonchaperonen (1-6 μM) i en monteringsbuffert [20 mM Tris HCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 1 mM MgCl2,0,1 mg/ml BSA och 100 mM NaCl] till en slutlig volym på 50 μl. Inkubera blandningen vid 4 °C i 30 minuter.
    2. Samtidigt, i en separat reaktion, förbehandla 500 ng av den negativt supercoiled pUC19-plasmiden med 1 μg topoisomeras I-enzym (se materialtabell) i monteringsbufferten i en slutlig volym på 50 μl och inkubera vid 30 °C i 30 minuter.
      OBS: Topoisomeras I slappnar av det supercoiled dubbelsträngade plasmid-DNA genom att generera en enkelsträngad nick. Ett topoisomeras I-enzym av eukaryot ursprung, såsom det kommersiellt tillgängliga vetegroddartopoisomeras I eller rekombinant uttryckt Drosophila melanogaster topoisomeras I, kan användas.
    3. Kombinera sedan H3/H4-tetrameren, H2A/H2B-dimeren, histonchaperonblandningen (från steg 5.1.1), den avslappnade plasmid-DNA-reaktionsblandningen (från steg 5.1.2) och inkubera ytterligare vid 30 °C i 90 minuter.
      OBS: Ställ in två kontrollreaktioner för analysen; den ena har histon chaperon och avslappnad plasmid DNA (men inte histonerna) och den andra har histon oligomerer och avslappnad plasmid DNA (men inte histon chaperone).
    4. Stoppa monteringsreaktionen genom att tillsätta 100 μl 2x stoppbuffert (40 mM EDTA, 2 % SDS och 0,4 mg/ml proteinas K) och inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
      OBS: Stoppbuffert deproteiniserar plasmid-DNA genom denaturering och proteolys av bundna histoner.
  2. Extraktion av fenol-kloroform och etanolutfällning
    1. Tillsätt en lika stor volym Tris-mättad fenol i röret som innehåller reaktionsblandningen från steg 5.1.4 och blanda väl, följt av centrifugering vid 16 200 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.
    2. Samla försiktigt den övre vattenfasen med plasmid-DNA med en mikropipett och blanda med en lika stor volym kloroform. Virvla blandningen och centrifugera vid 16 200 x g i 10 min vid rumstemperatur.
      OBS: Isoamylalkohol kan inkluderas i detta steg för att undvika ett luddigt gränssnitt mellan de vattenhaltiga och organiska faserna.
    3. Samla sedan upp den övre vattenfasen, tillsätt 1/10: e volymen 3 M natriumacetat (pH 5,5) och 2,5 volymer iskall etanol (se materialtabell). Blanda lösningen väl genom att invertera röret 3-4 gånger och förvara blandningen i en frys på -20 °C i 30 minuter för fullständig utfällning av plasmid-DNA.
    4. Centrifugera provet från steg 5.2.3 vid 16200 x g i 10 minuter och kassera supernatanten försiktigt. Håll rören öppna vid rumstemperatur tills även spårmängder etanol avdunstar och lämnar det utfällda plasmid-DNA:t i röret.
  3. Utför agarosgelelektroforesen för att observera plasmidsupercoiling-effekten.
    1. Lös upp det utfällda plasmid-DNA:t från steg 5.2.4 i sterilt dubbeldestillerat vatten.
    2. Lös proverna på en 1% agarosgel i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert (40 mM Tris, 20 mM ättiksyra och 1 mM EDTA) (se Materialförteckning).
    3. Färga gelén med 0,2-0,5 μg/ml koncentration av etidiumbromid och observera under UV för att visualisera DNA-banden på gelén.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den rekombinanta N-terminala nukleoplasmindomänen för proteinet FKBP53 från Arabidopsis thaliana utsattes för analytisk SEC. Elueringstoppvolymen plottades mot standardkurvan för att identifiera dess oligomera tillstånd. De analytiska SEC-resultaten avslöjade att domänen existerar som en pentamer i lösning, med en ungefärlig molekylmassa på 58 kDa (figur 1A,B). Vidare analyserades nukleoplasmindomänen för termisk och kemisk stabilitet i samband med analytisk SEC. Nukleoplasminprovet som utsattes för värmebehandling upp till 90 °C uppvisade ingen uppenbar förskjutning i elueringsvolymen och topphöjden jämfört med de prover som hölls vid 20 °C, vilket tyder på att domänen är mycket termostabil (figur 1C). På samma sätt visade nukleoplasmindomänen saltstabilitet upp till 2 M NaCl (figur 1D) och ureastabilitet upp till 4 M (figur 1E). Nukleoplasminpentameren började dock dissocieras i högre ureakoncentrationer.

