Summary
A avaliação clínica da espasticidade baseada no reflexo de Hoffmann (reflexo H) e utilizando a estimulação elétrica de nervos periféricos é um método estabelecido. Aqui, nós fornecemos um protocolo para uma estimulação nervosa terminal e direta para quantificação do reflexo H na pata dianteira de camundongos.
Abstract
O reflexo de Hoffmann (reflexo H), como análogo elétrico ao reflexo de estiramento, permite a validação eletrofisiológica da integridade dos circuitos neurais após lesões como lesão medular ou acidente vascular cerebral. Um aumento da resposta reflexa H, juntamente com sintomas como contrações musculares não voluntárias, reflexo de estiramento patologicamente aumentado e hipertonia no músculo correspondente, é um indicador de espasticidade pós-AVC (PSS).
Em contraste com medidas transcutâneas bastante inespecíficas do nervo, apresentamos aqui um protocolo para quantificar o reflexo-H diretamente nos nervos ulnar e mediano da pata anterior, que é aplicável, com pequenas modificações, ao nervo tibial e ciático da pata traseira. Baseado na estimulação direta e na adaptação a diferentes nervos, o método representa uma ferramenta confiável e versátil para validar mudanças eletrofisiológicas em modelos de doenças relacionadas à espasticidade.
Introduction
O reflexo de Hoffmann (reflexo H), nomeado em homenagem ao fisiologista Paul Hoffmann, pode ser evocado pela estimulação elétrica de nervos periféricos, que carregam axônios de neurônios sensoriais e motores que surgem e levam aos mesmos músculos. É o análogo eletricamente induzido do reflexo de estiramento monossináptico e compartilha a mesma via1. Diferentemente do alongamento muscular, o reflexo H resulta da estimulação elétrica. Quando os nervos periféricos são estimulados eletricamente em baixa intensidade de corrente, as fibras aferentes de Ia são tipicamente despolarizadas primeiro devido ao seu grande diâmetro axonal2. Seus potenciais de ação excitam neurônios motores alfa (αMNs) na medula espinhal, que por sua vez provocam potenciais de ação que viajam pelos axônios αMN em direção ao músculo (Figura 1). Essa cascata gera uma resposta muscular com pequena amplitude, refletida na chamada onda H. Ao aumentar gradualmente a intensidade do estímulo, a amplitude da onda H aumenta devido ao recrutamento de unidades motoras adicionais. A partir de uma certa intensidade de estímulo, potenciais de ação nos axônios mais finos dos αMNs são eliciados diretamente, o que é registrado como a onda M. Essa onda M aparece com latência menor que a onda H (Figura 2). Se a intensidade da estimulação é aumentada, a amplitude da onda M torna-se maior devido ao recrutamento de mais axônios αMN, enquanto a onda H gradualmente se torna menor. A onda H pode ser suprimida em altas intensidades de estímulo devido à retropropagação antidrômica dos potenciais de ação nos axônios αMN. Esses potenciais de ação desencadeados colidem com os da estimulação Ia e, assim, podem se anular. Em intensidades de estímulo supramáximas, os potenciais de ação ortodrômicos (em direção ao músculo) e antidrômicos (em direção à medula espinhal) ocorrem em todos os axônios do NM; o primeiro dá origem à amplitude máxima da onda M (Mmáx), enquanto o segundo resulta na completa abolição do reflexo H3.
Para a avaliação da espasticidade pós-AVE (ECP) ou lesão medular (LME), o reflexo H tem sido utilizado para avaliar a base neural do movimento e espasticidade emhumanos1. Uma melhor quantificação da mudança no reflexo H entre as medidas e entre os sujeitos é obtida usando a razão da onda H e M (relação H/M). Alternativamente, a depressão dependente da taxa (RDD) é medida, usando um conjunto de frequências ascendentes (por exemplo, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 e 5,0 Hz). A RDD reflete a integridade de circuitos inibitórios que podem ser perturbados por acidente vascular cerebral ou LME. Quando todos os circuitos neurais estão intactos, há uma supressão uniforme, independente da frequência, do reflexo-H. No entanto, se houver redução da inibição neural como resultado de AVC ou LME, a supressão do reflexo-H diminui com o aumento da frequência de estimulação4.
