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Chemistry

कैलिनेक्ट्स सैपिडस में न्यूरोपेप्टाइड्स की बहुआयामी मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक जांच

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/63322
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison
* These authors contributed equally

Summary

न्यूरोपेप्टाइड्स के मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक लक्षण वर्णन अनुक्रम, मात्रा और स्थानीयकरण जानकारी प्रदान करता है। यह अनुकूलित वर्कफ़्लो न केवल न्यूरोपेप्टाइड अध्ययनों के लिए उपयोगी है, बल्कि अन्य अंतर्जात पेप्टाइड्स के लिए भी उपयोगी है। यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल नमूना तैयारी, एमएस अधिग्रहण, एमएस विश्लेषण, और एलसी-ईएसआई-एमएस, मालडी-एमएस स्पॉटिंग और मालडी-एमएस इमेजिंग का उपयोग करके न्यूरोपेप्टाइड्स के डेटाबेस उत्पादन का वर्णन करते हैं।

Abstract

न्यूरोपेप्टाइड्स सिग्नलिंग अणु हैं जो लगभग सभी शारीरिक और व्यवहारिक प्रक्रियाओं को विनियमित करते हैं, जैसे कि विकास, प्रजनन, भोजन का सेवन, और बाहरी तनावों की प्रतिक्रिया। फिर भी, जैव रासायनिक तंत्र और न्यूरोपेप्टाइड्स के पूर्ण पूरक और उनकी कार्यात्मक भूमिकाओं को खराब तरीके से समझा जाता है। इन अंतर्जात पेप्टाइड्स के लक्षण वर्णन सिग्नलिंग अणुओं के इस वर्ग के भीतर विशाल विविधता से बाधित है। इसके अतिरिक्त, न्यूरोपेप्टाइड्स सांद्रता में बायोएक्टिव होते हैं 100x - न्यूरोट्रांसमीटर की तुलना में 1000x कम और सिनैप्टिक रिलीज के बाद एंजाइमेटिक गिरावट के लिए प्रवण होते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) एक अत्यधिक संवेदनशील विश्लेषणात्मक उपकरण है जो व्यापक रूप से एक प्राथमिकता ज्ञान के बिना एनालिस्ट की पहचान, मात्रा निर्धारित और स्थानीयकरण कर सकता है। यह विश्व स्तर पर प्रोफाइलिंग न्यूरोपेप्टाइड्स और उपन्यास पेप्टाइड्स की खोज में सहायता करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। पेप्टाइड्स के इस वर्ग की कम बहुतायत और उच्च रासायनिक विविधता के कारण, कई नमूना तैयारी विधियों, एमएस अधिग्रहण मापदंडों और डेटा विश्लेषण रणनीतियों को इष्टतम न्यूरोपेप्टाइड लक्षण वर्णन की अनुमति देने के लिए प्रोटिओमिक्स तकनीकों से अनुकूलित किया गया है। यहां, तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) -एमएस और मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption / ionization (MALDI) -MS का उपयोग करके अनुक्रम लक्षण वर्णन, मात्रा और स्थानीयकरण के लिए जटिल जैविक ऊतकों से न्यूरोपेप्टाइड्स को अलग करने के लिए विधियों का वर्णन किया गया है। नीले केकड़े से एक न्यूरोपेप्टाइड डेटाबेस तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल, कैलिनेक्ट्स सैपिडस, व्यापक जीनोमिक जानकारी के बिना एक जीव, शामिल है। इन वर्कफ़्लोज़ को विभिन्न प्रकार के उपकरणों का उपयोग करके विभिन्न प्रजातियों में अंतर्जात पेप्टाइड्स के अन्य वर्गों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

तंत्रिका तंत्र जटिल है और एक जीव में संकेतों को प्रसारित करने के लिए न्यूरॉन्स के एक नेटवर्क की आवश्यकता होती है। तंत्रिका तंत्र संवेदी जानकारी और जैविक प्रतिक्रिया का समन्वय करता है। सिग्नल ट्रांसमिशन में शामिल जटिल और जटिल इंटरैक्शन को न्यूरोट्रांसमीटर, स्टेरॉयड और न्यूरोपेप्टाइड्स जैसे कई अलग-अलग सिग्नलिंग अणुओं की आवश्यकता होती है। चूंकि न्यूरोपेप्टाइड्स सबसे विविध और शक्तिशाली सिग्नलिंग अणु हैं जो तनाव और अन्य उत्तेजनाओं के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, इसलिए इन शारीरिक प्रक्रियाओं में उनकी विशिष्ट भूमिका निर्धारित करना दिलचस्पी है। न्यूरोपेप्टाइड फ़ंक्शन उनकी अमीनो एसिड संरचना से संबंधित है, जो गतिशीलता, रिसेप्टर इंटरैक्शन और आत्मीयता1 को निर्धारित करता है। हिस्टोकेमिस्ट्री जैसी तकनीकें, जो महत्वपूर्ण हैं क्योंकि न्यूरोपेप्टाइड्स को ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों में संश्लेषित, संग्रहीत और जारी किया जा सकता है, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी को न्यूरोपेप्टाइड संरचना और फ़ंक्शन 2,3,4 की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है, लेकिन ये विधियां न्यूरोपेप्टाइड्स की विशाल अनुक्रम विविधता को हल करने के लिए थ्रूपुट और विशिष्टता द्वारा सीमित हैं।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) न्यूरोपेप्टाइड संरचना और बहुतायत के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण को सक्षम बनाता है। यह विभिन्न एमएस तकनीकों के माध्यम से किया जा सकता है, सबसे अधिक तरल क्रोमैटोग्राफी-इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण एमएस (एलसी-ईएसआई-एमएस) 5 और मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption / ionization MS (MALDI-MS)6। उच्च सटीकता द्रव्यमान माप और एमएस विखंडन का उपयोग करते हुए, एमएस अपने कार्य 7,8 का पता लगाने में सहायता करने के लिए एक प्राथमिकता ज्ञान के बिना जटिल मिश्रण से न्यूरोपेप्टाइड्स को अमीनो एसिड अनुक्रम और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) की स्थिति असाइन करने की क्षमता प्रदान करता है। गुणात्मक जानकारी के अलावा, एमएस लेबल-मुक्त मात्रा (एलएफक्यू) या लेबल-आधारित विधियों जैसे आइसोटोपिक या आइसोबेरिक लेबलिंग9 के माध्यम से न्यूरोपेप्टाइड्स की मात्रात्मक जानकारी को सक्षम बनाता है। एलएफक्यू के मुख्य लाभों में इसकी सादगी, विश्लेषण की कम लागत और नमूना तैयारी के कदम कम हो गए हैं जो नमूना हानि को कम कर सकते हैं। हालांकि, LFQ के नुकसान में बढ़ी हुई साधन समय लागत शामिल है क्योंकि इसे रन-टू-रन परिवर्तनशीलता से मात्रात्मक त्रुटि को संबोधित करने के लिए कई तकनीकी प्रतिकृतियों की आवश्यकता होती है। यह छोटे बदलावों को सही ढंग से मापने की क्षमता में कमी की ओर भी जाता है। लेबल-आधारित विधियों को कम व्यवस्थित भिन्नता के अधीन किया जाता है क्योंकि कई नमूनों को विभिन्न प्रकार के स्थिर आइसोटोप का उपयोग करके अलग-अलग लेबल किया जा सकता है, एक नमूने में संयुक्त किया जा सकता है, और एक साथ मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है। यह थ्रूपुट को भी बढ़ाता है, हालांकि आइसोटोपिक लेबल संश्लेषित करने या खरीदने के लिए समय लेने वाला और महंगा हो सकता है। पूर्ण स्कैन मास स्पेक्ट्रा (एमएस 1) वर्णक्रमीय जटिलता भी बढ़ जाती है क्योंकि मल्टीप्लेक्सिंग बढ़ जाती है, जो अद्वितीय न्यूरोपेप्टाइड्स की संख्या को कम कर देती है जो खंडित होने में सक्षम होती है और इसलिए, पहचानकी जाती है। इसके विपरीत, आइसोबेरिक लेबलिंग एमएस 1 स्तर पर वर्णक्रमीय जटिलता को नहीं बढ़ाता है, हालांकि यह न्यूरोपेप्टाइड्स जैसे कम बहुतायत वाले एनालिस्ट के लिए चुनौतियों का परिचय देता है। जैसा कि आइसोबेरिक मात्रा टुकड़ा आयन द्रव्यमान स्पेक्ट्रा (एमएस 2) स्तर पर किया जाता है, कम-बहुतायत वाले न्यूरोपेप्टाइड्स को परिमाणित करने में असमर्थ हो सकता है क्योंकि विखंडन के लिए अधिक प्रचुर मात्रा में मैट्रिक्स घटकों का चयन किया जा सकता है और चयनित लोगों में परिमाणित करने के लिए उच्च पर्याप्त बहुतायत नहीं हो सकती है। आइसोटोपिक लेबलिंग के साथ, प्रत्येक पहचाने गए पेप्टाइड पर मात्रा का प्रदर्शन किया जा सकता है।

पहचान और परिमाणीकरण के अलावा, स्थानीयकरण जानकारी एमएस द्वारा MALDI-MS इमेजिंग (MALDI-MSI)10 के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है। एक नमूना सतह पर एक लेजर rastering द्वारा, एमएस स्पेक्ट्रा प्रत्येक m / z मान के लिए एक गर्मी मानचित्र छवि में संकलित किया जा सकता है। परिस्थितियों में विभिन्न क्षेत्रों में क्षणिक न्यूरोपेप्टाइड सिग्नल तीव्रता का मानचित्रण कार्य निर्धारण11 के लिए मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकता है। न्यूरोपेप्टाइड्स का स्थानीयकरण विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि न्यूरोपेप्टाइड फ़ंक्शन स्थान12 के आधार पर भिन्न हो सकता है।