En pull-down-analys utfördes för att bestämma vilken typ av interaktioner som bidrar till den komplexa bildningen mellan histon chaperon (nukleoplasmindomänen för AtFKBP53) och histonoligomererna H2A / H2B dimer och H3 / H4 tetramer med användning av en gradient salttvätt. Interaktionen mellan nukleoplasmindomänen och H2A/H2B-dimeren var stabil upp till en saltkoncentration på 0,4 M NaCl (figur 2A). Som jämförelse var sambandet med H3/H4 någorlunda stabilt upp till 0,7 M NaCl (figur 2B). Chaperon-histonkomplexens förmåga att motstå hög saltkoncentration föreslår rollen som hydrofoba interaktioner för att stabilisera komplexen. Chaperonkomplexet med H3 / H4 som är stabilt även i höga saltkoncentrationer tyder på en dominerande roll av hydrofoba interaktioner i den komplexa bildningen. Den lägre stabiliteten hos H2A/H2B-chaperonkomplexet i höga saltkoncentrationer avslöjar en betydande roll för elektrostatiska interaktioner i den komplexa bildningen. I ett annat experiment användes pull-down-analysen för att undersöka om chaperonen föredrar antingen H2A/H2B-dimer- eller H3/H4-tetramer. Resultaten visade att chaperonen binder till H2A/H2B dimer och H3/H4-tetramer samtidigt och oavsett i vilken ordning de tillsätts chaperonen (figur 2C,D). Detta indikerade att chaperonen har separata platser för sin interaktion med histonoligomererna.

AUC-SV-experiment (figur 3) utfördes för att studera stökiometrin för interaktion mellan histonoligomerer och chaperoner. AUC-SV-dataanalys gav ett sedimentationskoefficientvärde på 5,40 S för AtFKBP53-nukleoplasmindomänen i komplex med H2A/H2B som motsvarade en molekylmassa på 104 kDa. Komplexet av nukleoplasmindomänen med H3 / H4 gav ett sedimentationskoefficientvärde på 7,35 S, motsvarande 129 kDa. Den uppskattade molekylmassan för komplexen avslöjar att det pentamera nukleoplasminet bildar komplex med både H2A / H2B-dimer- och H3 / H4-tetramer i en 1: 1-stökiometri.

Det är viktigt att visa att proteinet kan deponera histonoligomerer på DNA för att bekräfta att det är en histon chaperon. För detta ändamål antogs en plasmid supercoiling-analys (figur 4). Den avslappnade cirkulära plasmiden inkuberades med histonoligomererna H2A/H2B och H3/H4 med de rekombinanta växthistonerna i NAP-familjen - AtNRP1 och AtNRP228. Närvaron av chaperonen ökade mängden supercoiled plasmid, vilket tyder på att den kan deponera histoner på DNA för att bilda nukleosomer, vilket orsakar DNA-supercoiling.

