Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In vitro Karakterisering van Histone Chaperones met behulp van Analytische, Pull-Down en Chaperoning Assays

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63218
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3, 1,2, 1,2, 1, 1,4, 1,5, 1, 1
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft een reeks methoden die analytische grootte-uitsluitingschromatografie omvatten om histon chaperone oligomerisatie en stabiliteit te bestuderen, pull-down assay om histon chaperone-histon interacties te ontrafelen, AUC om de stoichiometrie van de eiwitcomplexen te analyseren, en histon chaperoning assay om functioneel een vermeende histon chaperone in vitro te karakteriseren.

Abstract

Histoneiwitten associëren zich met DNA om het eukaryote chromatine te vormen. De basiseenheid van chromatine is een nucleosoom, bestaande uit een histon octameer bestaande uit twee kopieën van de kern histonen H2A, H2B, H3 en H4, omwikkeld door het DNA. Het octameer bestaat uit twee kopieën van een H2A/H2B-dimeer en een enkele kopie van een H3/H4-tetrameer. De sterk geladen kern histonen zijn gevoelig voor niet-specifieke interacties met verschillende eiwitten in het cellulaire cytoplasma en de kern. Histon chaperones vormen een diverse klasse van eiwitten die histonen van het cytoplasma naar de kern brengen en hun afzetting op het DNA ondersteunen, waardoor het nucleosoomassemblageproces wordt ondersteund. Sommige histon chaperones zijn specifiek voor H2A / H2B of H3 / H4, en sommige functioneren als chaperones voor beide. Dit protocol beschrijft hoe in vitro laboratoriumtechnieken zoals pull-down assays, analytische grootte-uitsluitingschromatografie, analytische ultracentrifugatie en histon chaperoning assay in tandem kunnen worden gebruikt om te bevestigen of een bepaald eiwit functioneel is als een histon chaperone.

Introduction

Nucleosomen samengesteld uit DNA- en histoneiwitten vormen de structurele eenheid van chromatine en reguleren verschillende kritieke cellulaire gebeurtenissen. Nucleosomen worden dynamisch geherpositioneerd en gehermodelleerd om DNA toegankelijk te maken voor verschillende processen zoals replicatie, transcriptie en vertaling 1,2. Histonen die zeer basaal zijn, hebben de neiging om te interageren met zure eiwitten in het cellulaire milieu of ondergaan aggregatie, wat leidt tot verschillende cellulaire defecten 3,4,5. Een groep speciale eiwitten genaamd histon chaperones helpen het transport van histonen van het cytoplasma naar de kern en voorkomen afwijkende histon-DNA-aggregatiegebeurtenissen 6,7. Fundamenteel slaan de meeste histon chaperones histonen op en brengen ze over op DNA op fysiologische ionische sterkte, waardoor de vorming van nucleosomenwordt bevorderd 8,9. Sommige histon chaperones hebben een duidelijke voorkeur voor de histon oligomeren H2A/H2B of H3/H410.

Histon chaperones worden gekenmerkt op basis van hun vermogen om nucleosomen te assembleren afhankelijk of onafhankelijk van DNA-synthese11. Chromatine assembly factor-1 (CAF-1) is bijvoorbeeld afhankelijk, terwijl histonregulator A (HIRA) onafhankelijk is van DNA-synthese12,13. Evenzo is de nucleoplasminefamilie van histon chaperones betrokken bij spermachromatine-decondensatie en nucleosoomassemblage14. De nucleosoomassemblage-eiwit (NAP) familieleden vergemakkelijken de vorming van nucleosoomachtige structuren in vitro en zijn betrokken bij de shuttling van histonen tussen cytoplasma en nucleus15. Nucleoplasmineen en NAP-familie-eiwitten zijn beide functionele histon chaperones, maar delen geen structurele kenmerken. In wezen staat geen enkel structureel kenmerk de classificatie van een eiwit als een histon chaperone16 toe. Het gebruik van functionele en biofysische assays samen met structurele studies werken het beste bij het karakteriseren van histon chaperones.

Dit werk beschrijft biochemische en biofysische methoden om een eiwit te karakteriseren als een histon chaperonne die nucleosoomassemblage helpt. Eerst werd analytische grootte-uitsluitingschromatografie uitgevoerd om de oligomere status en stabiliteit van histon chaperones te analyseren. Vervolgens werd een pull-down assay uitgevoerd om de drijvende krachten en het competitieve karakter van histone chaperone-histone interacties te bepalen. De hydrodynamische parameters van deze interacties konden echter niet nauwkeurig worden berekend met behulp van analytische grootte-uitsluitingschromatografie vanwege de vorm van het eiwit en zijn complexen die hun migratie door de kolom beïnvloeden. Daarom werd analytische ultracentrifugatie gebruikt, die macromoleculaire eigenschappen in de oplossing biedt, waaronder nauwkeurig molecuulgewicht, de stoichiometrie van interactie en de vorm van de biologische moleculen. Eerdere studies hebben uitgebreid gebruik gemaakt van in vitro histon chaperoning assay om histon chaperones zoals yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120 functioneel te karakteriseren. Histon chaperoning assay werd ook gebruikt om de eiwitten functioneel te karakteriseren als histon chaperones.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Analytische grootte-uitsluitingschromatografie om de oligomere status en stabiliteit van histon chaperonnes op te helderen

  1. Analyse van de oligomere status van histon chaperones
    1. Breng een 24 ml analytische maat-uitsluitingschromatografie (SEC) kolom met 1,2 kolomvolume (CV), d.w.z. 28,8 ml ontgaste SEC-buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl en 1 mM β-mercaptoethanol (β-ME)] bij 4 °C (zie Materiaaltabel) in evenwicht.
      OPMERKING: Kolomtype, buffersamenstelling en buffer-pH kunnen worden geselecteerd op basis van het eiwit van belang. Het injectievolume van het monster mag niet hoger zijn dan 500 μL voor een kolom van 24 ml. Ook moet de kolomdruk onder de 5 MPa worden gehouden.
    2. Bereid uit een eiwitvoorraadoplossing met een hogere concentratie 500 μL eiwitmonster van 0,5 mg/ml in ontgaste SEC-buffer en injecteer dit in de vooraf gebalanceerde kolom met behulp van een injectielus van 500 μL. Laat de chromatografie lopen met een isocratisch debiet van 0,2-0,3 ml/min met de SEC-buffer bij 4 °C.
    3. Monitor het elutieprofiel van het eiwit door de absorptie te meten bij een golflengte van 280 nm. Bij het omgaan met eiwitten zonder aromatische residuen, meet dan de absorptie bij 214 nm.
    4. Gebruik het elutievolume van het eiwit om het geschatte molecuulgewicht in kDa te berekenen met behulp van de standaardkalibratiecurve21.
      OPMERKING: De kalibratiecurve wordt voorbereid door het retentievolume van bekende eiwitten met molecuulgewicht uit te zetten tegen het logboek van hun respectieve molecuulgewichten (log Mr), geëlueerd met behulp van dezelfde kolom.
  2. Analyse van de thermische stabiliteit van de histon chaperones
    1. Neem 500 μL van 0,5 mg/ml van het eiwitmonster bereid in ontgaste SEC-buffer (hetzelfde als gebruikt in 1.1.1) in afzonderlijke microcentrifugebuizen en verwarm elke buis tot een bepaalde temperatuur tussen 20 °C en 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C en 90 °C) gedurende 10 minuten in een waterbad.
    2. Centrifugeer vervolgens de warmtebehandelde monsters bij 16.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, verzamel het supernatant met een micropipette en injecteer elk monster afzonderlijk met behulp van een injectielus van 500 μL in de analytische kolom, vooraf in evenwicht gebracht met de SEC-buffer bij 4 °C.
    3. Laat de chromatografie lopen met een isocratisch debiet van 0,2-0,3 ml/min met de SEC-buffer bij 4 °C.
    4. Observeer de positie en hoogte van de elutiepieken en zoek naar het verschijnen van extra pieken voor de verschillende monsters.
  3. Analyse van de chemische stabiliteit van de histon chaperones
    1. Om de zoutstabiliteit van histon chaperones te onderzoeken, incubeer 500 μL van 0,5 mg/ ml eiwitmonster bereid in een Tris-buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM β-ME] aangevuld met toenemende concentraties NaCl (300 mM, 600 mM, 1 M, 1,5 M en 2 M) in afzonderlijke microcentrifugebuizen gedurende 30 minuten bij 4 °C. Centrifugeer de monsters bij 16.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en houd het supernatant vast.
    2. Laad vervolgens de eiwitmonsters afzonderlijk in verschillende NaCl-concentraties, met behulp van een injectielus van 500 μL in de analytische kolom die vooraf in evenwicht is gebracht met 1,2 CV (28,8 ml) van de respectieve buffer met toenemende NaCl-concentraties bij 4 °C.
    3. Laat de chromatografie uitvoeren met een isocratisch debiet van 0,2-0,3 ml/min met 1 CV (24 ml) van de respectieve buffer bij 4 °C.
    4. Observeer de positie en hoogte van elutiepieken en zoek naar het verschijnen van extra pieken voor de verschillende monsters.
    5. Evenzo incubeer voor ureumstabiliteitsanalyse 500 μL eiwitmonster van 0,5 mg / ml eiwitmonster bereid in een Tris-buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM β-ME] aangevuld met toenemende ureumconcentraties (1 M, 2 M, 3 M, 4 M en 5 M) in afzonderlijke microcentrifugebuizen gedurende 16 uur bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters bij 16.200 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en houd het supernatant vast.
    6. Laad vervolgens de met ureum behandelde eiwitmonsters afzonderlijk met behulp van een injectielus van 500 μL in de analytische kolom die vooraf in evenwicht is gebracht met 1,2 CV (28,8 ml) van de overeenkomstige buffer met verschillende ureumconcentraties bij kamertemperatuur.
    7. Laat de chromatografie lopen met een isocratisch debiet van 0,2-0,3 ml/min met 1 CV (24 ml) van de betreffende buffer bij kamertemperatuur.
      LET OP: Voer de experimenten niet uit met buffer die ureum bevat bij een lagere temperatuur, omdat ureum de neiging heeft om te kristalliseren en de kolom te beschadigen.
    8. Observeer de positie en hoogte van de elutiepieken en zoek naar het verschijnen van extra pieken voor de verschillende monsters.

2. Op zoutgradiënt gebaseerde pull-down assays om het type interacties te begrijpen dat bijdraagt aan de complexe vorming tussen histon oligomeren en een histon chaperone

  1. Pipetteer voor elke reactie van pull-down assay 40 μL Ni-NTA-hars in een spinkolom en was met steriel dubbel gedestilleerd water. Vervolgens moet de hars in evenwicht worden gebracht met 100 CV (4 ml) equilibratiebuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, 10 μg/ml BSA en 1 mM β-ME] (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Pull-down kan ook worden uitgevoerd in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
  2. Bereid het monster door 5 μM van het His-tagged histon chaperone te mengen met 20 μM histon H2A/H2B dimeer of H3/H4 tetrameer in de equilibratiebuffer. Incubeer het monster op ijs gedurende 1 uur.
    OPMERKING: H2A/H2B-dimeer en H3/H4-tetrameer worden bereid uit recombinante menselijke histonen21 en de integriteit van de oligomeren wordt bevestigd op basis van de geschatte moleculaire massa's door analytische ultracentrifugatie (AUC). Dezelfde histon oligomeren zijn gebruikt voor alle onderstaande experimenten.
  3. Laad de monsters in afzonderlijke voorgebalanceerde spinkolommen met Ni-NTA-hars uit stap 2.1, elk gelabeld voor een bepaalde zoutconcentratie, en houd de kolommen gedurende 30 minuten bij 4 °C. Centrifugeer de kolommen bij 1000 x g gedurende 1 min.
  4. Was vervolgens de kolommen met 100 CV (4 ml) wasbuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM imidazool, 0,2% Tween-20 en 1 mM β-ME] met verschillende zoutconcentraties (d.w.z. 300 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM en 1 M NaCl). Was elke kolom met een buffer met een bepaalde zoutconcentratie.
  5. Elueerde na de zoutwasstap het eiwit uit de verschillende kolommen met behulp van 100 μL elutiebuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 300 mM imidazool en 1 mM β-ME].
  6. Onderwerp vervolgens de geëlueerde monsters aan 18% SDS-PAGE22 en visualiseer de gel na kleuring met Coomassie Brilliant Blue R250 (zie Materiaaltabel). Als alternatief kunt u de hars rechtstreeks op de SDS-PAGE-gel laden in plaats van het gebonden eiwit uit de Ni-NTA-hars te elueren.
    OPMERKING: Equilibratie-, was- en elutiebuffersamenstellingen en pH kunnen worden gewijzigd afhankelijk van het eiwit van belang.

3. Competitieve pull-down assay om de voorkeur van een histone chaperone voor H2A / H2B of H3 / H4 te identificeren

  1. Spinkolom voorbereiden zoals beschreven in stap 2.1
  2. Incubeer 5 μM van de histon chaperone met 20 μM H2A/H2B dimeer in 300 μL equilibratiebuffer (bereid in stap 2.1) gedurende 30 minuten op ijs.
    OPMERKING: De verhouding van histon oligomeer tot histon chaperone in de reactie kan worden gekozen op basis van bekende bindende stoichiometriegegevens; gebruik een vijfvoudige overtollige histon als er geen informatie beschikbaar is.
  3. Centrifugeer het histon chaperone-H2A/H2B complex bij 16.200 x g gedurende 5 min bij 4 °C om eventuele neerslag te verwijderen. Laad vervolgens het monster op de spinkolom die vooraf in evenwicht is gebracht met de equilibratiebuffer (bereid in stap 2.1) en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  4. Was de kolom met 100 CV (4 ml) wasbuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 50 mM imidazol, 0,2% Tween-20 en 1 mM β-ME] om overtollig H2A/H2B-dimeer te verwijderen. Meng vervolgens het histon chaperone-H2A/H2B complex met 20-60 μM H3/H4 tetrameer en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
  5. Spoel de kolom opnieuw met 100 CV (4 ml) wasbuffer (bereid in stap 3.4) om elk ongebonden H3/H4-tetrameer te verwijderen en eluut het monster met behulp van elutiebuffer (bereid in stap 2.5). Onderwerp de geëlueerde monsters aan 18% SDS-PAGE en visualiseer na het kleuren met Coomassie Brilliant Blue R250.
    OPMERKING: De test kan worden omgekeerd, waarbij eerst H3 / H4-tetrameer kan worden gemengd met de chaperonne, het complex kan binden aan Ni-NTA-kralen en het complex vervolgens kan worden geïncubeerd met verschillende concentraties H2A / H2B-dimeer.

4. Analytische ultracentrifugatie - sedimentatiesnelheid (AUC-SV) experimenten om de bindende stoichiometrie tussen histon chaperones en histonen te analyseren

  1. Monstervoorbereiding voor AUC
    1. Dialyseer het gereconstitueerde histon H2A/H2B dimeer, H3/H4 tetrameer en de histon chaperone afzonderlijk door een 7 kDa cut-off dialysebuis23, tegen een dialysebuffer [20 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl en 1 mM β-ME] (zie Materiaaltabel). Om achtergrondfouten als gevolg van buffermismatch te minimaliseren, voert u dialyse uitgebreid uit tegen de dialysebuffer, bij voorkeur drie keer over een periode van 24 uur.
      OPMERKING: De initiële OD280 van de eiwitmonsters moet een twee tot een drievoudig hogere waarde hebben om een uiteindelijke OD280 van 0,3-0,5 te bereiken. Dit wordt in wezen gedaan om de effecten van verdunning teniet te doen.
    2. Zuiver H2A/H2B dimeer, H3/H4 tetrameer en de histon chaperone individueel met de dialysebuffer, met behulp van analytische grootte-uitsluiting chromatografie (zoals vermeld in stap 1). Sla de buffer op van de run om later verdere verdunningen voor te bereiden en als referentie in de AUC-cel te gebruiken.
  2. Monster laden voor AUC
    1. Meng de gezuiverde eiwitten in een eindvolume van 450 μL met behulp van dialysebuffer uit stap 4.1.1 om een OD280 van 0,3-0,6 te bereiken. Meng de histon chaperone met H2A/H2B dimeer of H3/H4 tetrameer voor complexe vorming in afzonderlijke reactiebuizen. Incubeer de eiwitmengsels gedurende 2-3 uur.
      OPMERKING: Als alternatief kunnen sedimentatiegegevens worden verkregen met een interferentie-optisch scansysteem in de analytische ultracentrifuge. Afzonderlijk, voor het mengen van gezuiverde eiwitten, fixeert u de histon chaperoneconcentratie en incubeert u deze met toenemende concentraties van de histon-oligomeren om de exacte stoichiometrie te verkrijgen.
    2. Monteer de cel met een dubbel sectormiddenstuk en kwartsvensters voor het AUC-SV-experiment met behulp van een absorptiedetector van de analytische ultracentrifuge zoals eerder in detail beschreven24.
    3. Vul 400 μL van de monsteroplossing en 420 μL dialysebuffer in de twee sectoren (respectievelijk monster- en referentiesectoren) van de cel.
      OPMERKING: In de referentiesector wordt een groter volume buffer gebruikt om de referentiemeniscus boven de meniscus van het monster te houden. Als u echter een optisch interferentiesysteem gebruikt, vult u de twee sectoren met hetzelfde volume.
    4. Weeg en balanceer de cellen nauwkeurig en laad ze in een titanium rotor met vier plaatsen (zie Materiaaltabel). Lijn de cellen uit met behulp van de markeringen aan de onderkant van de cellen en de rotor. Laad de rotor in de centrifuge, sluit het deksel en laat een vacuüm ontwikkelen totdat de druk daalt tot minder dan 15 micron Hg en de rotortemperatuur stabiliseert tot 20 °C (duurt meestal 2-2,5 uur).
      OPMERKING: AUC-bedrijfsparameters omvatten experimentele temperatuur, rotorsnelheid, het interval tussen scans en het aantal scans dat moet worden verzameld. In het geval van SV-experimenten wordt het scaninterval gegeven op basis van de moleculaire massa van het eiwit; kleinere eiwitten vereisen grotere tijdsintervallen tussen de scans. De rotorsnelheid wordt ook ingesteld op basis van de verwachte moleculaire massa van het eiwit en het experiment wordt uitgevoerd bij 20 °C. De absorptiegegevens worden gemonitord bij 280 nm.
    5. Om de exacte stoichiometrie te verkrijgen, houdt u de histon chaperoneconcentratie constant en incubeert u met toenemende concentraties histon oligomeren om verzadiging te bereiken.
  3. AUC data-analyse
    1. Voer de gegevensanalyse uit zoals eerder beschreven25. Bereken in het kort de dichtheid en viscositeit voor de buffercomponenten met behulp van het programma SEDNTERP26 (zie Materiaaltabel). Bereken op dezelfde manier het gedeeltelijke specifieke volume van het eiwit op basis van de aminozuursamenstelling, ook met behulp van SEDNTERP.
    2. Laad de gegevens van de AUC-machine in het programma SEDFIT27 en definieer de meniscus (rode lijn), de celonder (blauwe lijn) en gegevensanalysegrenzen (groene lijnen). Kies continue C('s) verdeling als model.
    3. Stel vervolgens een resolutiemaximum in tot 100; ingestelde sedimentatiecoëfficiënt (s), s min: 0 en s max: 10-15; stel de wrijvingsverhouding in eerste instantie in op 1,2 en kies ervoor om te zweven om de verhouding uit de gegevens af te leiden; stel het betrouwbaarheidsniveau (F-ratio; die de omvang van de regularisatie bepaalt) in op 0,68 voor 1 sigma regularisatie; stel partiële specifieke volume-, bufferdichtheids- en bufferviscositeitswaarden in zoals verkregen uit SEDNTERP.
    4. Druk op RUN om de software toe te staan de Lamm-vergelijking27 op te lossen. Pas de parameters aan als er een significante gegevensafwijking is. Nadat u de parameters hebt aangepast, drukt u op FIT om alle parameters te verfijnen. Beoordeel de kwaliteit van de pasvorm op basis van de RMSD-waarde (root-mean-square deviation), die minder dan 0,01 signaaleenheden moet zijn.
    5. Schat de moleculaire massa's van de pieken door de optie te kiezen: toon piek "Mw in c (s)" in de weergavefunctie van de hoofdwerkbalk, die informatie zal geven over de 's' van het molecuul / complex.