न्यूरोपेप्टाइड्स अन्य सिग्नलिंग अणुओं की तुलना में विवो में कम बहुतायत में पाए जाते हैं, जैसे कि न्यूरोट्रांसमीटर, और इस प्रकार पता लगाने के लिए संवेदनशील तरीकों की आवश्यकता होतीहै 13। यह उच्च बहुतायत मैट्रिक्स घटकों को हटाने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, जैसे लिपिड11,14। सामान्य प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो की तुलना में न्यूरोपेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए अतिरिक्त विचार किए जाने की आवश्यकता होती है, मुख्य रूप से क्योंकि अधिकांश न्यूरोपेप्टिडोमिक विश्लेषण एंजाइमेटिक पाचन को छोड़ देते हैं। यह न्यूरोपेप्टाइड डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर विकल्पों को सीमित करता है क्योंकि अधिकांश को पेप्टाइड डिटेक्शन द्वारा सूचित प्रोटिओमिक्स डेटा और प्रोटीन मैचों के आधार पर एल्गोरिदम के साथ बनाया गया था। हालांकि, कई सॉफ़्टवेयर जैसे PEAKS15 उनकी डे नोवो अनुक्रमण क्षमताओं के कारण न्यूरोपेप्टाइड विश्लेषण के लिए अधिक अनुकूल है। निष्कर्षण विधि से एमएस डेटा विश्लेषण तक शुरू होने वाले न्यूरोपेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए कई कारकों पर विचार करने की आवश्यकता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल में नमूना तैयारी और डाइमिथाइल आइसोटोपिक लेबलिंग, डेटा अधिग्रहण, और एलसी-ईएसआई-एमएस, मालडी-एमएस और मालडी-एमएसआई द्वारा न्यूरोपेप्टाइड्स के डेटा विश्लेषण के लिए तरीके शामिल हैं। कई प्रयोगों के प्रतिनिधि परिणामों के माध्यम से, नीले केकड़ों, कैलिनेक्ट्स सैपिडस से न्यूरोपेप्टाइड्स की पहचान करने, मात्रा निर्धारित करने और स्थानीयकरण करने के लिए इन तरीकों की उपयोगिता और क्षमता का प्रदर्शन किया जाता है। तंत्रिका तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, मॉडल सिस्टम आमतौर पर उपयोग किए जाते हैं। कई जीवों में पूरी तरह से अनुक्रमित जीनोम उपलब्ध नहीं होता है, जो पेप्टाइड स्तर पर व्यापक न्यूरोपेप्टाइड खोज को रोकता है। इस चुनौती को कम करने के लिए, पूर्ण जीनोम जानकारी के बिना जीवों के लिए डेटाबेस उत्पन्न करने के लिए उपन्यास न्यूरोपेप्टाइड्स और ट्रांसक्रिप्टोम खनन की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है। यहां प्रस्तुत सभी प्रोटोकॉल को किसी भी प्रजाति से न्यूरोपेप्टाइड नमूनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, साथ ही साथ किसी भी अंतर्जात पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

वर्णित सभी ऊतक नमूने विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय के दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए थे।

