Summary
우리는 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응에 의해 연령 의존적 신장 손상이있는 마우스의 신장 및 혈청에서 microRNA 발현을 평가하는 방법을 제시합니다.
Abstract
마이크로 RNA (miRNA)는 21-25 염기로 구성된 작은 비 코딩 RNA입니다. 그들은 단백질로 번역되지 않고 오히려 표적 메신저 RNA(mRNA)를 불안정하게 만들고 번역을 방해하여 기능을 방해합니다. 다양한 마우스 장기 및 조직에서 miRNA 발현 프로필이 조사되었지만 마우스 신장 및 혈청 miRNA를 정제하고 정량화하는 표준 방법은 없었습니다. 우리는 연령 의존적 신장 손상이 있는 마우스의 혈청과 신장에서 miRNA 발현을 추출하고 평가하기 위한 효과적이고 신뢰할 수 있는 방법을 확립했습니다.
이 방법은 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하며, 프로토콜에는 6단계가 필요합니다: (1) 노화 가속 마우스 내성 1(SAMR1) 마우스 및 노화 가속 마우스 경향(SAMP1) 마우스 준비; (2) 이들 마우스로부터 혈청 샘플을 추출하는 단계; (3) 각 마우스로부터 신장 샘플을 추출하는 단계; (4) 각 마우스의 신장 및 혈청 샘플로부터 총 RNA (miRNA 포함)를 추출하는 단계; (5) miRNA로부터의 역전사를 갖는 상보성 DNA (cDNA)의 합성; (6) 수득한 cDNA를 이용하여 qRT-PCR을 실시한다.
이 프로토콜은 대조군과 비교하여 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 발현이 연령 의존성 신장 손상 마우스 모델의 신장 및 혈청에서 유의하게 변화되었음을 확인하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 또한 연령 의존성 신장 손상의 마우스 모델의 신장과 혈청 사이의 관계를 명확히했습니다. 이 프로토콜은 연령 의존성 신장 손상이있는 마우스의 신장 및 혈청에서 miRNA 발현을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
생리학 및 질병(예를 들어, 염증, 섬유증, 대사 장애 및 암) 모두에서 중요한 역할을 하는 다양한 mRNA의 발현은 분해를 유발하고 mRNA1의 전사를 억제하는 짧은 비코딩 RNA인 miRNA에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 특정 miRNA가 다양한 질병 2,3,4,5에 대한 새로운 후보바이오마커 및/또는 치료 표적으로서 작용할 수 있다. 다양한 마우스 장기 및 조직(뇌6, 심장7, 폐8, 간9 및 신장10 포함)에서 miRNA 발현 프로필에 대한 연구가 수행되었습니다. 그러나 연령 의존성 신장 손상이 있는 마우스의 신장 또는 혈청에서 miRNA를 추출하고 평가하는 표준 또는 확립된 방법은 없습니다.
따라서 연령 의존적 신장 손상이 있는 마우스의 혈청 및 신장에서 miRNA 발현을 안정적으로 정제하고 검출하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 확립했습니다. 프로토콜에는 6가지 주요 단계가 있다: (1) 50주령 SAMR1 수컷 마우스 및 SAMP1 수컷 마우스 둘 다의 준비; (2) 두 균주의 하대 정맥에서 혈액 샘플을 추출하고, 이후 헤파린과 함께 스 피츠 튜브를 사용하고, 원심 분리하여 혈청 샘플을 얻는다. (3) 마우스로부터 신장 샘플 추출-실리콘 균질화기를 사용하여 신장 샘플을 개별적으로 균질화하고, 샘플을 마이크로원심분리 스핀 컬럼상의 바이오폴리머-파쇄 시스템으로 이송한 후; (4) 실리카막계 스핀 컬럼(12)을 사용하여 혈청 샘플로부터 추출한 총 RNA (miRNA 함유) 및 실리카 멤브레인계 스핀 컬럼(11)을 사용하여 신장 샘플로부터 miRNA를 추출한 총 RNA; (5) 역전사효소, 폴리(A) 중합효소 및 올리고-dT 프라이머13,14를 사용하여 전체 RNA로부터 상보성 DNA(cDNA)의 합성; 및 (6) 마지막으로, qRT-PCR 및 삽입염료13,14를 이용한 miRNA 발현의 결정.
