Summary
이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.
Abstract
내피 세포는 혈관 긴장도, 면역, 응고 및 투과성 조절에 중요한 역할을 합니다. 내피 기능 장애는 당뇨병, 죽상 동맥 경화증, 패혈증 및 급성 폐 손상을 포함한 의학적 상태에서 발생합니다. 마우스에서 순수한 내피 세포를 분리하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법은 이러한 상태 및 기타 상태의 발병기전에서 내피 세포의 역할을 조사하는 데 필요합니다. 이 프로토콜에서, 폐 미세혈관 내피 세포는 5-7일령 신생아 마우스 새끼로부터 제조되었다. 폐를 수확하고, 다지고, 콜라게나제 I로 효소적으로 분해하고, 방출된 세포를 밤새 배양합니다. 내피 세포는 자성 비드에 접합된 anti-PECAM1(CD-31) IgG를 사용하여 선택되고, 세포는 다시 합류하도록 배양됩니다. 그런 다음 내피 세포의 순도를 높이기 위해 자성 비드에 접합된 anti-ICAM2(CD-102) IgG로 2차 세포 선택이 발생하고 세포가 합류하도록 다시 배양됩니다. 전체 과정은 세포를 실험에 사용하기까지 약 7-10일이 걸립니다. 이 간단한 프로토콜은 내피 사이토카인 및 케모카인 생성, 백혈구-내피 상호작용, 내피 응고 경로 및 내피 투과성에 초점을 맞춘 연구를 포함하여 시험관 내 연구에 즉시 사용할 수 있는 고순도(순도 >92%) 내피 세포를 생성합니다. 많은 녹아웃과 형질전환 마우스 라인을 사용할 수 있는 이 절차는 부상, 감염 및 염증에 대한 건강하고 병리학적인 반응에서 내피 세포에 의해 발현되는 특정 유전자의 기능을 이해하는 데에도 도움이 됩니다.
Introduction
혈관 내피 세포들의 기능장애가 뇌졸중, 심혈관 질환, 당뇨병, 급성 폐 손상, 패혈증 및 비감염성 손상과 같은 다수의 인간 질환에서 발생함에 따라 혈관 내피를 연구하는 것에 대한 관심이 최근 증가하였다 1,2,3,4,5. 이러한 상태의 발병기전을 정의하고 보호 및 조절되지 않는 내피 세포 반응에서 특정 유전자의 역할을 이해하기 위해서는 마우스에서 고순도 미세혈관 내피 세포를 분리하고 배양하는 신뢰할 수 있는 방법이 필요합니다. 많은 연구에서 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 또는 인간 폐 미세혈관 내피 세포(HMVEC)와 같은 인간 내피 세포를 활용하지만, 내피 기능 및 기능 장애를 연구하기 위해 마우스 내피 세포를 사용하는 데에는 여러 가지 이유가 있습니다. 첫째, 상이한 인간 기증자로부터의 내피 세포의 반응에는 상당한 이질성이 있으며, 이는 개별 실험 6,7,8 사이의 결과의 가변성을 초래한다. 둘째, 일차 인간 세포주에서 유전자 표적을 침묵시키면 다양한 단백질 발현 수준(9,10)이 발생할 수 있습니다. 대조적으로, 마우스 내피 세포(11)의 반응에는 최소한의 이질성이 존재하며, 유전적 배경이 연구 그룹 간에 동일하다고 가정한다. 또한, 많은 수의 마우스 내피 세포는 여러 신생아 마우스의 폐를 풀링하여 제조할 수 있습니다. 이러한 요소를 통해 실험 간에 보다 일관되고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 녹아웃 또는 형질전환 마우스의 가용성은 또한 관심 단백질이 결여된 세포 유형의 분리를 제공합니다.
공개된 방법 12,13,14,15,16을 사용하여 마우스 폐 내피 세포의 건강하고 순수한 집단을 분리하는 데 상당한 어려움이 있었기 때문에 고품질 마우스 폐 미세혈관 내피 세포를 분리하는 보다 신뢰할 수 있고 간단한 방법을 개발하게 되었습니다. 현재 프로토콜의 장점은 쉽게 구할 수 있는 신생아 마우스를 사용하여 축산 및 주택 비용을 제한하는 것입니다. 또한, 우리의 경험에 따르면, 신생아 마우스의 내피 세포의 생존력은 성인 마우스에서 제조된 내피 세포보다 상당히 높습니다. 신생아 생쥐는 폐 조직이 작기 때문에, 성체 생쥐에서 채취하는 것이 권장되는 콜라게나제의 기관 점적을 사용하는 대신 절제된 폐를 콜라게나제로 소화하여 내피 세포를 채취할 수 있다16. 이것은 또한 마우스를 안락사시키고 내피 세포를 세포 배양 배지와 인큐베이터로 가져오는 사이의 시간을 감소시키면서 내피 반응의 순도나 수율 또는 재현성에 영향을 미치지 않습니다. 마지막으로, 순수한 세포 집단은 유세포 분석 없이 분리되었고, 이는 내피 세포를 손상시키거나 더 낮은 수율을 초래할 수 있다14,15,17.
현재 수정된 프로토콜은 7-10일 내에 고순도 및 생존 가능한 내피 세포를 일관되게 유도하여 시험관 내 실험에 즉시 사용할 수 있습니다. 녹아웃 동물로부터 직접 세포를 분리하는 것도 실험 전에 세포 조작을 최소화합니다. 이러한 방법은 여러 질병에 대한 내피 기반 치료 표적을 발견하기 위해 내피 기능에서 다양한 단백질의 역할을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.
Protocol
모든 동물 시술은 캘리포니아 대학교 샌프란시스코의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 수컷 C57BL/6 신생아 마우스 새끼(생후 5-7일)를 연구에 사용했습니다. 전체 프로토콜은 7-10일이 걸립니다(그림 1).
1. 내피세포배지의 제조
- 기본 배지 준비: 4,500mg/L의 포도당과 4mM의 L-글루타민(DMEM)에 20%(v/v) 열 비활성화 태아 소 혈청, 100U/100μg/mL의 페니실린/스트렙토마이신 및 25mM의 HEPES가 보충된 Dulbecco's Modified Eagle 배지( 재료 표 참조). 22 μM 필터가 있는 제균 필터. 기본 배지를 4 °C에서 보관하고 준비 후 한 달 이내에 사용하십시오.
- 완전한 배지 준비: 헤파린 100μg/mL, 내피 세포 성장 보충제 100μg/mL, 비필수 아미노산 1개 및 피루브산나트륨 1mM으로 보충된 기본 배지( 재료 표 참조). 22 μM 필터가 있는 제균 필터. 4 °C에서 보관하고 준비 후 한 달 이내에 사용하십시오.
2. 쥐 방지 마그네틱 비드의 사전 코팅13
- 50mL의 비드 세척 완충액 만들기: 0.1%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 인산염 완충 용액(PBS). 22 μM의 멸균 필터를 사용하여 4 °C에서 보관하고 준비 후 한 달 이내에 사용하십시오.
- 마그네틱 비드를 몇 초 동안 소용돌이치게 하여 비드를 재현탁하고 50μL의 비드(2 x 107 비드)를 두 개의 1.5mL 미세 원심분리 튜브(CD-31용 1개와 CD-102용 1개)에 피펫합니다( 재료 표 참조). 비드 세척 완충액 1mL를 넣고 잘 섞는다.
참고: 언급된 모든 부피는 3-4마리의 신생아 마우스 새끼(5-7일령)에서 내피 세포를 분리하는 데 사용되었습니다. CD-31 및 CD-102는 자기 면역비드 선택에 사용되는 내피 세포 표면 마커입니다. - 튜브를 자기 분리기에 놓고 유리 파스퇴르 피펫으로 상청액을 제거합니다. 매번 1mL의 비드 세척 완충액으로 3회 세척을 반복합니다.
- 비드 세척 버퍼를 사용하여 원래 비드 부피 50μL의 비드를 재현탁합니다. 그런 다음 50μL의 비드에 5μL(2.5μg)의 항체(CD-31/CD-102)를 추가합니다.
- 비드 현탁액을 엔드 오버 엔드 로테이터에서 4°C에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 3시간 동안 부드럽게 회전하여 배양합니다. 세척을 4 번 반복하십시오.
- 비드 세척 완충액으로 원래 부피인 50μL의 면역비드를 재현탁하고 4°C에서 보관하고 1-2주 이내에 사용합니다.