1. न्यूरोपेप्टाइड्स के एलसी-ईएसआई-एमएस विश्लेषण

  1. न्यूरोपेप्टाइड निष्कर्षण और desalting
    1. ऊतक अधिग्रहण से पहले, अम्लीकृत मेथनॉल (acMeOH) (90: 9: 1 MeOH: पानी: एसिटिक एसिड) तैयार करें जैसा कि16 में वर्णित है।
    2. क्रस्टेशियन 17 से मस्तिष्क केऊतकों को इकट्ठा करें और तुरंत acMeOH के 20 μL युक्त 0.6 mL ट्यूब में प्रत्येक में एक ऊतक रखने के लिए संदंश का उपयोग करें।
      नोट: ऊतक विच्छेदन प्रोटोकॉल विभिन्न जानवरों और विभिन्न ऊतक प्रकारों के लिए बहुत भिन्न होते हैं। पाठक को एक विस्तृत विवरण के लिए प्रोटोकॉल17 के लिए संदर्भित किया जाता है कि क्रस्टेशियन से मस्तिष्क के ऊतकों और कई अन्य ऊतक प्रकारों को कैसे विच्छेदित किया जाए। नमूनों को उपयोग करने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (आदर्श रूप से 6 महीने के भीतर)। वर्णित खंडों का उपयोग कैलिनेक्ट्स सैपिडस से एक मस्तिष्क के लिए किया जाता है। मात्रा ऊतक के आकार के लिए स्केल किया जाना चाहिए। ऊतक को विलायक के बिना तुरंत जमे हुए फ्लैश किया जा सकता है, हालांकि इसकी सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि अंतर्जात प्रोटियोलिटिक एंजाइमों को बाधित नहीं किया जाएगा और सक्रिय रहेगा, हालांकि ठंड लगने पर धीमी दर पर।
    3. नमूने के लिए acMeOH के 150 μL जोड़ें। कुल sonication समय 24 s के लिए सेट, 8 s के लिए नाड़ी समय, 15 s के लिए समय रोकें, और आयाम एक अल्ट्रासोनिक homogenizer पर 50% करने के लिए और बर्फ पर नमूनों homogenize.
      नोट: वहाँ विभिन्न homogenization सिस्टम उपलब्ध हैं। नमूना प्रकार और उपकरण के अनुसार सेटिंग्स और शर्तों को समायोजित करें।
    4. 20 मिनट के लिए 20,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। एक पिपेट के साथ, एक ट्यूब में supernatant हस्तांतरण और यह एक वैक्यूम सांद्रक (266 x g, 1 x 10-4 Torr) में लगभग 35 डिग्री सेल्सियस पर सूखी.
      नोट: सूखे नमूनों को उपयोग करने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (आदर्श रूप से 6 महीने के भीतर)। वैक्यूम कंसंट्रेटर को गर्म करना सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। जबकि गर्मी शुष्क समय को कम करती है, पेप्टाइड गिरावट को कम करने के लिए सभी तरल के वाष्पित होने के तुरंत बाद नमूने को कंसंट्रेटर से हटा दिया जाना चाहिए। इससे बचने के लिए, हीटिंग को इस और बाद के सभी चरणों से छोड़ा जा सकता है।
    5. desalting के लिए, 0.1% फार्मिक एसिड (एफए), भंवर अच्छी तरह से के 20 μL में निकाले गए ऊतक के नमूने का पुनर्गठन, और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक पानी के स्नान में sonicate.
      नोट: वहाँ विभिन्न desalting सामग्री उपलब्ध हैं. राल पहचान और neuropeptide राशि के अनुसार समाधान और मात्रा को समायोजित करें। कुल पेप्टाइड राशि का अनुमान एक वाणिज्यिक पेप्टाइड मात्रा परख का उपयोग करके लगाया जा सकता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. एक पीएच पट्टी के लिए नमूना के 0.5 μL लागू करने के लिए पुष्टि करें कि पीएच 4 <. यदि पीएच अधिक है, तो पीएच < 4 तक 10% एफए के 1 μL ऐलीकोट जोड़ें।
    7. 18 desalting के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें। 50% एसिटोनिट्राइल (एसीएन) के 100 μL, 0.1% FA के 100 μL युक्त संतुलन समाधान, 0.1% FA के 100 μL वाले वॉश समाधान, और 25% ACN/ 0.1% FA के 20 μL, 50% ACN/ 0.1% FA के 20 μL, और 75% ACN/ 0.1% FA के 20 μL युक्त एक गीला समाधान तैयार करें।
    8. C18 राल के साथ एक 10 μL desalting टिप प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    9. desalting टिप एक 20 μL पिपेट है कि 15 μL करने के लिए सेट किया गया है पर रखें। एक बार जब desalting टिप गीला है, तो हवा को पिपेट को उदास रखने से रोकें जब तक कि समाधान से बाहर न हो जाए जब तक कि इसे छोड़ नहीं दिया जाएगा।
    10. गीला समाधान के साथ टिप 3x और संतुलन समाधान के साथ 3x aspirate. नमूना 10x में aspirate धोने के समाधान में 3x धोने के बाद, प्रत्येक धोने को त्यागने. एसीएन बढ़ाने के क्रम में क्षालन समाधानों में से प्रत्येक में एस्पिरेटिंग 10x द्वारा elute.
      नोट: क्षालन अंशों को आगे के विश्लेषण के लिए अलग या संयुक्त रखा जा सकता है।
    11. उपयोग किए गए डिसाल्टिंग टिप को छोड़ दें और लगभग 35 डिग्री सेल्सियस पर एक वैक्यूम कंसंट्रेटर (266 x g, 1 x 10-4 Torr) में एल्यूटेड न्यूरोपेप्टाइड्स को सूखा दें।
      नोट: यह उपयोग करने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (आदर्श रूप से 6 महीने के भीतर)।
  2. ऊतक निकालने में न्यूरोपेप्टाइड्स का आइसोटोपिक लेबलिंग
    नोट:: यह चरण वैकल्पिक है और केवल जब परिमाणीकरण वांछित है उपयोग किया जाता है।
    1. एक धुएं के हुड में 2-plex आइसोटोपिक डाइमिथाइल लेबलिंग समाधान तैयार करें: 1% CH2OH2 (486.5 μL पानी में पानी के घोल में स्टॉक 37 वजन / वजन प्रतिशत (wt. %) का 13.5 μL), 1% CH2OD2 (स्टॉक 20 wt. % समाधान का 25 μL पानी के 475 μL में), और 0.03 M बोराने पाइरिडिन (3.75 μL स्टॉक 8 M समाधान का 996.5 μL पानी का)।
      सावधानी: फॉर्मेल्डिहाइड विषाक्त है, इसलिए सभी समाधानों को हवादार हुड में रखा जाना चाहिए। दस्ताने, एक प्रयोगशाला कोट, आंखों की सुरक्षा, और अभेद्य जूते पहनें। इस सामग्री के साथ काम करते समय संपर्क लेंस नहीं पहने जाने चाहिए।
      नोट: विभिन्न आइसोटोपिक अभिकर्मक हैं; नमूना प्रकार और वांछित लेबलिंग चैनलों की संख्या के आधार पर उपयुक्त लोगों का चयन करें।
    2. पानी के 10 μL में कच्चे neuropeptide निकालने भंग और 10 मिनट के लिए sonicate.
    3. मात्रात्मक रूप से मापे जाने वाले प्रत्येक अलग-अलग प्रयोगात्मक स्थिति में एक अलग आइसोटोपिक फॉर्मेल्डिहाइड समाधान (यानी, CH2OH2, CH2OD2, आदि) के 10 μL जोड़ें। भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और संक्षेप में 2,000 x जी पर प्रत्येक नमूने centrifuge.
    4. प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए 0.03 एम बोरेन pyridine के 10 μL जोड़ें। भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और संक्षेप में 2,000 x जी पर प्रत्येक नमूने centrifuge.
    5. एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    6. पानी के स्नान से नमूनों को निकालें और 100 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट के 10 μL जोड़ें। भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और संक्षेप में 2,000 x जी पर प्रत्येक नमूने centrifuge.
    7. एक 2-plex नमूने के लिए लेबल किए गए नमूनों को संयोजित करें और लगभग 35 डिग्री सेल्सियस पर एक वैक्यूम कंसंट्रेटर (266 x g, 1 x 10-4 Torr) में न्यूरोपेप्टाइड्स को सूखा दें।
    8. 1.1.5 - 1.1.10 चरणों को फिर से निष्पादित करके लेबल किए गए न्यूरोपेप्टाइड्स को डीसॉल्ट करें और डेटा अधिग्रहण के लिए तैयार होने तक उन्हें स्टोर करें।
  3. डेटा अधिग्रहण
    1. 3% एसीएन / 0.1% एफए के 12 μL में सूखे desalted neuropeptides का पुनर्गठन, भंवर अच्छी तरह से, 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में sonicate, और 2,000 x g पर संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज। Autosampler शीशियों में प्रत्येक नमूने को स्थानांतरित करें।
      नोट: प्रति μL ~ 1 μg पेप्टाइड की सांद्रता के लिए न्यूरोपेप्टाइड राशि के अनुसार नमूना मात्रा को समायोजित करें। कुल पेप्टाइड राशि का अनुमान एक वाणिज्यिक पेप्टाइड मात्रा परख का उपयोग करके लगाया जा सकता है ( सामग्री की तालिका देखें) ।
    2. एक उच्च रिज़ॉल्यूशन नैनो-एलसी-एमएस / एमएस उपकरण में नमूने के 1 μL को इंजेक्ट करने के लिए एक ऑटोसैम्पलर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. मोबाइल चरण A के रूप में पानी में 0.1% FA और एसीएन में 0.1% FA के साथ मोबाइल चरण B के रूप में 0.1% FA के साथ नमूना चलाने के लिए लगभग 15 सेमी लंबे उलट-चरण (RP) C18 कॉलम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। 11 मिनट से अधिक के लिए 300 nL / मिनट की दर से B के 3% - 95% की ढाल के साथ नमूने चलाएं।
    4. यहां उपयोग किए जाने वाले एमएस उपकरण के लिए, स्प्रे वोल्टेज के लिए 2.00 केवी और केशिका तापमान के लिए 275 डिग्री सेल्सियस की सामान्य एमएस स्थितियों का उपयोग करें।
    5. 60,000 के संकल्प के साथ 200 - 2,000 मीटर / जेड की सीमा में एमएस स्पेक्ट्रा प्राप्त करें, 1 x 106 के स्वचालित लाभ नियंत्रण (एजीसी) लक्ष्य, और 150 एमएस के अधिकतम आयन इंजेक्शन समय (आईटी) ।
    6. 30 की सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा का उपयोग करके उच्च-ऊर्जा टकराव पृथक्करण (एचसीडी) विखंडन के लिए 15 सबसे तीव्र आयनों (3.2 x 104 की न्यूनतम तीव्रता), 2.0 मीटर / जेड की अलगाव खिड़की, 15,000 का रिज़ॉल्यूशन, 2 x 10 5 का एक एजीसी लक्ष्य, और250 एमएस का अधिकतम आईटी चुनें।
    7. 30 s की डायनेमिक बहिष्करण विंडो सेट करें. 1 या ≥ 8 के चार्ज के साथ आयनों को बाहर करें और अपरिचित चार्ज राज्यों के साथ आयनों को बाहर करें।
  4. न्यूरोपेप्टाइड पहचान और परिमाणीकरण
    नोट: डेटाबेस खोज और पेप्टाइड परिमाणीकरण (दोनों खुले स्रोत और वाणिज्यिक) के लिए कई सॉफ़्टवेयर उपलब्ध हैं। यहां, पीसीएस स्टूडियो (प्रोटिओमिक्स सॉफ्टवेयर) 15 का उपयोग किया जाएगा।
    1. 1.4.2 - 1.4.6 में उल्लिखित चरणों का उपयोग करके डेटाबेस खोज निष्पादित करें।
    2. एक नई परियोजना बनाएँ और एंजाइम के लिए कोई नहीं , उपकरण के लिए Orbitrap , टुकड़े के लिए HCD , और अधिग्रहण के लिए डेटा-निर्भर अधिग्रहण (DDA) का चयन करने वाले LC-MS डेटा जोड़ें।
      नोट:: डेटा अधिग्रहण पैरामीटर पर आधारित उपयुक्त पैरामीटर का चयन करें।
    3. पहचान का चयन करें और सही अग्रदूत [DDA] और केवल मास का चयन करें।
    4. डेटाबेस खोज का चयन करें और अग्रदूत द्रव्यमान के लिए monoisotopic द्रव्यमान और टुकड़ा आयन द्रव्यमान के लिए 0.02 Da का उपयोग कर 20.0 पीपीएम की एक त्रुटि सहिष्णुता सेट, एंजाइम प्रकार के लिए कोई नहीं, डाइजेस्ट मोड के लिए अनिर्दिष्ट, अधिकतम छूटे हुए दरारों के लिए 100, और अधिकतम के साथ निम्नलिखित चर पीटीएम प्रति पेप्टाइड 3 की अनुमति दी चर पीटीएम के साथ: Amidation, ऑक्सीकरण (एम), ई से पाइरो-ग्लू, और क्यू से पाइरो-ग्लू।
    5. Neuropeptide डेटाबेस का चयन करें, डिकॉय-संलयन के साथ झूठी खोज दर (FDR) का अनुमान लगाएं।
      नोट:: बड़े पैमाने पर सहनशीलता त्रुटि एकत्र किए गए डेटा से मेल खाने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। नमूना प्रकार के लिए उपयुक्त डेटाबेस का उपयोग करें। जब कोई एंजाइम का चयन नहीं किया जाता है, तो अधिकतम छूटे हुए दरार पैरामीटर खोज को प्रभावित नहीं करता है। हालांकि, बड़ी संख्या में छूटे हुए दरारों की आवश्यकता होती है यदि सॉफ़्टवेयर में एक विकल्प के रूप में अनिर्दिष्ट डाइजेस्ट मोड नहीं है।
    6. यदि लेबल-मुक्त परिमाणीकरण वांछित है, तो परिमाणीकरण का चयन करें, लेबल-मुक्त का चयन करें और 20.0 पीपीएम की त्रुटि सहिष्णुता और 1.0 मिनट की अवधारण समय सहिष्णुता सेट करें।
    7. आइसोटोपिक लेबलिंग के लिए चरण 1.2 निष्पादित किया गया था, तो अग्रदूत आयन परिमाणीकरण निष्पादित करें।
      1. परिमाणीकरण का चयन करें, अग्रदूत आयन परिमाणीकरण का चयन करें, 1.0 मिनट की अवधारण समय सीमा का उपयोग करें, और 1% की FDR थ्रेशोल्ड का उपयोग करें।
      2. विधि का चयन करें ड्रॉप-डाउन मेनू से एक पूर्व निर्धारित या कस्टम परिमाणीकरण विधि का चयन करें ।
      3. कोई नई कस्टम विधि बनाने के लिए, विंडो > कॉन्फ़िगरेशन > लेबल Q विधि > नया क्लिक करें. नई विधि का नाम दें और विधि प्रकार के लिए अग्रदूत आयन परिमाणीकरण का चयन करें। पंक्ति जोड़ें का चयन करें और PTM विकल्प सूची से संशोधन का चयन करें।
      4. एलसी-एमएस डेटा जोड़ें और प्रयोग की नियंत्रण स्थिति से न्यूरोपेप्टाइड्स पर संशोधन होने के लिए संदर्भ स्थिति का चयन करें।
    8. चरण 1.4.9 - 1.4.11 में वर्णित के रूप में खोज परिणामों का मूल्यांकन करें।
    9. -10lgP ≥ 20 के साथ पेप्टाइड्स और प्रोटीन के लिए सारांश टैब के माध्यम से परिणामों को फ़िल्टर करें, ≥ 1 अद्वितीय पेप्टाइड का चयन करें, और महत्वपूर्ण पेप्टाइड्स के साथ लेबल किए गए बॉक्स का चयन करें।
    10. डेटाबेस खोज परिणामों का मूल्यांकन करें जहां प्रोटीन.csv न्यूरोपेप्टाइड पहचान और पेप्टाइड का प्रतिनिधित्व करता है.csv न्यूरोपेप्टाइड टुकड़ा पहचान का प्रतिनिधित्व करता है।
    11. प्रोटीन और पेप्टाइड स्कोर, बड़े पैमाने पर सटीकता, और अनुक्रम कवरेज के लिए डेटाबेस खोज का निरीक्षण करें।
      नोट:: प्रत्येक डेटाबेस खोज सॉफ़्टवेयर अद्वितीय स्कोरिंग एल्गोरिदम का उपयोग करता है और तदनुसार मूल्यांकन करने की आवश्यकता हो सकती है। पहचान का मूल्यांकन मैन्युअल रूप से पहचाने गए पेप्टाइड्स के लिए देखे गए स्पेक्ट्रा का निरीक्षण करके किया जा सकता है जिसमें पूर्ण टुकड़ा आयन श्रृंखला होती है।

2. MALDI-एमएस न्यूरोपेप्टाइड्स के स्पॉटिंग विश्लेषण

  1. नमूना तैयारी
    1. चरण 1.1 या चरण 1.1 - 1.2 का पालन करें यदि परिमाणीकरण वांछित है, तो चरण 1.2.8 को छोड़कर (आइसोटोपिक लेबलिंग के बाद डीसॉल्टिंग MALDI-MS विश्लेषण से पहले आवश्यक नहीं है)।
    2. 0.1% एफए के 5 μL में सूखे desalted neuropeptides का पुनर्गठन, भंवर अच्छी तरह से, 1 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में sonicate, और संक्षेप में 2,000 x g पर centrifuge.
    3. क्रस्टेशियन ऊतकों में न्यूरोपेप्टाइड्स के स्पॉटिंग के लिए, मैट्रिक्स के रूप में 50% मेथनॉल (MeOH)/ 0.1% एफए (v / v) में 150 मिलीग्राम / एमएल 2,5-डाइहाइड्रॉक्सीबेंजोइक एसिड (डीएचबी) तैयार करें।
    4. पिपेट एक हाइड्रोफोबिक फिल्म पर नमूने की एक 3 μL बूंद ( सामग्री की तालिका देखें) और नमूना बूंद पर सीधे मैट्रिक्स के पिपेट 3 μL। पिपेट ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए।
    5. पिपेट 1: 1 नमूने के μL: MALDI स्टेनलेस स्टील लक्ष्य प्लेट के एक कुएं में मैट्रिक्स मिश्रण। प्रत्येक मिश्रण को नमूने के किनारों पर अच्छी तरह से फैलाने के लिए पिपेट टिप का उपयोग करें। नमूना को समान वितरण (चित्रा 4 ए) की सुविधा के लिए अच्छी तरह से उत्कीर्णन के किनारों को छूना चाहिए।
    6. स्पॉट 1 μL 1: 1 कैलिब्रेट: मैट्रिक्स मिश्रण (वाणिज्यिक या कस्टम अंशांकन मिश्रण, बहुलक सामग्री (यानी, MeOH में भंग लाल फास्फोरस), या आम मैट्रिक्स क्लस्टर आयनों) 12 नमूने के पास एक अच्छी तरह से में।
      नोट: लाल फास्फोरस को स्पॉटिंग से पहले मैट्रिक्स के साथ मिश्रित करने की आवश्यकता नहीं है।
  2. डेटा अधिग्रहण
    1. MALDI टैंडेम टाइम-ऑफ-फ्लाइट (TOF/ TOF) उपकरण में सूखे नमूने के धब्बे युक्त लक्ष्य प्लेट डालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. DHB मैट्रिक्स के लिए, 95% करने के लिए लेजर शक्ति सेट, स्वचालित इष्टतम डिटेक्टर लाभ का चयन करें, और स्मार्ट - पूरा नमूना नमूना वाहक आंदोलन मोड। 200 - 3200 मीटर / जेड की सीमा में एमएस स्पेक्ट्रा प्राप्त करें और न्यूरोपेप्टाइड सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए प्रत्येक स्थान से एक साथ कई स्पेक्ट्रा जोड़ें।
      नोट: प्रतिशत लेजर शक्ति, डिटेक्टर लाभ का अनुकूलन करें, और उपयुक्त नमूना वाहक आंदोलन मोड का चयन करें ताकि प्रत्येक अधिग्रहण मोटे तौर पर पूरे स्थान को कवर करता है और बाद के अधिग्रहण पिछले पदों पर नहीं जाते हैं।
    3. उपकरण कैलिब्रेट करें।
      नोट: वांछित न्यूरोपेप्टाइड रेंज को शामिल करने के लिए द्रव्यमान सीमा को समायोजित करें।
  3. डेटा विश्लेषण
    1. DATA Analysis Software में MALDI-MS फ़ाइल खोलें ( सामग्री तालिका देखें) और यहाँ उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर के लिए आधार रेखा घटाव पर क्लिक करें।
    2. मास सूची ढूँढें क्लिक करके पीक पिकिंग निष्पादित करें. यदि बहुत कम चोटियां हैं, तो मास सूची को संपादित करें का चयन करके मैन्युअल रूप से मास सूची को संपादित करें और उन्हें बड़े पैमाने पर सूची में जोड़ने के लिए स्पेक्ट्रम में चोटियों पर क्लिक करें।
    3. [M + H] + m / z मान (± 200 पीपीएम त्रुटि) वाले न्यूरोपेप्टाइड डेटाबेस के साथ द्रव्यमान सूची की तुलना करके सटीक द्रव्यमान मिलान करें। 
      नोट: सामान्य नमक adducts, जैसे [M +K]+, [M+Na]+, और [M+NH4]+, को भी सटीक द्रव्यमान मिलान लक्ष्य सूची में शामिल किया जाना चाहिए.
    4. पहचानकी गई चोटियों को सत्यापित करने के लिए, ब्याज के m/ z की एक सूची उत्पन्न करें और MS/

3. MALDI-एमएस न्यूरोपेप्टाइड्स के इमेजिंग विश्लेषण

  1. नमूना तैयारी
    नोट:: एम्बेडिंग और अनुभाग चरणउत्तेजकों के लिए आवश्यक नहीं हैं जो अनुभागित होने के लिए बहुत पतले हैं।
    1. जिलेटिन के साथ आधा क्रायोस्टेट कप भरें (37 डिग्री सेल्सियस, विआयनीकृत पानी में 100 मिलीग्राम / एमएल) और इसे कमरे के तापमान पर ठोस करने की अनुमति दें। बचे हुए तरल जिलेटिन को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म रखें।
    2. जानवर से वांछित न्यूरोनल ऊतक एकत्र करें और ऊतक को तुरंत 0.6 मिलीलीटर ट्यूब में डुबोने के लिए संदंश का उपयोग करें जिसमें 1 एस के लिए विआयनीकृत पानी होता है।
      नोट:: न्यूरोनल ऊतक विच्छेदन के लिए चरण 1.1.2 नोट को देखें।
    3. ठोस जिलेटिन के शीर्ष पर ऊतक रखें और तरल जिलेटिन के साथ क्रायोस्टेट कप के बाकी हिस्सों को भरें। ऊतक की स्थिति के लिए संदंश का उपयोग करें।
    4. क्रायोस्टेट कप को एक सपाट सतह पर रखें और सूखी बर्फ के साथ फ्रीज करें।
      नोट: उपयोग (आदर्श रूप से 6 महीने के भीतर) तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
    5. सेक्शनिंग तैयारी के लिए, जिलेटिन-एम्बेडेड नमूने को क्रायोस्टेट मोल्ड से मोल्ड को दूर करके अलग करें।
    6. चक पर विआयनीकृत पानी की एक 1 मिलीलीटर बूंद को पिपेट करके और तुरंत बूंद पर एम्बेडेड ऊतक को दबाकर एम्बेडेड ऊतक को क्रायोस्टेट चक पर माउंट करें।
    7. एक बार जमे हुए होने के बाद, ऊतक के चारों ओर अधिक विआयनीकृत पानी पिपेट इसे चक पर सुरक्षित करने के लिए। क्रायोस्टेट बॉक्स के अंदर इन चरणों को निष्पादित करें ( सामग्री की तालिका देखें) -20 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    8. ऊतक को एक सेल (नमूना प्रकार के आधार पर 8-20 μm) की अनुमानित मोटाई पर अनुभाग करें और प्रत्येक अनुभाग को एक इंडियम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) पर माउंट करें - अनुभाग के पास स्लाइड के एक तरफ रखकर और स्लाइड के दूसरी तरफ एक उंगली रखकर स्लाइड के दूसरी ओर एक उंगली रखकर धीरे-धीरे कांच को गर्म करें और अनुभाग को स्लाइड से चिपकने की अनुमति दें।
      नोट: ऊतक वर्गों को चिमटी के साथ जिलेटिन के एक किनारे को उठाकर पिघलाया जा सकता है (-20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा), इसे आईटीओ-लेपित ग्लास स्लाइड पर रखना, और स्लाइड के दूसरी तरफ एक उंगली रखना धीरे-धीरे ग्लास को गर्म करने और अनुभाग को स्लाइड से चिपकने की अनुमति देता है।
    9. एक हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके ऊतक अनुभाग के पास एक छोटा सर्कल खींचकर और सर्कल के अंदर कैलिब्रेंट को स्पॉट करके (कैलिब्रेंट विकल्पों के लिए चरण 2.1.6 देखें) के रूप में उपयोग किए जाने वाले नमूने को स्पॉट करें।
    10. स्लाइड के प्रत्येक कोने को एक व्हाइटआउट पेन के साथ एक छोटे आकार के साथ चिह्नित करें जिसमें तेज किनारों (यानी, एक्स) को सिखाने के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
    11. MALDI स्लाइड एडाप्टर प्लेट में ग्लास स्लाइड रखें और एक स्कैनर का उपयोग करके एक उच्च रिज़ॉल्यूशन (≥2400 DPI) ऑप्टिकल छवि स्कैन लें।
    12. एक स्वचालित स्प्रेयर का उपयोग करके ऊतक अनुभाग पर स्प्रे मैट्रिक्स (स्प्रेयर विवरण और निर्देशों के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    13. क्रस्टेशियन ऊतकों में न्यूरोपेप्टाइड्स के एमएसआई के लिए मैट्रिक्स के रूप में 50% मेथनॉल / 0.1% एफए (वी / वी) में 40 मिलीग्राम / एमएल डीएचबी का उपयोग करें, नोजल तापमान को 80 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, वेग 1,250 मिमी / मिनट, प्रवाह दर 0.1 एमएल / मिनट, 12 तक पास की संख्या, और स्वचालित स्प्रेयर के लिए प्रत्येक पास के बीच में 30 एस।
  2. डेटा अधिग्रहण
    1. पूरी तरह से सूखे लक्ष्य प्लेट को डालें जिसमें पिघलने वाले ऊतक वर्गों को शामिल किया गया था जो मैट्रिक्स के साथ छिड़काव किए गए थे।
    2. MS इमेजिंग अधिग्रहण फ़ाइल पैरामीटर सेट करें ताकि लेजर व्यास रास्टर चरण आकार से छोटा हो.
    3. स्कैन ऑप्टिकल छवि लोड करें और एक्स शिक्षण बिंदुओं का उपयोग करके नमूना प्लेट को कैलिब्रेट करें। ब्याज के ऊतक क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए वास्तविक ऊतक अनुभाग से थोड़ा बड़ा मापा जा करने के लिए भी केवल मैट्रिक्स युक्त क्षेत्रों को शामिल करने के लिए।
    4. उपकरण को कैलिब्रेट करें और 200 - 3200 मीटर / जेड की सीमा में स्पेक्ट्रा प्राप्त करें। वांछित न्यूरोपेप्टाइड रेंज को शामिल करने के लिए द्रव्यमान सीमा को समायोजित करें।
  3. डेटा विश्लेषण
    1. डेटा को संसाधित करने के लिए, वांछित सॉफ़्टवेयर में एमएस इमेजिंग डेटासेट आयात करें, बेसलाइन हटाने के एल्गोरिथ्म का चयन करें, और कुल आयन गणना का उपयोग करके डेटा को सामान्य करें।
      नोट:: विभिन्न सामान्यीकरण एल्गोरिदम का चयन, जैसे माध्यिका, रूट माध्य वर्ग (RMS) मान, या संदर्भ m/z मान की तीव्रता, संभवतः कई m/z मानों के स्थानिक वितरण को बदल देगी. वांछित analytes के लिए सबसे उपयुक्त सामान्यीकरण एल्गोरिथ्म चुनें।
    2. एक सैद्धांतिक चोटी सूची से प्रत्येक m/z मान के लिए एक छवि उत्पन्न करने के लिए, एक अल्पविराम से अलग मान (CSV) फ़ाइल अपलोड करें जिसमें न्यूरोपेप्टाइड [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, आदि शामिल हैं। फ़ाइल > आयात > पीक सूची क्लिक करके m/z मान प्राप्त करें. चोटी सूची का नाम बताइए।
    3. उपयुक्त पीपीएम त्रुटि थ्रेशोल्ड का अनुमान लगाने के लिए, पहले मैन्युअल रूप से एमएस स्पेक्ट्रम में न्यूरोपेप्टाइड चोटी की पहचान करें और इसकी तुलना न्यूरोपेप्टाइड सैद्धांतिक द्रव्यमान के साथ करें। PPM त्रुटि की गणना करें और फ़ाइल > फ़ाइल गुण > अंतराल चौड़ाई और इनपुट ppm त्रुटि क्लिक करें।
    4. ड्रॉप-डाउन मेनू से चोटी सूची का चयन करें और पीक सूची के प्रत्येक अंतराल के लिए m/z छवियाँ बनाएँ पर क्लिक करें।
    5. प्रत्येक m/z छवि का स्क्रीनशॉट सहेजें क्लिक करके प्रत्येक m/z छवि सहेजें.
      नोट: परिष्कृत न्यूरोपेप्टाइड पहचान एम / जेड छवियों की पहचान करके की जा सकती है जहां विश्लेषक संकेत केवल ऊतक के भीतर स्थानीयकृत होता है और आसपास के मैट्रिक्स में नहीं।
    6. चोटी की पहचान सत्यापित करने के लिए, ब्याज के m / z की एक सूची उत्पन्न करें और MS / MS प्रयोग करें।

4. डी नोवो अनुक्रमण का उपयोग कर उपन्यास परिष्कृत neuropeptides की खोज

  1. चरण 1.4.2 - 1.4.5 निष्पादित करें।
  2. निर्यात डे नोवो केवल पेप्टाइड्स.csv 75 ≥ के स्थानीय विश्वास (एएलसी) स्कोर के औसत के साथ PEAKS सॉफ्टवेयर से।
    नोट: डे नोवो अनुक्रमण करने के लिए कई सॉफ़्टवेयर उपलब्ध हैं, जिनमें से प्रत्येक अपने स्वयं के स्कोरिंग एल्गोरिदम के साथ है और तदनुसार मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
  3. विशिष्ट न्यूरोपेप्टाइड परिवारों से संबंधित न्यूरोपेप्टाइड्स के संकेतित ज्ञात अनुक्रम रूपांकनों के लिए पेप्टाइड सूचीखोजें 19.
    नोट: जबकि रूपांकनों को आमतौर पर प्रजातियों में अच्छी तरह से संरक्षित किया जाता है, खोजे गए रूपांकनों को नमूना जीव के विचार के साथ चुना जाना चाहिए।

5. भविष्यवाणी न्यूरोपेप्टाइड अनुक्रमों के लिए ट्रांसक्रिप्टोम खनन

नोट:: यह चरण वैकल्पिक है और केवल एक मौजूदा neuropeptide डेटाबेस में जोड़ने या एक नया neuropeptide डेटाबेस बनाने के लिए उपयोग किया जाता है।

  1. ब्याज के एक ज्ञात preprohormone अमीनो एसिड अनुक्रम चुनें और tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE =BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
    _LOC = blasthome) nr / nt, Refseq_genomes, EST और TSA सहित डेटाबेस के खिलाफ क्वेरी preprohormone अनुक्रम खोज करने के लिए।
    नोट:: प्रोटीन डेटाबेस के विरुद्ध क्वेरी अनुक्रम खोजने के लिए, BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE का उपयोग करें
    _TYPE = ब्लास्टसर्च&SHOW_DEFAULTS = पर &blast
    _SPEC =&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn)।
    1. लक्ष्य जीव (कर आईडी) का चयन करें और कम स्कोर संरेखण शामिल करने के लिए 1000 के लिए थ्रेशोल्ड एल्गोरिथ्म पैरामीटर की अपेक्षा बदलें।
    2. ब्लास्ट प्रोग्राम चलाएँ और फिर क्वेरी और विषय अनुक्रमों के बीच उच्च होमोलॉजी स्कोर के लिए परिणामों की जाँच करें जो महत्वपूर्ण संरेखण का उत्पादन करते हैं। न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम युक्त FASTA फ़ाइल सहेजें.
      नोट: यदि समान होमोलॉजी स्कोर के साथ कई विषय अनुक्रम हैं, तो20,21 अनुक्रमों को संकीर्ण करने के लिए एक एमएएफटी संरेखण करें।
  2. Expasy अनुवाद उपकरण (https://web.expasy.org/translate/) का उपयोग कर preprohormone पेप्टाइड अनुक्रमों में preprohormone न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का अनुवाद करें। सी sapidus के लिए, आनुवंशिक कोड के लिए अकशेरुकी माइटोकॉन्ड्रियल का चयन करें।
  3. सिग्नलपी (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP) का उपयोग करके पेप्टाइड अनुक्रमों में सिग्नल पेप्टाइड अनुक्रम और प्रोहॉर्मोन क्लीवेज साइटों की जांच करें।
    नोट: ज्ञात preprohormone प्रसंस्करण योजनाओं के लिए होमोलॉजी भी prohormone दरार साइटों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सिग्नल पेप्टाइड्स के लिए संभावित पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की भविष्यवाणी की जा सकती है यदि वांछित हो। Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) tyrosine अवशेषों की सल्फेशन स्थिति की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Dianna (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) का उपयोग डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड कनेक्टिविटी की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है।

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Representative Results

नमूना तैयारी और MS विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लो चित्र 1 में दर्शाया गया है। न्यूरोनल ऊतक के विच्छेदन के बाद, न्यूरोपेप्टाइड नमूनों को शुद्ध करने के लिए होमोजेनाइजेशन, निष्कर्षण और डिसाल्टिंग किया जाता है। यदि आइसोटोपिक लेबल-आधारित परिमाणीकरण वांछित है, तो नमूनों को तब लेबल किया जाता है और एक बार फिर से डीसाल्ट किया जाता है। परिणामस्वरूप नमूने का विश्लेषण न्यूरोपेप्टाइड पहचान और परिमाणीकरण के लिए एलसी-एमएस / एमएस के माध्यम से किया जाता है।

प्रोटिओमिक्स सॉफ्टवेयर के माध्यम से पहचाने जाने वाले न्यूरोपेप्टाइड्स में अच्छा पेप्टाइड विखंडन अनुक्रम कवरेज होना चाहिए, हालांकि, यह वैश्विक रूप से परिभाषित या मानकीकृत नहीं है। पूर्ण पहचान के लिए, प्रत्येक अमीनो एसिड को एक टुकड़ा आयन का उत्पादन करना चाहिए जो स्पष्ट पहचान और स्थानीयकरण प्रदान करता है। यह भी प्रत्येक टुकड़ा आयन की तीव्रता की पुष्टि के लिए एक संश्लेषित पेप्टाइड के साथ तुलना की जानी चाहिए। चूंकि हर कल्पित पहचान पर ऐसा करने की लागत संभव नहीं है, इसलिए पहचान को आमतौर पर विश्वास के आधार पर वर्णित किया जाता है जहां अधिक देखे गए टुकड़े आयन पेप्टाइड पहचान आत्मविश्वास को बढ़ाते हैं। जबकि चित्रा 2ए, बी दो न्यूरोपेप्टाइड्स को दर्शाता है जो दोनों को 100% अनुक्रम कवरेज और 0.02 डीए की अधिकतम सीमा द्वारा परिभाषित कम द्रव्यमान त्रुटि के साथ पहचाना गया था, खराब विखंडन कवरेज (केवल तीन आयनों से) केवल चित्रा 2 बी में न्यूरोपेप्टाइड के लिए मनाया गया एक विशिष्ट आइसोफॉर्म की पहचान के आत्मविश्वास को कम करता है। चित्रा 2C निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम (XICs) को दर्शाता है, जो एक प्लॉट है जिसमें प्रतिधारण समय के एक फ़ंक्शन के रूप में एक चयनित m / z मान की सिग्नल तीव्रता होती है, LFQ के लिए उपयोग किए जाने वाले दो नमूनों में पाए गए न्यूरोपेप्टाइड का। न्यूरोपेप्टाइड के लिए प्रतिधारण समय थोड़ा भिन्न होता है क्योंकि इसे दो अलग-अलग और लगातार रनों में पहचाना गया था; हालांकि, अंतर 1 मिनट के विश्वसनीय थ्रेशोल्ड मान के भीतर है। इस प्रकार, XIC से वक्र के तहत सॉफ़्टवेयर-परिकलित क्षेत्र के बीच के अनुपात का उपयोग इस न्यूरोपेप्टाइड के LFQ के लिए किया जाता है।

डाइमिथाइल लेबल वाले न्यूरोपेप्टाइड्स की मात्रा के लिए, एमएस 1 स्पेक्ट्रम में सैद्धांतिक न्यूरोपेप्टाइड एम / जेड मूल्य पर एक चोटी और एक बड़े पैमाने पर बदलाव के साथ एम / जेड मूल्य पर एक चोटी होनी चाहिए जो उपयोग किए जाने वाले आइसोटोपिक लेबलिंग अभिकर्मकों के बीच द्रव्यमान अंतर से संबंधित है। चित्रा 2D में, इस 2-plex dimethyl लेबल नमूने का द्रव्यमान बदलाव 4.025 Da है। इसके XICs से अग्रदूत आयन के वक्र के तहत क्षेत्र तो सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की जाती है और सापेक्ष बहुतायत अनुपात की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। प्रोटिओमिक्स सॉफ़्टवेयर निर्यात तालिका का एक सरलीकृत संस्करण जिसमें पहचाने गए न्यूरोपेप्टाइड्स और उनके LFQ अनुपात शामिल हैं , तालिका 1 में दिखाया गया है। इसी तरह के परिणाम आइसोटोपिक रूप से लेबल किए गए न्यूरोपेप्टाइड्स के लिए प्राप्त किए जाते हैं।

सॉफ्टवेयर एल्गोरिदम स्पेक्ट्रा के डे नोवो अनुक्रमण को सक्षम करने के लिए उपन्यास परिष्कृत neuropeptides का पता लगाने के लिए. जब परिष्कृत उपन्यास न्यूरोपेप्टाइड्स का पता लगाने का दावा किया जाता है, तो उच्च आत्मविश्वास की पहचान आदर्श मामले होते हैं जहां सभी अमीनो एसिड की पहचान की जाती है और खंड आयन अवलोकन के आधार पर स्पष्ट रूप से स्थानीयकृत किया जाता है। चित्रा 3 सी-टर्मिनल पर -RYamide आकृति युक्त एक डे नोवो अनुक्रमित पेप्टाइड के स्पेक्ट्रम को दर्शाता है, एक संरक्षित अनुक्रम आकृति क्रस्टेशियन RYamide परिवार22 के ज्ञात neuropeptides द्वारा साझा की गई है। एक पेप्टाइड को 100% अनुक्रम कवरेज के साथ डेटाबेस से मिलान किया गया था, सभी अमीनो एसिड बनाने वाले टुकड़े आयनों को देखा गया था, कम टुकड़ा आयन द्रव्यमान त्रुटि जैसा कि 0.02 Da की अधिकतम सीमा द्वारा परिभाषित किया गया था और इसमें एक गाऊसी क्षालन प्रोफ़ाइल शामिल थी। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि क्रस्टेशियन -RYamide न्यूरोपेप्टाइड परिवार से संबंधित एक अंतर्जात पेप्टाइड देखा गया था।

