Summary
يوفر التوصيف الطيفي الكتلي للببتيدات العصبية معلومات التسلسل والقياس الكمي والتوطين. سير العمل المحسن هذا ليس مفيدا فقط لدراسات الببتيد neuropeptide ، ولكن أيضا الببتيدات الداخلية الأخرى. تصف البروتوكولات المقدمة هنا إعداد العينات ، والحصول على MS ، وتحليل MS ، وتوليد قاعدة بيانات من neuropeptides باستخدام LC-ESI-MS ، MALDI-MS اكتشاف ، وتصوير MALDI-MS.
Abstract
الببتيدات العصبية هي جزيئات تشير إلى جميع العمليات الفسيولوجية والسلوكية تقريبا ، مثل التطوير والتكاثر وتناول الطعام والاستجابة للضغوطات الخارجية. ومع ذلك ، فإن الآليات البيوكيميائية والمجموعة الكاملة من الببتيدات العصبية وأدوارها الوظيفية لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. ويعوق توصيف هذه الببتيدات الذاتية المنشأ التنوع الهائل داخل هذه الفئة من جزيئات الإشارة. بالإضافة إلى ذلك ، تكون الببتيدات العصبية نشطة بيولوجيا بتركيزات أقل 100x - 1000x من تلك الموجودة في الناقلات العصبية وهي عرضة للتحلل الأنزيمي بعد الإطلاق المشبكي. قياس الطيف الكتلي (MS) هو أداة تحليلية حساسة للغاية يمكنها تحديد التحليلات وتحديدها كميا وتوطينها دون معرفة مسبقة شاملة. وهي مناسبة تماما لتحديد ملامح الببتيدات العصبية عالميا والمساعدة في اكتشاف الببتيدات الجديدة. نظرا للوفرة المنخفضة والتنوع الكيميائي العالي لهذه الفئة من الببتيدات ، تم تكييف العديد من طرق إعداد العينات ، ومعلمات اكتساب MS ، واستراتيجيات تحليل البيانات من تقنيات البروتينات للسماح بالتوصيف الأمثل ل neuropeptide. هنا ، يتم وصف طرق عزل الببتيدات العصبية عن الأنسجة البيولوجية المعقدة لتوصيف التسلسل والقياس الكمي والتوطين باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة (LC)-MS والامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI)-MS. يتم تضمين بروتوكول لإعداد قاعدة بيانات neuropeptide من سرطان البحر الأزرق ، Callinectes sapidus ، وهو كائن حي بدون معلومات جينومية شاملة. يمكن تكييف سير العمل هذا لدراسة فئات أخرى من الببتيدات الذاتية المنشأ في أنواع مختلفة باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات.
Introduction
الجهاز العصبي معقد ويتطلب شبكة من الخلايا العصبية لنقل الإشارات عبر الكائن الحي. ينسق الجهاز العصبي المعلومات الحسية والاستجابة البيولوجية. تتطلب التفاعلات المعقدة والمعقدة التي ينطوي عليها نقل الإشارة العديد من جزيئات الإشارات المختلفة مثل الناقلات العصبية والمنشطات والببتيدات العصبية. نظرا لأن الببتيدات العصبية هي جزيئات الإشارة الأكثر تنوعا وقوة التي تلعب أدوارا رئيسية في تنشيط الاستجابات الفسيولوجية للإجهاد والمحفزات الأخرى ، فمن المهم تحديد دورها المحدد في هذه العمليات الفسيولوجية. ترتبط وظيفة Neuropeptide ببنية الأحماض الأمينية الخاصة بها ، والتي تحدد الحركة وتفاعل المستقبلات والتقارب1. تقنيات مثل الكيمياء النسيجية ، وهو أمر مهم لأنه يمكن توليف الببتيدات العصبية وتخزينها وإطلاقها في مناطق مختلفة من الأنسجة ، وقد تم استخدام الفيزيولوجيا الكهربية للتحقيق في بنية الببتيد neuropeptide ووظيفتها 2,3,4 ، ولكن هذه الطرق محدودة بالإنتاجية والخصوصية لحل تنوع التسلسل الهائل من neuropeptides.
يتيح قياس الطيف الكتلي (MS) تحليل الإنتاجية العالية لبنية الببتيد النيوروبي ووفرته. ويمكن القيام بذلك من خلال تقنيات MS المختلفة، والأكثر شيوعا الكروماتوغرافيا السائلة - التأين الكهربائي MS (LC-ESI-MS)5 والامتزاز/التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة MS (MALDI-MS)6. باستخدام قياسات الكتلة عالية الدقة وتجزئة MS ، يوفر MS القدرة على تعيين تسلسل الأحماض الأمينية وحالة التعديل بعد الترجمة (PTM) إلى neuropeptides من مخاليط معقدة دون معرفة مسبقة للمساعدة في التحقق من وظيفتها 7,8. بالإضافة إلى المعلومات النوعية، يتيح MS المعلومات الكمية عن الببتيدات العصبية من خلال القياس الكمي الخالي من الملصقات (LFQ) أو الطرق القائمة على الملصقات مثل وضع العلامات النظيرية أو المتساوية الضغط9. تشمل المزايا الرئيسية ل LFQ بساطتها وانخفاض تكلفة التحليل وانخفاض خطوات إعداد العينات التي يمكن أن تقلل من فقدان العينة. ومع ذلك ، فإن عيوب LFQ تشمل زيادة تكاليف وقت الأداة لأنها تتطلب تكرارات تقنية متعددة لمعالجة الخطأ الكمي من التباين من تشغيل إلى تشغيل. وهذا يؤدي أيضا إلى انخفاض القدرة على تحديد الاختلافات الصغيرة بدقة. تخضع الطرق القائمة على الملصقات لتباين أقل منهجية حيث يمكن تصنيف عينات متعددة بشكل تفاضلي باستخدام مجموعة متنوعة من النظائر المستقرة ، ودمجها في عينة واحدة ، وتحليلها من خلال قياس الطيف الكتلي في وقت واحد. وهذا يزيد أيضا من الإنتاجية، على الرغم من أن الملصقات النظيرية يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ومكلفة في توليفها أو شرائها. كما يزداد التعقيد الطيفي لأطياف كتلة المسح الكامل (MS1) مع زيادة تعدد الإرسال ، مما يقلل من عدد الببتيدات العصبية الفريدة التي يمكن تجزئتها وبالتالي تحديدها. وعلى العكس من ذلك، فإن وضع العلامات متساوي الضغط لا يزيد من التعقيد الطيفي على مستوى MS1، على الرغم من أنه يقدم تحديات للتحليلات منخفضة الوفرة مثل الببتيدات العصبية (neuropeptides). وبما أن القياس الكمي متساوي الضغط يتم إجراؤه على مستوى أطياف كتلة أيون الشظايا (MS2)، فقد لا يمكن تحديد كمية الببتيدات العصبية منخفضة الوفرة حيث يمكن اختيار مكونات مصفوفة أكثر وفرة للتجزئة وقد لا يكون لدى تلك المختارة وفرة عالية بما يكفي لتحديدها كميا. مع وضع العلامات النظيرية ، يمكن إجراء القياس الكمي على كل ببتيد محدد.
بالإضافة إلى التحديد والقياس الكمي، يمكن الحصول على معلومات التوطين بواسطة MS من خلال تصوير MALDI-MS (MALDI-MSI)10. عن طريق تنقيط ليزر عبر سطح عينة، يمكن تجميع أطياف MS في صورة خريطة حرارية لكل قيمة m/z . يمكن أن يوفر رسم خرائط كثافة إشارة neuropeptide العابرة في مناطق مختلفة عبر الظروف معلومات قيمة لتحديد الوظيفة11. توطين الببتيدات العصبية مهم بشكل خاص لأن وظيفة neuropeptide قد تختلف اعتمادا على الموقع12.
تم العثور على Neuropeptides بوفرة أقل في الجسم الحي من جزيئات الإشارات الأخرى ، مثل الناقلات العصبية ، وبالتالي تتطلب طرقا حساسة للكشف13. يمكن تحقيق ذلك من خلال إزالة مكونات مصفوفة الوفرة العالية ، مثل الدهون11,14. يجب إجراء اعتبارات إضافية لتحليل الببتيدات العصبية عند مقارنتها بسير عمل البروتيوميات الشائعة ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن معظم التحليلات غير المنطقية العصبية تحذف الهضم الأنزيمي. هذا يحد من خيارات البرامج لتحليل بيانات neuropeptide حيث تم بناء معظمها باستخدام خوارزميات تعتمد على بيانات البروتينات ومطابقة البروتين المستنيرة باكتشاف الببتيد. ومع ذلك ، فإن العديد من البرامج مثل PEAKS15 أكثر ملاءمة لتحليل neuropeptide بسبب قدراتها على تسلسل de novo. هناك عدة عوامل يجب مراعاتها لتحليل الببتيدات العصبية بدءا من طريقة الاستخراج إلى تحليل بيانات التصلب المتعدد.