3. 폐 세포의 분리 및 도금
- 분리 당일 Type 1 collagenase 용액 준비: HBSS 25mL에 Type 1 collagenase 25mg을 추가합니다( 재료 표 참조). 37°C에서 1시간 동안 부드럽게 회전하고 22μM 필터를 사용하는 멸균 필터로 배양합니다. 용액을 37°C에서 따뜻하게 유지하십시오.
- 생후 5-7일 된 새끼에게 헤파린(25 μL/mouse, 1,000 U/mL)을 안락사 10분 전에 근육주사하여 내피 세포 활성화와 혈전 형성을 최소화한다14,15.
- 2020 AVMA 안락사 지침에 따라 날카로운 가위를 사용하여 참수한 마우스 강아지를 안락사시킵니다. 그런 다음 복부 쪽이 위로 향하도록 해부 보드에 마우스를 고정합니다.
- 시체에 70 % 에탄올을 뿌린 다음 먼저 횡격막을 절단 한 다음 가슴의 전체 측벽을 따라 위쪽으로 절단하여 흉강을 노출시킵니다. 흉곽을 반사하면 심장과 폐가 노출됩니다.
알림: 신생아 생쥐의 크기가 작기 때문에 이 단계에서는 더 작은 집게와 가위를 사용하고 폐에서 혈액을 제대로 제거하지 못할 수 있으므로 심장이나 폐를 뚫지 않도록 하십시오. - 10mL 주사기에 25G 바늘을 넣고 차가운 DMEM 5mL를 심장의 우심실에 주입하여 폐에서 혈액을 제거합니다. 폐가 하얗게 변합니다.
- 해당 기관지 원위부에 엽을 절단하여 한 번에 한 엽씩 흉강에서 폐를 제거합니다.
- 모든 폐엽을 20mL의 얼음처럼 차가운 기본 배지로 미리 채워진 50mL 원뿔형 튜브에 풀링합니다(1.1단계부터).
- 다른 새끼 생쥐와 함께 3.2-3.7단계를 반복하여 모든 폐엽을 동일한 50mL 원뿔형 튜브에 모았습니다.
- 튜브를 손으로 10-15초 동안 부드럽게 저어 폐 표면에서 시각적으로 볼 수 있는 과도한 적혈구를 씻어냅니다.
참고: 폐 내부 또는 주변의 모든 혈액을 제거할 필요는 없습니다. 그러나 이것은 순도를 향상시킵니다. 추가 조직 취급은 멸균 후드에서 수행해야 합니다. - 세포 여과기를 사용하여 배지에서 폐를 제거하고 조직을 멸균된 일회용 100mm 직경의 조직 배양 접시에 옮기고 멸균된 가위로 다집니다.
- 다진 조직을 미리 데워진 콜라게나제 용액 25mL와 함께 50mL 원추형 튜브로 옮깁니다(3.1단계). 37°C에서 45분 동안 회전 믹서에서 부드럽게 교반합니다.
알림: 60분만 해도 과소화되면 수율이 낮아질 수 있습니다. - 20mL 주사기를 15G 무딘 캐뉼라( 재료 표 참조)에 부착하고 현탁액을 10-15회 분쇄하여 조직을 세포 현탁액으로 분해합니다. 활기차게 하되 과도한 거품을 피하십시오.
참고: 더 이상 폐 조각이 보이지 않으며 대신 이 단계가 완료되면 서스펜션이 흐려집니다. - 70μm 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 여과합니다. 또한, 소화에 사용되는 원뿔형 튜브와 세포 여과기를 추가로 15mL의 기본 배지로 헹굽니다.
- 세포 현탁액을 4°C에서 8분 동안 400 x g 로 원심분리합니다.
- 유리 파스퇴르 피펫으로 상청액을 제거하고 펠릿을 2mL의 완전 배지에 재현탁합니다. T-75 플라스크로 옮기고 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 8 mL의 완전 배지 배양물을 첨가한다.
- 다음 날, 플라스크를 칼슘과 마그네슘이 없는 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS/CMF) 10mL로 두 번 세척하고( 재료 표 참조) 10mL의 완전한 배지를 추가합니다.
참고: 2-3일 후, 배양은 90-95% 합류하고 1차 면역비드 분리를 위한 준비가 됩니다.
4. 내피 세포의 1차 면역비드 분리 및 배양
- 부착성 내피 세포를 10mL HBSS/CMF로 두 번 세척합니다. 트립신이 없는 세포 분리 용액 2mL( 재료 표 참조)를 추가하고 37°C에서 ~5분 동안 배양합니다. 모든 세포가 플라스크에서 들어 올려졌는지 확인합니다.
참고: 트립신이 세포 표면 접착 마커 CD-31을 방해할 수 있으므로 트립신 대신 트립신이 없는 박리 용액을 사용해야 합니다. - 8mL의 기본 배지를 추가하여 세포 분리 용액을 중화하고 내용물을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 실온에서 400 x g 로 4분 동안 회전합니다.
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 2mL의 기본 배지에 세포를 재현탁합니다. 2mL 세포 현탁액을 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조).
- 소용돌이 항-CD-31 코팅된 비드를 몇 초 동안 사용하여 비드를 재현탁하고 세포 현탁액 2mL마다 30μL의 비드를 추가합니다. 뚜껑을 단단히 닫습니다.
- 엔드 오버 엔드 로테이터에서 실온에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 그런 다음 튜브를 자기 분리기에 놓고 2분 동안 그대로 두십시오.
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 상층액을 흡인합니다. 자석에서 튜브를 제거하고 3mL의 기본 배지를 튜브에 추가하여 비드 셀 펠릿을 다시 현탁하고 여러 번 위아래로 피펫합니다.
- 자기 분리기의 튜브를 2분 동안 교체한 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
- 상층액이 투명해질 때까지 세척(4.6-4.7단계)을 4회 이상 반복합니다.
- 최종 세척 후 비드 세포 펠릿을 3mL 완전 성장 배지에 재현탁하고 T-75 플라스크에 옮깁니다. 완전한 성장 배지 7 mL를 첨가하고, 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.
- 다음날 HBSS/CMF로 세포를 세척한 다음 10mL의 신선한 완전 배지를 추가합니다. 90-95%가 합류할 때까지 2-3일마다 배지를 10mL의 완전한 새 배지로 교체합니다.
참고: 세포가 ~90-95% 합류하여 ~3-4일이 걸리면 배양은 2차 면역비드 분리를 위한 준비가 됩니다.
5. 내피 세포의 2차 면역비드 분리 및 배양
- 부착성 내피 세포를 10mL의 HBSS/CMF로 두 번 세척합니다. 트립신이 없는 세포 분리 용액 2mL를 넣고 37°C에서 ~5분 동안 배양합니다. 모든 세포가 플라스크에서 들어 올려졌는지 확인합니다.
- 8mL의 기본 배지를 추가하여 세포 분리 용액을 중화하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 실온에서 400 x g 로 4분 동안 회전합니다.
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 2mL의 기본 배지에 세포를 재현탁합니다. 2mL 세포 현탁액을 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.
- 소용돌이 항-CD-102 코팅된 비드를 몇 초 동안 사용하여 비드를 재현탁하고 세포 현탁액 2mL마다 30μL의 비드를 추가합니다. 뚜껑을 단단히 닫습니다.
- 엔드 오버 엔드 로테이터에서 실온에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 튜브를 자기 분리기에 놓고 2분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상청액을 부드럽게 흡인합니다.
- 자석에서 튜브를 제거하고 3mL의 기본 배지를 튜브에 추가하여 비드 셀 펠릿을 다시 현탁하고 여러 번 위아래로 피펫합니다.
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡입하기 전에 자기 분리기의 튜브를 2분 동안 교체합니다.
- 상청액이 투명해질 때까지 세척 (5.6-5.7 단계)을 4 회 이상 반복하십시오.
- 최종 세척 후 비드 세포 펠릿을 3mL 완전 성장 배지에 재현탁하고 T-75 플라스크에 옮깁니다. 7 mL의 완전 성장 배지를 첨가하고, 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 인큐베이션한다.
- 다음날 HBSS/CMF로 세포를 세척한 다음 10mL의 신선한 완전 배지를 추가합니다. 90-95%가 합류할 때까지 2-3일마다 배지를 10mL의 완전한 새 배지로 교체합니다. 내피 세포가 완전히 합류하면 실험 준비가 된 것입니다. 세포는 노화가 발생할 수 있고 다른 세포 유형이 대신할 수 있으므로 계대 6 이상으로 사용해서는 안 됩니다.
6. 유세포 분석에 의한 내피 세포 표면 마커의 확인
- 트립신이 없는 세포 분리 용액을 사용하여 세포를 분리한 후 세포 펠릿을 1 x 105 cells/mL로 재현탁하고 세포 현탁액의 분취액 100μL를 1, 2 및 3으로 표시된 3개의 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 분취합니다.
- 1x PBS 1mL로 세포를 세척합니다. 4°C에서 2분 동안 500 x g 로 원심분리합니다. 세척액을 제거하고 두 번 반복합니다.
- 세포 펠릿을 1x PBS 100μL에 재현탁합니다. 튜브 1에 1μL의 접합 항-마우스 CD-31(PECAM-1) 항체(예: 피코에리트린(PE) 항-마우스 CD-31 항체)와 1μL의 접합 항-마우스 CD-102(ICAM-2)(예: 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 항-마우스 CD102 항체)( 재료 표 참조). 튜브 2에 적절한 isotype 컨트롤을 추가합니다. 3번 튜브는 얼룩이 묻지 않은 상태로 유지됩니다.
- 튜브를 얼음과 어둠 속에서 30-45분 동안 배양합니다.
- 각 튜브에 PBS 1mL를 넣고 부드럽게 와동시키고 4°C에서 2분 동안 500 x g 에서 원심분리합니다. 세척을 제거하고 세 번 반복하십시오. 500 μL의 PBS에 최종 펠릿을 재현탁합니다.
- 분석할 때까지 알루미늄 호일로 덮인 튜브를 4°C에서 보관하십시오. 분석은 3-4시간 이내에 완료해야 합니다.
- 유세포 분석기를 사용하여 유동 데이터를 수집합니다. 염색되지 않은 샘플을 음성 대조군으로 사용하여 세포 자가형광에 따라 레이저 전압을 적절하게 설정합니다. 전방 산점도와 측면 산점도를 사용하여 전체 세포 집단을 게이트합니다.
참고: 이중선을 제외한 후 CD31+ CD102+ 이중 양성 세포는 내피 세포로 정의됩니다.
Representative Results
이 간단한 프로토콜을 통해 7-10일 동안 마우스 미세혈관 내피 세포를 분리, 배양 및 특성화할 수 있습니다(그림 1). 간단히 말해서, 폐는 도금 전에 절제되고 효소에 의해 소화됩니다. 도금 직후, 내피 세포 및 기타 세포는 세포 배양 배지에 떠 있습니다. 다음날까지 내피 세포와 오염 세포가 플레이트에 부착되고 파편과 부유 세포를 제거하기 위해 강력한 세척 기술이 필요합니다. 세포가 합류점에 도달하면 첫 번째 면역비드 선택이 수행됩니다. 그런 다음 CD-31 양성 세포는 조약돌 형태로 성장하기 시작합니다(그림 2). 조약돌 형태가 없거나 과도하게 자라는 세포는 오염 물질이며 내피 세포가 아닙니다13,14,15,16.
이어서, 제2 면역비드 선택은 다른 프로토콜과 유사하게 내피 세포의 순도를 증가시키기 위해 항-CD-102 코팅된 비드를 사용하여 수행된다 13,16. 두 번째 면역비드 선택 후 합류하도록 성장한 세포는 실험에 사용할 수 있습니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)는 세포 집단이 CD-31 및 CD-102 양성임을 확인하는 데 사용됩니다(그림 3).
이러한 내피 세포는 내피 염증 경로 및 내피 장벽 기능 연구와 같은 많은 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 쥐 사이토믹스(IFNg, TNFa 및 IL1b, 각각 10ng/mL)로 처리하면 내피 세포에서 IL-6 생성이 유도되는 것이 관찰되었습니다 (그림 4A). 그런 다음 ECIS(Electric Cell-substrate Impedance Sensing)18 를 사용하여 쥐의 폐 내피 세포 단층을 가로지르는 전류 흐름에 대한 경내피 저항(TER)을 측정했습니다. 사이토믹스로 처리된 세포가 TER의 감소를 유도하는 것이 관찰되었으며 (도 4B), 이는 증가된 내피 투과성과 일치한다. 이러한 예는 이 프로토콜을 사용하여 준비된 내피 세포가 다양한 내피 과정을 연구할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이를 통해 연구자들은 사용 가능한 녹아웃 및 형질전환 마우스의 수가 계속 증가함에 따라 내피 세포에서 관심 유전자를 보다 쉽게 연구할 수 있습니다.