이 새로운 프로토콜은 다양한 유형의 조직11,12,13에서 miRNA를 추출하고 평가하는 데 성공한 연구를 기반으로했습니다. 프로토콜의 바이오폴리머-파쇄 시스템은 조직11로부터 고품질의 총 RNA를 정제할 수 있음이 입증되었다. 삽입 염료를 사용한 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현의 평가에 사용되는 이 프로토콜의 측면의 정확성 및 감도는13,14, 예를 들어 추출된 총 RNA로부터 역전사효소, 폴리(A) 중합효소 및 올리고-dT 프라이머를 사용한 cDNA 합성이 확립되었습니다. 새로운 프로토콜에는 단순성, 시간 절약 및 기술 오류 감소와 같은 몇 가지 장점이 있습니다. 따라서 신장 및 혈청 miRNA 프로파일의 정확하고 민감한 식별이 필요한 조사에 사용할 수 있습니다. 많은 병리학 적 상태에 대한 연구도 새로운 프로토콜을 활용할 수 있습니다.
연령 의존성 신장 손상의 모델인 SAMP1 마우스의 miRNA 발현 프로필은 아래와 같이 결정할 수 있습니다. 인간의 경우 연령 의존성 신장 손상은 신부전의 진행과 관련이 있으며 신장 간질 섬유증 영역의 증가와 사구체 경화증의 진행을 특징으로합니다15,16. 연령 의존성 신장 손상은 또한 만성 신장 질환 및 말기 신장 질환의 중요하고 빈번한 특징입니다15,16.
Protocol
실험 프로토콜은 지치 의과 대학 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 지치 의과 대학 실험 동물 가이드 및 실험 동물의 사용 및 관리에 관한 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 4 개의 50 주 된 SAMR1 수컷 마우스와 SAMP1 수컷 마우스 (40-45g)를 사용합니다.
1. 혈청 샘플 수집
- 각 마우스에 대해 다음을 준비하십시오 : 1.0mL 주사기가 달린 30G 바늘, 헤파린이 포함 된 1.0mL 스 피츠 원심 분리 튜브, 1.5mL 미세 원심 분리 튜브, 이소 플루 란 마취제, 코르크 시트, 70 % 에탄올, 인산염 완충 식염수 (PBS)를 적신 면봉 2 개, PBS가 담긴 페트리 접시, 핀셋 및 수술 용 가위.
- 마우스를 1.5% 이소플루란으로 마취시키고 1.5%로 유지한다. 진통제 (Meloxicam 5 mg / kg)를 피하 투여 한 다음 복부에 70 % 에탄올 1.0mL를 주입하고 코르크 시트의 앙와위 위치에 놓습니다.
- 페달 철수 반사의 소실로 마취 깊이를 확인하십시오. 핀셋과 수술 용 가위로 복부의 피부를 절개하십시오. 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막 막을 자릅니다.
- 핀셋을 사용하여 복막막을 들어 올리고 수술 용 가위로 복막의 상단 가장자리를 측면 절개하십시오. 갈비뼈의 가장 낮은 가장자리를 따라 절개를 계속하십시오.
- 두 개의 PBS에 적신 면봉을 사용하여 하대 정맥을 식별하십시오. 1.0mL 주사기가 있는 30G 바늘 중 하나를 하대정맥에 삽입한 다음 주사기를 당깁니다. 용혈을 피하기 위해 하대 정맥에서 바늘을 천천히 빼냅니다. 혈액을 헤파린과 함께 1.0mL 스 피츠 튜브로 옮긴 다음 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다.
참고: 마우스는 자궁 경부 탈구에 의해 안락사됩니다. - 스피츠 튜브를 실온(RT), 3,000× g 에서 10분 동안 돌립니다.
- 상청액을 천천히 흡인하고 침전물이 포함되어 있지 않은지 확인한 다음 사용하지 않은 1.5mL 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
- 사용하기 전에 튜브를 -80 ° C에 보관하십시오.
알림: 즉시 3단계로 진행하는 경우 튜브를 -80°C에서 보관할 필요가 없습니다.