Figure 1
Figur 1: Oligomeriskt tillstånd och stabilitet hos nukleoplasmindomänen för AtFBP53. (A) Analytisk storleksuteslutningskromatografiprofil för AtFKBP53-nukleoplasmindomänen. B) Kalibreringskurva erhållen med hjälp av klotformiga proteiner med känd molekylmassa. De blå prickarna representerar molekylmassan för de kända proteinerna, medan den röda pricken representerar AtFKBP53-nukleoplasmindomänen. (440 kDa - ferritin, 158 kDa-aldolase, 75 kDa-con albumin, 44 kDa-ovalbumin, 6,5 kDa-aprotinin). (C) Analytiskt kromatogram med storleksuteslutning på 500 μl 0,5 mg/ml AtFKBP53-nukleoplasmindomän som utsätts för värmebehandling vid olika temperaturer: 20 °C (grön), 40 °C (orange), 60 °C (svart), 90 °C (ljusblå). (D) Analytiskt storleksuteslutningskromatogram på 500 μl av 0,5 mg / ml AtFKBP53-nukleoplasmindomän i buffertar som innehåller olika NaCl-koncentrationer: 0,3 M (lila), 0,6 M (röd), 1,0 M (ljusblå), 1,5 M (grön), 2,0 M (svart). (E) Analytiskt storleksuteslutningskromatogram för AtFKBP53-nukleoplasmindomänen i buffertar med olika ureakoncentrationer: 0 M (kontroll; ljusblå), 1,0 M (rosa), 2,0 M (svart), 3,0 M (mörkblå), 4,0 M (grön), 5,0 M (brun). Nukleoplasminpentameren visar hög stabilitet mot termiska och kemiska spänningsförhållanden. Figuren är anpassad från referens21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Pull-down-analyser för interaktionen mellan nukleoplasmindomänen för AtFKBP53 och histonoligomerer. 18% SDS-PAGE-bilder av elueringsfraktionerna från analyserna presenteras här. Pull-down-analys för ( A ) 20 μM H2A/H2B-dimer och (B) 20 μM H3/H4-tetramer med 5 μM AtFKBP53-nukleoplasmindomän i ökande koncentrationer av NaCl i intervallet 0,3 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M och 1,0 M. 5 μM AtFKBP53 FKBD användes som en negativ kontroll här. För det konkurrensutsatta bindningsexperimentet har ( C ) en blandning av 5 μM AtFKBP53 nukleoplasmindomän och 20 μM H3/H4-tetramer inkuberad med ett intervall av 20-60 μM H2A/H2B-dimer och (D) en blandning av 5 μM AtFKBP53-nukleoplasmindomän och 20 μM H2A/H2B-dimer inkuberad med ett intervall av 20-60 μM H3/H4-tetramer använts. Etiketten AtFKBP53 motsvarar nukleoplasmindomänen för AtFKBP53. Elueringsfraktioner visar samtidig bindning av båda histonoligomererna till nukleoplasminet. Figuren är anpassad från referens21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Analytisk ultracentrifugering - sedimenteringshastighet (AUC-SV) experiment av histonoligomerer, nukleoplasmindomänen för AtFKBP53 och deras komplex. AUC-avståndsfördelningen jämfört med sedimenteringskoefficient (S) plot. De erhållna sedimenteringskoefficientvärdena och molekylmassorna tillhandahålls också. Etiketten AtFKBP53 motsvarar nukleoplasmindomänen för AtFKBP53. De uppskattade molekylmassorna avslöjar en 1: 1 stökiometri för AtFKBP53-nukleoplasmindomänen med histonoligomererna H2A / H2B-dimeren och H3 / H4-tetrameren. 450 μL av alla proteinprover med en OD280 på 0,3-0,5 användes för AUC-SV-experimenten. Figuren är anpassad från referens21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Plasmid supercoiling analys. Plasmid supercoiling analys för histon chaperones AtNRP1 och AtNRP2. 500 ng pUC19 plasmid-DNA förbehandlades med 1 μg Topoisomeras I för experimentet. 4 μM AtNRP1, 4 μM AtNRP2 och en blandning av 4 μM H2A/H2B dimer och 2 μM H3/H4 tetramer var som kontroll som inte visar någon supercoilingaktivitet när den inkuberas med det förbehandlade pUC19-DNA:t. Körfälten med en blandning av 4 μM H2A/H2B dimer och 2 μM H3/H4 tetramer och 4 μM vardera av AtNRP1 och AtNRP2 visar bildandet av supercoiled DNA vid inkubation med det förbehandlade pUC19-DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta arbete demonstrerar och validerar en omfattande uppsättning protokoll för biokemisk och biofysisk karakterisering av en förmodad histon chaperon. Häri användes rekombinant uttryckta och renade NAP-familjeproteiner, AtNRP1 och AtNRP2 och den N-terminala nukleoplasmindomänen för AtFKBP53 för att demonstrera protokollen. Samma uppsättning experiment kan mycket väl användas för att avgränsa de funktionella egenskaperna hos tidigare okarakteriserade histon chaperoner från vilken organism som helst.