그림 1: 쥐 폐 내피 세포의 분리를 위한 개략도. 5-7 일 된 신생아 새끼의 폐를 수확하고 다진 것입니다. 다진 조직을 콜라겐나제 I.로 효소적으로 분해하였다. 세포 현탁액을 도말하고, 2-3일 동안 배양하였다. 그런 다음 세포는 CD-31 코팅 비드로 1차 면역비드 분리를 거치고 추가 3-4일 동안 배양됩니다. 2-3일 동안 추가로 배양하기 전에 CD-102 코팅된 비드로 면역비드를 분리한다. 세포는 이제 기능 실험을 할 준비가되었습니다. 이미지는 웹 기반 일러스트레이션 도구인 Biorender로 만들었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 쥐 폐 내피 세포의 형태. 배양된 쥐 폐 내피 세포는 조약돌 형태를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유세포 분석에 의한 내피 세포 분석 . (A) 모든 이벤트는 FSC(Forward Scatter) 및 SSC(Side Scatter)의 점도표로 시각화됩니다. (B) 쥐 폐 내피 세포가 내피 특이적 세포 표면 항원 CD-31 및 CD-102 모두에 대해 양성인 산점도 확인. (C) 동형 샘플 및 CD-31/CD-102 특이적 항체로 염색된 샘플의 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Cytomix는 쥐 폐 내피 세포 IL-6 생성 및 내피 세포 투과성을 유도합니다. C57BL/6 마우스의 쥐 폐 미세혈관 내피 세포를 사이토믹스(IFNg, TNFa 및 IL1b, 각각 10ng/mL)로 처리했습니다. (A) IL-6 수준은 15 h (** p <0.01, n = 4 웰 / 조건)에서 배양 상청액에서 정량화되었습니다. (B) Electric Cell-Substrate Impedance Sensing을 사용하여 15시간 동안 반복적으로 경내피 저항(TER)을 측정했습니다. 데이터는 지정된 대로 사이토믹스를 첨가하기 직전의 내성으로 정규화되었고, 이원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey 사후 검정19 (**p<0.01, n = 4웰/조건)에 의해 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 간단한 프로토콜은 쥐 폐의 고순도 내피 세포에 적합합니다. 처음부터 끝까지 총 시간은 7-10 일이지만 실습 시간은 약 3-4 시간입니다. 다른 방법(13,14,15,16)과 비교하여, 현재의 프로토콜은 간소화되어 수율 및 순도를 손상시키지 않으면서 필수 단계를 유지한다.
이 프로토콜의 몇 가지 중요한 측면에 주목할 가치가 있습니다. 첫째, 성인 마우스보다 신생아 강아지를 사용하는 것이 중요합니다. 우리의 경험에 따르면, 성인 마우스의 내피 세포는 신생아 새끼의 세포만큼 쉽게 증식하지 않으며, 섬유아세포 또는 중간엽 줄기 세포와 일치하는 방추형 형태를 가진 세포에 의해 쉽게 오버런됩니다15,16. 그 차이에 대한 한 가지 가능한 설명은 폐 발달이 신생아 마우스의 폐포 단계에 있으며, 내피 세포의 보다 빠른 증식을 특징으로 한다는것이다 20. 또한21세의 노화에 따라 어느 정도의 노화가 있을 수 있습니다. 효소 소화 시간도 정확해야 하는데, 소화 불량은 낮은 수율의 단일 세포 현탁액으로 이어질 수 있기 때문입니다. 대조적으로, 과도한 소화는 상당한 양의 세포 사멸로 이어질 수 있습니다. 콜라게나제 소화를 위한 최적의 시간은 45분으로 결정하였다. 그런 다음 뭉툭한 캐뉼라로 기계적 해리가 이어집니다. 효소 소화 동안 기관내 콜라게나제를 주입하는 것도 보고되었다14,15; 그러나 이것은 시간이 많이 소요될 수 있으며 현재 작업 중에 불완전한 소화로 이어질 수 있습니다. 마지막으로, 일부 프로토콜은 효소 분해 직후 면역비드 분리로 직접 진행됩니다13,16. 우리는 면역비드 선택을 하기 전에 하루나 이틀 동안 배지에서 해리된 폐의 세포를 배양하면 생존 가능하고 고순도의 내피 세포의 수율이 크게 증가한다는 것을 발견했습니다. 이는 분리된 세포를 조직 배양 배지로 가져오는 속도와 관련이 있을 수 있으며, 이는 마우스에서 제거한 후 초기 단계에서 세포 사멸을 줄이고, 초기 파종 밀도를 높이고, 첫 번째 면역비드 분리 전에 내피 세포가 부착 및 증식하는 시간을 유도합니다.