2. 신장 검체 채취
- 각 마우스에 대해 2.0mL 냉동 튜브, 이소플루란 마취제, 코르크 시트, 70% 에탄올, PBS가 있는 페트리 접시, 핀셋 및 수술용 가위를 준비합니다.
- 마우스를 1.5% 이소플루란으로 마취시키고 1.5%로 유지한다. 진통제 (Meloxicam 5 mg / kg)를 피하 투여 한 다음 복부에 70 % 에탄올 1.0mL를 주입하고 코르크 시트의 앙와위 위치에 놓습니다.
- 페달 철수 반사의 소실로 마취 깊이를 확인하십시오. 핀셋과 수술 용 가위를 사용하여 복부 피부를 절개하십시오. 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막 막을 자릅니다.
- 핀셋을 사용하여 복막을 들어 올리고 수술 용 가위로 복막의 위쪽 가장자리를 측면 절개합니다. 갈비뼈의 가장 낮은 가장자리를 따라 절개를 계속하십시오.
- 왼쪽 신장을 확인하십시오. PBS로 역류시켜 신장이 황백색이 될 때까지 혈관에서 혈액을 씻어냅니다. 왼쪽 신장 동맥과 정맥을 절단하기 위해 수술 용 가위를 사용하여 먼저 전체 신장을 절제하십시오. 신장을 페트리 접시에 넣고 PBS로 조심스럽게 씻으십시오.
참고: 마우스는 자궁 경부 탈구에 의해 안락사됩니다. - 핀셋과 수술용 가위를 사용하여 신장을 10mg 샘플로 자릅니다(10mg은 다음 단계에 적합한 샘플 크기). 신장의 각 샘플을 자체 2.0mL 냉동 튜브에 넣습니다. 튜브의 캡을 닫습니다.
- 장기 보관을 위해 각 냉동 튜브를 액체 질소로 옮기고 -80 ° C에서 보관하십시오.
3. 혈청 샘플에서 총 RNA 추출
- 먼저 다음 항목을 준비하십시오: 와류 혼합기, 페놀/구아니딘 기반 용해 시약, 80% 에탄올, 100% 에탄올, 100% 클로로포름, 바이오폴리머 스핀 컬럼(2.0mL 수집 튜브 11), 멤브레인 고정 스핀 컬럼(2.0mL 수집 튜브11), 세척 완충액 #1(즉, 구아니딘과100% 에탄올을 1:2의 비율로 포함하는 세척 완충액), 세척 완충액 #2(즉, 구아니딘과 100 % 에탄올을 1 : 4의 비율로 포함하는 세척 완충액), RNase가없는 물, 1.5mL 미세 원심 분리 튜브 및 2.0mL 미세 원심 분리 튜브.
- 먼저 1.5mL 미세 원심분리 튜브에서 200μL 혈청 샘플을 채취한 다음 페놀/구아니딘 기반 용해 시약 1,000μL를 추가합니다. 혼합물을 5 초 동안 소용돌이.
- 샘플을 RT에서 5분 동안 인큐베이션합니다.
- 튜브의 혈청 샘플에 200μL의 클로로포름을 넣고 튜브 캡을 단단히 닫습니다. 튜브를 15x 뒤집어 클로로포름과 혈청 샘플을 혼합합니다.
- 각 샘플은 RT에서 3분 동안 인큐베이션됩니다. 다음으로, 샘플을 4°C에서 12,000 x g에서 15분 동안 회전시킵니다.
- 펠릿을 방해하지 않고 300μL의 상청액을 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 450 μL의 100 % 에탄올을 첨가하고 튜브를 5 초 동안 볼텍스합니다.
참고: 다음 모든 단계에서 RNA와 DNA 분리를 위한 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 2.0mL 수집 튜브에 넣어 원심분리합니다. - 그런 다음 샘플 700μL를 제거하고 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 로드하고 캡을 닫습니다. 컬럼을 RT에서 8,000 × g 에서 15초 동안 스핀하고 상청액을 컬럼에 그대로 둡니다. 수집 튜브에 남아 있는 펠릿을 폐기하십시오.
- 혈청/혈장 키트( 재료 표 참조)의 일부인 세척 완충액 #1 700μL를 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 추가하여 샘플을 철저히 세척합니다. 컬럼 캡을 닫고 컬럼을 RT에서 8,000×g에서 15초 동안 회전시키고 상 청액을 컬럼에 그대로 둡니다. 수집 튜브에 남아 있는 펠릿을 폐기하십시오.