5. Plasmid supercoiling assay om histon chaperoning functie te bevestigen

  1. Nucleosoom assemblage reactie
    1. Meng 2 μM H3/H4 tetrameer en 4 μM H2A/H2B dimeer met toenemende concentraties van de histon chaperone (1-6 μM) in een assemblagebuffer [20 mM Tris HCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 0,1 mg/ml BSA en 100 mM NaCl] tot een eindvolume van 50 μL. Incubeer het mengsel bij 4 °C gedurende 30 min.
    2. Gelijktijdig, in een afzonderlijke reactie, voorbehandeling 500 ng van de negatief gesupercoileerde pUC19 plasmide met 1 μg topoisomerase I enzym (zie materiaaltabel) in de assemblagebuffer in een eindvolume van 50 μL en incubeer bij 30 °C gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Topoisomerase I ontspant het supercoiled dubbelstrengs plasmide-DNA door een enkelstrengs nick te genereren. Een topoisomerase I-enzym van eukaryote oorsprong, zoals het in de handel verkrijgbare tarwekiem topoisomerase I of recombinant uitgedrukte Drosophila melanogaster topoisomerase I, zou kunnen worden gebruikt.
    3. Combineer vervolgens het H3/H4-tetrameer, H2A/H2B-dimeer, histon chaperonnemengsel (uit stap 5.1.1), het ontspannen plasmide-DNA-reactiemengsel (uit stap 5.1.2) en incubeer verder bij 30 °C gedurende 90 minuten.
      OPMERKING: Stel twee controlereacties in voor de test; de ene met de histon chaperone en het relaxte plasmide DNA (maar niet de histonen) en de andere met de histon oligomeren en het relaxte plasmide DNA (maar niet de histon chaperone).
    4. Stop de assemblagereactie door 100 μL 2x stopbuffer (40 mM EDTA, 2% SDS en 0,4 mg/ml proteïnase K) toe te voegen en gedurende 30 minuten bij 37 °C te incuberen.
      OPMERKING: Stopbuffer deproteiniseert het plasmide-DNA door denaturatie en proteolyse van gebonden histonen.
  2. Fenol-chloroform extractie en ethanol precipitatie
    1. Voeg een gelijk volume Tris-verzadigd fenol toe aan de buis die het reactiemengsel uit stap 5.1.4 bevat en meng goed, gevolgd door centrifugatie bij 16.200 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Verzamel voorzichtig de bovenste waterige fase met het plasmide-DNA met een micropipette en meng met een gelijk volume chloroform. Vortex het mengsel en centrifugeer bij 16.200 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Isoamylalcohol kan in deze stap worden opgenomen om een wazige interface tussen de waterige en organische fasen te voorkomen.
    3. Verzamel vervolgens de bovenste waterige fase, voeg 1/10e volume van 3 M natriumacetaat (pH 5,5) en 2,5 volumes ijskoude ethanol toe (zie Materiaaltabel). Meng de oplossing goed door de buis 3-4 keer om te keren en bewaar het mengsel gedurende 30 minuten in een vriezer van -20 °C voor volledige precipitatie van het plasmide-DNA.
    4. Centrifugeer het monster uit stap 5.2.3 bij 16200 x g gedurende 10 minuten en gooi het supernatant voorzichtig weg. Houd de buizen open bij kamertemperatuur totdat zelfs sporenhoeveelheden ethanol verdampen, waardoor het neergeslagen plasmide-DNA in de buis achterblijft.
  3. Voer de agarose gel-elektroforese uit om het plasmide supercoiling-effect te observeren.
    1. Los het neergeslagen plasmide-DNA uit stap 5.2.4 op in steriel dubbel gedestilleerd water.
    2. Los de monsters op een 1% agarose gel in 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA) (zie Tabel van materialen).
    3. Kleur de gel met 0,2-0,5 μg / ml concentratie ethidiumbromide en observeer onder UV om de DNA-banden op de gel te visualiseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het recombinante N-terminale nucleoplasminedomein van het eiwit FKBP53 uit Arabidopsis thaliana werd onderworpen aan analytische SEC. Het elutiepiekvolume werd uitgezet tegen de standaardcurve om de oligomere toestand ervan te identificeren. De analytische SEC-resultaten toonden aan dat het domein bestaat als een pentameer in oplossing, met een geschatte molecuulmassa van 58 kDa (figuur 1A, B). Verder werd het nucleoplasminedomein geanalyseerd op thermische en chemische stabiliteit in combinatie met analytische SEC. Het nucleoplasminemonster dat een warmtebehandeling tot 90 °C onderging, vertoonde geen duidelijke verschuiving in het elutievolume en de piekhoogte in vergelijking met de monsters die op 20 °C werden gehouden, wat suggereert dat het domein zeer thermostabiel is (figuur 1C). Evenzo vertoonde het nucleoplasminedomein zoutstabiliteit tot 2 M NaCl (figuur 1D) en ureumstabiliteit tot 4 M (figuur 1E). Het nucleoplasmine pentameer begon echter te dissociëren in hogere ureumconcentraties.