마우스 내피세포의 제조 및 분석의 한계는 다음과 같다. 각 마우스는 몇 구절 내에서 사용해야 하는 제한된 수의 셀만 제공합니다. 이 문제는 여러 생쥐의 폐 소화를 풀링하여 극복할 수 있습니다. 안타깝게도 우리는 향후 사용을 위해 세포를 냉동 보존하고 해동하려는 노력에 실패했습니다. 이러한 한계에도 불구하고, 마우스 내피 세포는 몇 가지 장점을 가지고 있다. 특히 인간 내피 세포를 사용할 수 없는 상황(예: 유전자 녹아웃), 인간 세포와의 결과를 확증하기 위해 보완 연구가 필요한 경우, 또는 다른 인간 기증자의 내피 세포 반응의 이질성으로 인해 실험 간의 재현성이 문제가 되는 경우에 도움이 될 수 있다6. 유전적으로 동일한 마우스의 균질한 내피 세포 집단은 안정적인 배경 조건에서 실험과 특정 유전자 및 경로 연구 사이의 재현성을 허용합니다.
마우스 내피 세포는 다양한 질병 과정에서 내피 활성화 및 기능 장애에 대한 통찰력을 제공하기 위해 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 내피 세포는 패혈증에서 필수적인 역할을 하며, 국소 및 전신 염증을 활성화하고, 조직에서 백혈구 이동 및 활성화를 촉진하고, 응고를 조절하고, 내피 투과성을 조절하는 역할을 통해 유익한 반응과 병리학적 반응 모두에 기여합니다 2,22,23. 이 간단한 프로토콜은 이러한 각 내피 과정에 대한 분석에 사용할 수 있는 실행 가능하고 기능적인 내피 세포를 제공합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH T32GM008440(JH/EW) 및 NIH R01AI058106(JH)의 지원을 받았습니다. 우리는 Grant NIH P30 DK063720 및 NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01에 의해 부분적으로 지원되는 UCSF Parnassus Flow Cytometry Core(RRID:SCR_018206)를 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conicals | Corning Life Sciences | 430829 | |
| Accutase Cell Detachment Solution | Innovative Cell Technologies, Inc | AT-104 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8" | Becton Disckinson | 305122 | |
| BioRender.com | BioRender | ||
| Blunt Cannula 15 G x 1-1/2" | Covidien | 8881202314 | |
| CD-102 Rat anti-mouse (3C4 (MIC2/4)) | BD Biosciences | 553326 | |
| CD-31 Rat anti-mouse (MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004194 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| Endothelial Cell Growth Supplment | EMD Millipore Corp | 02-102 | |
| Falcon cell strainers (70 µm) | Corning Life Sciences | 352350 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10082-147 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4) | BD Biosciences | 557444 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Control (R35-95) | BD Biosciences | 553929 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL) | Medline | 0409-2720-02 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3393 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630106 | |
| Nonessential amino acids (100x) | Gibco | 11140050 | |
| PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3) | BD Biosciences | 553373 | |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control R35-95) | BD Biosciences | 553930 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL, 10,000 µg/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05 | |
| Recombinant Murine IL-1β | Peprotech | 211-11B | |
| Recombinant Murine TNF-α | Peprotech | 315-01A | |
| Round bottom polystyrene test tubes | Corning Life Sciences | 352058 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | |
| Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System, 250 mL | Millipore | S2GPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Milipore | SCGP00525 | |
| Sterile syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| Sterile syringe (20 mL) | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| T-75 cell culture flask with vent cap, CellBIND treated | Corning Life Sciences | 3290 |
References
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