O correto registro eletrofisiológico utilizando eletrodos de superfície pode ser desafiador e pode ser afetado por tarefas motoras, mecanismos inibitórios e excitabilidade de αMN5. No registro transcutâneo em roedores, um eletrodo de estímulo é colocado próximo ao nervo tibial e um eletrodo de registro é colocado próximo aos músculos relacionados na pata anterior. De acordo com nossa experiência, entretanto, o correto posicionamento dos eletrodos transcutâneos (Figura 1A) é ainda mais complexo e variável em roedores do que o posicionamento de eletrodos de superfície em humanos. Isso pode levar a diferenças no comprimento, frequência e intensidade de estimulação necessários para eliciar o reflexo H. Esses desafios metodológicos poderiam explicar por que há apenas um número muito limitado de estudos de mensuração do reflexo H (por exemplo, em modelos experimentais deAVE3,4 e outros modelos de espasticidade6. Uma estimulação precisa (a longo prazo) e o registro do reflexo-H em nervos individuais poderiam, em princípio, ser obtidos usando eletrodos implantáveis ao redor do nervo alvo 7,8. Devido ao desafio cirúrgico com potenciais efeitos colaterais para o animal e potencial instabilidade da sonda, essa abordagem não se tornou um padrão na área. O método aqui apresentado também requer alguns conhecimentos cirúrgicos. No entanto, permite uma nova e precisa estimulação e registro de nervos isolados in vivo usando baixas intensidades de estimulação, o que evita a estimulação simultânea de nervos vizinhos.
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Protocol
Todos os experimentos foram conduzidos em conformidade com as leis europeias e nacionais de cuidados com animais e diretrizes institucionais, e foram aprovados pelo Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz North Rhine-Westphalia (Az: 81-02.04.2019.A309). O protocolo é otimizado para camundongos adultos (aprox. 8-16 semanas de idade C57Bl/6J) e para o registro do membro torácico. Pode ser facilmente adaptado, estimulando-se os respectivos nervos do membro pélvico e registrando-se os músculos da pata traseira (Figura 1B). Uma descrição dos eletrodos de gravação e estimulação é adicionada na Tabela de Materiais. Observe que o protocolo é usado apenas para uma medição terminal.
1. Preparo
- Pesar o animal e iniciar a anestesia injetando i.p . uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
- Mantenha o mouse na caixa de aquecimento até que a tolerância cirúrgica seja atingida. Aguarde alguns minutos até que o mouse esteja calmo, a respiração esteja estável e os reflexos estejam ausentes. Verifique a profundidade da anestesia medindo a falta de resposta ao pinça do dedo do pé.
- Vire o mouse de costas e coloque-o em uma almofada de aquecimento (o ideal seria o aquecimento controlado por feedback usando uma sonda de temperatura retal). Fixe as patas dianteiras com fita adesiva. Aqui, certifique-se de que a fita esteja posicionada de forma que os eletrodos de medição sejam facilmente inseridos nas patas dianteiras.
- Inserir uma sonda retal para medir a temperatura do animal e fixá-la com fita adesiva. Aplique pomada ocular para evitar que os olhos sequem.
2. Cirurgia
OBS: A condição estável do animal anestesiado, ou seja, respiração, temperatura e perda de reflexos, deve ser monitorada regularmente durante todo o procedimento. O procedimento de medida direta da onda H do nervo é mostrado para o nervo radial/ulnar/mediano da pata anterior (Figura 3A). A medida também pode ser adaptada para a pata traseira (nervo ciático/tibial) com modificações.
- Para uma melhor visão geral da área cirúrgica, remova os cabelos com uma navalha elétrica ou uma tesoura em um lugar separado antes. Para cirurgiões mais experientes, isso é apenas opcional.