وتشمل البروتوكولات الموصوفة هنا طرقا لإعداد العينات ووضع العلامات على نظائر ثنائي الميثيل، والحصول على البيانات، وتحليل بيانات الببتيدات العصبية بواسطة LC-ESI-MS، MALDI-MS، وMALDI-MSI. من خلال النتائج التمثيلية للعديد من التجارب ، يتم إثبات فائدة وقدرة هذه الطرق على تحديد وقياس وتوطين الببتيدات العصبية من سرطان البحر الأزرق ، Callinectes sapidus. لفهم الجهاز العصبي بشكل أفضل ، يتم استخدام أنظمة النماذج بشكل شائع. العديد من الكائنات الحية ليس لديها جينوم متسلسل بالكامل متاح ، مما يمنع اكتشاف neuropeptide الشامل على مستوى الببتيد. ومن أجل التخفيف من حدة هذا التحدي، أدرج بروتوكول لتحديد الببتيدات العصبية الجديدة وتعدين النسخ لإنشاء قواعد بيانات للكائنات الحية التي لا تحتوي على معلومات كاملة عن الجينوم. يمكن تحسين جميع البروتوكولات المعروضة هنا لعينات neuropeptide من أي نوع ، وكذلك تطبيقها لتحليل أي ببتيدات داخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع عمليات أخذ عينات الأنسجة الموصوفة وفقا للمبادئ التوجيهية لجامعة ويسكونسن ماديسون.
1. تحليل LC-ESI-MS للببتيدات العصبية
- استخراج نيوروببتيد وتحلية المياه
- قبل اكتساب الأنسجة ، قم بإعداد الميثانول المحمض (acMeOH) (90: 9: 1 MeOH: الماء: حمض الخليك) كما هو موضح في16.
- جمع أنسجة المخ من القشريات17 واستخدام ملقط لوضع نسيج واحد على الفور في أنبوب 0.6 مل يحتوي على 20 ميكرولتر من acMeOH.
ملاحظة: تختلف بروتوكولات تشريح الأنسجة اختلافا كبيرا بين الحيوانات المختلفة وأنواع الأنسجة المختلفة. تتم إحالة القارئ إلى البروتوكول17 للحصول على وصف مفصل حول كيفية تشريح أنسجة المخ وأنواع الأنسجة الأخرى المتعددة من القشريات. يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام (من الناحية المثالية في غضون 6 أشهر). تستخدم المجلدات الموصوفة لدماغ واحد من Callinectes sapidus. يجب تحجيم الأحجام لحجم الأنسجة. قد يتم تجميد الأنسجة على الفور بدون مذيب ، على الرغم من أن هذا لا ينصح به لأن الإنزيمات المحللة للبروتين الذاتية المنشأ لن يتم تثبيطها وتظل نشطة ، وإن كان ذلك بمعدل أبطأ عند البرد. - أضف 150 ميكرولتر من acMeOH إلى العينة. اضبط إجمالي وقت الصوتنة على 24 ثانية ، ووقت النبض على 8 ثوان ، ووقت التوقف المؤقت على 15 ثانية ، والسعة على 50٪ على مجانس بالموجات فوق الصوتية وتجانس العينات على الجليد.
ملاحظة: هناك أنظمة تجانس مختلفة متاحة. اضبط الإعدادات والشروط وفقا لنوع العينة والمعدات. - جهاز طرد مركزي للعينة عند 4 درجات مئوية عند 20000 × جم لمدة 20 دقيقة. باستخدام ماصة ، انقل السوبرناتانت في أنبوب وجففه في مكثف فراغ (266 × جم ، 1 × 10-4 تور) عند حوالي 35 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات المجففة في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام (من الناحية المثالية في غضون 6 أشهر). يجب إجراء تسخين مكثف الفراغ بحذر. في حين أن الحرارة تقصر وقت الجفاف ، يجب إزالة العينة من المكثف مباشرة بعد تبخر كل السائل لتقليل تدهور الببتيد. لتجنب ذلك ، قد يتم حذف التدفئة من هذه الخطوات وجميع الخطوات اللاحقة. - لإزالة الملح ، أعد تكوين عينة الأنسجة المستخرجة في 20 ميكرولتر من 0.1٪ من حمض الفورميك (FA) ، دوامة جيدة ، وسونيكات في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
ملاحظة: هناك مواد مختلفة لتحلية المياه المتاحة. اضبط الحلول والأحجام وفقا لهوية الراتنج وكمية neuropeptide. يمكن تقدير إجمالي كمية الببتيد باستخدام مقايسة كمية الببتيد التجارية (انظر جدول المواد) . - ضع 0.5 ميكرولتر من العينة على شريط الأس الهيدروجيني للتأكد من أن الرقم الهيدروجيني < 4. إذا كان الرقم الهيدروجيني أعلى ، أضف 1 ميكرولتر من 10٪ FA حتى الرقم الهيدروجيني < 4.
- اتبع بروتوكول الشركة المصنعة لتحلية المياه18. قم بإعداد محلول ترطيب يحتوي على 100 ميكرولتر من 50٪ أسيتونيتريل (ACN) ، ومحلول توازن يحتوي على 100 ميكرولتر من 0.1٪ FA ، ومحلول غسيل يحتوي على 100 ميكرولتر من 0.1٪ FA ، وحلول إزالة تحتوي على 20 ميكرولتر من 25٪ ACN / 0.1٪ FA ، و 20 ميكرولتر من 50٪ ACN / 0.1٪ FA ، و 20 ميكرولتر من 75٪ ACN / 0.1٪ FA.
- احصل على طرف تحلية 10 ميكرولتر باستخدام راتنج C18 (انظر جدول المواد).
- ضع طرف تحلية المياه على ماصة سعة 20 ميكرولتر تم ضبطها على 15 ميكرولتر. بمجرد أن يصبح طرف التحلية رطبا ، امنع الهواء من المرور عن طريق الحفاظ على الماصة مكتئبة عند الخروج من المحلول حتى يتم التخلص منها.
- شفط الطرف 3x مع محلول الترطيب و 3x مع حل التوازن. الشفط في العينة 10x تليها غسل 3x في محلول الغسيل ، والتخلص من كل غسلة. اللوت عن طريق شفط 10x في كل من حلول الاستخلاص من أجل زيادة ACN.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بكسور الإزالة منفصلة أو مدمجة لمزيد من التحليلات. - تخلص من طرف إزالة الملح المستخدم وجفف الببتيدات العصبية المطفأة في مكثف فراغ (266 × جم ، 1 × 10-4 تور) عند حوالي 35 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين هذا في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام (من الناحية المثالية في غضون 6 أشهر).
- وضع العلامات النظيرية للببتيدات العصبية في مستخلص الأنسجة
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ولا تستخدم إلا عند الرغبة في التحديد الكمي.- تحضير محلول وسم ثنائي ميثيل النظائر 2-plex في غطاء الدخان: 1٪ CH 2 OH 2 (13.5 ميكرولتر من المخزون 37 نسبة الوزن / الوزن (الوزن) في محلول الماء في 486.5 ميكرولتر من الماء) ، 1٪ CH 2 OD 2(25 ميكرولتر من المخزون 20 وزنا ٪ محلول في 475 ميكرولتر من الماء) ، و 0.03 M بوران بيريدين (3.75 ميكرولتر من محلول المخزون 8 M في 996.25 ميكرولتر من الماء).
تحذير: الفورمالديهايد سام ، لذلك يجب الاحتفاظ بجميع المحاليل في غطاء رأس جيد التهوية. ارتد قفازات ومعطفا مختبريا وحماية للعين وأحذية منيعة. لا ينبغي ارتداء العدسات اللاصقة عند العمل مع هذه المواد.
ملاحظة: هناك كواشف نظائرية مختلفة؛ حدد القنوات المناسبة بناء على نوع العينة وعدد قنوات وضع العلامات المطلوبة. - يذوب مستخلص نيوروببتيد الخام في 10 ميكرولتر من الماء وسونيكات لمدة 10 دقائق.
- أضف 10 ميكرولتر من محلول فورمالديهايد نظيري مختلف (أي CH 2 OH2 و CH 2 OD2وما إلى ذلك) إلى كل حالة تجريبية مختلفة ليتم قياسها كميا. دوامة لخلط جيدا ولفترة وجيزة الطرد المركزي كل عينة في 2000 × غرام.
- أضف 10 ميكرولتر من 0.03 م بيريدين البوران إلى كل أنبوب عينة. دوامة لخلط جيدا ولفترة وجيزة الطرد المركزي كل عينة في 2000 × غرام.
- احتضان العينات لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- قم بإزالة العينات من الحمام المائي وإضافة 10 ميكرولتر من 100 mM بيكربونات الأمونيوم. دوامة لخلط جيدا ولفترة وجيزة الطرد المركزي كل عينة في 2000 × غرام.
- اجمع العينات الموسومة لعينة واحدة 2-plex وجفف الببتيدات العصبية في مكثف فراغ (266 × g ، 1 × 10-4 Torr) عند حوالي 35 درجة مئوية.
- قم بإزالة الملح من الببتيدات العصبية المصنفة عن طريق إعادة تنفيذ الخطوات 1.1.5 - 1.1.10 وتخزينها حتى تصبح جاهزة للحصول على البيانات.
- تحضير محلول وسم ثنائي ميثيل النظائر 2-plex في غطاء الدخان: 1٪ CH 2 OH 2 (13.5 ميكرولتر من المخزون 37 نسبة الوزن / الوزن (الوزن) في محلول الماء في 486.5 ميكرولتر من الماء) ، 1٪ CH 2 OD 2(25 ميكرولتر من المخزون 20 وزنا ٪ محلول في 475 ميكرولتر من الماء) ، و 0.03 M بوران بيريدين (3.75 ميكرولتر من محلول المخزون 8 M في 996.25 ميكرولتر من الماء).
- الحصول على البيانات
- إعادة تشكيل الببتيدات العصبية المملحة المجففة في 12 ميكرولتر من 3٪ ACN / 0.1٪ FA ، دوامة جيدة ، سونيكات في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة عند 2000 × غرام. انقل كل عينة إلى قوارير أخذ العينات التلقائية.
ملاحظة: اضبط حجم العينة وفقا لكمية الببتيد neuropeptide إلى تركيز ~ 1 ميكروغرام من الببتيد لكل ميكرولتر. - استخدم جهاز أخذ عينات تلقائي لحقن 1 ميكرولتر من العينة في جهاز نانو-LC-MS/MS عالي الدقة (انظر جدول المواد).
- استخدم عمود C18 ذي الطور المعكوس (RP) بطول 15 سم تقريبا (انظر جدول المواد) لتشغيل العينة مع 0.1٪ FA في الماء كمرحلة متنقلة A و 0.1٪ FA في ACN كمرحلة متنقلة B. قم بتشغيل العينات بتدرج يتراوح بين 3٪ و 95٪ من B بمعدل 300 nL / min لأكثر من 11 دقيقة.
- بالنسبة لأداة MS المستخدمة هنا ، استخدم ظروف MS الشائعة من 2.00 كيلو فولت لجهد الرش و 275 درجة مئوية لدرجة حرارة الشعيرات الدموية.
- احصل على أطياف MS في نطاق 200 - 2000 م / z بدقة 60000 ، وهدف التحكم التلقائي في الكسب (AGC) من 1 × 106 ، والحد الأقصى لوقت حقن الأيونات (IT) من 150 مللي ثانية.
- حدد الأيونات ال 15 الأكثر كثافة (الحد الأدنى للكثافة 3.2 × 104) لتجزئة تفكك التصادم (HCD) ذات الطاقة العالية باستخدام طاقة تصادم طبيعية تبلغ 30 ، ونافذة عزل تبلغ 2.0 م / z ، ودقة 15000 ، وهدف AGC 2 × 105 ، والحد الأقصى لتكنولوجيا المعلومات 250 مللي ثانية.
- قم بتعيين نافذة استبعاد ديناميكية من 30 ثانية. استبعد الأيونات ذات الشحنة 1 أو ≥ 8 والأيونات ذات حالات الشحنة غير المعترف بها.
- إعادة تشكيل الببتيدات العصبية المملحة المجففة في 12 ميكرولتر من 3٪ ACN / 0.1٪ FA ، دوامة جيدة ، سونيكات في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة عند 2000 × غرام. انقل كل عينة إلى قوارير أخذ العينات التلقائية.
- تحديد الببتيد النيوروبيتيد وتحديده كميا
ملاحظة: تتوفر العديد من البرامج للبحث في قواعد البيانات وتحديد كمية الببتيد (مفتوحة المصدر وتجارية على حد سواء). هنا ، سيتم استخدام PEAKS Studio (برنامج البروتينات)15 .- قم بإجراء البحث في قاعدة البيانات باستخدام الخطوات الموضحة في 1.4.2 - 1.4.6.
- قم بإنشاء مشروع جديد وأضف بيانات LC-MS التي تحدد None للإنزيم ، و Orbitrap للأداة، و HCD للجزء ، والاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) للاستحواذ.
ملاحظة: حدد المعلمات المناسبة استنادا إلى معلمات الحصول على البيانات. - حدد الهويات وحدد السلائف الصحيحة [DDA] والكتلة فقط.
- حدد البحث في قاعدة البيانات وقم بتعيين تسامح خطأ قدره 20.0 جزء في المليون باستخدام كتلة أحادية النظائر لكتلة السلائف و 0.02 Da لكتلة أيون الشظايا ، لا شيء لنوع الإنزيم ، غير محدد لوضع الهضم ، 100 للحد الأقصى للانقسامات الفائتة ، و PTMs المتغيرة التالية مع الحد الأقصى المسموح به PTM المتغير لكل ببتيد من 3: Amidation ، الأكسدة (M) ، Pyro-glu من E ، وبايرو غلو من Q.
- حدد قاعدة بيانات Neuropeptide ، وتقدير معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) مع اندماج شرك.
ملاحظة: يجب ضبط خطأ التسامح الجماعي لمطابقة البيانات التي تم تجميعها. استخدم قاعدة البيانات المناسبة لنوع العينة. عندما لا يتم تحديد أي إنزيم ، لا تؤثر معلمة الانقسامات المفقودة القصوى على البحث. ومع ذلك ، يلزم وجود عدد كبير من الانقسامات الفائتة إذا لم يكن البرنامج يحتوي على وضع الاستيعاب غير المحدد كخيار. - إذا كنت ترغب في القياس الكمي الخالي من التسميات، فحدد تحديد كمي، وحدد خال من التسميات، وقم بتعيين تسامح خطأ قدره 20.0 صفحة في الدقيقة وتسامح وقت الاحتفاظ بمقدار 1.0 دقيقة.
- إجراء تحديد كمي لأيون السلائف إذا أجريت الخطوة 1-2 لوضع العلامات النظيرية.
- حدد القياس الكمي، وحدد تحديد كمية أيون السلائف، واستخدم نطاقا زمنيا للاحتفاظ قدره 1.0 دقيقة، واستخدم عتبة FDR بنسبة 1٪.
- حدد طريقة تحديد كمي محددة مسبقا أو مخصصة من القائمة المنسدلة تحديد طريقة .
- لإنشاء طريقة مخصصة جديدة، انقر فوق تكوين > النافذة > أسلوب تسمية Q > جديد. قم بتسمية الطريقة الجديدة وحدد تحديد كمية أيون السلائف لنوع الطريقة. حدد إضافة صف وحدد التعديل من قائمة خيارات PTM.
- أضف بيانات LC-MS وحدد الشرط المرجعي ليكون التعديل على الببتيدات العصبية من حالة التحكم في التجربة.
- تقييم نتائج البحث كما هو موضح في الخطوات 1.4.9 - 1.4.11.
- قم بتصفية النتائج من خلال علامة التبويب الملخص للببتيدات والبروتينات باستخدام -10lgP ≥ 20 ، وحدد ≥ 1 ببتيد فريد ، وحدد المربع المسمى بالببتيدات المهمة.
- تقييم نتائج البحث في قاعدة البيانات حيث يمثل البروتين .csv تعريفات الببتيد النيوروبيتيد والببتيد .csv يمثل تحديدات شظايا الببتيد العصبي.
- افحص البحث في قاعدة البيانات عن درجات البروتين والببتيد ودقة الكتلة وتغطية التسلسل.
ملاحظة: يستخدم كل برنامج بحث في قاعدة البيانات خوارزميات تسجيل نقاط فريدة وقد يحتاج إلى تقييمه وفقا لذلك. يمكن تقييم الهويات عن طريق فحص الأطياف المرصودة يدويا بحثا عن الببتيدات المحددة التي تحتوي على سلسلة أيون الشظايا الكاملة.
2. تحليل اكتشاف MALDI-MS للببتيدات العصبية
- إعداد العينات
- اتبع الخطوة 1.1 أو الخطوات 1.1 - 1.2 إذا كان القياس الكمي مطلوبا، باستثناء الخطوة 1.2.8 (لا يلزم إزالة الملح بعد وضع العلامات النظيرية قبل تحليل MALDI-MS).
- إعادة تشكيل الببتيدات العصبية المملحة المجففة في 5 ميكرولتر من 0.1٪ FA ، دوامة جيدة ، سونيكات في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة عند 2000 × غرام.
- لاكتشاف الببتيدات العصبية في أنسجة القشريات ، قم بإعداد 150 ملغ / مل 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) في 50٪ ميثانول (MeOH) / 0.1٪ FA (v / v) كمصفوفة.
- ماصة قطرة 3 ميكرولتر من العينة على فيلم مسعور (انظر جدول المواد) وماصة 3 ميكرولتر من المصفوفة مباشرة على قطرة العينة. ماصة لأعلى ولأسفل للخلط.
- ماصة 1 ميكرولتر من عينة 1: 1: خليط مصفوفة في بئر من لوحة الهدف من الفولاذ المقاوم للصدأ MALDI. استخدم طرف الماصة لنشر كل خليط إلى حواف العينة جيدا. يجب أن تلمس العينة حواف نقش البئر لتسهيل التوزيع الموحد (الشكل 4A).
- البقعة 1 ميكرولتر من عيار 1:1:خليط المصفوفة (مزيج معايرة تجاري أو مخصص، مواد بوليمر (أي فوسفور أحمر مذاب في MeOH)، أو أيونات مجموعة مصفوفة شائعة)12 في بئر بالقرب من العينة.
ملاحظة: لا يحتاج الفوسفور الأحمر إلى خلطه مع المصفوفة قبل اكتشافه.
- الحصول على البيانات
- أدخل لوحة الهدف التي تحتوي على بقع عينة مجففة في أداة MALDI Tandem Time of Flight (TOF/TOF) (انظر جدول المواد).
- بالنسبة لمصفوفة DHB ، اضبط طاقة الليزر على 95٪ ، وحدد الكسب التلقائي الأمثل للكاشف ، ووضع حركة حامل العينة الذكي - الكامل . احصل على أطياف MS في حدود 200 - 3200 m/z وأضف أطياف متعددة من كل بقعة معا لزيادة نسبة إشارة neuropeptide إلى الضوضاء.
ملاحظة: قم بتحسين النسبة المئوية لطاقة الليزر، وكسب الكاشف، وحدد وضع حركة حامل العينة المناسب بحيث يغطي كل عملية استحواذ البقعة بأكملها تقريبا ولا تنتقل عمليات الاستحواذ اللاحقة إلى المواضع السابقة. - معايرة الأداة.
ملاحظة: اضبط نطاق الكتلة ليشمل نطاق الببتيد neuropeptide المطلوب.
- تحليل البيانات
- افتح الملف MALDI-MS في برنامج تحليل البيانات (انظر جدول المواد) وانقر على طرح خط الأساس للبرنامج المستخدم هنا.
- قم بإجراء اختيار الذروة بالنقر فوق البحث عن قائمة جماعية. إذا كان هناك عدد قليل جدا من القمم ، فقم بتحرير قائمة الكتلة يدويا عن طريق تحديد تحرير قائمة الكتلة والنقر فوق القمم في الطيف لإضافتها إلى قائمة الكتلة.
- قم بإجراء مطابقة دقيقة للكتلة عن طريق مقارنة قائمة الكتلة بقاعدة بيانات neuropeptide التي تحتوي على قيم [M + H] + m / z (± خطأ 200 جزء في المليون).
ملاحظة: ينبغي أيضا إدراج قنوات الملح الشائعة، مثل [M+K]+ و[M+Na]+ و[M+NH4]+، في قائمة الأهداف الدقيقة لمطابقة الكتلة. - للتحقق من القمم المحددة ، قم بإنشاء قائمة ب m / z من الاهتمام وإجراء تجارب MS / MS.
3. تحليل التصوير MALDI-MS للببتيدات العصبية
- إعداد العينات
ملاحظة: خطوات التضمين والتقسيم ليست ضرورية للأنسجة الرقيقة جدا بحيث لا يمكن تقسيمها.- املأ نصف كوب كريوستات بالجيلاتين (37 درجة مئوية، 100 ملغم/مل في الماء منزوع الأيونات) واتركه يتصلب في درجة حرارة الغرفة. حافظ على بقايا الجيلاتين السائل دافئا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- جمع الأنسجة العصبية المطلوبة من الحيوان واستخدام ملقط لغمس الأنسجة على الفور في أنبوب 0.6 مل يحتوي على ماء منزوع الأيونات لمدة 1 ثانية.
ملاحظة: راجع الخطوة 1.1.2 ملاحظة لتشريح الأنسجة العصبية. - ضع الأنسجة فوق الجيلاتين الصلب واملأ بقية كوب cryostat بالجيلاتين السائل. استخدم الملقط لوضع الأنسجة.
- ضع كوب cryostat على سطح مستو وقم بتجميده بالثلج الجاف.
ملاحظة: قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام (من الناحية المثالية في غضون 6 أشهر). - لإعداد التقسيم ، افصل العينة المضمنة في الجيلاتين عن قالب cryostat عن طريق قطع القالب بعيدا.
- قم بتركيب الأنسجة المدمجة على تشاك cryostat عن طريق سحب قطرة 1 مل من الماء منزوع الأيونات على الظرف والضغط على الفور على الأنسجة المضمنة على القطرة.
- بمجرد تجميدها ، قم بماصة المزيد من الماء منزوع الأيونات حول الأنسجة لزيادة تأمينها إلى الظرف. نفذ هذه الخطوات داخل صندوق cryostat (انظر جدول المواد) المحدد عند -20 درجة مئوية.
- قم بتقسيم الأنسجة بسماكة تقريبية لخلية واحدة (8-20 ميكرومتر حسب نوع العينة) وقم بإذابة كل قسم على شريحة زجاجية مغلفة بأكسيد القصدير الإنديوم (ITO) عن طريق وضع جانب واحد من الشريحة بالقرب من القسم ووضع إصبع على الجانب الآخر من الشريحة لتدفئة الزجاج ببطء والسماح للقسم بالالتصاق بالشرائح.
ملاحظة: يمكن أيضا إذابة مقاطع الأنسجة عن طريق التقاط حافة واحدة من الجيلاتين باستخدام ملاقط (مبردة إلى -20 درجة مئوية) ، ووضعها على شريحة الزجاج المطلية ب ITO ، ووضع إصبع على الجانب الآخر من الشريحة لتسخين الزجاج ببطء والسماح للقسم بالالتصاق بالشرائح. - حدد العينة المراد استخدامها كمعايرة (انظر الخطوة 2.1.6 للحصول على خيارات المعايرة) عن طريق رسم دائرة صغيرة بالقرب من قسم الأنسجة باستخدام قلم مسعور وتحديد المعايرة داخل الدائرة.
- ضع علامة على كل ركن من أركان الشريحة بقلم تبييض ذو شكل صغير يحتوي على حواف حادة (أي x) لاستخدامها كنقاط تعليم.
- ضع الشريحة الزجاجية في لوحة محول الشريحة MALDI والتقط مسحا ضوئيا للصور عالية الدقة (≥2400 نقطة لكل بوصة) باستخدام ماسح ضوئي.
- مصفوفة الرش على قسم الأنسجة باستخدام بخاخ آلي (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل وتعليمات البخاخ).
- بالنسبة ل MSI من الببتيدات العصبية في أنسجة القشريات ، استخدم 40 مجم / مل DHB في 50٪ ميثانول / 0.1٪ FA (v / v) كمصفوفة ، واضبط درجة حرارة الفوهة على 80 درجة مئوية ، والسرعة على 1250 مم / دقيقة ، ومعدل التدفق على 0.1 مل / دقيقة ، وعدد التمريرات إلى 12 ، و 30 ثانية بين كل تمريرة للبخاخ التلقائي.
- الحصول على البيانات
- أدخل اللوحة المستهدفة المجففة تماما التي تحتوي على مقاطع الأنسجة المثبتة على الذوبان والتي تم رشها باستخدام المصفوفة.
- قم بإعداد معلمات ملف اكتساب تصوير MS بحيث يكون قطر الليزر أصغر من حجم الخطوة النقطية.
- قم بتحميل الصورة البصرية الممسوحة ضوئيا ومعايرة لوحة العينة باستخدام نقاط التدريس x. حدد مناطق الأنسجة ذات الأهمية التي سيتم قياسها أكبر قليلا من قسم الأنسجة الفعلي لتشمل أيضا المناطق التي تحتوي على مصفوفة فقط.
- قم بمعايرة الأداة والحصول على أطياف في حدود 200 - 3200 م / ض. اضبط نطاق الكتلة ليشمل نطاق الببتيد neuropeptide المطلوب.
- تحليل البيانات
- لمعالجة البيانات، قم باستيراد مجموعة بيانات تصوير MS إلى البرنامج المطلوب، وحدد خوارزمية إزالة خط الأساس، وقم بتطبيع البيانات باستخدام إجمالي عدد الأيونات.
ملاحظة: من المحتمل أن يؤدي اختيار خوارزميات التطبيع المختلفة، مثل الوسيط أو قيمة الجذر المتوسط التربيعي (RMS) أو شدة قيمة m/z المرجعية، إلى تغيير التوزيع المكاني للعديد من قيم m/z. اختر خوارزمية التطبيع الأنسب للتحليلات المطلوبة. - لإنشاء صورة لكل قيمة m/z من قائمة ذروة نظرية، قم بتحميل ملف قيم مفصولة بفواصل (CSV) يحتوي على neuropeptide [M+H]+، [M+Na]+، [M+NH4]+، إلخ. احصل على قيم m/z بالنقر فوق ملف > استيراد > قائمة الذروة. قم بتسمية قائمة الذروة.
- لتقدير عتبة الخطأ المناسبة في الدقيقة ، حدد أولا يدويا ذروة الببتيد neuropeptide في طيف MS وقارنها بالكتلة النظرية neuropeptide. احسب خطأ جزء في الدقيقة وانقر فوق خصائص ملف > > عرض الفاصل الزمني وإدخال جزء في المليون.
- حدد قائمة الذروة من القائمة المنسدلة وانقر فوق إنشاء صور m/z لكل فاصل زمني من قائمة الذروة.
- احفظ كل صورة m/z بالنقر فوق حفظ لقطة شاشة لكل صورة m/z.
ملاحظة: يمكن إجراء تحديد الببتيد النيوروبيبتيد المفترض عن طريق تحديد صور m/z حيث يتم توطين إشارة التحليل فقط داخل الأنسجة وليس في المصفوفة المحيطة. - للتحقق من هوية الذروة، قم بإنشاء قائمة ب m/z ذات الأهمية وقم بإجراء تجارب MS/MS.
- لمعالجة البيانات، قم باستيراد مجموعة بيانات تصوير MS إلى البرنامج المطلوب، وحدد خوارزمية إزالة خط الأساس، وقم بتطبيع البيانات باستخدام إجمالي عدد الأيونات.
4. اكتشاف الببتيدات العصبية المفترضة الجديدة باستخدام تسلسل de novo
- تنفيذ الخطوات 1.4.2 - 1.4.5.
- تصدير الببتيدات الجديدة فقط .csv من برنامج PEAKS بمتوسط درجة ثقة محلية (ALC) يبلغ ≥ 75.
ملاحظة: هناك العديد من البرامج المتاحة لإجراء تسلسل de novo ، ولكل منها خوارزميات تسجيل خاصة بها ويجب تقييمها وفقا لذلك. - ابحث في قائمة الببتيد عن زخارف التسلسل المعروفة التي تشير إلى الببتيدات العصبية التي تنتمي إلى عائلات محددة من الببتيد النيوروببتيد19.
ملاحظة: في حين أن الزخارف عادة ما يتم حفظها بشكل جيد عبر الأنواع ، إلا أنه ينبغي اختيار الزخارف التي تم البحث عنها مع مراعاة الكائن الحي العينة.
5. تعدين Transcriptome لتسلسلات neuropeptide المتوقعة
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية وتستخدم فقط للإضافة إلى قاعدة بيانات neuropeptide موجودة أو إنشاء قاعدة بيانات neuropeptide جديدة.
- اختر تسلسل الأحماض الأمينية preprohormone المعروف للاهتمام واستخدم tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
_LOC=blasthome) للبحث في تسلسل preprohormone للاستعلام ضد قواعد البيانات بما في ذلك nr / nt و Refseq_genomes و EST و TSA.
ملاحظة: للبحث في تسلسلات الاستعلام مقابل قاعدة بيانات البروتين، استخدم BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).- حدد الكائن الحي المستهدف (المعرف الضريبي) وقم بتغيير معلمات خوارزمية العتبة المتوقعة إلى 1000 لتضمين محاذاة الدرجات المنخفضة.
- قم بتشغيل برنامج BLAST ثم تحقق من النتائج للحصول على درجات تماثل عالية بين تسلسلات الاستعلام والموضوع التي تنتج محاذاة كبيرة. حفظ ملف FASTA الذي يحتوي على تسلسل النيوكليوتيدات.
ملاحظة: إذا كان هناك العديد من تسلسلات الموضوعات ذات درجات التماثل المماثلة ، فقم بإجراء محاذاة MAFFT لتضييق نطاق التسلسلات المفترضة20,21.
- ترجمة تسلسل النيوكليوتيد preprohormone إلى تسلسلات الببتيد preprohormone باستخدام أداة Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). بالنسبة إلى C. sapidus ، حدد الميتوكوندريا اللافقارية للشفرة الوراثية .
- تحقق من تسلسل الببتيد المرجعي ومواقع انقسام البروهورمونات في تسلسل الببتيد باستخدام SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام التماثل مع مخططات معالجة ما قبل الهرمونات المعروفة لتحديد مواقع الانقسام الاستباقي. ويمكن التنبؤ بالتعديلات المحتملة بعد الترجمة لببتيدات الإشارة إذا رغبت في ذلك. يمكن استخدام الكبريتاتور (https://web.expasy.org/sulfinator/) للتنبؤ بحالة الكبريت لبقايا التيروزين. يمكن استخدام DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) للتنبؤ باتصال رابطة ثاني كبريتيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 سير العمل لإعداد العينات وتحليل التصلب المتعدد. بعد تشريح الأنسجة العصبية ، يتم إجراء التجانس والاستخراج وتحلية المياه لتنقية عينات الببتيد neuropeptide. وإذا رغبت في تحديد كمي قائم على الملصقات النظيرية، فإن العينات توسم وتملح مرة أخرى. يتم تحليل العينة الناتجة من خلال LC-MS / MS لتحديد NEUROPEPTIDE وقياسه كميا.
يجب أن يكون للببتيدات العصبية التي تم تحديدها من خلال برنامج البروتينات تغطية جيدة لتسلسل تجزئة الببتيد ، ومع ذلك ، فإن هذا ليس محددا أو موحدا عالميا. من أجل التحديد المطلق ، يجب أن ينتج كل حمض أميني أيون شظية يوفر تحديد وتوطين لا لبس فيهما. يجب أيضا مقارنة هذا مع الببتيد المركب لتأكيد شدة كل أيون شظية. وبما أن تكلفة إجراء ذلك على كل تحديد مفترض غير مجدية، فإن تحديد الهوية يوصف عادة على أساس الثقة حيث تزيد أيونات الشظايا الأكثر ملاحظة من الثقة في تحديد الببتيد. في حين أن الشكل 2A ، B يصور اثنين من الببتيدات العصبية التي تم تحديدها على حد سواء مع تغطية تسلسل 100 ٪ وخطأ كتلة منخفضة كما هو محدد من قبل الحد الأقصى البالغ 0.02 Da ، فإن تغطية التجزئة الضعيفة (من ثلاثة أيونات فقط) التي لوحظت فقط ل neuropeptide في الشكل 2B يقلل من الثقة في تحديد شكل متساوي معين. ويصور الشكل 2C كروماتوغرام الأيونات المستخرجة (XICs)، وهي عبارة عن مخطط يحتوي على شدة إشارة قيمة m/z مختارة كدالة لوقت الاستبقاء، لبتيد نيوروببتيد مكتشف في عينتين تستخدمان في LFQ. تختلف أوقات الاحتفاظ ب neuropeptide اختلافا طفيفا لأنه تم تحديده في شوطين منفصلين ومتتاليين ؛ ومع ذلك ، فإن الفرق هو ضمن قيمة عتبة موثوقة من 1 دقيقة. وبالتالي ، يتم استخدام النسبة بين المنطقة المحسوبة بواسطة البرنامج تحت المنحنى من XIC ل LFQ لهذا الببتيد neuropeptide.
من أجل تحديد كمية الببتيدات العصبية المسماة بثنائي الميثيل ، يجب أن يحتوي طيف MS1 على ذروة عند قيمة neuropeptide m / z النظرية وذروة عند قيمة m / z مع تحول كتلي يرتبط بفرق الكتلة بين كواشف وضع العلامات النظيرية المستخدمة. في الشكل 2D ، فإن التحول الكتلي لهذه العينة ذات العلامتين ثنائي ميثيل 2-plex هو 4.025 Da. ثم تحسب البرمجيات المساحة الواقعة تحت منحنى أيون السلائف من ال XICs الخاصة به وتستخدم لحساب نسب الوفرة النسبية. ويبين الجدول 1 نسخة مبسطة من جدول تصدير برمجيات البروتينات التي تحتوي على الببتيدات العصبية المحددة ونسب LFQ الخاصة بها. يتم الحصول على نتائج مماثلة للببتيدات العصبية ذات العلامات النظائرية.
تمكن خوارزميات البرمجيات تسلسل الأطياف من جديد للكشف عن الببتيدات العصبية المفترضة الجديدة. عند المطالبة بالكشف عن الببتيدات العصبية الجديدة المفترضة ، فإن عمليات تحديد الثقة العالية هي الحالات المثالية التي يتم فيها تحديد جميع الأحماض الأمينية وتوطينها بشكل لا لبس فيه ، استنادا إلى مراقبة أيون الشظايا. ويصور الشكل 3 طيف الببتيد المتسلسل دي نوفو الذي يحتوي على زخارف -RYamide في المحطة C، وهي زخارف ذات تسلسل محفوظ تتقاسمها الببتيدات العصبية المعروفة من عائلة RYamideللقشريات 22. تمت مطابقة الببتيد من قاعدة البيانات مع تغطية تسلسل 100٪ ، ولوحظ أن جميع الأحماض الأمينية تشكل أيونات شظايا ، وخطأ كتلة أيون شظايا منخفض كما هو محدد في الحد الأقصى البالغ 0.02 Da ويحتوي على ملف تعريف استخلاص غاوسي. تشير هذه النتائج إلى أنه لوحظ وجود ببتيد داخلي ينتمي إلى عائلة القشريات -RYamide neuropeptide.
يمكن أن توفر القياسات الموضعية MALDI-MS تعريفات نيوروببتيد مكملة لتحديد LC-ESI-MS ، بالإضافة إلى توفير قدرات إنتاجية أعلى. بعد استخراج تجانس الأنسجة الخام للببتيدات العصبية ، المملحة ، ووضع العلامات عليها (إذا رغبت في ذلك) ، يمكن خلط العينة مع المصفوفة ورصدها على لوحة الهدف من الفولاذ المقاوم للصدأ MALDI ، كما هو موضح في الشكل 4A. ينتج عن السحب الناجح لبقع العينات المتجانسة قمم تم حلها بوضوح ، خاصة داخل طيف المعايرة (الشكل 4B). عند استخدام أداة MALDI-TOF ، يجب معايرة الأداة في بداية كل تجربة. يمكن استخدام أي تحليلات ذات كتل معروفة لمعايرة الأداة إذا كانت ضمن نطاق الكتلة المطلوب للعينة. هنا ، يتم استخدام الفوسفور الأحمر لمعايرة كتلة الأيونات الإيجابية للأداة. لديها مزايا على استخدام خلطات معايرة الببتيد بسبب استقرارها في درجة حرارة الغرفة ، والتكلفة الرخيصة ، والقمم الوفيرة بسبب البلمرة ، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية ، ولا تتطلب مصفوفة للتأين.
بالنسبة لتصوير MALDI-MS للببتيدات العصبية ، تتطلب أداة MALDI TOF / TOF المستخدمة معايرة يدوية للصورة للشريحة المطلية ب ITO (الخطوة 3.1.10) لربط الصورة البصرية بالعينة. يوضح الرسم البياني في الشكل 5 الموضع المناسب للشعيرات المتقاطعة البيضاء لاستخدامها كنقاط تعليم للسماح للأداة بربط الصورة البصرية الممسوحة ضوئيا بلوحة العينة الفعلية. كما يوضح مناطق الشريحة المطلية ب ITO التي يجب على المستخدم تجنبها (أي لا تحتوي على عينة أو مصفوفة). بالنسبة لمعايرة الكتلة ، يؤثر وضع بقعة عينة المعايرة بالنسبة لعينة الأنسجة على الشريحة المطلية ب ITO بشكل مباشر على خطأ الكتلة بسبب الطبيعة المتأصلة لمحللات كتلة وقت الطيران ، على الرغم من أن حجم هذه المشكلة يعتمد على وفرة التحليلات المستهدفة. الحل لهذه المشكلة هو التحقق يدويا من القمم من أطياف MS1 من أقسام الأنسجة المختلفة للحصول على دليل على تحول الذروة. إذا كان هناك تحول ذروة، ففكر في إضافة بقع معايرة كتلة إضافية على الشريحة المغلفة ب ITO بجوار كل قسم من أقسام الأنسجة مباشرة. من هناك ، يمكن للمستخدم متوسط الأطياف من بقع المعايرة معا أو إجراء تصوير MS على قسم نسيج واحد في كل مرة باستخدام بقعة المعايرة الأقرب إلى قسم الأنسجة فقط. بعد جمع العينة، تحقق من أن الإشارة من قيم m/z المقابلة للببتيدات العصبية يتم توطينها فقط داخل منطقة الأنسجة (الشكل 6) قبل تعيين تحديد مفترض للببتيد العصبي.
الشكل 1: سير عمل إعداد عينة نيوروببتيد لتحليل مطياف الكتلة. لتحليل استخراج الأنسجة ، يتم تحلية تجانس الأنسجة الخام ، ووضع علامات عليها بملصقات نظائرية مستقرة ، وتحليحها مرة أخرى ، وتحليلها بواسطة MS. لتحليل التصوير ، يتم تضمين الأنسجة السليمة ، وتقسيمها بالتبريد ، وتطبيقها باستخدام المصفوفة ، وتحليلها بواسطة MALDI-MSI. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد الهوية والقياس الكمي من خلال برنامج البروتينات. يتم الكشف عن الببتيدات العصبية من خلال أطياف ذات جودة تتراوح مع (أ) تغطية تجزئة MS2 جيدة أو (ب) ضعيفة. يظهر خطأ مطابقة كتلة أيون الشظايا أسفل الأطياف. (C) يمكن فحص أشكال ملف تعريف XIC ووقت الاحتفاظ (RT) يدويا بحثا عن الببتيدات العصبية التي تم تحديدها كميا من خلال LFQ. (د) تستخدم أطياف MS1 للكشف عن الببتيدات العصبية المسماة بثنائي ميثيل وتحديدها كميا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تسلسل De novo للكشف عن الببتيد النيوروبي الجديد . (أ) يوضح طيف MS2 لرواية RYamide المفترضة تغطية جيدة للتجزئة مع خطأ كتلة منخفض لكل شظية. (ب) تدرج أيونات الشظايا المحددة للتفتيش اليدوي. (ج) يتم فحص XIC للرواية neuropeptide يدويا بحثا عن شكل الذروة الغاوسي. الاختصارات: RT = وقت الاستبقاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: بقع MALDI-MS وطيف المعايرة. (أ) تعتمد جودة أطياف التصلب المتعدد على توزيع مصفوفة الببتيد الموحد في البئر المستهدفة من الفولاذ المقاوم للصدأ MALDI. البقع الثلاث اليسرى هي أمثلة على البقع الجيدة التي تلامس حواف النقش جيدا والبقع الثلاث اليمنى هي أمثلة على البقع السيئة. تحتوي كلتا النقطتين على مصفوفة حمض α-سيانو-4-هيدروكسي سيناميك (CHCA) ومزيج قياسي من الببتيد. (ب) طيف المعايرة باستخدام مجموعات الفوسفور الأحمر من 500 إلى 3200 م/ض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصوير الشريحة الزجاجية المطلية ب ITO. (أ) تخطيطية مع المناطق المهمة المشار إليها: مواقع لوضع أقسام الأنسجة (مستطيلات زرقاء فاتحة) ، مواقع نقاط التدريس التلقائية التي يجب تجنبها (المستطيلات الحمراء) ، أمثلة على المواقع التي يمكن فيها رسم نقاط التدريس (الشعيرات البيضاء المتقاطعة) ، وحيث تعلق البراغي على لوحة المحول ويجب تجنبها (البيضاوي الأزرق الداكن). (ب) صورة لشريحة زجاجية تحتوي على قسمين من الأنسجة، وبقعة تحتوي على مزيج معايرة، وعلامات متقاطعة. يتم تحديد موقع قسم الأنسجة وبقع المعايرة على الجانب الآخر من الشريحة الزجاجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صور التصلب العصبي المتعدد للغدد الجيبية C. sapidus. يتم عرض صور توزيع أيونات Neuropeptide [M + H] + ل (A) HL/IGSL / IYRamide (m / z 844.48) ، (B) Allatostatin A-type NPYAFGLamide أو GGPYAFGLamide (m / z 780.40) ، (C) Allatostatin A-type GQYAFGLamide (m / z 754.39) ، و (D) RFamide GRNFLRFamide (m / z 908.52). يتم إنشاء الصور باستخدام نافذة ± 50 صفحة في الدقيقة من قيمة m/z النظرية. يشير شريط الألوان إلى نطاق شدة الإشارة من 0 إلى 100٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: البحث في قاعدة البيانات ونتائج LFQ. تم تحديد الببتيدات العصبية وقياسها كميا من خلال LC-MS وبرامج البروتينات. يتم سرد PTMs المحددة جنبا إلى جنب مع شدة الببتيدات المكتشفة في كلتا العينتين ل LFQ ، إلى جانب نسبة LFQ الناتجة. يتم سرد متوسط الكتل وأوصاف neuropeptide المرصودة من ملف FASTA. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد التحديد الدقيق والقياس الكمي والتوطين للببتيدات العصبية والببتيدات الداخلية الموجودة في الجهاز العصبي أمرا بالغ الأهمية لفهم وظيفتها23,24. قياس الطيف الكتلي هو تقنية قوية يمكن أن تسمح بتحقيق كل هذا ، حتى في الكائنات الحية التي لا تحتوي على جينوم متسلسل بالكامل. يتم إثبات قدرة هذا البروتوكول على اكتشاف الببتيدات العصبية وتحديدها كميا وتوطينها من الأنسجة التي تم جمعها من C. sapidus من خلال مزيج من LC-ESI- و MALDI- MS.
أثناء إعداد العينة لتحليل LC-ESI-MS ، يجب إجراء الاعتبارات. في حين أن مرض التصلب العصبي المتعدد هو تقنية حساسة، فإن انخفاض تركيز الببتيد في الأنسجة العصبية (وصولا إلى نطاق الفيمتومولار25) يشكل قيدا خطيرا. مطلوب إعداد عينة دقيقة ليس فقط لإزالة مكونات مصفوفة أكثر وفرة وتداخلا ، مثل البروتينات والدهون ولكن أيضا تقليل فقدان الببتيدات العصبية في كل خطوة26,27. على سبيل المثال ، يمكن تقليل فقدان العينة باستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تقاوم امتزاز الببتيد. اعتمادا على تكوين الأنسجة ذات الأهمية ، يمكن استخدام المذيبات المختلفة (للاستخراج أو هطول الأمطار) أو مواد استخراج الطور الصلب لفصل الجزيئات الحيوية ذات الأحجام المختلفة والخصائص الكيميائية. لضمان وجود الببتيدات المحبة للماء أو الكارهة للماء في مستخلص neuropeptide ، يمكن استخدام أنظمة مذيبات استخراج متعددة اختياريا لاستهداف neuropeptides ذات الخصائص الفيزيائية والكيميائية المختلفة. هذه ، جنبا إلى جنب مع استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني ، قد تحتاج إلى تعديل لتحسين تنقية لتحسين استعادة الببتيد neuropeptide28. تتمثل عيوب استخدام أنظمة استخراج متعددة في أن العديد من الأنسجة العصبية تحتاج إلى تجميع لتلبية متطلبات محتوى الببتيد الأعلى بشكل عام ، بالإضافة إلى انخفاض الإنتاجية. توصي العديد من الخطوات مثل إزالة الملح ووضع العلامات النظيرية وحقن التصلب المتعدد ببعض كميات الببتيد البادئة. لتوصيف العينات الثمينة ، مثل neuropeptides ، يتم تجنب اختبارات الببتيد بشكل عام لمنع استهلاك الببتيد الدخيل. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير اختبارات الببتيد لتحديد تركيز الببتيد الدقيق من هضم البروتين ، والتي لها خصائص كيميائية مختلفة عن الببتيدات الذاتية. للتغلب على المضاعفات الناجمة عن تركيز الببتيد غير المعروف ، يمكن إجراء فحص أولي للببتيد باستخدام مستخلصات الأنسجة العصبية المجمعة ، حيث يتم استخدام النتائج كتقدير لجميع التحليلات اللاحقة ، على الرغم من أنه يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن جميع الببتيدات في المحلول يتم قياسها ، وليس كل هذه الببتيدات neuropeptides29. وتشمل القيود الأخرى لهذه الطريقة التحيزات المحتملة للببتيدات العصبية غير القطبية والكارهة للماء وعدم الحفاظ على البنية المحلية. يمكن إجراء تعديلات على تركيبات ومواد المذيبات ، مثل استخدام المحاليل الأكثر كرها للماء أو حذف استخدام المذيبات العضوية ، لمعالجة ذلك.
تعتمد قياسات MALDI-MS على خطوات إعداد عينات دقيقة للحصول على نتائج متسقة ويمكن أن يكون لها اعتبارات عينة مختلفة عن قياسات LC-ESI-MS. لا تزال خطوات مثل الحفاظ على مستخلص neuropeptide على الجليد قبل تحليل MS مطبقة. تشمل الطرق الإضافية لمنع تحلل الببتيد neuropeptide الاحتفاظ بشرائح زجاجية تحتوي على مقاطع أنسجة مثبتة على الذوبان في صندوق مجفف بعد التشريح لمنع التكثيف من تراكم30 ، على الرغم من أن ترك عينة الأنسجة في المجفف بعد جفافها قد يؤدي إلى تدهور العينة أيضا. يقترح وضع شرائح الأنسجة في مجفف فراغ (الضغط النهائي: 1x10-4 Torr في درجة حرارة الغرفة) لمدة 5-10 دقائق مباشرة قبل تطبيق المصفوفة. بعد إيداع المصفوفة على شريحة الأنسجة ، يمكن الاحتفاظ بها في الثلاجة أو الفريزر طوال الليل وتجفيفها في مجفف الفراغ قبل قياس التصوير MALDI-MS. بالنسبة للقياسات الموضعية ل MALDI ، لا يتم توزيع البنية البلورية للمصفوفة الببتيد بالتساوي في جميع أنحاء هدف MALDI بشكل جيد حتى لو بدا الأمر كذلك. هناك طرق للتخفيف من اختلافات أطياف الكتلة من النسخ المتماثلة التقنية بسبب هذه العملية. أولا ، احصل على متوسط طيف من كل بئر باستخدام لقطات ليزر متعددة (عادة مئات إلى آلاف) حيث يتم تنقيط الليزر عشوائيا عبر البئر (أي اختيار حركة حامل العينة SMART أو العشوائية في معلمات الأداة). احصل على ما لا يقل عن خمس نسخ طبق الأصل تقنية لكل نوع من أنواع العينات واختر ثلاثة نسخ متماثلة تقنية حيث يكون التباين في شدة الإشارة للقمم المطلوبة هو الأدنى. المفاضلة هنا هي الإنتاجية التجريبية. من الضروري الحفاظ على معلمات مثل عدد لقطات الليزر وقطر الليزر وإعدادات الأدوات الأخرى متسقة لجميع الأطياف المكتسبة. من الناحية المثالية ، يتم تحليل جميع النسخ المتماثلة التقنية والتكرارات البيولوجية في نفس الوقت باستخدام نفس محلول المصفوفة ومعايرة الأداة. يمكن إجراء تحديد Neuropeptide عن طريق مطابقة الكتلة الدقيقة لقائمة الذروة التي تحتوي على [M + H] + النظرية ، [M + Na] + ، [M + NH4] + ، [M + K ] + ، وغيرها من قنوات الملح التي تنتج قيم أيون m / z مشحونة بشكل فردي. يعد تطبيع البيانات أمرا بالغ الأهمية لتقليل القطع الأثرية المنهجية من تجارب MALDI-MS. ويكتسي تقييم قابلية الاستنساخ أهمية خاصة عندما تستخدم القياسات الموضعية ل MALDI-MS لتحديد كمي الببتيد النيوروبتيد عن طريق وسم النظائر المستقرة (SIL). يمكن تقييم جودة إعداد العينة والحصول على البيانات عن طريق أخذ معيار الببتيد أو مستخلص neuropeptide ، وتقسيمه إلى أليكوتين متساويين ، ووضع علامات تفاضلية على كل عينة بواسطة SIL ، وتحليل العينة لضمان أن الكثافة النسبية للقمم المقترنة هي 1: 1. ويمكن استخدام التباين المبلغ عنه من تلك النسب لتقدير مستوى التباين في التجربة الإجمالية التي تعزى إلى خطأ المستخدم.
ومن المهم ملاحظة أن نظام MALDI-MS قادر أيضا على توفير معلومات تسلسلية وكمية؛ ومع ذلك ، فإن الأيونات المشحونة بشكل فردي التي تنتجها عادة MALDI تحد من اكتشاف شظايا الببتيد ، مما يجعل من الصعب الحصول على التسلسل الكامل ويثبط طرق التكميم التي نوقشت ل LC-ESI-MS. بغض النظر عن ذلك ، فإن MALDI-MS هي طريقة جذابة بسبب قدرتها على الإنتاجية العالية ، فضلا عن تحمل أعلى للأملاح والشوائب داخل العينة12,31. بالإضافة إلى ذلك ، يتمتع تصوير MALDI-MS بمزايا على تقنيات التصوير التقليدية الأخرى التي تتطلب أجساما مضادة. في معظم طرائق التصلب العصبي المتعدد، سيؤدي خفض دقة الكتلة إلى تعزيز الحساسية، مما يتيح الكشف المحسن عن الببتيدات العصبية منخفضة الوفرة. قد تكون هذه الاستراتيجية أكثر عملية لأجهزة MALDI-TOF / TOF من أجهزة LC-ESI-MS بسبب سهولة معايرة أداة MALDI لكل تجربة. هناك طريقة أخرى يمكن أن تكون بها MALDI مفيدة ل neuropeptidomics وهي من خلال متوسط الأطياف. عادة ، لا يتم استخدام متوسط الأطياف من قياسات LC-ESI-MS لأنه ينفي فوائد فصل LC ؛ لذلك ، يتم الاعتماد بشكل كبير على برامج المعلوماتية الحيوية لتحديد neuropeptides ويتم التحقق من الهويات يدويا. ومع ذلك، هناك عواقب أقل لمتوسط الأطياف من قياسات MALDI-MS لأنه لم يكن هناك فصل أولي؛ لذلك ، تكون البيانات الخام أصغر وأسهل بالنسبة للمستخدم لتمشيطها يدويا. تعد سهولة إدارة البيانات مهمة لأنها تغير الترتيب الذي يمكن للمستخدم من خلاله التعامل مع استراتيجيات تحديد والتحقق من الببتيد neuropeptide. في حين أن الثقة في تحديد نيوروببتيد من LC-ESI-MS يمكن أن تستفيد من زيادة مستوى صرامة العتبة داخل برامج تحليل البيانات ، فمن غير المرجح أن تفيد هذه الاستراتيجية تحديدات MALDI-MS. وفي مثال القشريات النيوروبتيدات (neuropeptides)، فإن وجود أقل من 1000 مدخل من قاعدة البيانات التي تم بناؤها في المختبر (أي ما لا يزيد عن <1000 ذروات طيفية أو صور MS لمسحها ضوئيا يدويا)، يجعل من الممكن أولا تصفية بيانات MALDI-MS بعتبة خطأ كتلة سخية، ثم التحقق يدويا من تلك التحديدات عن طريق فحص الأظرف النظيرية على مستوى MS1، بالإضافة إلى طرق التحقق الأخرى التي نوقشت في قسم النتائج التمثيلية. يمكن لبرنامج تحليل بيانات تصوير التصلب المتعدد الشائع إجراء مطابقة دقيقة للكتلة مع قاعدة بيانات كتلة neuropeptide واستخراج صور MS المقابلة. بالنسبة للأسئلة البحثية القائمة على السريرية، مثل اكتشاف المؤشرات الحيوية، فإن هذه البرامج قادرة على استخراج قيم m/z الفريدة لمنطقة الأنسجة ذات الأهمية (تسمى عادة تحليل منطقة الاهتمام (ROI))32 وإجراء اختبارات إحصائية لتحديد مدى اختلاف منطقتي الأنسجة. تجدر الإشارة أيضا إلى أن هناك أيضا خيارات برامج تحليل بيانات أقل لتصوير MS مقارنة ب LC-ESI-MS.
عادة ما يستلزم إجراء عمليات البحث في قاعدة بيانات LC-ESI-MS عن الببتيدات العصبية استخدام خوارزميات برمجية مصممة لتحليل الببتيدات المهضومة. على هذا النحو ، هناك قيود على قدرة البرامج على إجراء عمليات بحث غير محددة في قاعدة بيانات الإنزيمات أو مقدار الوقت الذي يستغرقه إكمال البحث. في الوقت الحالي ، يتم إجراء عمليات البحث عن الببتيد الداخلي بأكبر عدد ممكن من الانقسامات الفائتة ، لكن هذا العدد لا يزال محدودا ، مما يؤدي إلى تحديد الهوية التي يحتمل أن تكون مفقودة. عندما لا يكون جينوم نوع ما متتسلسلا بشكل كامل ، كما هو الحال مع C. sapidus ، يمكن إجراء تسلسل de novo لتحديد الببتيدات العصبية غير المعروفة / الجديدة من خلال زخارف تسلسل neuropeptide المحفوظة المعروفة ، على الرغم من أن هذه الطريقة تفشل في تحديد neuropeptides التي لها زخارف غير معروفة أو لا تحتوي على الزخارف المستخدمة كمعرفات عائلة neuropeptide19. على سبيل المثال ، WSSMRGAWamide هو زخارف لعائلة neuropeptide من النوع B من الألوستاتين19. هنا تكمن أهمية تعدين النسخ لتسلسل الببتيد النيوروبتيد المتوقع للأنواع التي لا تحتوي على تسلسل جينوم تم فك تشفيره بالكامل33. ثم يتم تأكيد تحديد الببتيد Neuropeptide عن طريق توليف تسلسل الببتيد المفترض ومقارنة أطياف MS / MS من الببتيد الاصطناعي والأنسجة البيولوجية34. حتى بعد التحقق من التسلسل ، من غير المعروف أحيانا ما إذا كان تسلسل neuropeptide الكامل أو منتج تدهور. تجدر الإشارة إلى أن الاختلافات بين مصادر التأين MALDI و ESI-MS (ESI هي طريقة تأين أكثر ليونة من MALDI) قد تؤدي إلى معدلات مختلفة من التحلل الاصطناعي (أي التجزئة داخل المصدر). للتمييز بين نسخة مبتورة من الببتيد من منتج تحلل مستحث صناعيا (أي ليس في الجسم الحي) ، يجب معرفة مسار معالجة ما قبل الهرمونات لهذا الببتيد neuropeptide. نظرا لأن هذا ليس هو الحال في كثير من الأحيان ، فيجب استخدام شكل اصطناعي من الببتيد في الفحوصات الفسيولوجية والتحقق من النشاط البيولوجي.
بشكل عام ، يمكن أن يفيد سير العمل الموضح هنا لتحليل neuropeptide مجموعة متنوعة من المجالات المختلفة. إنه يملأ فجوة تقنية في تحليل MS من منتصف إلى أسفل للببتيدات لأنه محسن للببتيدات الداخلية التي تكون أصغر من البروتينات التي يتم تحليلها عادة بواسطة تحليلات MS من أسفل إلى أعلى أو من أعلى إلى أسفل. لذلك ، يجب أن تكون طرق تحضير العينات المستخدمة من قبل neuropeptidomics قابلة للترجمة إلى حد كبير إلى الببتيدات الداخلية النشطة بيولوجيا الأخرى ، مثل تلك التي يستهدفها الكيميائيون الطبيون للخصائص المضادة للبكتيريا35. ومن فوائد هذا البروتوكول أنه يستخدم أدوات مشتركة من البائعين المشهورين الذين يقدمون درجة إضافية من قابلية الترجمة أيضا. وبهذه الطريقة ، يمكن استخدام سير العمل في الإعدادات الأكاديمية والتجارية ، مثل فحص الأدوية المرشحة أو أهداف الأدوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (CHE-1710140 و CHE-2108223) والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) من خلال منحة R01DK071801. تم دعم A.P. جزئيا من قبل منحة التدريب على واجهة الكيمياء والبيولوجيا في المعاهد الوطنية للصحة (T32 GM008505). تم دعم N.V.Q. جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة ، بموجب جائزة Ruth L. Kirschstein National Research Service Award من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم إلى مركز أبحاث القلب والأوعية الدموية بجامعة ويسكونسن ماديسون (T32 HL007936). L.L. يود أن يعرب عن تقديره لمنح المعاهد الوطنية للصحة R56 MH110215 و S10RR029531 و S10OD025084 ، بالإضافة إلى دعم التمويل من أستاذية Vilas للإنجاز المتميز وأستاذية تشارلز ملبورن جونسون بتمويل مقدم من مؤسسة أبحاث خريجي ويسكونسن وكلية الصيدلة بجامعة ويسكونسن ماديسون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde - D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge - 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac - SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) - Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al.
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P.
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
- Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
- Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
- Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
- Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
- Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
- Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
- Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
- Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
- Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
- Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
- Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
- Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
- DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
- Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
- Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
- Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S.
- DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
- Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
- Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
- Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
- Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
- Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
- Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
- Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
- Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
- Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
- Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).