MALDI-MS स्पॉट माप न्यूरोपेप्टाइड पहचान प्रदान कर सकते हैं जो एलसी-ईएसआई-एमएस पहचान के पूरक हैं, साथ ही साथ उच्च थ्रूपुट क्षमताओं की पेशकश करते हैं। कच्चे ऊतक homogenate neuropeptides के लिए निकाला जाता है के बाद, desalted, और लेबल (यदि वांछित), नमूने मैट्रिक्स के साथ मिश्रित किया जा सकता है और MALDI स्टेनलेस स्टील लक्ष्य प्लेट पर देखा जा सकता है, जैसा कि चित्रा 4A में दिखाया गया है। समरूप नमूना धब्बों की सफल पिपेटिंग स्पष्ट रूप से हल की गई चोटियों का उत्पादन करती है, विशेष रूप से अंशांकन स्पेक्ट्रम (चित्रा 4 बी) के भीतर। MALDI-TOF उपकरण का उपयोग करते समय, उपकरण को प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। ज्ञात द्रव्यमान के साथ किसी भी analytes उपकरण कैलिब्रेट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यदि यह नमूने के वांछित द्रव्यमान सीमा के भीतर है। यहां, लाल फास्फोरस का उपयोग उपकरण के सकारात्मक आयन द्रव्यमान अंशांकन के लिए किया जाता है। कमरे के तापमान पर इसकी स्थिरता, सस्ती लागत, इसके पोलीमराइजेशन, उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के कारण प्रचुर मात्रा में चोटियों के कारण पेप्टाइड अंशांकन मिश्रणों का उपयोग करने के फायदे हैं, और इसे आयनीकरण के लिए मैट्रिक्स की आवश्यकता नहीं है।

Neuropeptides के MALDI-MS इमेजिंग के लिए, MALDI TOF/ TOF उपकरण का उपयोग किया जाता है, नमूने के साथ ऑप्टिकल छवि को सहसंबंधित करने के लिए ITO-लेपित स्लाइड (चरण 3.1.10) के मैनुअल छवि अंशांकन की आवश्यकता होती है। चित्रा 5 में आरेख व्हाइटआउट क्रॉसहेयर के उचित प्लेसमेंट को दिखाता है जिसका उपयोग वास्तविक नमूना प्लेट के साथ स्कैन की गई ऑप्टिकल छवि को सहसंबंधित करने के लिए उपकरण को पढ़ाने वाले बिंदुओं के रूप में किया जाता है। यह आईटीओ-लेपित स्लाइड के क्षेत्रों को भी दिखाता है जिन्हें उपयोगकर्ता द्वारा टाला जाना चाहिए (यानी, नमूना या मैट्रिक्स शामिल नहीं है)। बड़े पैमाने पर अंशांकन के लिए, आईटीओ-लेपित स्लाइड पर ऊतक के नमूने के सापेक्ष अंशांकन नमूना स्पॉट का प्लेसमेंट सीधे समय-उड़ान द्रव्यमान विश्लेषकों की अंतर्निहित प्रकृति के कारण द्रव्यमान त्रुटि को प्रभावित करता है, हालांकि इस मुद्दे का परिमाण लक्ष्य analytes की बहुतायत पर निर्भर है। इस समस्या का एक समाधान मैन्युअल रूप से पीक शिफ्टिंग के सबूत के लिए विभिन्न ऊतक वर्गों से MS1 स्पेक्ट्रा से चोटियों की जांच करना है। यदि पीक शिफ्टिंग है, तो प्रत्येक ऊतक अनुभाग के ठीक बगल में आईटीओ-लेपित स्लाइड पर अतिरिक्त द्रव्यमान अंशांकन स्पॉट जोड़ने पर विचार करें। वहां से, उपयोगकर्ता अंशांकन स्पॉट से स्पेक्ट्रा को एक साथ औसत कर सकता है या ऊतक अनुभाग के निकटतम अंशांकन स्थान का उपयोग करके एक समय में एक ऊतक अनुभाग पर एमएस इमेजिंग कर सकता है। नमूना एकत्र करने के बाद, सत्यापित करें कि न्यूरोपेप्टाइड्स के अनुरूप एम / जेड मानों से संकेत केवल ऊतक क्षेत्र (चित्रा 6) के भीतर स्थानीयकृत है, इससे पहले कि एक परिष्कृत न्यूरोपेप्टाइड पहचान असाइन की जाए।

Figure 1
चित्रा 1: मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए न्यूरोपेप्टाइड नमूना तैयारी वर्कफ़्लो। ऊतक निकालने के विश्लेषण के लिए कच्चे ऊतक homogenate desalted है, स्थिर आइसोटोपिक लेबल के साथ लेबल, फिर से desalted, और एमएस द्वारा विश्लेषण किया. इमेजिंग विश्लेषण के लिए बरकरार ऊतक एम्बेडेड, क्रायोसेक्शन, मैट्रिक्स के साथ लागू किया जाता है, और MALDI-MSI द्वारा विश्लेषण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटिओमिक्स सॉफ़्टवेयर के माध्यम से की गई पहचान और परिमाणीकरण। न्यूरोपेप्टाइड्स (ए) अच्छे या (बी) खराब एमएस 2 विखंडन कवरेज के साथ गुणवत्ता के स्पेक्ट्रा के माध्यम से पता लगाया जाता है। खंड आयन द्रव्यमान मिलान त्रुटि स्पेक्ट्रा के नीचे दिखाया गया है। (सी) XIC प्रोफ़ाइल आकार और प्रतिधारण समय (RT) मैन्युअल रूप से LFQ के माध्यम से परिमाणित neuropeptides के लिए निरीक्षण किया जा सकता है। (डी) एमएस 1 स्पेक्ट्रा का उपयोग डाइमिथाइल लेबल वाले न्यूरोपेप्टाइड्स का पता लगाने और मापने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: उपन्यास न्यूरोपेप्टाइड का पता लगाने के लिए डे नोवो अनुक्रमण। (A) एक परिष्कृत उपन्यास RYamide का MS2 स्पेक्ट्रम प्रत्येक टुकड़े के लिए कम द्रव्यमान त्रुटि के साथ अच्छे विखंडन कवरेज को दर्शाता है। (बी) पहचान किए गए टुकड़ा आयनों को मैनुअल निरीक्षण के लिए सूचीबद्ध किया गया है। (सी) उपन्यास न्यूरोपेप्टाइड के एक्सआईसी को गॉसियन पीक आकार के लिए मैन्युअल रूप से निरीक्षण किया जाता है। संक्षेप: RT = प्रतिधारण समय। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: MALDI-एमएस धब्बे और अंशांकन स्पेक्ट्रम. (ए) एमएस स्पेक्ट्रा गुणवत्ता MALDI स्टेनलेस स्टील लक्ष्य में अच्छी तरह से एकसमान मैट्रिक्स-पेप्टाइड वितरण पर निर्भर करता है। बाएं तीन धब्बे अच्छे धब्बों के उदाहरण हैं जो अच्छी तरह से उत्कीर्णन के किनारों को छूते हैं और दाएं तीन धब्बे बुरे धब्बों के उदाहरण हैं। दोनों धब्बों में α-सायनो-4-हाइड्रॉक्सीसिनमिक एसिड (सीएचसीए) मैट्रिक्स और एक पेप्टाइड मानक मिश्रण होता है। (बी) 500 - 3200 मीटर / जेड से लाल फास्फोरस समूहों का उपयोग करके अंशांकन स्पेक्ट्रम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ITO-लेपित ग्लास स्लाइड का चित्रण. (A) महत्वपूर्ण क्षेत्रों के साथ योजनाबद्ध: ऊतक वर्गों (हल्के नीले आयतों) को रखने के लिए स्थान, स्वचालित शिक्षण बिंदु स्थान जिन्हें टाला जाना चाहिए (लाल आयत), उदाहरण स्थान जहां शिक्षण अंक खींचे जा सकते हैं (सफेद क्रॉसहेयर), और जहां स्क्रू एडाप्टर प्लेट से जुड़ते हैं और उनसे बचा जाना चाहिए (गहरे नीले अंडाकार)। (बी) ग्लास स्लाइड की तस्वीर जिसमें दो ऊतक अनुभाग होते हैं, एक अंशांकन मिश्रण युक्त एक स्थान, और क्रॉसहेयर के निशान। ऊतक अनुभाग और अंशांकन धब्बे का स्थान ग्लास स्लाइड के दूसरी तरफ उल्लिखित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: सी sapidus साइनस ग्रंथियों की एमएस छवियों. न्यूरोपेप्टाइड [M+H]+ आयन वितरण छवियाँ (A) HL/IGSL/IYRamide (m/z 844.48), (B) Allatostatin A-type NPYAFGLamide या GGPYAFGLamide (m/z 780.40), (C) Allatostatin A-type GQYAFGLamide (m/z 754.39), और (D) RFamide GRNFLRFamide (m/z 908) को दिखाया गया है। छवियों को सैद्धांतिक m/z मान से ± 50 ppm विंडो का उपयोग करके उत्पन्न किया जाता है। रंग पट्टी 0 से 100% तक सिग्नल तीव्रता की सीमा को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: डेटाबेस खोज और LFQ परिणाम। न्यूरोपेप्टाइड्स ने एलसी-एमएस और प्रोटिओमिक्स सॉफ्टवेयर के माध्यम से पहचाना और परिमाणित किया। पहचाने गए पीटीएम को एलएफक्यू के लिए दोनों नमूनों में पता लगाए गए पेप्टाइड्स की तीव्रता के साथ-साथ परिणामी एलएफक्यू अनुपात के साथ सूचीबद्ध किया गया है। FASTA फ़ाइल से औसत द्रव्यमान और मनाया न्यूरोपेप्टाइड विवरण सूचीबद्ध हैं। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

तंत्रिका तंत्र में पाए जाने वाले न्यूरोपेप्टाइड्स और अंतर्जात पेप्टाइड्स की सटीक पहचान, परिमाणीकरण और स्थानीयकरण उनके कार्य23,24 को समझने की दिशा में महत्वपूर्ण हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री एक शक्तिशाली तकनीक है जो पूरी तरह से अनुक्रमित जीनोम के बिना जीवों में भी इस सब को पूरा करने की अनुमति दे सकती है। एलसी-ईएसआई- और MALDI- एमएस के संयोजन के माध्यम से सी. सैपिडस से एकत्र ऊतक से न्यूरोपेप्टाइड्स का पता लगाने, मात्रा निर्धारित करने और स्थानीयकरण करने के लिए इस प्रोटोकॉल की क्षमता का प्रदर्शन किया जाता है।

एलसी-ईएसआई-एमएस विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी के दौरान, विचार किए जाने चाहिए। जबकि एमएस एक संवेदनशील तकनीक है, न्यूरोनल ऊतक की कम पेप्टाइड एकाग्रता (फेम्टोमोलर रेंज25 के नीचे) एक गंभीर सीमा पैदा करती है। सावधानीपूर्वक नमूना तैयारी न केवल प्रोटीन और लिपिड जैसे अधिक प्रचुर मात्रा में और हस्तक्षेप करने वाले मैट्रिक्स घटकों को हटाने के लिए आवश्यक है, बल्कि प्रत्येक चरण26,27 में न्यूरोपेप्टाइड्स के नुकसान को भी कम करती है। उदाहरण के लिए, नमूना हानि को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करके कम किया जा सकता है जो पेप्टाइड सोखना का विरोध करते हैं। ब्याज के ऊतक की संरचना के आधार पर, विभिन्न सॉल्वैंट्स (निष्कर्षण या वर्षा के लिए) या ठोस-चरण निष्कर्षण सामग्री के उपयोग का उपयोग विभिन्न आकारों और रासायनिक गुणों के साथ बायोमोलेक्यूल्स को अलग करने के लिए किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि हाइड्रोफिलिक या हाइड्रोफोबिक पेप्टाइड्स न्यूरोपेप्टाइड निकालने में मौजूद हैं, कई निष्कर्षण विलायक प्रणालियों का उपयोग वैकल्पिक रूप से विभिन्न भौतिक-रासायनिक गुणों के साथ न्यूरोपेप्टाइड्स को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। ये, प्रोटीज अवरोधकों के उपयोग के साथ, न्यूरोपेप्टाइड रिकवरी28 में सुधार के लिए अनुकूलित शुद्धिकरण के लिए संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है। एकाधिक निष्कर्षण प्रणालियों का उपयोग करने की कमियां यह हैं कि कई न्यूरोनल ऊतकों को समग्र उच्च पेप्टाइड सामग्री की आवश्यकता को पूरा करने के लिए पूल करने की आवश्यकता होती है, साथ ही साथ थ्रूपुट में कमी आती है। डिसाल्टिंग, आइसोटोपिक लेबलिंग और एमएस इंजेक्शन जैसे कई चरण कुछ शुरुआती पेप्टाइड मात्रा की सिफारिश करते हैं। कीमती नमूनों के लक्षण वर्णन के लिए, जैसे कि न्यूरोपेप्टाइड्स, पेप्टाइड assays आमतौर पर बाहरी पेप्टाइड खपत को रोकने के लिए टाला जाता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटीन डाइजेस्ट से सटीक पेप्टाइड एकाग्रता निर्धारित करने के लिए पेप्टाइड एसेस विकसित किए गए थे, जिनमें अंतर्जात पेप्टाइड्स की तुलना में अलग-अलग रासायनिक गुण होते हैं। अज्ञात न्यूरोपेप्टाइड एकाग्रता से जटिलताओं को दूर करने के लिए, एक प्रारंभिक पेप्टाइड परख को पूल किए गए न्यूरोनल ऊतक अर्क का उपयोग करके किया जा सकता है, जहां परिणामों का उपयोग बाद के सभी विश्लेषणों के लिए एक अनुमान के रूप में किया जाता है, हालांकि यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि समाधान में सभी पेप्टाइड्स को मापा जाता है, और इनमें से सभी न्यूरोपेप्टाइड्स29 नहीं हैं। इस विधि की अन्य सीमाओं में गैर-ध्रुवीय और हाइड्रोफोबिक न्यूरोपेप्टाइड्स के लिए संभावित पूर्वाग्रह और देशी संरचना संरक्षण की कमी शामिल है। विलायक रचनाओं और सामग्रियों में संशोधन, जैसे कि समाधानों का उपयोग करना जो अधिक हाइड्रोफोबिक हैं या कार्बनिक सॉल्वैंट्स के उपयोग को छोड़कर, इसे संबोधित करने के लिए किया जा सकता है।

MALDI-MS माप सुसंगत परिणामों के लिए सावधानीपूर्वक नमूना तैयारी चरणों पर निर्भर करते हैं और LC-ESI-MS माप की तुलना में अलग-अलग नमूना विचार हो सकते हैं। एमएस विश्लेषण से पहले बर्फ पर न्यूरोपेप्टाइड निकालने को रखने जैसे कदम अभी भी लागू किए जाते हैं। न्यूरोपेप्टाइड गिरावट को रोकने के अतिरिक्त तरीकों में विच्छेदन के बाद एक डेसिकेंट बॉक्स में पिघलने वाले ऊतक वर्गों वाले ग्लास स्लाइड्स को रखना शामिल है ताकि संघनन को30 जमा होने से रोका जा सके, हालांकि सूखने के बाद ऊतक के नमूने को डेसिकेटर में छोड़ने के परिणामस्वरूप नमूना गिरावट भी हो सकती है। मैट्रिक्स आवेदन से ठीक पहले 5-10 मिनट के लिए एक वैक्यूम डेसिकेटर (अंतिम दबाव: कमरे के तापमान पर 1x10-4 टोर) में ऊतक स्लाइड रखने का सुझाव दिया जाता है। मैट्रिक्स को ऊतक स्लाइड पर जमा करने के बाद, इसे रात भर रेफ्रिजरेटर या फ्रीजर में रखा जा सकता है और MALDI-MS इमेजिंग माप से पहले वैक्यूम डेसिकेटर में सुखाया जा सकता है। MALDI स्पॉट माप के लिए, मैट्रिक्स-पेप्टाइड क्रिस्टल संरचना समान रूप से MALDI लक्ष्य में अच्छी तरह से वितरित नहीं की जाती है, भले ही यह ऐसा प्रतीत होता है। इस प्रक्रिया के कारण तकनीकी प्रतिकृतियों से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा विविधताओं को कम करने के तरीके हैं। सबसे पहले, कई लेजर शॉट्स (आमतौर पर सैकड़ों से हजारों) का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से एक औसत स्पेक्ट्रम प्राप्त करें, जहां लेजर बेतरतीब ढंग से अच्छी तरह से रैस्टर किया जाता है (यानी, साधन पैरामीटर में स्मार्ट या यादृच्छिक नमूना वाहक आंदोलन का चयन करना)। प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए कम से कम पांच तकनीकी प्रतिकृति प्राप्त करें और तीन तकनीकी प्रतिकृतियों का चयन करें जहां वांछित चोटियों के लिए सिग्नल तीव्रता में भिन्नता सबसे कम है। यहाँ ट्रेडऑफ़ प्रयोगात्मक थ्रूपुट है। लेजर शॉट्स की संख्या, लेजर व्यास, और अन्य साधन सेटिंग्स जैसे पैरामीटर को सभी अधिग्रहित स्पेक्ट्रा के लिए सुसंगत रखना आवश्यक है। आदर्श रूप से, सभी तकनीकी प्रतिकृतियों और जैविक प्रतिकृतियों का विश्लेषण एक ही समय में एक ही मैट्रिक्स समाधान और साधन अंशांकन का उपयोग करके किया जाता है। न्यूरोपेप्टाइड की पहचान एक चोटी की सूची में सटीक द्रव्यमान मिलान द्वारा की जा सकती है जिसमें सैद्धांतिक [M + H] + , [M + Na] + , [M + NH4]+, [M + K]+, और अन्य नमक adducts एकल चार्ज आयन m / z मानों का उत्पादन करते हैं। MALDI-MS प्रयोगों से व्यवस्थित कलाकृतियों को कम करने के लिए डेटा का सामान्यीकरण महत्वपूर्ण है। पुनरुत्पादन का मूल्यांकन विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब MALDI-MS स्पॉट माप का उपयोग स्थिर आइसोटोप लेबलिंग (SIL) द्वारा न्यूरोपेप्टाइड परिमाणीकरण के लिए किया जाता है। नमूना तैयारी और डेटा अधिग्रहण की गुणवत्ता का मूल्यांकन पेप्टाइड मानक या न्यूरोपेप्टाइड अर्क लेकर किया जा सकता है, इसे दो समान एलीकोट में विभाजित किया जा सकता है, एसआईएल द्वारा प्रत्येक नमूने को अलग-अलग लेबल किया जा सकता है, और युग्मित चोटियों की सापेक्ष तीव्रता सुनिश्चित करने के लिए नमूने का विश्लेषण किया जा सकता है 1: 1। उन अनुपातों से रिपोर्ट की गई भिन्नता का उपयोग उपयोगकर्ता त्रुटि के लिए जिम्मेदार समग्र प्रयोग में विचरण के स्तर का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि MALDI-MS अनुक्रम और मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने में भी सक्षम है; हालांकि, अकेले चार्ज किए गए आयन आमतौर पर MALDI सीमा पेप्टाइड फ्रैगमेंट डिटेक्शन द्वारा उत्पादित होते हैं, जिससे पूर्ण अनुक्रम प्राप्त करना और एलसी-ईएसआई-एमएस के लिए चर्चा की गई मात्रा विधियों को रोकना अधिक कठिन हो जाता है। भले ही, MALDI-MS उच्च थ्रूपुट के लिए अपनी क्षमता के कारण एक आकर्षक साधन है, साथ ही साथ नमूना12,31 के भीतर लवण और अशुद्धियों के लिए एक उच्च सहिष्णुता भी है। इसके अतिरिक्त, MALDI-MS इमेजिंग के अन्य पारंपरिक इमेजिंग तकनीकों पर लाभ हैं जिनके लिए एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है। अधिकांश एमएस तौर-तरीकों में, बड़े पैमाने पर रिज़ॉल्यूशन को कम करने से संवेदनशीलता को बढ़ावा मिलेगा, जिससे कम बहुतायत वाले न्यूरोपेप्टाइड्स का बेहतर पता लगाया जा सके। यह रणनीति प्रत्येक प्रयोग के लिए MALDI साधन को कैलिब्रेट करने में आसानी के कारण LC-ESI-MS उपकरणों की तुलना में MALDI-TOF/TOF उपकरणों के लिए अधिक व्यावहारिक हो सकती है। एक और तरीका है कि MALDI neuropeptidomics के लिए फायदेमंद हो सकता है स्पेक्ट्रा औसत के माध्यम से है। आमतौर पर, एलसी-ईएसआई-एमएस माप से औसत स्पेक्ट्रा का उपयोग नहीं किया जाता है क्योंकि यह एलसी अलगाव के लाभों को नकारता है; इसलिए, बायोइन्फॉर्मेटिक्स सॉफ़्टवेयर पर न्यूरोपेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए भारी भरोसा किया जाता है और पहचान को मैन्युअल रूप से सत्यापित किया जाता है। हालांकि, MALDI-MS माप से स्पेक्ट्रा के औसत के लिए कम परिणाम हैं क्योंकि कोई प्रारंभिक अलगाव नहीं था; इसलिए, कच्चे डेटा छोटे और एक उपयोगकर्ता के लिए मैन्युअल रूप से कंघी के माध्यम से कंघी करने के लिए आसान है। डेटा प्रबंधन में आसानी महत्वपूर्ण है क्योंकि यह उस क्रम को बदलता है जिसमें उपयोगकर्ता न्यूरोपेप्टाइड पहचान और सत्यापन रणनीतियों से संपर्क कर सकता है। जबकि एलसी-ईएसआई-एमएस से न्यूरोपेप्टाइड पहचान में विश्वास डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के भीतर थ्रेशोल्ड स्ट्रिंगेंसी के स्तर को बढ़ाने से लाभान्वित हो सकता है, इस रणनीति से MALDI-MS पहचान को लाभ होने की संभावना कम है। क्रस्टेशियन न्यूरोपेप्टाइड्स के उदाहरण में, तथ्य यह है कि प्रयोगशाला-निर्मित डेटाबेस से 1000 से कम प्रविष्टियां हैं (यानी, मैन्युअल रूप से स्कैन करने के लिए अधिकतम <1000 वर्णक्रमीय चोटियों या एमएस छवियों) से, पहले एक उदार द्रव्यमान त्रुटि सीमा के साथ MALDI-MS डेटा को फ़िल्टर करना संभव बनाता है, और फिर मैन्युअल रूप से MS1 स्तर पर आइसोटोपिक लिफाफे की जांच करके उन पहचानों को सत्यापित करता है, साथ ही प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में चर्चा की गई अन्य सत्यापन विधियों के रूप में अच्छी तरह से। लोकप्रिय एमएस इमेजिंग डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक न्यूरोपेप्टाइड मास डेटाबेस के लिए सटीक द्रव्यमान मिलान कर सकता है और संबंधित एमएस छवियों को निकाल सकता है। नैदानिक-आधारित अनुसंधान प्रश्नों के लिए, जैसे बायोमार्कर खोज, ये सॉफ़्टवेयर ब्याज के ऊतक क्षेत्र के लिए अद्वितीय एम / जेड मूल्यों को निकालने में सक्षम हैं (आमतौर पर रुचि का क्षेत्र (आरओआई) विश्लेषण कहा जाता है) 32 और यह निर्धारित करने के लिए सांख्यिकीय परीक्षण करते हैं कि दो ऊतक क्षेत्र कितने अलग-अलग हैं। यह भी ध्यान देने योग्य है कि एलसी-ईएसआई-एमएस की तुलना में एमएस इमेजिंग के लिए कम डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर विकल्प भी हैं।

न्यूरोपेप्टाइड्स के लिए एलसी-ईएसआई-एमएस डेटाबेस खोजों का प्रदर्शन आमतौर पर पचे हुए पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए बनाए गए सॉफ़्टवेयर एल्गोरिदम के उपयोग पर जोर देता है। इस प्रकार, सॉफ़्टवेयर की सीमाएं हैं जो गैर-विशिष्ट एंजाइम डेटाबेस खोजों को करने में सक्षम हैं या खोज को पूरा करने में लगने वाले समय की मात्रा। वर्तमान में, अंतर्जात पेप्टाइड खोजों को छूटे हुए दरारों की अधिकतम संख्या के साथ किया जाता है, लेकिन यह संख्या अभी भी सीमित है, जिससे संभावित रूप से चूक पहचान हो सकती है। जब किसी प्रजाति के लिए जीनोम पूरी तरह से अनुक्रमित नहीं होता है, जैसा कि सी. सैपिडस के साथ होता है, तो डी नोवो अनुक्रमण को ज्ञात संरक्षित न्यूरोपेप्टाइड अनुक्रम रूपांकनों के माध्यम से अज्ञात / उपन्यास न्यूरोपेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि यह विधि न्यूरोपेप्टाइड्स की पहचान करने में विफल रहती है जिसमें अज्ञात रूपांकन होते हैं या न्यूरोपेप्टाइड परिवार पहचानकर्ता के रूप में उपयोग किए जाने वाले रूपांकनों को शामिल नहीं किया जाताहै। उदाहरण के लिए, WSSMRGAWamide allatostatin B-type neuropeptide परिवार19 के लिए एक आकृति है। इसमें पूरी तरह से डिकोड किए गए जीनोम अनुक्रम33 के बिना प्रजातियों के लिए अनुमानित न्यूरोपेप्टाइड अनुक्रमों के लिए ट्रांसक्रिप्टोम खनन का महत्व निहित है। न्यूरोपेप्टाइड पहचान तब परिष्कृत पेप्टाइड अनुक्रम को संश्लेषित करके और सिंथेटिक पेप्टाइड और जैविक ऊतक34 से एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा की तुलना करके पुष्टि की जाती है। एक अनुक्रम सत्यापित होने के बाद भी, यह कभी-कभी अज्ञात होता है कि क्या यह पूर्ण न्यूरोपेप्टाइड अनुक्रम या गिरावट उत्पाद है। यह ध्यान देने योग्य है कि MALDI और ESI-MS ionization स्रोतों (ESI MALDI की तुलना में एक नरम आयनीकरण विधि है) के बीच अंतर के परिणामस्वरूप कृत्रिम गिरावट की विभिन्न दरों (यानी, इन-सोर्स विखंडन) हो सकती है। कृत्रिम रूप से प्रेरित (यानी, विवो में नहीं) गिरावट उत्पाद से पेप्टाइड के एक कटे हुए संस्करण के बीच अंतर करने के लिए, उस न्यूरोपेप्टाइड के लिए प्रीप्रोहॉर्मोन प्रोसेसिंग मार्ग को जाना जाना चाहिए। चूंकि यह अक्सर मामला नहीं होता है, इसलिए पेप्टाइड के सिंथेटिक रूप का उपयोग शारीरिक assays में किया जाना चाहिए और जैविक गतिविधि के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए।

कुल मिलाकर, न्यूरोपेप्टाइड विश्लेषण के लिए यहां उदाहरण दिया गया वर्कफ़्लो विभिन्न क्षेत्रों की एक किस्म को लाभ पहुंचा सकता है। यह पेप्टाइड्स के मध्य-डाउन एमएस विश्लेषण के भीतर एक तकनीकी अंतर को भरता है क्योंकि यह अंतर्जात पेप्टाइड्स के लिए अनुकूलित किया जाता है जो आमतौर पर नीचे-ऊपर या ऊपर-नीचे एमएस विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किए जाने वाले प्रोटीन से छोटे होते हैं। इसलिए, न्यूरोपेप्टिडोमिक्स द्वारा उपयोग किए जाने वाले नमूना तैयारी विधियों को काफी हद तक अन्य बायोएक्टिव अंतर्जात पेप्टाइड्स के लिए अनुवाद योग्य होना चाहिए, जैसे कि जीवाणुरोधी गुणों के लिए औषधीय रसायनज्ञों द्वारा लक्षित35। इस प्रोटोकॉल का एक लाभ यह है कि यह लोकप्रिय विक्रेताओं से सामान्य उपकरणों का उपयोग करता है जो अनुवाद की एक अतिरिक्त डिग्री की पेशकश करते हैं। इस तरह, वर्कफ़्लो का उपयोग अकादमिक और वाणिज्यिक सेटिंग्स में किया जा सकता है, जैसे कि दवा दवा उम्मीदवारों या दवा लक्ष्यों के लिए स्क्रीनिंग।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (CHE-1710140 और CHE-2108223) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) द्वारा अनुदान R01DK071801 के माध्यम से समर्थित किया गया था। एपी एनआईएच रसायन विज्ञान-जीव विज्ञान इंटरफ़ेस प्रशिक्षण अनुदान (T32 GM008505) द्वारा भाग में समर्थित था। N.V.Q. को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, रूथ एल किर्शस्टीन नेशनल रिसर्च सर्विस अवार्ड के तहत नेशनल हार्ट लंग एंड ब्लड इंस्टीट्यूट से विस्कॉन्सिन-मैडिसन कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च सेंटर (T32 HL007936) के विश्वविद्यालय के लिए। एलएल एनआईएच अनुदान R56 MH110215, S10RR029531, और S10OD025084, साथ ही साथ एक विलास विशिष्ट उपलब्धि प्रोफेसरशिप और चार्ल्स मेलबोर्न जॉनसन प्रोफेसरशिप से विस्कॉन्सिन पूर्व छात्र अनुसंधान फाउंडेशन और विस्कॉन्सिन-मैडिसन स्कूल ऑफ फार्मेसी द्वारा प्रदान किए गए वित्त पोषण के साथ वित्त पोषण समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix Supelco 39319
Acetic acid Fisher Chemical A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A955-500
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
Borane pyridine Sigma-Aldrich 179752
Bruker peptide calibration mix Bruker Daltonics NC9846988
Capillary Polymicro 1068150019 to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup Sigma-Aldrich E6032 any cup or mold should work
 Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30108434
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde - D2 Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Optima LC/MS grade Fisher Chemical A117-50
Gelatin Difco 214340 place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen Vector Labs 15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides Delta Technologies CB-90IN-S107 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials Thermo TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade Fisher Chemical A456-500
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 Hydrophobic film
pH-Indicator strips Supelco 109450
Red phosphorus clusters Sigma-Aldrich 343242
Reversed phase C18 material Waters 186002350 manually packed into nanoflow column
Wite-out pen BIC 150810
ZipTip Millipore Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5 HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R Eppendorf 05-401-205
Cryostat- HM 550 Thermo Fisher Scientific 956564A
Desiccant Drierite 2088701
Forceps WPI 501764
MALDI stainless steel target plate Bruker Daltonics 8280781
Pipet-Lite XLS Rainin 17014391 200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100 Savant SVC-100D
Ultrasonic Cleaner Bransonic 2510R-MTH for sonication
Ultrasonic homogenizer Fisher Scientific FB120110 FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A Ideal Vacuum Products P10976 ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer Corning 6775
Water bath (37C) - Isotemp 110 Fisher Scientific 15-460-10
Data Analysis Software
Expasy https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis Bruker Daltonics
FlexControl Bruker Daltonics
FlexImaging Bruker Daltonics
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab https://scils.de/
SignalP 5.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMS=tblastn&PAGE_
TYPE=BlastSearch&SHOW_
DEFAULTS=on&LINK_LOC
=blasthome

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Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L.… More

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus. J. Vis. Exp. (183), e63322, doi:10.3791/63322 (2022).

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