NOTA: A desinfecção não é necessária aqui, pois este é um experimento final. O animal será sacrificado posteriormente. - Levante a pele com uma pinça e faça uma incisão de aproximadamente 1 cm na pele ao longo do eixo ventro-posterior da pata anterior (área acima da axila e tórax) com uma tesoura fina e arredondada.
- Remova cuidadosamente o tecido conjuntivo e exponha o músculo e o nervo por baixo. Retirar o músculo peitoral profundo exposto com pinças para acessar o nervo mediano (Figura 3E,F). Remova pequenas quantidades de sangue e fluido tecidual com tecidos moles.
- Na etapa seguinte, corte cuidadosamente a mama ou o músculo axilar de cima para baixo para expor o feixe nervoso por baixo. Liberte o feixe nervoso do tecido conjuntivo e muscular em um comprimento de aproximadamente 1,5 cm.
NOTA: Aqui, deve-se tomar cuidado especial para não danificar os vasos sanguíneos que correm em paralelo ao nervo mediano. Ao cortar o tecido, sempre corte ao longo do nervo para evitar machucá-lo. Se isso acontecer, remova o líquido e o sangue que vazam com um cotonete. O microscópio estéreo não é necessário para todo o experimento, no entanto, pode ser útil para a preparação dos nervos. - Separe cuidadosamente o nervo ulnar e mediano da pata anterior usando uma pipeta de vidro dobrada (Figura 3E). A parte superior dos dois nervos é o nervo ulnar, e a inferior é o nervo mediano.
NOTA: Ao separar os nervos uns dos outros, certifique-se de que o vaso sanguíneo abaixo não está ferido.
3. Colocação do eletrodo
- Dispor os eletrodos do gancho de estimulação em paralelo a uma distância de 0,5-1,0 mm e usar um micromanipulador para posicionar o gancho duplo próximo ao nervo.
- Use o gancho de vidro como uma ferramenta para levantar o nervo ulnar sobre os eletrodos do gancho de estimulação. Puxe o eletrodo com o nervo e separe-o dos outros nervos por aproximadamente 1-2 mm usando o micromanipulador (Figura 3D,F).
- Coloque os eletrodos ao longo do longo eixo da pata para reduzir o crosstalk entre os músculos.
NOTA: A colocação dos eletrodos é muito importante, mas difícil de padronizar devido à anatomia individual. É necessário um cirurgião experiente para colocar os eletrodos corretamente. Os fios também podem ser reposicionados caso a amplitude do sinal seja insatisfatória. - Secar superficialmente os ganchos de eletrodos presos ao nervo e aplicar vaselina usando uma seringa para fornecer isolamento elétrico do tecido adjacente.
NOTA: Deve-se tomar cuidado para aplicar vaselina suficiente no eletrodo e também entre os dois ganchos para garantir o isolamento elétrico e evitar que os nervos sequem.
4. Colocação dos eletrodos de gravação e referência
- Para medir o reflexo H, posicione os eletrodos EMG por via intramuscular na pata dianteira. Além disso, posicione o eletrodo de referência no subcutâneo do membro posterior (por exemplo, usando um pino minúsculo), segurado por um clipe de jacaré em miniatura (Figura 3B).
- Quando o estimulador estiver ligado, observe uma estimulação bem-sucedida como pequenas contrações da pata dianteira. A corrente de estimulação mínima para eliciar a onda M e pequenas contrações visíveis na pata anterior deve estar na faixa de 10-50 μA.
NOTA: Se nenhuma contração for visível a 50 μA, ajuste os eletrodos de estimulação e reaplique vaselina líquida. Além disso, em camundongos, não é incomum que a onda M apareça em intensidades de estimulação menores do que a onda H5.
5. Medição
- Repetir a estimulação do nervo 15 vezes com pulsos longos de 0,2 ms cada. Com pausas de 2 min entre as séries de estímulos, a frequência é aumentada de 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 para 5 Hz.
NOTA: Estas frequências são necessárias se calcular o RDD posteriormente. Todos os dados EMG são gravados, digitalizados e analisados usando software, por exemplo, o software Spike2 (CED, versão 7.19). A maior amplitude da onda H é esperada em 0,1 Hz. Quanto maior a frequência, menor a amplitude da onda H torna-se devido ao RDD. - Após o experimento, sacrificar o animal conforme protocolo da IACUC do instituto. Neste experimento, a perfusão transcárdica em camundongos foi realizada com PBS e PFA a 4% sob anestesia profunda.
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Representative Results
A partir do n = 15 tentativas de estimulação por frequência de estimulação e pata, selecione pelo menos n = 10 registros bem-sucedidos para a análise. Tentativas com erros de medição (por exemplo, ausência de onda M) são excluídas da análise. Analise cada ensaio separadamente e gere uma média para comparações de grupo/tempo mais tarde. A latência entre a estimulação e o aparecimento da onda M e da onda H é registrada para cada tentativa. Em nossa experiência, a onda M ocorre aproximadamente 2 ms após a estimulação, e a onda H após 6-8 ms, devido ao maior tempo de trânsito através da medula espinhal (Figura 1A e Figura 2B). Meça a amplitude das ondas M e H como pico a pico.
Para avaliar as alterações fisiológicas que ocorrem na lesão medular ou acidente vascular cerebral, a razão entre a amplitude das ondas H e M (relação H/M, Figura 2) é menos propensa à variabilidade experimental, que se refletiria, por exemplo, em diferenças de amplitude. A razão fornece, assim, uma avaliação mais confiável das alterações eletrofisiológicas relacionadas à doença. Por exemplo, em camundongos com AVC no córtex motor primário e secundário, a onda H está aumentada, enquanto a onda M permanece inalterada (Figura 2), sugerindo um aumento da excitabilidade de αMN. Além disso, há uma RDD reduzida (ou seja, uma diminuição reduzida na supressão da onda H com o aumento da frequência de estimulação). A diminuição da DRD é resultado da redução da inibição medular4. Assim, a DRD pode validar a ativação de circuitos inibitórios espinhais, cuja interrupção pode resultar em espasticidade. Para o cálculo da DDR do reflexo-H, recomenda-se o método descrito por Lee e col.4. Resumidamente, a estimulação do reflexo H em 0,1 Hz é calculada em média e definida em 100%. O reflexo H obtido para as demais frequências de estimulação é expresso em valores relativos a 0,1 Hz. De cada trem de estimulação, os três primeiros estímulos são descartados.
Figura 1: Ilustração do arranjo do registro e das vias para mensuração do reflexo de Hoffman (reflexo H) e da resposta muscular (onda M). (A) O reflexo H é induzido pela estimulação de aferentes Ia, que ativam motoneurônios alfa correspondentes na medula espinhal e, posteriormente, evocam contrações musculares nos músculos inervados da pata dianteira. (B) Localização dos nervos radial/ulnar/mediano eletricamente estimulados na pata anterior e ciático/tibial na pata traseira. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados esquemáticos e representativos do registro elétrico. (A) Esquema de uma gravação. O estímulo e respectivo artefato de estimulação são ajustados para 0 ms, que é seguido pela resposta muscular direta (onda M) e o subsequente menor pico representando a onda H. Nos modelos de espasticidade, o reflexo H será maior em relação ao controle saudável. (B) Capturas de tela de uma gravação representativa com o software mostrando dados originais com um artefato de estímulo (traços inferiores) e a aparência da onda M isolada versus um exemplo em que as ondas M e H são visíveis na gravação (traço superior, painel médio e direito, respectivamente). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Posicionamento dos eletrodos para medição eletrofisiológica terminal. (A,B) Visão geral da medida do reflexo H terminal com os eletrodos de estimulação do gancho, os eletrodos de registro dentro da pata dianteira e o eletrodo de referência inserido no membro posterior. (C,D) No membro pélvico, após a remoção da pele e dos músculos, o nervo ciático torna-se visível e pode ser dividido em ciático e tibial. (E) No membro torácico, os nervos radial, mediano e ulnar tornam-se visíveis. (F) O nervo ulnar pode ser estimulado com o eletrodo de gancho sem estimulação dos nervos vizinhos. Criado com BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em contraste com as medidas transcutâneas do reflexo H previamente descritas emcamundongos6, fornecemos uma medida mais direta e específica do nervo. Essa nova abordagem pode ser aplicada aos nervos dos membros anteriores e posteriores (por exemplo, mediano, ulnar e radial, tibial e ciático, respectivamente), tornando esse método adaptável como ferramenta diagnóstica a muitos modelos de doenças (por exemplo, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, traumatismo cranioencefálico e lesão medular). Dependendo do nervo selecionado, recomenda-se a validação da amplitude da onda H em função da intensidade da estimulação. A amplitude pode variar devido ao diâmetro do nervo e excitabilidade do motoneurônio, bem como contato elétrico. Medindo-se a relação C/M e a DDR, influências experimentais como o posicionamento da agulha podem ser reduzidas, o que aumenta significativamente a confiabilidade dos valores obtidos.
A principal limitação do protocolo aqui apresentado é a aplicação terminal sem a possibilidade de medidas longitudinais. Além disso, vários detalhes metodológicos devem ser considerados. A anestesia constante com relaxamento muscular mínimo é fundamental para uma mensuração confiável e deve ser validada para cada modelo/aplicação específico. Ao contrário da anestesia com isoflurano, que causa forte supressão dos reflexos musculares (reflexo H) 9,10,11, a combinação de cetamina e xilazina proporciona uma anestesia segura e é amplamente utilizada para registros eletromiográficos 12. De acordo com as medidas dos potenciais evocados motores no rato 13, em nossa experiência 100 mg/kg de quetamina e10 mg/kg de xilazina fornecem o melhor protocolo para registros estáveis e confiáveis. Para um experimentador habilidoso, é possível realizar medições da pata dianteira e traseira em um experimento final. O procedimento descrito aqui para a pata dianteira, incluindo o preparo do animal e a medição de todas as frequências para depressão dependente da taxa, pode ser realizado em cerca de 30-40 min. Recomenda-se fortemente a prática da técnica de dissecção nervosa antes da realização de experimentos in vivo. Em modelos de doença unilateral (por exemplo, acidente vascular cerebral cortical), recomendamos repetir a estimulação 15 vezes em ambas as patas contralaterais para incluir a pata não afetada como controle interno. Como apenas um nervo deve ser estimulado no método mostrado aqui, cuidados especiais devem ser tomados para distribuir vaselina suficiente ao redor dos eletrodos de estimulação para que nenhuma estimulação dos nervos vizinhos ocorra.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio de T. Akay, da Dalhousie University, durante uma visita de MG ao seu laboratório. Este trabalho foi financiado pela Fundação Friebe (T0498/28960/16) e pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundação Alemã de Pesquisa) - Project-ID 431549029 - SFB 1451.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent underpad | VWR | 115-0684 | |
| AD converter | Cambridge Electronic Design, UK | CED 1401micro | |
| Amplifier | Workshop Zoological Institute, UoC | - | |
| Digital stimulator | Workshop Zoological Institute, UoC | MS 501 | |
| EMG electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier. | |
| Eye ointment | Bayer | Bepanthen | |
| Glass pipette | Workshop Zoological Institute, UoC | - | Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner. |
| Heating box | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| Heating pad | WPI | 61840 Heating pad | |
| Hook electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | - | To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device. |
| Ketamine | Pfizer | Ketavet | |
| Rectal probe | WPI | RET-3 | |
| Stimulator isolation unit | Workshop Zoological Institute, UoC | MI 401 | |
| Sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C). |
| Temperature controller | WPI | ATC200 | |
| Vaseline | Bayer | - | |
| Xylazine | Bayer | Rompun |
References
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