- 미량 염을 제거하려면 500μL의 세척 버퍼 #2를 취하여 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 로드합니다. 컬럼 캡을 닫은 후 컬럼을 RT에서 8,000×g에서 15초 동안 회전시키고 상 청액을 컬럼에 그대로 둡니다. 수집 튜브에 펠릿을 폐기하십시오.
- 미량 염을 제거하려면 500 μL의 80 % 에탄올을 취하여 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 적재하십시오. 컬럼 캡을 닫은 후 컬럼을 RT에서 8,000×g에서 15초 동안 회전시키고 상 청액을 컬럼에 그대로 둡니다. 수집 튜브에 펠릿을 폐기하십시오.
- 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 RT에서 15,000× g에서 5분 동안 다시 회전시킵니다.
- 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브로 옮긴 후 RNase가 없는 물 14μL를 컬럼에 추가하여 총 RNA를 용해시킵니다. 컬럼 캡을 닫은 후 튜브를 RT에 두고 5분 동안 기다립니다. RT에서 15,000× g 으로 1분 동안 컬럼을 다시 돌립니다.
- 사용하기 전에 샘플과 함께 튜브를 -80 ° C에 보관하십시오.
4. 신장 샘플에서 총 RNA 추출
- 먼저 다음 항목을 준비하십시오: 실리콘 균질화기, 얼음, 와류 혼합기, 100% 에탄올, 100% 클로로포름, 바이오폴리머 스핀 컬럼(2.0mL 수집 튜브 11), 멤브레인 고정 스핀 컬럼(2.0mL 수집 튜브11), 페놀/구아니딘계 용해 시약, 세척 완충액 #1(단계 3.1과 동일한 완충액), 세척 완충액 #2(단계 3.1과 동일한 완충액), RNase가 없는 물, 1.5mL 미세 원심분리 튜브 및 2.0mL 미세 원심분리 튜브.
- 10mg 신장 샘플을 실리콘 균질화기에 넣고 페놀/구아니딘 기반 용해 시약 700μL를 추가합니다.
- 균질화기를 설정합니다. 균질화기의 유봉을 신장 샘플에 대고 부드럽게 누르고 비틀어 샘플을 균질화합니다. 신장 샘플이 페놀/구아니딘 기반 용해 시약에서 완전히 균질화될 때까지 유봉을 계속 누르고 비틀십시오.
- 추가 균질화를 위해 균질화된 용해물(2.0mL 수집 튜브에서)을 취하여 바이오폴리머 스핀 컬럼으로 옮깁니다.
- RT에서 균질화된 용해물을 14,000×g에서 3분 동안 원심 분리한 다음 침전된 펠릿 전체를 사용하지 않은 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮겨 침전된 펠릿을 반전시킵니다.
- 펠릿을 튜브에 140μL의 클로로포름과 혼합합니다. 그런 다음 튜브 캡을 단단히 닫습니다. 튜브를 15x 뒤집어 용해물과 클로로포름을 혼합합니다.
알림: 클로로포름은 후드 없이 안전하게 사용할 수 있습니다. - 샘플을 RT에서 2-3분 동안 인큐베이션합니다. 샘플을 4°C에서 12,000×g에서 15분 동안 원심분리합니다.
- 침전물을 방해하지 않고 상청액(일반적으로 ~300μL)을 새로운 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 부피의 1.5 배 (보통 ~ 450 μL)의 100 % 에탄올을 첨가하십시오. 혼합물을 5 초 동안 소용돌이.
참고: 다음 모든 단계에서 RNA와 DNA를 분리하기 위한 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 2.0mL 수집 튜브에 넣어 원심분리합니다. - 700μL의 시료를 멤브레인 고정 스핀 컬럼 중 하나에 로드합니다. 캡을 닫고 컬럼을 15,000× g 에서 15초 동안 원심분리합니다. 수집 튜브에 남아있는 침전된 용해물을 버립니다.
- 700μL의 세척 완충액 #1을 스핀 컬럼에 추가하여 완전히 세척합니다. 캡을 닫고 컬럼을 15,000× g 에서 15초 동안 원심분리합니다. 수집 튜브에 남아있는 침전된 용해물을 버립니다.
- 미량의 염분을 제거하려면 500μL의 세척 완충액 #2를 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 로드합니다. 컬럼 캡을 닫은 후 컬럼을 15,000× g 에서 15초 동안 원심분리합니다. 침전된 용해물을 수집 튜브에 버립니다.
- 4.11단계를 반복합니다.
- 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 15,000 × g에서 1분 동안 다시 원심분리합니다. 침전된 용해물을 수집 튜브에 버립니다.
- 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 새 1.5mL 수집 튜브로 옮깁니다. RNase가 없는 물 30μL를 컬럼에 추가하여 총 RNA를 용해시킵니다. 컬럼의 캡을 닫은 후 RT에서 튜브로 5분 동안 기다린 다음 컬럼을 15,000×g에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 총 RNA를 포함하는 샘플의 총 부피를 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 분광 광도법으로 총 RNA 농도를 측정합니다. 총 RNA 농도가 ~300-1,500ng/μL인지 확인하십시오.
- 사용하기 전에 샘플이 포함된 튜브를 -80°C에서 보관하십시오.
5. 혈청 내 총 RNA의 역전사를 통한 cDNA 합성
참고: 정량적 실시간 PCR 실험(MIQE) 가이드라인의 출판을 위한 최소 정보는 신뢰할 수 있고 명확한 결과를 얻기 위해 더 나은 실험 관행을 사용할 것을 권장합니다17. 이 프로토콜에서 cDNA는 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머를 사용하여 2 단계 절차로 정제 된 총 RNA로부터 합성됩니다.
- 먼저 다음을 준비하십시오 : 와류 믹서, 열 순환기, 8 웰 스트립 튜브, 각 8 스트립 튜브의 캡, 증류수, 얼음, 녹은 상태의 역전사 효소 키트 (재료 표 참조) 13,14 및 1.5mL 마이크로 원심 분리기 튜브.
- 열 순환기를 시작하십시오.
- 마스터 믹스 용액을 준비하십시오. 8웰 스트립 튜브당 총 8.0μL의 마스터 믹스를 얻으려면 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브의 역전사 완충액 4.0μL에 2.0μL의 역전사효소 믹스(키트에 포함)와 2.0μL의 10x 핵산 믹스를 추가합니다.
- 8.0 μL의 마스터 믹스 용액을 8웰 스트립 튜브의 각 튜브에 넣습니다.
- 8웰 스트립 튜브의 각 튜브에 총 RNA의 12μL 분취량을 놓고 튜브의 캡을 닫습니다. RT에서 15초 동안 튜브를 원심분리하고 2,000× g을 원심분리합니다.
- 튜브를 열 순환기에 넣고 37 ° C에서 60 분 동안 배양합니다. 샘플을 95°C 분에서 추가 5분 동안 인큐베이션하여 cDNA를 합성한다.
- 배양 후 cDNA를 새로운 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. cDNA를 증류수로 10배(1:10) 희석합니다. 튜브를 RT에서 5초 동안 소용돌이 및 원심분리하고 2,000× g을 분리합니다.
- 희석된 cDNA를 얼음에 일시적으로 보관한다. 사용하기 전에 희석된 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.
6. 신장에서 총 RNA의 역전사를 통한 cDNA 합성
참고 : MIQE 지침은 신뢰할 수 있고 명확한 결과를 보장하기 위해 더 나은 실험 관행을 권장합니다17. 이 프로토콜은 역전사효소, 폴리(A) 중합효소 및 올리고 dT 프라이머를 사용하여 2단계 절차에서 정제된 총 RNA 1.0μg에서 cDNA를 합성합니다.
- 먼저 와류 믹서, 열 순환기, 1.5mL 미세 원심 분리 튜브, 8 웰 스트립 튜브, 각 8 스트립 튜브의 캡, 증류수, 얼음 및 역전사 효소 키트 (재료 표 참조) 13,14를 용융 상태로 준비하십시오.
- 열 순환기를 시작하십시오.
- 마스터 믹스 용액을 준비하십시오. 튜브당 총 8.0μL의 마스터 믹스 용액을 얻으려면 키트에 포함된 역전사효소 믹스 2.0μL와 10x 핵산 믹스 2.0μL를 역전사 버퍼 4.0μL에 추가합니다.
- 8.0 μL의 마스터 믹스 용액을 8웰 스트립 튜브의 각 튜브에 추가합니다.
- 총 RNA 밀도를 다음과 같이 조정한다. 신장 샘플로부터 1.0 μg의 총 RNA를 12 μL의 RNase-free water로 분리하기 위해, 적당량의 총 RNA를 취하고, 상기와 같이 측정된 농도를 사용하여 증류수로 옮긴다(단계 4.15에서).
참고: DNA 오염이 있는 경우 오염된 DNA는 qRT-PCR에 의해 공동 증폭됩니다. - 위의 5.5.-5.8단계에서 설명한 것과 동일한 프로세스를 수행합니다.
7. miRNA의 qRT-PCR
참고: 인터칼레이터 방법은 miRNA의 qRT-PCR에 사용됩니다. 프라이머는 RNA에 사용됩니다 : U6 작은 핵 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p.
- 다음을 준비하십시오 : 와류 믹서, real-time PCR 시스템, qRT-PCR 용 96 웰 반응 플레이트, 96 웰 반응 플레이트 용 접착 필름, 접착 필름 애플리케이터, 96 웰 원심 분리기 로터, miRNA 특이 적 프라이머, 2x PCR 마스터 믹스 및 10x 범용 프라이머가 포함 된 녹색 염료 기반 PCR 키트 (재료 표 참조) 13,14, 및 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 포함한다.
- 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에서 이들을 혼합한 후 다음을 와동시킨다: 증류수 6.25 μL, 뉴클레아제 비함유 물에 용해된 5 μM miRNA 프라이머 각각 1.25 μL, 2x PCR 마스터 믹스 12.5 μL, 및 10x 범용 프라이머 2.5 μL.
- 단계 5(혈청) 또는 단계 6(신장)에 기재된 바와 같이 합성된 cDNA를 제조하고 용융시킨다. 5 초 동안 cDNA를 소용돌이 및 원심 분리합니다.
- 시약의 22.5μL 분취량(위의 단계 7.2.에 설명된 대로)을 취하여 96웰 플레이트의 각 웰에 별도로 배치합니다.
- 2.5 μL 분취량의 cDNA를 플레이트의 각 웰에 첨가한다.
- 접착 필름을 플레이트에 고정하려면 접착 필름 어플리케이터를 사용하십시오. 96웰 원심분리기 로터에서 플레이트를 1,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 각 웰의 바닥에서 반응을 안정화시킵니다.
8. 실시간 PCR 시스템 및 소프트웨어를 사용하여 PCR 사이클링 프로그램 실행
- 실시간 PCR 시스템을 시작합니다. 7.6단계에서 설명한 대로 생성된 플레이트를 놓습니다. 실시간 PCR 시스템에서. 설정을 수정하십시오. 실험 이름을 제공한 다음 시스템의 실험 유형으로 96웰(0.2mL ), 정량 분석법으로 비교 CT(ΔΔCT), 시스템 실행 모드로 표준물질 , 표적 서열 검출을 위한 시약으로 SYBR Green 시약을 선택합니다.
- 샘플 및 표적 miRNA의 이름을 제공하고 각 웰의 샘플 및 표적 miRNA의 이름을 지정합니다. 중복 샘플을 할당하여 결과를 확인하기에 적합한 데이터를 얻고 기준 샘플과 내인성 대조군을 선택합니다. 수동 참조로 사용할 염료의 경우 없음을 선택합니다. 시약 교차 오염을 제거하려면 miRNA 발현을 위한 음성 역전사효소 및 비주형 대조군을 설정합니다.
- 다음으로, 반응 부피가 20 μL 로 설정되고 PCR 사이클링 조건이 다음과 같이 설정되어 있는지 확인하십시오 : 95 ° C에서 15 분, 94 ° C에서 15 초 동안 40 사이클의 변성, 55 ° C에서 30 초 동안 어닐링, 마지막으로 70 ° C에서 30 초 동안 연장.
- 시스템의 소프트웨어 프로그램에서 분석을 클릭하여 프로세스가 완료된 후 qRT-PCR 데이터를 분석합니다. 프로그램에서 자동으로 선택한 임계값 선이 각 웰에 적합한지 확인합니다.
- 각 샘플에서 분석된 내인성 대조군 및 표적 miRNA의 역치 주기(CT) 값을 확인합니다. 증폭 곡선과 역치 선의 교차점으로 CT 값을 결정하십시오.
참고: 본 연구에서는 RNU6-2 및 miRNA-423-5p를 표적 miRNA 발현 수준에 대한 내인성 대조군으로 사용하였고, ΔΔCT 방법을 사용하여 각 표적 miRNA18의 상대적 발현 수준을 결정하였다.
Representative Results
연령 의존적 신장 손상 마우스 모델의 경우 체중이 40-45g 인 50 주 된 SAMP1 수컷 마우스를 사용했습니다. 마우스 당 약 0.8mL의 혈액을 수집하고 헤파린이 포함 된 1.0mL 스 피츠 튜브로 옮기고 반전시키고 원심 분리했습니다. 각 신장을 PBS로 헹구고, 해부하고, 추가 분석을 위해 액체 질소에 저장하였다. 50주 된 SAMR1 마우스가 대조군으로 작용했습니다. 이 연령 의존적 신장 손상 모델을 사용하여 얻은 miRNA qRT-PCR 데이터를 기반으로 SAMP1 마우스에서 miRNA-7219-5p의 신장 수준이 유의하게 증가하고 miRNA-7218-5p의 신장 수준이 대조군에 비해 상당히 감소하는 것을 관찰했습니다(그림 1). miRNA-7219-5p 및 miRNA-7218-5p의 혈청 수준은 대조군에 비해 SAMP1 마우스에서 상당히 증가했습니다(그림 2). miRNA-223-3p의 발현 수준은 어느 균주에서도 그리고 신장과 혈청 사이에서 변하지 않았습니다 (그림 1 및 그림 2).
그림 1: SAMP1 마우스의 신장에서 차등적으로 발현된 마이크로RNA . SAMR1 마우스(대조군, n=4) 및 SAMP1 마우스(n=4)에서 miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 발현에 대한 qRT-PCR 분석. 데이터는 평균 ± 표준 오차(오차 막대)입니다. t-검정은 그룹 간 차이를 분석하는 데 사용되었습니다. p < 0.05는 유의한 것으로 간주되었으며(*p < 0.05), n.s.: 유의하지 않음. 약어 : miRNA = 마이크로 RNA; SAMP1 = 노화 가속 마우스 경향; SAMR1 = 노화-가속 마우스 저항성 1; qRT-PCR = 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: SAMP1 마우스의 혈청에서 차별적으로 발현된 miRNA. SAMR1 마우스(대조군, n=4) 및 SAMP1 마우스(n=4)에서 miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 발현에 대한 qRT-PCR 분석. 데이터는 평균 ± SE(오차 막대)입니다. t-검정은 그룹 간의 유의미한 차이를 조사하는 데 사용되었습니다. * p< t-검정에 의한 0.05입니다. 약어 : miRNA = 마이크로 RNA; SAMP1 = 노화 가속 마우스 경향; SAMR1 = 노화-가속 마우스 저항성 1; qRT-PCR = 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
표적 miRNA의 발현 수준은 qRT-PCR을 사용하는 상술한 프로토콜에 의해 성공적으로 결정하였다. 추출된 miRNA의 평가는 의미 있는 qRT-PCR 데이터를 얻기 위한 중요한 단계입니다. qRT-PCR을 수행하기 전에 miRNA의 적절한 품질을 확인하려면 분광 광도법을 사용하여 260nm에서의 흡광도와 280nm에서의 흡광도 비율을 결정해야합니다. qRT-PCR이 예상 길이 및 용융 온도의 단일 PCR 증폭을 제공하지 않거나 모노모달 용융 곡선을 제공하는 경우 DNA 오염이 발생할 수 있으며/또는 반응 플레이트의 각 웰에 프라이머 이량체가 존재할 수 있습니다.
MiRNA 발현 수준은 노던 블롯팅, 마이크로어레이 및 리보뉴클레아제 보호 분석을 포함하는 qRT-PCR 이외의 여러 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나, qRT-PCR 방법은 노던 블로팅 및 리보뉴클레아제 보호 분석에 필요한 것보다 더 적은 샘플 부피를 필요로 하는 민감하고 정확하며 간단하고 재현 가능한 절차이다19. 마이크로어레이는 수만 개의 miRNA의 발현을 동시에 측정할 수 있기 때문에 후보 miRNA 마커를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 마이크로어레이 데이터는 또한 qRT-PCR20에 의해 수득된 데이터와 높은 전반적인 상관관계를 나타낸다. 그러나, 상이한 연구21에서 수득된 마이크로어레이 데이터를 비교하기 위한 최적 방법론에 관한 합의에 도달하지 못했다.
혈청 miRNA의 평가에는 다음과 같은 특징이 있습니다. 첫째, 혈청 수집이 용이하고, 혈청 miRNA는 동결 및 해동, 온도 및 산에 대해 안정적이므로 miRNA는 좋은 바이오마커가 될 수 있습니다. 둘째, 종들 사이에서 miRNA의 상동성이 높고, 동물실험의 결과는 인간에게 쉽게 외삽된다. 셋째, 혈청 miRNA는 치료 약물로 사용할 가능성을 보여주었습니다3. 여러 연구에서 장기에서 miRNA의 발현 수준이 혈청22,23,24의 miRNA와 상관 관계가 있음을 입증했습니다. 본 연구에서, 신장 수준이 SAMR1과 SAMP1 마우스 사이에 유의한 차이를 나타내지 않았던 miRNA-223-3p도 혈청에서 균주간 유의한 차이를 나타내지 않았다. 대조적으로, 신장 수준이 SAMR1과 SAMP1 마우스 사이에 유의한 차이를 보인 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p는 혈청에서 상당한 균주 간 차이를 보였다.
이 프로토콜에는 다음과 같은 제한 사항이 있습니다. 첫째, 간, 폐와 같은 다른 장기에서 그 유용성이 검증되지 않았고, 둘째, 쥐, 개, 돼지와 같은 다른 실험실 동물에 대해 테스트되지 않았습니다. 몇몇 연구 그룹은 qRT-PCR에 의한 miRNA의 정제 및 검출을 위해이 프로토콜을 사용했으며,이 프로토콜이 조직 및 혈청13,14,22,23,24에서 고품질 RNA의 정제를 가능하게한다고보고했다. 이 방법은 miRNA13,14,22,23,24의 발현을 검출하기 위한 높은 정확도 및 민감도를 갖는 것으로 입증되었다. 본 연구의 결과는이 프로토콜이 마우스의 혈청과 신장에서 miRNA 발현을 성공적으로 검출 할 수 있음을 보여줍니다. 따라서, 상기 프로토콜은 다양한 병리를 갖는 마우스에서 혈청 및 신장 miRNA 발현 프로필을 결정하는데 사용될 수 있다. 프로토콜의 단순성으로 인해 많은 수의 샘플을 동시에 처리할 수 있습니다. 신장의 다양한 병리학적 상태에서 많은 miRNA의 발현의 분석은, 따라서, 본원에 기재된 프로토콜을 사용할 수 있다.
명심해야 할 프로토콜의 특정 측면이 있습니다. 실온에서 발생하는 정제된 miRNA의 분해를 방지하려면 miRNA를 얼음 위에 보관해야 합니다. 신장 샘플은 용해 시약에 완전히 용해 될 때까지 균질화되어야합니다. 마우스 신장은 용해 시약에 녹지 않는 상당한 양의 결합 조직을 포함하므로 추가 균질화를 위해 컬럼 분쇄기가 필요합니다. 또한 적절한 내인성 대조군 miRNA(샘플 중에서 안정적인 발현을 가짐)는 qRT-PCR 실험 설정 전반에 걸쳐 검증되어야 합니다. 이는 이 프로토콜을 수행하는 동안 다양한 물질의 간섭이 내인성 대조군 miRNA의 발현 수준을 변경하여 결과를 손상시킬 수 있기 때문입니다. 결론적으로, 이 논문은 연령 의존적 신장 손상이 있는 마우스의 혈청 및 신장에서 miRNA 발현의 검출, 정제 및 평가를 위한 qRT-PCR 프로토콜을 설명합니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
| Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
| miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
| miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
| miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
| SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |
References
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