Een pull-down assay werd uitgevoerd om het type interacties te bepalen dat bijdraagt aan de complexe vorming tussen de histon chaperone (nucleoplasmine domein van AtFKBP53) en de histon oligomeren H2A / H2B dimer en H3 / H4 tetrameer met behulp van een gradiënt zoutwas. De interactie van het nucleoplasminedomein met H2A/H2B-dimeer was stabiel tot een zoutconcentratie van 0,4 M NaCl (figuur 2A). Ter vergelijking: de associatie met H3/H4 was redelijk stabiel tot 0,7 M NaCl (figuur 2B). Het vermogen van de chaperone-histoncomplexen om hoge zoutconcentraties te weerstaan, suggereert de rol van hydrofobe interacties bij het stabiliseren van de complexen. Het chaperonnecomplex waarbij H3/H4 stabiel is, zelfs in hoge zoutconcentraties, suggereert een overheersende rol van hydrofobe interacties in de complexe formatie. De lagere stabiliteit van het H2A/H2B-chaperonnecomplex in hoge zoutconcentraties onthult een belangrijke rol voor elektrostatische interacties in de complexe formatie. In een ander experiment werd de pull-down assay gebruikt om te onderzoeken of de chaperonne de voorkeur geeft aan H2A / H2B-dimeer of H3 / H4-tetrameer. Uit de resultaten bleek dat de chaperonne gelijktijdig en ongeacht de volgorde waarin ze aan de chaperonne worden toegevoegd, bindt aan H2A/H2B-dimeer en H3/H4-tetrameer (figuur 2C,D). Dit gaf aan dat de chaperonne afzonderlijke plaatsen bezit voor zijn interactie met de histon-oligomeren.

AUC-SV experimenten (figuur 3) werden uitgevoerd om de stoichiometrie van interactie tussen histon oligomeren en chaperones te bestuderen. AUC-SV data-analyse leverde een sedimentatiecoëfficiënt (s) waarde op van 5,40 S voor het AtFKBP53 nucleoplasmine domein in complex met H2A/H2B dat overeenkwam met een molecuulmassa van 104 kDa. Het complex van het nucleoplasminedomein met H3/H4 gaf een sedimentatiecoëfficiënt van 7,35 S, overeenkomend met 129 kDa. De geschatte molecuulmassa van de complexen laat zien dat het pentamere nucleoplasmine complex vormt met zowel H2A/ H2B-dimeer als H3 / H4-tetrameer in een 1: 1-stoichiometrie.

Het is essentieel om aan te tonen dat het eiwit histon oligomeren op DNA kan afzetten om te bevestigen dat het een histon chaperonne is. Daartoe werd een plasmide supercoiling assay aangenomen (figuur 4). Het ontspannen cirkelvormige plasmide werd geïncubeerd met de histon oligomeren H2A/H2B en H3/H4 met de recombinante plant histon chaperones van de NAP familie - AtNRP1 en AtNRP228. De aanwezigheid van de chaperonne verhoogde de hoeveelheid supercoiled plasmide, wat suggereert dat het histonen op het DNA zou kunnen afzetten om nucleosomen te vormen, waardoor DNA-supercoiling ontstaat.