Den första delen av protokollavsnittet handlar om att undersöka det oligomera tillståndet och stabiliteten hos en histon chaperone. Flera rapporter tyder på att histon chaperoner uppvisar stor mångfald i sitt oligomera tillstånd. Till exempel finns humant CAF-1 som en monomer29. NAP-familjemedlemmar finns som dimer eller tetramer 29,30,31. Nukleoplasminer avslöjar pentamera och ofta decameriska oligomera tillstånd32,33. Ett analytiskt SEC-experiment kan bestämma det oligomera tillståndet hos en histon chaperone, och AUC-SV-experiment kan bekräfta detsamma. Flera av histon chaperonerna är kända för att vara mycket stabila under olika termiska och kemiska stressförhållanden33,34. De termiska och kemiska stabilitetsegenskaperna hos histon chaperoner kan också utforskas i samband med analytisk SEC. Vidare kan cirkulär dikroismspektroskopi effektivt användas för fördjupad analys av förändringarna i chaperonens sekundära struktur när den utsätts för ökande temperaturer eller högre koncentrationer av ett kemiskt medel.

Den andra delen av protokollavsnittet täcker pull-down-analyser som kan undersöka de grundläggande interaktionerna som hjälper föreningen av histonoligomerer med chaperonen genom att använda en saltgradientmetod och en konkurrenskraftig pull-down-analys för att identifiera histonoligomerpreferensen för en chaperon. Om komplexet faller sönder med en liten ökning av saltkoncentrationen, skulle det föreslå ett stort bidrag från elektrostatiska interaktioner för att stabilisera komplexet. Ett intakt komplex i högt salt skulle föreslå en betydande roll för hydrofobicitet vid stabilisering av komplexet35. Den konkurrenskraftiga pull-down-analysen kan lätt användas för att bestämma specificiteten eller preferensen hos en histon chaperone till en specifik histonoligomerklass. Baserat på deras preferens mot histonoligomerer kan histon chaperoner klassificeras i tre kategorier såsom H2A / H2B chaperoner, H3 / H4 chaperoner och H2A / H2B-H3 / H4 chaperoner10,36. Dessutom kan isotermisk titreringskalorimetri (ITC) vid behov användas för att förstå histonoligomerspecificiteten hos en given chaperon och de termodynamiska egenskaperna hos deras interaktioner.

Den tredje delen av protokollavsnittet täcker undersökningen av interaktionsstökiometrin mellan en histon chaperon och histonoligomererna. I allmänhet skiljer sig de olika familjerna av histon chaperoner avsevärt för stökiometrin i deras samband med H2A / H2B eller / och H3 / H4 21,28,37,38. AUC-SV-experiment hjälper till att erhålla sedimenteringskoefficient (er) och molekylmassa för ett protein eller dess komplex, vilket blir mycket användbart för att exakt uppskatta stökiometrin i den komplexa bildningen. Alternativt kan ITC också användas för att undersöka stökiometri.

Den fjärde delen av protokollavsnittet fokuserar på att undersöka nukleosommonteringsfunktionen hos histon chaperoner. Histonchuperoner spelar en avgörande roll i nukleosommontering, som reglerar viktiga cellulära processer såsom replikation, transkription och DNA-reparation39. Plasmid supercoiling analys som vanligtvis används för in vitro-bedömning av histon chaperoning aktivitet av histon chaperoner utvecklas i detta avsnitt.

Det kan noteras att inte alla histon chaperoner är fullt strukturerade. Få är kända för att ha inneboende oordnade regioner40,41. Därför kan termiska och kemiska stabilitetsanalyser inte vara lämpliga för sådana proteiner. Vidare har histon chaperoner från olika organismer olika oligomera tillstånd och differentiella förmågor att binda till histoner. Därför kan detta protokoll vara en bra utgångspunkt men skulle innebära ändringar vid behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen intressekonflikt förklarades.

Acknowledgments

De extramurala bidragen till Dileep Vasudevan från Science and Engineering Research Board, Indiens regering [CRG/2018/000695/PS] och Institutionen för bioteknik, ministeriet för vetenskap och teknik, Indiens regering [BT/INF/22/SP33046/2019], liksom det intramurala stödet från Institute of Life Sciences, Bhubaneswar är mycket erkända. Vi tackar Sudeshna Sen och Annapurna Sahoo för deras hjälp med histonberedning. Diskussionerna med våra kollegor Dr. Chinmayee Mohapatra, Manas Kumar Jagdev och Dr. Shaikh Nausad Hossain erkänns också.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 20, Unit20.12 (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Tags

Biokemi utgåva 178 Histon chaperon nukleosommontering kromatin nukleoplasmin NAP plasmidsupercoiling analytisk ultracentrifugering
<em>In vitro</em> Karakterisering av Histone Chaperones med hjälp av analytiska, pull-down och chaperoning analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bobde, R. C., Saharan, K., Baral,… More

Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter