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Chemistry

Investigación espectrométrica de masas multifacética de neuropéptidos en Callinectes sapidus

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/63322
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison
* These authors contributed equally

Summary

La caracterización espectrométrica de masas de neuropéptidos proporciona información de secuencia, cuantificación y localización. Este flujo de trabajo optimizado no solo es útil para estudios de neuropéptidos, sino también para otros péptidos endógenos. Los protocolos proporcionados aquí describen la preparación de muestras, la adquisición de EM, el análisis de EM y la generación de neuropéptidos en bases de datos utilizando LC-ESI-MS, maldi-MS spotting e imágenes MALDI-MS.

Abstract

Los neuropéptidos son moléculas de señalización que regulan casi todos los procesos fisiológicos y conductuales, como el desarrollo, la reproducción, la ingesta de alimentos y la respuesta a los factores estresantes externos. Sin embargo, los mecanismos bioquímicos y el complemento completo de los neuropéptidos y sus funciones funcionales siguen siendo poco conocidos. La caracterización de estos péptidos endógenos se ve obstaculizada por la inmensa diversidad dentro de esta clase de moléculas de señalización. Además, los neuropéptidos son bioactivos en concentraciones 100x - 1000x más bajas que las de los neurotransmisores y son propensos a la degradación enzimática después de la liberación sináptica. La espectrometría de masas (EM) es una herramienta analítica altamente sensible que puede identificar, cuantificar y localizar analitos sin un conocimiento exhaustivo a priori . Es muy adecuado para perfilar neuropéptidos a nivel mundial y ayudar en el descubrimiento de nuevos péptidos. Debido a la baja abundancia y la alta diversidad química de esta clase de péptidos, se han adaptado varios métodos de preparación de muestras, parámetros de adquisición de EM y estrategias de análisis de datos a partir de técnicas proteómicas para permitir una caracterización óptima de neuropéptidos. Aquí, se describen métodos para aislar neuropéptidos de tejidos biológicos complejos para la caracterización de secuencias, cuantificación y localización mediante cromatografía líquida (LC)-MS y desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI)-MS. Se incluye un protocolo para preparar una base de datos de neuropéptidos a partir del cangrejo azul, Callinectes sapidus, un organismo sin información genómica completa. Estos flujos de trabajo se pueden adaptar para estudiar otras clases de péptidos endógenos en diferentes especies utilizando una variedad de instrumentos.

Introduction

El sistema nervioso es complejo y requiere una red de neuronas para transmitir señales a través de un organismo. El sistema nervioso coordina la información sensorial y la respuesta biológica. Las interacciones intrincadas y enrevesadas involucradas en la transmisión de señales requieren muchas moléculas de señalización diferentes, como neurotransmisores, esteroides y neuropéptidos. Como los neuropéptidos son las moléculas de señalización más diversas y potentes que desempeñan un papel clave en la activación de las respuestas fisiológicas al estrés y otros estímulos, es de interés determinar su papel específico en estos procesos fisiológicos. La función neuropeptídica está relacionada con su estructura de aminoácidos, que determina la movilidad, la interacción del receptor y la afinidad1. Técnicas como la histoquímica, que es importante porque los neuropéptidos se pueden sintetizar, almacenar y liberar en diferentes regiones del tejido, y la electrofisiología se han empleado para investigar la estructura y función de los neuropéptidos 2,3,4, pero estos métodos están limitados por el rendimiento y la especificidad para resolver la vasta diversidad de secuencias de los neuropéptidos.

La espectrometría de masas (EM) permite el análisis de alto rendimiento de la estructura y abundancia de neuropéptidos. Esto se puede realizar a través de diferentes técnicas de EM, más comúnmente cromatografía líquida-ionización electrospray MS (LC-ESI-MS)5 y MS de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS)6. Utilizando mediciones de masa de alta precisión y fragmentación de EM, la EM proporciona la capacidad de asignar la secuencia de aminoácidos y el estado de modificación post-traduccional (PTM) a neuropéptidos de mezclas complejas sin conocimiento a priori para ayudar a determinar su función 7,8. Además de la información cualitativa, la EM permite la información cuantitativa de neuropéptidos a través de la cuantificación sin etiquetas (LFQ) o métodos basados en etiquetas, como el etiquetado isotópico o isobárico9. Las principales ventajas de LFQ incluyen su simplicidad, bajo costo de análisis y disminución de los pasos de preparación de la muestra que pueden minimizar la pérdida de muestras. Sin embargo, las desventajas de LFQ incluyen un aumento de los costos de tiempo del instrumento, ya que requiere múltiples réplicas técnicas para abordar el error cuantitativo de la variabilidad de ejecución a ejecución. Esto también conduce a una disminución de la capacidad de cuantificar con precisión pequeñas variaciones. Los métodos basados en etiquetas se someten a una variación menos sistemática, ya que múltiples muestras pueden etiquetarse diferencialmente utilizando una variedad de isótopos estables, combinados en una muestra y analizados a través de espectrometría de masas simultáneamente. Esto también aumenta el rendimiento, aunque las etiquetas isotópicas pueden llevar mucho tiempo y ser costosas de sintetizar o comprar. La complejidad espectral de los espectros de masas de exploración completa (MS1) también aumenta a medida que aumenta la multiplexación, lo que disminuye el número de neuropéptidos únicos capaces de fragmentarse y, por lo tanto, identificarse. Por el contrario, el etiquetado isobárico no aumenta la complejidad espectral a nivel de MS1, aunque introduce desafíos para los analitos de baja abundancia, como los neuropéptidos. Como la cuantificación isobárica se realiza a nivel de espectros de masas de iones de fragmento (MS2), los neuropéptidos de baja abundancia pueden no poder cuantificarse, ya que se pueden seleccionar componentes de matriz más abundantes para la fragmentación y los seleccionados pueden no tener una abundancia lo suficientemente alta como para ser cuantificados. Con el etiquetado isotópico, la cuantificación se puede realizar en cada péptido identificado.

Además de la identificación y cuantificación, la información de localización puede ser obtenida por MS a través de imágenes MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Al rasterizar un láser a través de una superficie de muestra, los espectros MS se pueden compilar en una imagen de mapa de calor para cada valor m / z . El mapeo de la intensidad de la señal neuropeptídica transitoria en diferentes regiones a través de las condiciones puede proporcionar información valiosa para la determinación de la función11. La localización de neuropéptidos es especialmente importante porque la función del neuropéptido puede diferir dependiendo de la ubicación12.

Los neuropéptidos se encuentran en menor abundancia in vivo que otras moléculas de señalización, como los neurotransmisores, y por lo tanto requieren métodos sensibles para la detección13. Esto se puede lograr mediante la eliminación de componentes de la matriz de mayor abundancia, como los lípidos11,14. Es necesario realizar consideraciones adicionales para el análisis de neuropéptidos en comparación con los flujos de trabajo proteómicos comunes, principalmente porque la mayoría de los análisis neuropeptidómicos omiten la digestión enzimática. Esto limita las opciones de software para el análisis de datos de neuropéptidos, ya que la mayoría se construyeron con algoritmos basados en datos de proteómica y coincidencias de proteínas informadas por la detección de péptidos. Sin embargo, muchos programas como PEAKS15 son más adecuados para el análisis de neuropéptidos debido a sus capacidades de secuenciación de novo. Se deben considerar varios factores para el análisis de neuropéptidos desde el método de extracción hasta el análisis de datos de EM.

Los protocolos descritos aquí incluyen métodos para la preparación de muestras y el etiquetado isotópico de dimetilo, adquisición de datos y análisis de datos de neuropéptidos por LC-ESI-MS, MALDI-MS y MALDI-MSI. A través de resultados representativos de varios experimentos, se demuestra la utilidad y la capacidad de estos métodos para identificar, cuantificar y localizar neuropéptidos de cangrejos azules, Callinectes sapidus. Para comprender mejor el sistema nervioso, los sistemas modelo se utilizan comúnmente. Muchos organismos no tienen un genoma completamente secuenciado disponible, lo que impide el descubrimiento integral de neuropéptidos a nivel de péptidos. Con el fin de mitigar este desafío, se incluye un protocolo para la identificación de nuevos neuropéptidos y la minería de transcriptomas para generar bases de datos para organismos sin información completa del genoma. Todos los protocolos presentados aquí pueden optimizarse para muestras de neuropéptidos de cualquier especie, así como aplicarse para el análisis de cualquier péptido endógeno.

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Protocol

Todos los muestreos de tejido descritos se realizaron de conformidad con las directrices de la Universidad de Wisconsin-Madison.

1. Análisis LC-ESI-MS de neuropéptidos

  1. Extracción y desalinización de neuropéptidos
    1. Antes de la adquisición de tejidos, prepare metanol acidificado (acMeOH) (90:9:1 MeOH:agua:ácido acético) como se describe en16.
    2. Recolecte tejido cerebral del crustáceo17 y use fórceps para colocar inmediatamente un tejido cada uno en un tubo de 0,6 ml que contenga 20 μL de acMeOH.
      NOTA: Los protocolos de disección de tejidos varían mucho para diferentes animales y diferentes tipos de tejidos. Se remite al lector al protocolo17 para obtener una descripción detallada sobre cómo diseccionar el tejido cerebral y muchos otros tipos de tejido del crustáceo. Las muestras se pueden almacenar a -80 °C hasta su uso (idealmente dentro de los 6 meses). Los volúmenes descritos se utilizan para un solo cerebro de Callinectes sapidus. Los volúmenes deben escalarse para el tamaño del tejido. El tejido puede congelarse inmediatamente sin disolvente, aunque esto no se recomienda ya que las enzimas proteolíticas endógenas no se inhibirán y permanecerán activas, aunque a un ritmo más lento cuando están frías.
    3. Añadir 150 μL de acMeOH a la muestra. Establezca el tiempo total de sonicación en 24 s, el tiempo de pulso en 8 s, el tiempo de pausa en 15 s y la amplitud en un homogeneizador ultrasónico y homogeneice las muestras en hielo.
      NOTA: Existen diferentes sistemas de homogeneización disponibles. Ajuste los ajustes y las condiciones de acuerdo con el tipo de muestra y el equipo.
    4. Centrifugar la muestra a 4 °C a 20.000 x g durante 20 min. Con una pipeta, transfiera el sobrenadante en un tubo y séquelo en un concentrador de vacío (266 x g, 1 x 10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
      NOTA: Las muestras secas se pueden almacenar a -80 °C hasta su uso (idealmente dentro de los 6 meses). El calentamiento del concentrador de vacío debe realizarse con precaución. Si bien el calor acorta el tiempo de secado, la muestra debe retirarse del concentrador inmediatamente después de que todo el líquido se haya evaporado para minimizar la degradación peptídica. Para evitar esto, el calentamiento puede omitirse de este y todos los pasos posteriores.
    5. Para la desalinización, reconstituir la muestra de tejido extraída en 20 μL de ácido fórmico (FA) al 0,1%, pozo de vórtice y sonicar en un baño de agua a temperatura ambiente durante 1 min.
      NOTA: Hay diferentes materiales de desalinización disponibles. Ajuste las soluciones y los volúmenes de acuerdo con la identidad de la resina y la cantidad de neuropéptidos. La cantidad total de péptidos puede estimarse utilizando un ensayo comercial de cuantificación de péptidos (ver Tabla de Materiales).
    6. Aplique 0,5 μL de muestra a una tira de pH para confirmar que el pH < 4. Si el pH es más alto, agregue 1 μL de alícuotas de 10% de FA hasta que el pH < 4.
    7. Siga el protocolo del fabricante para desalinizar18. Prepare una solución humectante que contenga 100 μL de acetonitrilo al 50% (ACN), una solución de equilibrio que contenga 100 μL de FA al 0,1%, una solución de lavado que contenga 100 μL de FA al 0,1% y soluciones de elución que contengan 20 μL de ACN/0,1% FA al 25%, 20 μL de ACN al 50% /0,1% FA y 20 μL de ACN/0,1% FA.
    8. Obtener una punta desalinizante de 10 μL con resina C18 (ver Tabla de Materiales).
    9. Coloque la punta de desalinización en una pipeta de 20 μL que esté ajustada a 15 μL. Una vez que la punta de desalinización esté húmeda, evite que pase el aire manteniendo la pipeta presionada cuando esté fuera de la solución hasta que se deseche.
    10. Aspire la punta 3x con solución humectante y 3x con solución de equilibrio. Aspirar en la muestra 10x seguido de lavar 3x en solución de lavado, desechando cada lavado. Elute aspirando 10x en cada una de las soluciones de elución en orden de aumento de ACN.
      NOTA: Las fracciones de elución se pueden mantener separadas o combinadas para análisis adicionales.
    11. Deseche la punta desalinizante utilizada y seque los neuropéptidos eluidos en un concentrador de vacío (266 x g, 1 x 10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
      NOTA: Esto se puede almacenar a -80 ° C hasta su uso (idealmente dentro de los 6 meses).
  2. Etiquetado isotópico de neuropéptidos en extracto tisular
    NOTA: Este paso es opcional y solo se utiliza cuando se desea la cuantificación.
    1. Preparar la solución de etiquetado de dimetilo isotópico de 2 plex en una campana extractora de humos: 1% CH2OH2 (13,5 μL de stock 37 porcentaje peso/peso (wt. %) en solución de agua en 486,5 μL de agua), 1% CH2OD2 (25 μL de stock 20 % en peso de solución en 475 μL de agua) y 0,03 M de piridina de borano (3,75 μL de solución de stock de 8 M en 996,25 μL de agua).
      PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico, por lo que todas las soluciones deben mantenerse en una campana ventilada. Use guantes, una bata de laboratorio, protección ocular y calzado impermeable. No se deben usar lentes de contacto cuando se trabaja con este material.
      NOTA: Existen diferentes reactivos isotópicos; seleccione los apropiados en función del tipo de muestra y el número de canales de etiquetado deseados.
    2. Disolver el extracto crudo de neuropéptidos en 10 μL de agua y sonicato durante 10 min.
    3. Añadir 10 μL de una solución de formaldehído isotópico diferente (es decir, CH2OH2, CH2OD2, etc.) a cada condición experimental diferente que se medirá cuantitativamente. Vórtice para mezclar bien y centrifugar brevemente cada muestra a 2.000 x g.
    4. Añadir 10 μL de 0,03 M de borano piridina a cada tubo de muestra. Vórtice para mezclar bien y centrifugar brevemente cada muestra a 2.000 x g.
    5. Incubar las muestras durante 15 min a 37 °C en un baño de agua.
    6. Retire las muestras del baño de agua y agregue 10 μL de bicarbonato de amonio de 100 mM. Vórtice para mezclar bien y centrifugar brevemente cada muestra a 2.000 x g.
    7. Combine las muestras etiquetadas para una muestra de 2 plexos y seque los neuropéptidos en un concentrador de vacío (266 x g, 1 x 10-4 Torr) a aproximadamente 35 °C.
    8. Desalar los neuropéptidos etiquetados volviendo a realizar los pasos 1.1.5 - 1.1.10 y almacenarlos hasta que estén listos para la adquisición de datos.
  3. Adquisición de datos
    1. Reconstituir los neuropéptidos desalados secos en 12 μL de ACN al 3%/0,1% FA, bien de vórtice, sonicar en baño de agua a 37 °C durante 1 min, y centrifugar brevemente a 2.000 x g. Transfiera cada muestra a viales de automuestreador.
      NOTA: Ajuste el volumen de la muestra de acuerdo con la cantidad de neuropéptidos a una concentración de ~ 1 μg de péptido por μL. La cantidad total de péptidos puede estimarse utilizando un ensayo comercial de cuantificación de péptidos (consulte la Tabla de materiales).
    2. Utilice un muestreador automático para inyectar 1 μL de muestra en un instrumento nano-LC-MS/MS de alta resolución (consulte la Tabla de materiales).
    3. Utilice una columna C18 de fase invertida (RP) de aproximadamente 15 cm de largo (consulte la Tabla de materiales) para ejecutar la muestra con 0,1% de FA en agua como fase móvil A y 0,1% de FA en ACN como fase móvil B. Ejecute las muestras con un gradiente de 3% - 95% de B a una velocidad de 300 nL / min durante más de 11 min.
    4. Para el instrumento MS utilizado aquí, use condiciones comunes de MS de 2.00 kV para el voltaje de pulverización y 275 ° C para la temperatura capilar.
    5. Adquirir espectros MS en el rango de 200 - 2.000 m/z con una resolución de 60.000, objetivo de control automático de ganancia (AGC) de 1 x 106 y tiempo máximo de inyección de iones (IT) de 150 ms.
    6. Seleccione los 15 iones más intensos (intensidad mínima de 3,2 x 104) para la fragmentación de disociación por colisión (HCD) de mayor energía utilizando una energía de colisión normalizada de 30, una ventana de aislamiento de 2,0 m/z, una resolución de 15.000, un objetivo AGC de 2 x 105 y una TI máxima de 250 ms.
    7. Establezca una ventana de exclusión dinámica de 30 s. Excluya los iones con una carga de 1 o ≥ 8 y los iones con estados de carga no reconocidos.
  4. Identificación y cuantificación de neuropéptidos
    NOTA: Muchos programas para la búsqueda de bases de datos y la cuantificación de péptidos (tanto de código abierto como comerciales) están disponibles. Aquí se utilizará PEAKS Studio (software de proteómica)15 .
    1. Realice búsquedas en la base de datos siguiendo los pasos descritos en 1.4.2 - 1.4.6.
    2. Cree un nuevo proyecto y agregue los datos lc-MS seleccionando Ninguno para la enzima, Orbitrap para el instrumento, HCD para el fragmento y Adquisición dependiente de datos (DDA) para la adquisición.
      NOTA: Seleccione los parámetros apropiados en función de los parámetros de adquisición de datos.
    3. Seleccione Identificaciones y seleccione Correcto precursor [DDA] y Masa solamente.
    4. Seleccione Búsqueda en la base de datos y establezca una tolerancia de error de 20.0 ppm usando masa monoisotópica para la masa precursora y 0.02 Da para la masa de iones fragmento, Ninguno para el tipo de enzima, Inespecífico para el modo de digestión, 100 para las escisiones máximas perdidas y los siguientes PTM variables con la variable ptM máxima permitida por péptido de 3: Amidación, Oxidación (M), Pyro-glu de E, y Pyro-glu de Q.
    5. Seleccione la base de datos de neuropéptidos, estime la tasa de descubrimiento falso (FDR) con señuelo-fusión.
      NOTA: El error de tolerancia de masa debe ajustarse para que coincida con los datos recopilados. Utilice la base de datos adecuada para el tipo de ejemplo. Cuando no se selecciona ninguna enzima, el parámetro de escisión máxima omitida no afecta a la búsqueda. Sin embargo, se requiere una gran cantidad de divisiones perdidas si el software no tiene el modo de resumen no especificado como opción.
    6. Si desea una cuantificación sin etiquetas, seleccione Cuantificación, seleccione Sin etiquetas y establezca una tolerancia de error de 20,0 ppm y una tolerancia de tiempo de retención de 1,0 min.
    7. Realizar la cuantificación de iones precursores si se realizó el paso 1.2 para el etiquetado isotópico.
      1. Seleccione Cuantificación, seleccione Cuantificación de iones precursores, utilice un intervalo de tiempo de retención de 1,0 min y utilice un umbral FDR del 1%.
      2. Seleccione un método de cuantificación preestablecido o personalizado en el menú desplegable Seleccionar método .
      3. Para crear un nuevo método personalizado, haga clic en Configuración de > de ventana > Etiqueta Q Método > Nuevo. Asigne un nombre al nuevo método y seleccione Cuantificación de iones precursores para Tipo de método. Seleccione Agregar fila y seleccione modificación en la lista Opciones de PTM.
      4. Agregue los datos de LC-MS y seleccione Condición de referencia para que sea la modificación en neuropéptidos de la condición de control del experimento.
    8. Evalúe los resultados de la búsqueda como se describe en los pasos 1.4.9 a 1.4.11.
    9. Filtre los resultados a través de la pestaña de resumen de péptidos y proteínas con -10lgP ≥ 20, seleccione ≥ 1 péptido único y seleccione la casilla etiquetada con péptidos significativos.
    10. Evalúe los resultados de búsqueda de la base de datos donde Proteína.csv representa identificaciones de neuropéptidos y Péptido.csv representa identificaciones de fragmentos de neuropéptidos.
    11. Inspeccione la búsqueda de la base de datos para obtener puntuaciones de proteínas y péptidos, precisión de masa y cobertura de secuencia.
      NOTA: Cada software de búsqueda de bases de datos utiliza algoritmos de puntuación únicos y es posible que deba evaluarse en consecuencia. Las identificaciones se pueden evaluar inspeccionando manualmente los espectros observados en busca de péptidos identificados que contengan la serie completa de iones de fragmentos.

2. Análisis de manchas MALDI-MS de neuropéptidos

  1. Preparación de muestras
    1. Siga el paso 1.1 o los pasos 1.1 a 1.2 si se desea la cuantificación, excluyendo el paso 1.2.8 (no se requiere desalinización después del etiquetado isotópico antes del análisis MALDI-MS).
    2. Reconstituir los neuropéptidos desalados secos en 5 μL de FA al 0,1%, bien de vórtice, sonicar en un baño de agua a 37 °C durante 1 min, y centrifugar brevemente a 2.000 x g.
    3. Para el manchado de neuropéptidos en tejidos de crustáceos, prepare 150 mg / ml de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) en metanol al 50% (MeOH) / 0.1% FA (v / v) como matriz.
    4. Pipetear una gota de muestra de 3 μL sobre una película hidrofóbica (ver Tabla de Materiales) y pipetear 3 μL de la matriz directamente sobre la gota de muestra. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
    5. Pipeta 1 μL de la muestra 1:1: mezcla de matriz en un pozo de la placa diana de acero inoxidable MALDI. Use la punta de la pipeta para extender cada mezcla a los bordes del pozo de muestra. La muestra debe tocar los bordes del pozo de grabado para facilitar una distribución uniforme (Figura 4A).
    6. Punto 1 μL de calibrante 1:1: mezcla de matriz (mezcla de calibración comercial o personalizada, materiales poliméricos (es decir, fósforo rojo disuelto en MeOH) o iones de racimo de matriz común)12 en un pozo cerca de la muestra.
      NOTA: El fósforo rojo no necesita mezclarse con la matriz antes de mancharse.
  2. Adquisición de datos
    1. Inserte la placa objetivo que contiene puntos de muestra secos en el instrumento MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (consulte la Tabla de materiales).
    2. Para la matriz DHB, ajuste la potencia del láser al 95%, seleccione Ganancia óptima automática del detector y Modo de movimiento del portador de muestra Inteligente - Muestra completa . Adquiera espectros de MS en el rango de 200 a 3200 m / z y agregue múltiples espectros de cada punto juntos para aumentar la relación señal-ruido del neuropéptido.
      NOTA: Optimice el porcentaje de potencia del láser, la ganancia del detector y seleccione el modo de movimiento portador de muestra apropiado para que cada adquisición cubra aproximadamente todo el punto y las adquisiciones posteriores no vayan a las posiciones anteriores.
    3. Calibrar el instrumento.
      NOTA: Ajuste el rango de masa para abarcar el rango de neuropéptidos deseado.
  3. Análisis de datos
    1. Abra el archivo MALDI-MS en el software de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales) y haga clic en Resta de línea base para el software utilizado aquí.
    2. Realice la selección máxima haciendo clic en Buscar lista de masas. Si hay muy pocos picos, edite la lista de masas manualmente seleccionando Editar lista de masas y haga clic en los picos del espectro para agregarlos a la lista de masas.
    3. Realice una coincidencia de masa precisa comparando la lista de masas con la base de datos de neuropéptidos que contiene valores [M + H] + m / z (± error de 200 ppm). 
      NOTA: Los aductos de sal comunes, como [M + K] +, [M + Na] + y [M + NH4] + , también deben incluirse en la lista de objetivos de coincidencia de masa precisa.
    4. Para verificar los picos identificados, genere una lista de m/z de interés y realice experimentos de MS/MS.

3. Análisis de imágenes MALDI-MS de neuropéptidos

  1. Preparación de muestras
    NOTA: Los pasos de incrustación y seccionamiento no son necesarios para los tejidos que son demasiado delgados para ser seccionados.
    1. Llene media taza de criostato con gelatina (37 °C, 100 mg/ml en agua desionizada) y deje que se solidifique a temperatura ambiente. Mantenga caliente la gelatina líquida sobrante en un baño de agua a 37 °C.
    2. Recoja el tejido neuronal deseado del animal y use fórceps para sumergir inmediatamente el tejido en un tubo de 0,6 ml que contiene agua desionizada durante 1 s.
      NOTA: Consulte el Paso 1.1.2 NOTA para la disección del tejido neuronal.
    3. Coloque el tejido sobre la gelatina sólida y llene el resto de la taza de criostato con gelatina líquida. Use fórceps para colocar el tejido.
    4. Coloque la copa de criostato sobre una superficie plana y congele con hielo seco.
      NOTA: Guarde las muestras a -80 °C hasta su uso (idealmente dentro de los 6 meses).
    5. Para la preparación de la sección, separe la muestra incrustada en gelatina del molde de criostato cortando el molde.
    6. Monte el tejido incrustado en un mandril criostato pipeteando una gota de 1 ml de agua desionizada sobre el mandril e inmediatamente presionando el tejido incrustado sobre la gota.
    7. Una vez congelado, pipetee más agua desionizada alrededor del tejido para asegurarlo aún más al mandril. Realice estos pasos dentro de la caja de criostatos (consulte la Tabla de materiales) establecida a -20 °C.
    8. Seccione el tejido a un grosor aproximado de una celda (8-20 μm dependiendo del tipo de muestra) y descongele monte cada sección en un portaobjetos recubierto de óxido de indio y estaño (ITO) colocando un lado de la diapositiva cerca de la sección y colocando un dedo en el otro lado de la diapositiva para calentar lentamente el vidrio y permitir que la sección se pegue a la diapositiva.
      NOTA: Las secciones de tejido también se pueden montar descongelando recogiendo un borde de la gelatina con pinzas (refrigerado a -20 ° C), colocándolo en el portaobjetos de vidrio recubierto de ITO y colocando un dedo en el otro lado del portaobjetos para calentar lentamente el vidrio y permitir que la sección se pegue al portaobjetos.
    9. Detecte la muestra que se utilizará como calibrante (consulte el paso 2.1.6 para conocer las opciones de calibrante) dibujando un pequeño círculo cerca de la sección de tejido con una pluma hidrofóbica y detectando el calibrante dentro del círculo.
    10. Marque cada esquina de la diapositiva con un lápiz blanco con una forma pequeña que contenga bordes afilados (es decir, x) para usarlos como puntos de enseñanza.
    11. Coloque la diapositiva de vidrio en la placa adaptadora de diapositiva MALDI y realice un escaneo óptico de imagen de alta resolución (≥2400 DPI) con un escáner.
    12. Matriz de pulverización en la sección de tejido con un pulverizador automático (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles e instrucciones sobre el pulverizador).
    13. Para MSI de neuropéptidos en tejidos de crustáceos use 40 mg / ml de DHB en 50% de metanol / 0.1% FA (v / v) como matriz, ajuste la temperatura de la boquilla a 80 ° C, la velocidad a 1,250 mm / min, la tasa de flujo a 0.1 mL / min, el número de pasadas a 12 y 30 s entre cada pasada para el pulverizador automático.
  2. Adquisición de datos
    1. Inserte la placa objetivo completamente seca que contiene secciones de tejido montadas en descongelación que se rociaron con la matriz.
    2. Configure los parámetros del archivo de adquisición de imágenes de MS para que el diámetro del láser sea menor que el tamaño del paso ráster.
    3. Cargue la imagen óptica escaneada y calibre la placa de muestra utilizando los x puntos de enseñanza. Defina las áreas de tejido de interés que se medirán ligeramente más grandes que la sección de tejido real para incluir también áreas que contengan solo matriz.
    4. Calibra el instrumento y adquiere espectros en el rango de 200 - 3200 m/z. Ajuste el rango de masa para abarcar el rango de neuropéptidos deseado.
  3. Análisis de datos
    1. Para procesar datos, importe el conjunto de datos de imágenes de MS en el software deseado, seleccione un algoritmo de eliminación de línea base y normalice los datos utilizando el recuento total de iones.
      NOTA: La selección de diferentes algoritmos de normalización, como la mediana, el valor del cuadrado medio raíz (RMS) o la intensidad de un valor de referencia m/z , probablemente cambiará la distribución espacial de muchos valores m/z . Elija el algoritmo de normalización más adecuado para los analitos deseados.
    2. Para generar una imagen para cada valor m/z de una lista teórica de picos, cargue un archivo de valores separados por comas (CSV) que contenga el neuropéptido [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, etc. Obtenga valores m/z haciendo clic en Archivo > Importar > lista de picos. Asigne un nombre a la lista de picos.
    3. Para estimar el umbral de error de ppm apropiado, primero identifique manualmente un pico de neuropéptido en el espectro de EM y compárelo con la masa teórica del neuropéptido. Calcule el error ppm y haga clic en Archivo > Propiedades del archivo > Ancho de intervalo e ingrese el error ppm.
    4. Seleccione la lista de picos en el menú desplegable y haga clic en Crear imágenes m/z para cada intervalo de la lista de picos.
    5. Guarde cada imagen m/z haciendo clic en Guardar captura de pantalla de cada imagen m/z.
      NOTA: La identificación de neuropéptidos putativos se puede realizar mediante la identificación de imágenes m / z donde la señal del analito solo se localiza dentro del tejido y no en la matriz circundante.
    6. Para verificar la identidad máxima, genere una lista de m/z de interés y realice experimentos de MS/MS.

4. Descubriendo nuevos neuropéptidos putativos utilizando la secuenciación de novo

  1. Realice los pasos 1.4.2 - 1.4.5.
  2. Exporte solo péptidos de novo.csv del software PEAKS con una puntuación media de confianza local (ALC) de ≥ 75.
    NOTA: Hay muchos programas disponibles para realizar secuenciación de novo , cada uno con sus propios algoritmos de puntuación y deben evaluarse en consecuencia.
  3. Busque en la lista de péptidos motivos de secuencia conocidos indicativos de neuropéptidos pertenecientes a familias específicas de neuropéptidos19.
    NOTA: Si bien los motivos se conservan comúnmente bien en todas las especies, los motivos buscados deben seleccionarse teniendo en cuenta el organismo de la muestra.

5. Minería del transcriptoma para secuencias de neuropéptidos predichas

NOTA: Este paso es opcional y solo se usa para agregar a una base de datos de neuropéptidos existente o crear una nueva base de datos de neuropéptidos.

  1. Elija una secuencia conocida de aminoácidos preprohormonas de interés y use tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
    _LOC=blasthome) para buscar la secuencia de preprohormonas de consulta en bases de datos que incluyen nr/nt, Refseq_genomes, EST y TSA.
    Nota : para buscar secuencias de consulta en la base de datos de proteínas, utilice BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. Seleccione el organismo objetivo (número de identificación fiscal) y cambie los parámetros del algoritmo Expect Threshold a 1000 para incluir alineaciones de puntuación baja.
    2. Ejecute el programa BLAST y luego verifique los resultados para obtener puntuaciones de homología altas entre las secuencias de consulta y de sujeto que producen alineaciones significativas. Guarde el archivo FASTA que contiene la secuencia de nucleótidos.
      NOTA: Si hay varias secuencias de sujetos con puntuaciones de homología similares, realice una alineación MAFFT para reducir las secuencias putativas20,21.
  2. Traduzca la secuencia de nucleótidos preprohormonas en secuencias de péptidos preprohormonas utilizando la herramienta Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). Para C. sapidus, seleccione Invertebrado mitocondrial para el código genético.
  3. Compruebe si hay secuencia de péptidos de señal y sitios de escisión de prohormonas en las secuencias de péptidos utilizando SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    NOTA: La homología con esquemas conocidos de procesamiento de preprohormonas también se puede utilizar para identificar los sitios de escisión de la prohormona. Si se desea, se pueden predecir posibles modificaciones post-traduccionales para péptidos señal. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) se puede utilizar para predecir el estado de sulfatación de los residuos de tirosina. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) se puede utilizar para predecir la conectividad del enlace disulfuro.

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Representative Results

El flujo de trabajo para la preparación de muestras y el análisis de EM se muestra en la Figura 1. Después de la disección del tejido neuronal, se realiza la homogeneización, extracción y desalinización para purificar muestras de neuropéptidos. Si se desea una cuantificación isotópica basada en etiquetas, las muestras se etiquetan y desalan una vez más. La muestra resultante se analiza a través de LC-MS/MS para la identificación y cuantificación de neuropéptidos.

Los neuropéptidos identificados a través del software de proteómica deben tener una buena cobertura de secuencia de fragmentación de péptidos, sin embargo, esto no está definido o estandarizado globalmente. Para la identificación absoluta, cada aminoácido debe producir un fragmento de ion que proporcione una identificación y localización inequívocas. Esto también debe compararse con un péptido sintetizado para confirmar la intensidad de cada fragmento de ion. Como el costo de realizar esto en cada identificación putativa no es factible, la identificación se describe comúnmente en función de la confianza donde más iones de fragmento observados aumentan la confianza en la identificación de péptidos. Mientras que la Figura 2A,B representa dos neuropéptidos que fueron identificados con una cobertura de secuencia del 100% y un error de masa bajo según lo definido por el límite máximo de 0.02 Da, la pobre cobertura de fragmentación (de solo tres iones) observada solo para el neuropéptido en la Figura 2B disminuye la confianza en la identificación de una isoforma específica. La Figura 2C muestra los cromatogramas iónicos extraídos (XIC), que es una gráfica que contiene la intensidad de la señal de un valor m/z seleccionado en función del tiempo de retención, de un neuropéptido detectado en dos muestras utilizadas para LFQ. Los tiempos de retención para el neuropéptido difieren ligeramente porque se identificó en dos tiradas separadas y consecutivas; sin embargo, la diferencia está dentro del valor umbral confiable de 1 min. Por lo tanto, la relación entre el área calculada por software bajo la curva del XIC se utiliza para el LFQ de este neuropéptido.

Para la cuantificación de neuropéptidos marcados con dimetilo, el espectro MS1 debe contener un pico en el valor teórico del neuropéptido m/z y un pico en el valor m/z con un desplazamiento de masa que se correlacione con la diferencia de masa entre los reactivos de etiquetado isotópico utilizados. En la Figura 2D, el desplazamiento de masa de esta muestra marcada con dimetilo 2-plex es de 4.025 Da. El área bajo la curva del ion precursor de sus XICs es calculada por el software y utilizada para calcular las relaciones de abundancia relativa. En la Tabla 1 se muestra una versión simplificada de la tabla de exportación del software proteómico que contiene neuropéptidos identificados y sus proporciones LFQ. Se obtienen resultados similares para los neuropéptidos marcados isotópicamente.

Los algoritmos de software permiten la secuenciación de novo de espectros para detectar nuevos neuropéptidos putativos. Al afirmar la detección de nuevos neuropéptidos putativos, las identificaciones de alta confianza son casos ideales en los que todos los aminoácidos se identifican y localizan sin ambigüedades, sobre la base de la observación de iones de fragmentos. La Figura 3 representa el espectro de un péptido secuenciado de novo que contiene el motivo -RYamide en el terminal C, un motivo de secuencia conservado compartido por neuropéptidos conocidos de la familia de crustáceos RYamide22. Se comparó un péptido de la base de datos con una cobertura de secuencia del 100%, todos los iones de fragmentos formadores de aminoácidos observados, un error de masa de iones de fragmento bajo según lo definido por el límite máximo de 0.02 Da y contenía un perfil de elución gaussiana. Estos resultados indican que se observó un péptido endógeno perteneciente a la familia de neuropéptidos crustáceo-RYamida.

Las mediciones puntuales de MALDI-MS pueden proporcionar identificaciones de neuropéptidos que son complementarias a la identificación LC-ESI-MS, así como ofrecer capacidades de mayor rendimiento. Después de extraer el homogeneizado de tejido crudo para neuropéptidos, desalinizar y etiquetar (si se desea), la muestra se puede mezclar con matriz y detectar en la placa diana de acero inoxidable MALDI, como se muestra en la Figura 4A. El pipeteo exitoso de puntos de muestra homogéneos produce picos claramente resueltos, especialmente dentro del espectro de calibración (Figura 4B). Cuando se utiliza un instrumento MALDI-TOF, el instrumento debe calibrarse al comienzo de cada experimento. Cualquier analito con masas conocidas se puede utilizar para calibrar el instrumento si está dentro del rango de masa deseado de la muestra. Aquí, el fósforo rojo se utiliza para la calibración de la masa de iones positivos del instrumento. Tiene ventajas sobre el uso de mezclas de calibración de péptidos debido a su estabilidad a temperatura ambiente, costo barato, picos abundantes debido a su polimerización, alta relación señal-ruido y no requiere una matriz para la ionización.

Para las imágenes MALDI-MS de neuropéptidos, el instrumento MALDI TOF/TOF utilizado requiere la calibración manual de la imagen de la diapositiva recubierta de ITO (paso 3.1.10) para correlacionar la imagen óptica con la muestra. El diagrama de la Figura 5 muestra la colocación adecuada de los puntos de mira blancos que se utilizarán como puntos de enseñanza para permitir que el instrumento correlacione la imagen óptica escaneada con la placa de muestra real. También ilustra las áreas de la diapositiva recubierta de ITO que el usuario debe evitar (es decir, no contienen muestra o matriz). Para la calibración de masa, la colocación del punto de muestra de calibración en relación con la muestra de tejido en la diapositiva recubierta de ITO afecta directamente el error de masa debido a la naturaleza inherente de los analizadores de masa de tiempo de vuelo, aunque la magnitud de este problema depende de la abundancia de los analitos objetivo. Una solución a este problema es verificar manualmente los picos de los espectros MS1 de diferentes secciones de tejido para detectar evidencia de desplazamiento de picos. Si hay un cambio máximo, considere agregar puntos de calibración de masa adicionales en la diapositiva recubierta de ITO justo al lado de cada sección de tejido. A partir de ahí, el usuario puede promediar los espectros de los puntos de calibración juntos o realizar imágenes de EM en una sección de tejido a la vez utilizando solo el punto de calibración más cercano a la sección de tejido. Después de recolectar la muestra, verifique que la señal de los valores de m / z correspondientes a los neuropéptidos solo se localice dentro de la región del tejido (Figura 6) antes de asignar una supuesta identificación de neuropéptidos.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo de preparación de muestras de neuropéptidos para el análisis de espectrometría de masas. Para el análisis de extracto tisular, el homogeneizado de tejido crudo se desala, se etiqueta con etiquetas isotópicas estables, se desala nuevamente y se analiza mediante EM. Para el análisis de imágenes, el tejido intacto se incrusta, se criosecciona, se aplica con matriz y se analiza mediante MALDI-MSI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Identificación y cuantificación realizada a través del software de proteómica. Los neuropéptidos se detectan a través de espectros de calidad de rango con (A) buena o (B) mala cobertura de fragmentación de MS2. El error de coincidencia de masa de iones de fragmento se muestra debajo de los espectros. (C) Las formas del perfil XIC y el tiempo de retención (RT) se pueden inspeccionar manualmente en busca de neuropéptidos cuantificados a través de LFQ. (D) Los espectros MS1 se utilizan para detectar y cuantificar neuropéptidos marcados con dimetilo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Secuenciación de novo para la detección de nuevos neuropéptidos. (A) El espectro MS2 de una supuesta nueva RYamide demuestra una buena cobertura de fragmentación con un bajo error de masa para cada fragmento. (B) Los iones de fragmento identificados se enumeran para su inspección manual. (C) El XIC del nuevo neuropéptido se inspecciona manualmente para determinar la forma del pico gaussiano. Abreviaturas: RT = tiempo de retención. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Puntos MALDI-MS y espectro de calibración. (A) La calidad de los espectros MS se basa en una distribución uniforme de matriz-péptido en el pozo objetivo de acero inoxidable MALDI. Los tres puntos de la izquierda son ejemplos de buenos puntos que tocan los bordes del grabado del pozo y los tres puntos de la derecha son ejemplos de puntos malos. Ambas manchas contienen α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) y una mezcla estándar de péptidos. (B) Espectro de calibración utilizando grupos de fósforo rojo de 500 a 3200 m/z. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Representación de la diapositiva de vidrio recubierta de ITO. (A) Esquema con áreas importantes señaladas: ubicaciones para colocar secciones de tejido (rectángulos azul claro), ubicaciones automáticas de puntos de enseñanza que deben evitarse (rectángulos rojos), ubicaciones de ejemplo de dónde se pueden dibujar los puntos de enseñanza (puntos de mira blancos) y donde los tornillos se unen a la placa adaptadora y deben evitarse (óvalos azul oscuro). (B) Foto de una diapositiva de vidrio que contiene dos secciones de tejido, un punto que contiene una mezcla de calibración y marcas de punto de mira. La ubicación de la sección de tejido y los puntos de calibración se delinean en el otro lado del portaobjetos de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Imágenes de EM de las glándulas sinusales de C. sapidus . Se muestran imágenes de distribución iónica de neuropéptidos [M+H]+ de (A) HL/IGSL/IYRamida (m/z 844.48), (B) NPYAFGLamida de tipo A de alitostatina o GGPYAFGLamida (m/z 780.40), (C) GQYAFGLamida de tipo A de alitostatina (m/z 754.39) y (D) RFamida GRNFLRFamida (m/z 908.52). Las imágenes se generan utilizando una ventana ± de 50 ppm a partir del valor teórico m/z . La barra de color indica el rango de intensidad de la señal de 0 a 100%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Búsqueda en bases de datos y resultados de la LFQ. Neuropéptidos identificados y cuantificados a través de LC-MS y software de proteómica. Los PTM identificados se enumeran junto con las intensidades de los péptidos detectados en ambas muestras para LFQ, junto con la relación LFQ resultante. Se enumeran las masas promedio y las descripciones de neuropéptidos observadas del archivo FASTA. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

La identificación, cuantificación y localización precisas de los neuropéptidos y péptidos endógenos que se encuentran en el sistema nervioso son cruciales para comprender su función23,24. La espectrometría de masas es una técnica poderosa que puede permitir que todo esto se logre, incluso en organismos sin un genoma completamente secuenciado. Se demuestra la capacidad de este protocolo para detectar, cuantificar y localizar neuropéptidos a partir de tejido recolectado de C. sapidus a través de una combinación de LC-ESI- y MALDI- MS.

Durante la preparación de la muestra para el análisis LC-ESI-MS, se deben tener en cuenta. Si bien la EM es una técnica sensible, la baja concentración peptídica del tejido neuronal (hasta el rango femtomolar25) plantea una seria limitación. Se requiere una cuidadosa preparación de la muestra no solo para eliminar los componentes de la matriz más abundantes e interferentes, como las proteínas y los lípidos, sino también para minimizar la pérdida de neuropéptidos en cada paso26,27. Por ejemplo, la pérdida de muestra se puede reducir mediante el uso de tubos de microcentrífuga que resisten la adsorción de péptidos. Dependiendo de la composición del tejido de interés, el uso de varios disolventes (para extracción o precipitación) o materiales de extracción en fase sólida se puede utilizar para separar biomoléculas con diferentes tamaños y propiedades químicas. Para garantizar que los péptidos hidrófilos o hidrófobos estén presentes en el extracto de neuropéptidos, se pueden usar opcionalmente múltiples sistemas de solventes de extracción para atacar neuropéptidos con diferentes propiedades fisicoquímicas. Estos, junto con el uso de inhibidores de la proteasa, pueden necesitar ser modificados para una purificación optimizada para mejorar la recuperación de neuropéptidos28. Los inconvenientes de usar múltiples sistemas de extracción son que varios tejidos neuronales deben agruparse para cumplir con un requisito general de mayor contenido de péptidos, así como una disminución del rendimiento. Muchos pasos, como la desalinización, el etiquetado isotópico y la inyección de EM, recomiendan ciertas cantidades iniciales de péptidos. Para la caracterización de muestras preciosas, como los neuropéptidos, generalmente se evitan los ensayos de péptidos para prevenir el consumo de péptidos extraños. Además, se desarrollaron ensayos de péptidos para determinar la concentración precisa de péptidos a partir de digestiones de proteínas, que tienen diferentes propiedades químicas que los péptidos endógenos. Para superar las complicaciones de la concentración desconocida de neuropéptidos, se puede realizar un ensayo inicial de péptidos utilizando extractos de tejido neuronal agrupados, donde los resultados se utilizan como estimación para todos los análisis posteriores, aunque debe tenerse en cuenta que se miden todos los péptidos en solución, y no todos estos son neuropéptidos29. Otras limitaciones de este método incluyen posibles sesgos a los neuropéptidos no polares e hidrofóbicos y la falta de conservación de la estructura nativa. Se pueden realizar modificaciones en las composiciones y materiales de los disolventes, como el uso de soluciones que son más hidrofóbicas u omitir el uso de disolventes orgánicos, para abordar esto.

Las mediciones de MALDI-MS se basan en pasos cuidadosos de preparación de muestras para obtener resultados consistentes y pueden tener diferentes consideraciones de muestra que para las mediciones de LC-ESI-MS. Pasos como mantener el extracto de neuropéptido en hielo antes del análisis de EM todavía se aplican. Los métodos adicionales para prevenir la degradación de neuropéptidos incluyen mantener portaobjetos de vidrio que contienen secciones de tejido montadas en deshielo en una caja desecante después de la disección para evitar que la condensación acumule30, aunque dejar la muestra de tejido en el desecador después de que se haya secado también puede resultar en la degradación de la muestra. Se sugiere colocar los portaobjetos de tejido en un desecador al vacío (presión final: 1x10-4 Torr a temperatura ambiente) durante 5-10 min inmediatamente antes de la aplicación de la matriz. Después de depositar la matriz en el portaobjetos de tejido, se puede mantener en el refrigerador o congelador durante la noche y secarse en el desecador al vacío antes de la medición de imágenes MALDI-MS. Para las mediciones puntuales de MALDI, la estructura cristalina del péptido de matriz no está distribuida equitativamente en todo el objetivo maldi, incluso si así lo parece. Hay formas de mitigar las variaciones de los espectros de masas de las réplicas técnicas debido a este proceso. Primero, adquiera un espectro promedio de cada pozo utilizando múltiples disparos láser (generalmente cientos a miles) donde el láser se rastra aleatoriamente a través del pozo (es decir, seleccionando el movimiento del portador de muestra SMART o aleatorio en los parámetros del instrumento). Adquiera al menos cinco réplicas técnicas para cada tipo de muestra y seleccione tres réplicas técnicas donde la variación en la intensidad de la señal para los picos deseados sea la más baja. La compensación aquí es el rendimiento experimental. Es necesario mantener parámetros como el número de disparos láser, el diámetro del láser y otros ajustes del instrumento consistentes para todos los espectros adquiridos. Idealmente, todas las réplicas técnicas y biológicas se analizan al mismo tiempo utilizando la misma solución de matriz y calibración del instrumento. La identificación de neuropéptidos se puede realizar mediante la coincidencia precisa de la masa a una lista de picos que contiene valores teóricos de [M + H] +, [M + Na]+, [M + NH4] +, [M + K] + y otros aductos de sal que producen valores de iones m / z cargados individualmente. La normalización de los datos es fundamental para minimizar los artefactos sistemáticos de los experimentos MALDI-MS. La evaluación de la reproducibilidad es especialmente importante cuando las mediciones puntuales de MALDI-MS se utilizan para la cuantificación de neuropéptidos mediante el etiquetado de isótopos estables (SIL). La calidad de la preparación de la muestra y la adquisición de datos se puede evaluar tomando un péptido estándar o extracto de neuropéptido, dividiéndolo en dos alícuotas iguales, etiquetando diferencialmente cada muestra por SIL y analizando la muestra para garantizar que la intensidad relativa de los picos emparejados sea 1: 1. La variación reportada a partir de esas proporciones se puede utilizar para estimar el nivel de varianza en el experimento general atribuido al error del usuario.

Es importante tener en cuenta que MALDI-MS también es capaz de proporcionar información secuencial y cuantitativa; sin embargo, los iones cargados individualmente producidos por MALDI limitan la detección de fragmentos de péptidos, lo que dificulta la obtención de la secuencia completa e inhibe los métodos de cuantificación discutidos para LC-ESI-MS. En cualquier caso, MALDI-MS es una modalidad atractiva debido a su capacidad para un alto rendimiento, así como una mayor tolerancia a sales e impurezas dentro de la muestra 12,31. Además, las imágenes MALDI-MS tienen ventajas sobre otras técnicas de imagen convencionales que requieren anticuerpos. En la mayoría de las modalidades de EM, la reducción de la resolución de masa aumentará la sensibilidad, lo que permitirá una mejor detección de neuropéptidos de baja abundancia. Esta estrategia puede ser más práctica para los instrumentos MALDI-TOF/TOF que para los instrumentos LC-ESI-MS debido a la facilidad de calibrar el instrumento MALDI para cada experimento. Otra forma en que MALDI puede ser ventajoso para la neuropeptidómica es a través del promedio de espectros. Por lo general, el promedio de espectros de las mediciones LC-ESI-MS no se utiliza porque niega los beneficios de la separación LC; por lo tanto, se confía en gran medida en el software de bioinformática para identificar neuropéptidos y las identificaciones se verifican manualmente. Sin embargo, hay menos consecuencias para promediar los espectros de las mediciones de MALDI-MS porque no hubo separación inicial; por lo tanto, los datos sin procesar son más pequeños y más fáciles de peinar manualmente para un usuario. La facilidad de gestión de datos es importante, ya que cambia el orden en que el usuario puede abordar las estrategias de identificación y verificación de neuropéptidos. Si bien la confianza en las identificaciones de neuropéptidos de LC-ESI-MS podría beneficiarse de aumentar el nivel de rigurosidad del umbral dentro del software de análisis de datos, es menos probable que esta estrategia beneficie a las identificaciones de MALDI-MS. En el ejemplo de los neuropéptidos de crustáceos, el hecho de que haya menos de 1000 entradas de la base de datos construida en laboratorio (es decir, un máximo de <1000 picos espectrales o imágenes de MS para escanear manualmente), permite filtrar primero los datos de MALDI-MS con un umbral de error de masa generoso, y luego verificar manualmente esas identificaciones examinando las envolturas isotópicas a nivel MS1, así como otros métodos de verificación examinados en la sección de Resultados Representativos. El popular software de análisis de datos de imágenes de EM puede realizar una coincidencia de masa precisa con una base de datos de masa de neuropéptidos y extraer las imágenes de EM correspondientes. Para preguntas de investigación basadas en la clínica, como el descubrimiento de biomarcadores, estos software pueden extraer valores m/z únicos de una región tisular de interés (generalmente llamado análisis de región de interés (ROI)32 y realizar pruebas estadísticas para cuantificar qué tan diferentes son dos regiones tisulares. También vale la pena señalar que también hay menos opciones de software de análisis de datos para imágenes de EM que para LC-ESI-MS.

Realizar búsquedas de neuropéptidos en la base de datos LC-ESI-MS comúnmente implica el uso de algoritmos de software construidos para el análisis de péptidos digeridos. Como tal, existen limitaciones para que el software pueda realizar búsquedas en bases de datos de enzimas no específicas o la cantidad de tiempo que lleva completar la búsqueda. Actualmente, las búsquedas de péptidos endógenos se realizan con el número máximo de escisiones perdidas, pero este número sigue siendo limitado, lo que lleva a identificaciones potencialmente perdidas. Cuando el genoma de una especie no está completamente secuenciado, como con C. sapidus, se puede realizar una secuenciación de novo para identificar neuropéptidos desconocidos / nuevos a través de motivos de secuencia de neuropéptidos conservados conocidos, aunque este método no identifica neuropéptidos que tienen motivos desconocidos o que no contienen los motivos utilizados como identificadores de familia de neuropéptidos19. Por ejemplo, WSSMRGAWamide es un motivo para la familia de neuropéptidos de tipo B de alitostatina19. Aquí radica la importancia de la minería del transcriptoma para secuencias de neuropéptidos predichas para especies sin una secuencia del genoma completamente decodificada33. Las identificaciones de neuropéptidos se confirman sintetizando la secuencia de péptidos putativos y comparando los espectros MS/MS a partir de péptidos sintéticos y tejido biológico34. Incluso después de que se verifica una secuencia, a veces se desconoce si se trata de la secuencia completa de neuropéptidos o de un producto de degradación. Vale la pena señalar que las diferencias entre maldi y las fuentes de ionización ESI-MS (ESI es un método de ionización más suave que MALDI) pueden dar lugar a diferentes tasas de degradación artificial (es decir, fragmentación en la fuente). Para distinguir entre una versión truncada de un péptido de un producto de degradación inducido artificialmente (es decir, no in vivo), se debe conocer la vía de procesamiento de preprohormonas para ese neuropéptido. Dado que este no es a menudo el caso, una forma sintética del péptido debe usarse en ensayos fisiológicos y verificarse para la actividad biológica.

En general, el flujo de trabajo ejemplificado aquí para el análisis de neuropéptidos puede beneficiar a una variedad de campos diferentes. Llena un vacío técnico dentro del análisis de péptidos de EM de medio hacia abajo porque está optimizado para péptidos endógenos que son más pequeños que las proteínas típicamente analizadas por análisis de EM de abajo hacia arriba o de arriba hacia abajo. Por lo tanto, los métodos de preparación de muestras utilizados por los neuropeptidómicos deben ser en gran medida traducibles a otros péptidos endógenos bioactivos, como los dirigidos por los químicos medicinales para las propiedades antibacterianas35. Un beneficio de este protocolo es que utiliza instrumentos comunes de proveedores populares que también ofrecen un grado adicional de traducibilidad. De esta manera, el flujo de trabajo se puede utilizar en entornos académicos y comerciales, como la detección de candidatos a medicamentos farmacéuticos u objetivos farmacológicos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias (CHE-1710140 y CHE-2108223) y los Institutos Nacionales de Salud (NIH) a través de la subvención R01DK071801. A.P. fue apoyado en parte por la Beca de Capacitación de Interfaz Química-Biología de los NIH (T32 GM008505). N.V.Q. fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud, bajo el Premio del Servicio Nacional de Investigación Ruth L. Kirschstein del Instituto Nacional de Corazón, Pulmón y Sangre al Centro de Investigación Cardiovascular de la Universidad de Wisconsin-Madison (T32 HL007936). L.L. desea reconocer las subvenciones de los NIH R56 MH110215, S10RR029531 y S10OD025084, así como el apoyo financiero de una Cátedra vilas distinguished Achievement y una cátedra Charles Melbourne Johnson con fondos proporcionados por la Fundación de Investigación de Ex Alumnos de Wisconsin y la Facultad de Farmacia de la Universidad de Wisconsin-Madison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix Supelco 39319
Acetic acid Fisher Chemical A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A955-500
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
Borane pyridine Sigma-Aldrich 179752
Bruker peptide calibration mix Bruker Daltonics NC9846988
Capillary Polymicro 1068150019 to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup Sigma-Aldrich E6032 any cup or mold should work
 Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30108434
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde - D2 Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Optima LC/MS grade Fisher Chemical A117-50
Gelatin Difco 214340 place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen Vector Labs 15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides Delta Technologies CB-90IN-S107 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials Thermo TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade Fisher Chemical A456-500
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 Hydrophobic film
pH-Indicator strips Supelco 109450
Red phosphorus clusters Sigma-Aldrich 343242
Reversed phase C18 material Waters 186002350 manually packed into nanoflow column
Wite-out pen BIC 150810
ZipTip Millipore Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5 HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R Eppendorf 05-401-205
Cryostat- HM 550 Thermo Fisher Scientific 956564A
Desiccant Drierite 2088701
Forceps WPI 501764
MALDI stainless steel target plate Bruker Daltonics 8280781
Pipet-Lite XLS Rainin 17014391 200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100 Savant SVC-100D
Ultrasonic Cleaner Bransonic 2510R-MTH for sonication
Ultrasonic homogenizer Fisher Scientific FB120110 FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A Ideal Vacuum Products P10976 ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer Corning 6775
Water bath (37C) - Isotemp 110 Fisher Scientific 15-460-10
Data Analysis Software
Expasy https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis Bruker Daltonics
FlexControl Bruker Daltonics
FlexImaging Bruker Daltonics
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab https://scils.de/
SignalP 5.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMS=tblastn&PAGE_
TYPE=BlastSearch&SHOW_
DEFAULTS=on&LINK_LOC
=blasthome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Química Número 183 neuropéptido espectrometría de masas purificación de péptidos etiquetado isotópico secuenciación de novo cuantificación LC MALDI imágenes de espectrometría de masas búsqueda en bases de datos minería de transcriptomas
Investigación espectrométrica de masas multifacética de neuropéptidos en <em>Callinectes sapidus</em>
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Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus. J. Vis. Exp. (183), e63322, doi:10.3791/63322 (2022).

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