Figure 1
Figuur 1: Oligomere toestand en stabiliteit van het nucleoplasminedomein van AtFBP53. (A) Analytisch grootte-exclusiechromatografieprofiel van het AtFKBP53-nucleoplasminedomein. B) Kalibratiecurve verkregen met behulp van bolvormige eiwitten met een bekende molecuulmassa. De blauwe stippen vertegenwoordigen de moleculaire massa van de bekende eiwitten, terwijl de rode stip het AtFKBP53-nucleoplasminedomein vertegenwoordigt. (440 kDa - ferritine, 158 kDa-aldolase, 75 kDa-con albumine, 44 kDa-ovalbumine, 6,5 kDa-aprotinine). C) Analytisch grootte-uitsluitingschromatogram van 500 μL van 0,5 mg/ml AtFKBP53 nucleoplasminedomein onderworpen aan een warmtebehandeling bij verschillende temperaturen: 20 °C (groen), 40 °C (oranje), 60 °C (zwart), 90 °C (lichtblauw). (D) Analytisch grootte-exclusiechromatogram van 500 μL van 0,5 mg/ml AtFKBP53 nucleoplasminedomein in buffers met verschillende NaCl-concentraties: 0,3 M (paars), 0,6 M (rood), 1,0 M (lichtblauw), 1,5 M (groen), 2,0 M (zwart). (E) Analytisch grootte-uitsluitingschromatogram van het AtFKBP53-nucleoplasminedomein in buffers met verschillende ureumconcentraties: 0 M (controle; lichtblauw), 1,0 M (roze), 2,0 M (zwart), 3,0 M (donkerblauw), 4,0 M (groen), 5,0 M (bruin). Het nucleoplasmine pentameer vertoont een hoge stabiliteit tegen thermische en chemische stressomstandigheden. De figuur is aangepast van referentie21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Pull-down assays voor de interactie van het nucleoplasminedomein van AtFKBP53 met histon oligomeren. 18% SDS-PAGE beelden van de elutiefracties uit de assays worden hier gepresenteerd. Pull-down assay voor (A) 20 μM H2A/H2B dimeer en (B) 20 μM H3/H4 tetrameer met 5 μM AtFKBP53 nucleoplasmine domein in toenemende concentraties van NaCl in het bereik van 0,3 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M en 1,0 M. 5 μM AtFKBP53 FKBD werd hier als negatieve controle gebruikt. Voor het competitieve bindingsexperiment is (C) een mengsel van 5 μM AtFKBP53 nucleoplasminedomein en 20 μM H3/H4 tetrameer geïncubeerd met een bereik van 20-60 μM H2A/H2B dimeer en (D) een mengsel van 5 μM AtFKBP53 nucleoplasminedomein en 20 μM H2A/H2B dimeer geïncubeerd met een bereik van 20-60 μM H3/H4 tetrameer gebruikt. Het label AtFKBP53 komt overeen met het nucleoplasminedomein van AtFKBP53. Elutiefracties vertonen gelijktijdige binding van beide histon oligomeren aan het nucleoplasmine. De figuur is aangepast van referentie21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Analytisch ultracentrifugatie - sedimentatiesnelheid (AUC-SV) experiment van histon oligomeren, het nucleoplasmine domein van AtFKBP53, en hun complexen. De AUC-afstandsverdeling vs. bezinkingscoëfficiënt (S) plot. De verkregen sedimentatiecoëfficiënt(en) waarden en moleculaire massa's worden ook verstrekt. Het label AtFKBP53 komt overeen met het nucleoplasminedomein van AtFKBP53. De geschatte moleculaire massa's onthullen een 1:1 stoichiometrie voor het AtFKBP53 nucleoplasmine domein met de histon oligomeren H2A/H2B dimer en H3/H4 tetrameer. 450 μL van alle eiwitmonsters met een OD280 van 0,3-0,5 werden gebruikt voor de AUC-SV-experimenten. De figuur is aangepast van referentie21. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Plasmid supercoiling assay. Plasmide supercoiling assay voor de histon chaperones AtNRP1 en AtNRP2. 500 ng pUC19 plasmide-DNA werd voorbehandeld met 1 μg Topoisomerase I voor het experiment. 4 μM AtNRP1, 4 μM AtNRP2 en een mengsel van 4 μM H2A/H2B dimeer en 2 μM H3/H4 tetrameer waren als controle die geen supercoiling activiteit vertoont wanneer geïncubeerd met het voorbehandelde pUC19 DNA. De banen met een mengsel van 4 μM H2A/H2B dimeer en 2 μM H3/H4 tetrameer en 4 μM elk van AtNRP1 en AtNRP2 tonen de vorming van supercoiled DNA bij incubatie met het voorbehandelde pUC19 DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit werk demonstreert en valideert een uitgebreide reeks protocollen voor de biochemische en biofysische karakterisering van een vermeende histon chaperonne. Hierin werden recombinant tot expressie gebrachte en gezuiverde NAP-familie-eiwitten, AtNRP1 en AtNRP2, en het N-terminale nucleoplasminedomein van AtFKBP53 gebruikt om de protocollen te demonstreren. Dezelfde reeks experimenten zou heel goed kunnen worden gebruikt om de functionele kenmerken van voorheen niet-gekarakteriseerde histon chaperones van elk organisme af te bakenen.

Het eerste deel van het protocolgedeelte gaat over het onderzoeken van de oligomere toestand en stabiliteit van een histon chaperonne. Verschillende rapporten geven aan dat histon chaperones een aanzienlijke diversiteit vertonen in hun oligomere toestand. Menselijke CAF-1 bestaat bijvoorbeeld als een monomeer29. NAP-familieleden bestaan als dimeer of tetrameer 29,30,31. Nucleoplasmineen onthullen pentamere en vaak decamerische oligomere toestanden32,33. Een analytisch SEC-experiment kan de oligomere toestand van een histon chaperonne bepalen, en AUC-SV-experimenten kunnen hetzelfde bevestigen. Van verschillende histon chaperones is bekend dat ze zeer stabiel zijn onder verschillende thermische en chemische stressomstandigheden 33,34. De thermische en chemische stabiliteitskenmerken van histon chaperones kunnen ook worden onderzocht in combinatie met analytische SEC. Verder kan circulaire dichroïsmespectroscopie effectief worden gebruikt voor een diepgaande analyse van de veranderingen in de secundaire structuur van de chaperonne bij blootstelling aan stijgende temperaturen of hogere concentraties van een chemisch agens.

Het tweede deel van de protocolsectie behandelt pull-down assays die de fundamentele interacties kunnen onderzoeken die de associatie van histon oligomeren met de chaperone helpen door een zout-gradiëntbenadering en een competitieve pull-down assay te gebruiken om de histon oligomeervoorkeur van een chaperonne te identificeren. Als het complex uit elkaar valt met een lichte toename van de zoutconcentratie, zou dat een belangrijke bijdrage van elektrostatische interacties suggereren bij het stabiliseren van het complex. Een intact complex in hoog zout zou een belangrijke rol voor hydrofobiciteit suggereren bij het stabiliseren van het complex35. De competitieve pull-down assay kan gemakkelijk worden gebruikt om de specificiteit of voorkeur van een histon chaperone voor een specifieke histon oligomeer klasse te bepalen. Op basis van hun voorkeur voor histon oligomeren, kunnen histon chaperones worden ingedeeld in drie categorieën, zoals H2A / H2B chaperones, H3 / H4 chaperones en H2A / H2B-H3 / H4 chaperones 10,36. Bovendien kan, indien nodig, isotherme titratiecalorimetrie (ITC) worden gebruikt om de histon-oligomeerspecificiteit van een bepaalde chaperonne en de thermodynamische kenmerken van hun interacties te begrijpen.

Het derde deel van de protocolsectie behandelt het onderzoek naar de interactie stoichiometrie tussen een histon chaperonne en de histon oligomeren. Over het algemeen verschillen de verschillende families van histon chaperones aanzienlijk voor de stoichiometrie van hun associatie met H2A/H2B of/en H3/H4 21,28,37,38. AUC-SV-experiment helpt bij het verkrijgen van sedimentatiecoëfficiënt (s) en moleculaire massa van een eiwit of zijn complex, wat zeer nuttig wordt bij het nauwkeurig schatten van de stoichiometrie in de complexe formatie. Als alternatief kan ITC ook worden gebruikt om stoichiometrie te onderzoeken.

Het vierde deel van de protocolsectie richt zich op het onderzoeken van de nucleosoomassemblagefunctie van histon chaperones. Histon chaperones spelen een cruciale rol in nucleosoomassemblage, die vitale cellulaire processen zoals replicatie, transcriptie en DNA-reparatie reguleert39. Plasmide supercoiling assay die typisch wordt gebruikt voor de in vitro beoordeling van histon chaperoning activiteit van histon chaperones wordt uitgewerkt in deze sectie.

Opgemerkt kan worden dat niet alle histon chaperones volledig gestructureerd zijn. Van weinigen is bekend dat ze intrinsiek ongeordende regio's hebben40,41. Daarom zijn thermische en chemische stabiliteitstests mogelijk niet geschikt voor dergelijke eiwitten. Verder hebben histon chaperones van verschillende organismen verschillende oligomere toestanden en differentiële vermogens om aan histonen te binden. Daarom kan dit protocol een goed uitgangspunt zijn, maar zou het indien nodig wijzigingen met zich meebrengen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er werd geen belangenverstrengeling gemeld.

Acknowledgments

De extramurale subsidies aan Dileep Vasudevan van de Science and Engineering Research Board, government of India [CRG/2018/000695/PS] en het Department of Biotechnology, Ministry of Science and Technology, Government of India [BT/INF/22/SP33046/2019], evenals de intramurale steun van het Institute of Life Sciences, Bhubaneswar worden zeer erkend. We bedanken mevrouw Sudeshna Sen en mevrouw Annapurna Sahoo voor hun hulp bij de voorbereiding van histon. De gesprekken met onze collega's Dr. Chinmayee Mohapatra, Mr. Manas Kumar Jagdev en Dr. Shaikh Nausad Hossain worden ook erkend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 20, Unit20.12 (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Tags

Biochemie Nummer 178 Histon chaperone nucleosoomassemblage chromatine nucleoplasmine NAP plasmide supercoiling analytische ultracentrifugatie
<em>In vitro</em> Karakterisering van Histone Chaperones met behulp van Analytische, Pull-Down en Chaperoning Assays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bobde, R. C., Saharan, K., Baral,… More

Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter