Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Mangesidet massespektrometrisk undersøgelse af neuropeptider i Callinectes sapidus

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/63322
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison
* These authors contributed equally

Summary

Massespektrometrisk karakterisering af neuropeptider giver sekvens-, kvantations- og lokaliseringsinformation. Denne optimerede arbejdsgang er ikke kun nyttig til neuropeptidundersøgelser, men også andre endogene peptider. Protokollerne her beskriver prøveforberedelse, MS-erhvervelse, MS-analyse og databasegenerering af neuropeptider ved hjælp af LC-ESI-MS, MALDI-MS-spotting og MALDI-MS-billeddannelse.

Abstract

Neuropeptider er signalmolekyler, der regulerer næsten alle fysiologiske og adfærdsmæssige processer, såsom udvikling, reproduktion, fødeindtagelse og reaktion på eksterne stressorer. Alligevel forbliver de biokemiske mekanismer og det fulde supplement til neuropeptider og deres funktionelle roller dårligt forstået. Karakterisering af disse endogene peptider hindres af den enorme mangfoldighed inden for denne klasse af signalmolekyler. Derudover er neuropeptider bioaktive i koncentrationer 100x - 1000x lavere end neurotransmittere og er tilbøjelige til enzymatisk nedbrydning efter synaptisk frigivelse. Massespektrometri (MS) er et meget følsomt analytisk værktøj, der kan identificere, kvantificere og lokalisere analytter uden omfattende a priori viden. Det er velegnet til globalt profilering af neuropeptider og hjælp til opdagelsen af nye peptider. På grund af den lave overflod og høje kemiske mangfoldighed af denne klasse af peptider er flere prøveforberedelsesmetoder, MS-erhvervelsesparametre og dataanalysestrategier blevet tilpasset fra proteomics-teknikker for at muliggøre optimal neuropeptidkarakterisering. Her beskrives metoder til isolering af neuropeptider fra komplekse biologiske væv til sekvenskarakterisering, kvantitering og lokalisering ved hjælp af væskekromatografi (LC)-MS og matrixassisteret laserdesorption/ionisering (MALDI)-MS. En protokol til fremstilling af en neuropeptiddatabase fra den blå krabbe, Callinectes sapidus, en organisme uden omfattende genomisk information, er inkluderet. Disse arbejdsgange kan tilpasses til at studere andre klasser af endogene peptider i forskellige arter ved hjælp af en række instrumenter.

Introduction

Nervesystemet er komplekst og kræver et netværk af neuroner til at transmittere signaler gennem en organisme. Nervesystemet koordinerer sensorisk information og biologisk respons. De indviklede og indviklede interaktioner involveret i signaloverførsel kræver mange forskellige signalmolekyler såsom neurotransmittere, steroider og neuropeptider. Da neuropeptider er de mest forskelligartede og potente signalmolekyler, der spiller nøgleroller i aktivering af fysiologiske reaktioner på stress og andre stimuli, er det af interesse at bestemme deres specifikke rolle i disse fysiologiske processer. Neuropeptidfunktion er relateret til deres aminosyrestruktur, som bestemmer mobilitet, receptorinteraktion og affinitet1. Teknikker som histokemi, hvilket er vigtigt, fordi neuropeptider kan syntetiseres, opbevares og frigives i forskellige områder af vævet, og elektrofysiologi er blevet anvendt til at undersøge neuropeptidstruktur og funktion 2,3,4, men disse metoder er begrænset af gennemstrømning og specificitet for at løse den enorme sekvensdiversitet af neuropeptider.

Massespektrometri (MS) muliggør analyse af neuropeptidstruktur og overflod med høj kapacitet. Dette kan udføres gennem forskellige MS-teknikker, oftest væskekromatografi-elektrosprayionisering MS (LC-ESI-MS)5 og matrixassisteret laserdesorption/ionisering MS (MALDI-MS)6. Ved hjælp af massemålinger med høj nøjagtighed og MS-fragmentering giver MS mulighed for at tildele aminosyresekvens og posttranslationel modifikation (PTM) status til neuropeptider fra komplekse blandinger uden forudgående viden for at hjælpe med at fastslå deres funktion 7,8. Ud over kvalitativ information muliggør MS kvantitativ information om neuropeptider gennem etiketfri kvantation (LFQ) eller etiketbaserede metoder såsom isotopisk eller isobarisk mærkning9. De vigtigste fordele ved LFQ inkluderer dens enkelhed, lave analyseomkostninger og reducerede prøveforberedelsestrin, som kan minimere prøvetab. Ulemperne ved LFQ omfatter imidlertid øgede instrumenttidsomkostninger, da det kræver flere tekniske replikater for at imødegå kvantitative fejl fra run-to-run-variabilitet. Dette fører også til en nedsat evne til nøjagtigt at kvantificere små variationer. Etiketbaserede metoder udsættes for mindre systematisk variation, da flere prøver kan mærkes forskelligt ved hjælp af en række stabile isotoper, kombineres til en prøve og analyseres gennem massespektrometri samtidigt. Dette øger også gennemstrømningen, selvom isotopetiketter kan være tidskrævende og dyre at syntetisere eller købe. Fuld scanningsmassespektre (MS1) spektral kompleksitet øges også, når multiplexering øges, hvilket reducerer antallet af unikke neuropeptider, der kan fragmenteres og derfor identificeres. Omvendt øger isobarisk mærkning ikke spektral kompleksitet på MS1-niveau, selvom det introducerer udfordringer for analytter med lav overflod såsom neuropeptider. Da isobarisk kvantificering udføres på fragmentionsmassespektre (MS2) niveau, kan neuropeptider med lav overflod muligvis ikke kvantificeres, da mere rigelige matrixkomponenter kan vælges til fragmentering, og de udvalgte muligvis ikke har høj nok overflod til at blive kvantificeret. Med isotopmærkning kan kvantation udføres på hvert identificeret peptid.

Ud over identifikation og kvantificering kan lokaliseringsoplysninger opnås af MS gennem MALDI-MS-billeddannelse (MALDI-MSI)10. Ved at rastere en laser hen over en prøveoverflade kan MS-spektre kompileres til et varmekortbillede for hver m/z-værdi . Kortlægning af forbigående neuropeptidsignalintensitet i forskellige regioner på tværs af forhold kan give værdifuld information til funktionsbestemmelse11. Lokalisering af neuropeptider er især vigtig, fordi neuropeptidfunktionen kan variere afhængigt af placering12.

Neuropeptider findes i lavere overflod in vivo end andre signalmolekyler, såsom neurotransmittere, og kræver derfor følsomme metoder tilpåvisning 13. Dette kan opnås ved fjernelse af matrixkomponenter med højere overflod, såsom lipider11,14. Yderligere overvejelser i forbindelse med analysen af neuropeptider skal foretages i forhold til almindelige proteomics-arbejdsgange, hovedsageligt fordi de fleste neuropeptidomiske analyser udelader enzymatisk fordøjelse. Dette begrænser softwaremulighederne for neuropeptiddataanalyse, da de fleste blev bygget med algoritmer baseret på proteomics-data og proteinmatch informeret af peptiddetektion. Imidlertid er mange software som PEAKS15 mere velegnet til neuropeptidanalyse på grund af deres de novo-sekventeringsfunktioner. Flere faktorer skal overvejes til analyse af neuropeptider startende fra ekstraktionsmetode til MS-dataanalyse.

De protokoller, der er beskrevet her, omfatter metoder til prøveforberedelse og dimethylisotopmærkning, dataindsamling og dataanalyse af neuropeptider af LC-ESI-MS, MALDI-MS og MALDI-MSI. Gennem repræsentative resultater fra flere eksperimenter demonstreres nytten og evnen af disse metoder til at identificere, kvantificere og lokalisere neuropeptider fra blå krabber, Callinectes sapidus. For bedre at forstå nervesystemet anvendes modelsystemer ofte. Mange organismer har ikke et fuldt sekventeret genom til rådighed, hvilket forhindrer omfattende neuropeptidopdagelse på peptidniveau. For at afbøde denne udfordring er en protokol til identifikation af nye neuropeptider og transkriptomminedrift til generering af databaser for organismer uden fuldstændig genominformation inkluderet. Alle protokoller, der præsenteres her, kan optimeres til neuropeptidprøver fra enhver art såvel som anvendes til analyse af eventuelle endogene peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al beskrevet vævsprøveudtagning blev udført i overensstemmelse med University of Wisconsin-Madison retningslinjer.

1. LC-ESI-MS-analyse af neuropeptider

  1. Neuropeptidekstraktion og afsaltning
    1. Før vævsopkøb fremstilles forsuret methanol (acMeOH) (90:9:1 MeOH:vand:eddikesyre) som beskrevet i16.
    2. Saml hjernevæv frakrebsdyret 17 og brug tang til straks at placere et væv hver i et 0,6 ml rør indeholdende 20 μL acMeOH.
      BEMÆRK: Vævsdissektionsprotokoller varierer meget for forskellige dyr og forskellige vævstyper. Læseren henvises til protokol17 for en detaljeret beskrivelse af, hvordan man dissekerer hjernevæv og flere andre vævstyper fra krebsdyret. Prøverne kan opbevares ved -80 °C indtil brug (ideelt set inden for 6 måneder). De beskrevne volumener anvendes til en enkelt hjerne fra Callinectes sapidus. Volumener skal skaleres til vævsstørrelse. Væv kan lynfryses straks uden opløsningsmiddel, selvom dette ikke anbefales, da endogene proteolytiske enzymer ikke hæmmes og forbliver aktive, men i en langsommere hastighed, når de er kolde.
    3. Der tilsættes 150 μL acMeOH til prøven. Indstil den samlede sonikeringstid til 24 s, pulstid til 8 s, pausetid til 15 s og amplitude til 50% på en ultralydshomogenisator og homogeniser prøverne på is.
      BEMÆRK: Der findes forskellige homogeniseringssystemer. Juster indstillingerne og betingelserne i henhold til prøvetype og udstyr.
    4. Prøven centrifugeres ved 4 °C ved 20.000 x g i 20 minutter. Med en pipette overføres supernatanten i et rør og tørres i en vakuumkoncentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) ved ca. 35 °C.
      BEMÆRK: De tørrede prøver kan opbevares ved -80 °C indtil brug (ideelt set inden for 6 måneder). Opvarmning af vakuumkoncentratoren skal udføres med forsigtighed. Mens varme forkorter den tørre tid, skal prøven fjernes fra koncentratoren umiddelbart efter, at al væsken er fordampet for at minimere peptidnedbrydningen. For at undgå dette kan opvarmning udelades fra dette og alle efterfølgende trin.
    5. Til afsaltning rekonstitueres den ekstraherede vævsprøve i 20 μL 0,1% myresyre (FA), hvirvelbrønde og sonikat i et vandbad ved stuetemperatur i 1 minut.
      BEMÆRK: Der findes forskellige afsaltningsmaterialer. Juster opløsningerne og volumenerne i henhold til harpiksidentiteten og neuropeptidmængden. Den samlede peptidmængde kan estimeres ved hjælp af et kommercielt peptidkvantationsassay (se tabel over materialer).
    6. Påfør 0,5 μL prøve på en pH-strimmel for at bekræfte, at pH < 4. Hvis pH er højere, tilsættes 1 μL alikvoter på 10% FA, indtil pH < 4.
    7. Følg producentens protokol for afsaltning18. Der fremstilles en befugtningsopløsning indeholdende 100 μL 50 % acetonitril (ACN), ligevægtsopløsning indeholdende 100 μL 0,1 % FA, vaskeopløsning indeholdende 100 μL 0,1 % FA og elueringsopløsninger indeholdende 20 μL 25 % ACN/0,1 % FA, 20 μL 50 % ACN/0,1 % FA og 20 μL 75 % ACN/0,1 % FA.
    8. Der opnås en afsaltningsspids på 10 μL med C18-harpiks (se materialetabel).
    9. Anbring afsaltningsspidsen på en 20 μL pipette, der er indstillet til 15 μL. Når afsaltningsspidsen er våd, skal du forhindre luft i at passere igennem ved at holde pipetten nede, når den er ude af opløsningen, indtil den kasseres.
    10. Aspirer spidsen 3x med befugtningsopløsning og 3x med ligevægtsopløsning. Aspirat i prøven 10x efterfulgt af vask 3x i vaskeopløsning, kassere hver vask. Elute ved at aspireret 10x i hver af elueringsløsningerne for at øge ACN.
      BEMÆRK: Elueringsfraktioner kan holdes adskilt eller kombineres til yderligere analyser.
    11. Den brugte afsaltningsspids kasseres, og de eluerede neuropeptider tørres i en vakuumkoncentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) ved ca. 35 °C.
      BEMÆRK: Dette kan opbevares ved -80 °C indtil brug (ideelt set inden for 6 måneder).
  2. Isotopmærkning af neuropeptider i vævsekstrakt
    BEMÆRK: Dette trin er valgfrit og bruges kun, når kvantificering ønskes.
    1. Den 2-plex isotopiske dimethylmærkningsopløsning fremstilles i en stinkhætte: 1 %CH2OH2 (13,5 μL lager 37 vægt/vægtprocent (vægtprocent ) i vandopløsning i 486,5 μL vand), 1 %CH2OD2 (25 μL lager 20 vægtprocent opløsning i 475 μL vand) og 0,03 M boranpyridin (3,75 μL stam 8 M opløsning i 996,25 μL vand).
      FORSIGTIG: Formaldehyd er giftigt, så alle opløsninger skal opbevares i en ventileret hætte. Brug handsker, en laboratoriefrakke, øjenbeskyttelse og uigennemtrængeligt fodtøj. Kontaktlinser bør ikke bæres, når du arbejder med dette materiale.
      BEMÆRK: Der er forskellige isotopreagenser; vælg de relevante baseret på prøvetype og antal ønskede mærkningskanaler.
    2. Opløs rå neuropeptidekstrakt i 10 μL vand og sonikat i 10 minutter.
    3. Der tilsættes 10 μL af en anden isotopisk formaldehydopløsning (dvs. CH2OH2,CH2 OD2osv.) til hver enkelt forsøgstilstand, der skal måles kvantitativt. Vortex til at blande godt og kort centrifugere hver prøve ved 2.000 x g.
    4. Der tilsættes 10 μL 0,03 M boranpyridin til hvert prøverør. Vortex til at blande godt og kort centrifugere hver prøve ved 2.000 x g.
    5. Inkubere prøverne i 15 minutter ved 37 °C i et vandbad.
    6. Prøverne fjernes fra vandbadet, og der tilsættes 10 μL 100 mM ammoniumbicarbonat. Vortex til at blande godt og kort centrifugere hver prøve ved 2.000 x g.
    7. Kombiner de mærkede prøver til en 2-plex prøve og tør neuropeptiderne i en vakuumkoncentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) ved ca. 35 °C.
    8. Afsalt de mærkede neuropeptider ved at reperformere trin 1.1.5 - 1.1.10 og opbevar dem, indtil de er klar til dataindsamling.
  3. Dataindsamling
    1. Rekonstituere de tørrede afsaltede neuropeptider i 12 μL af 3% ACN / 0,1% FA, hvirvelbrønde, sonikat i 37 ° C vandbad i 1 minut og kort centrifuge ved 2.000 x g. Overfør hver prøve til hætteglas med autosampler.
      BEMÆRK: Juster prøvevolumenet i henhold til neuropeptidmængden til en koncentration på ~ 1 μg peptid pr. μL. Den samlede peptidmængde kan estimeres ved hjælp af et kommercielt peptidkvantationsassay (se tabel over materialer).
    2. Brug en autosampler til at injicere 1 μL prøve i et nano-LC-MS/MS-instrument med høj opløsning (se tabel over materialer).
    3. Brug en ca. 15 cm lang C18-kolonne med omvendt fase (RP) (se materialetabel) til at køre prøven med 0,1 % FA i vand som mobil fase A og 0,1 % FA i ACN som mobil fase B. Kør prøverne med en gradient på 3 % - 95 % B med en hastighed på 300 nL/min i over 11 minutter.
    4. For det MS-instrument, der anvendes her, skal du anvende almindelige MS-betingelser på 2,00 kV for sprøjtespænding og 275 °C for kapillærtemperatur.
    5. Erhverv MS-spektre i området 200 - 2.000 m /z med en opløsning på 60.000, automatisk forstærkningskontrolmål (AGC) på 1 x 106 og maksimal ionindsprøjtningstid (IT) på 150 ms.
    6. Vælg de 15 mest intense ioner (minimumsintensitet på 3,2 x 104) til HCD-fragmentering (higher energy collision dissociation) ved hjælp af en normaliseret kollisionsenergi på 30, isolationsvindue på 2,0 m/z, opløsning på 15.000, et AGC-mål på 2 x 105 og maks. IT på 250 ms.
    7. Indstil et dynamisk eksklusionsvindue på 30 s. Ekskluder ioner med en ladning på 1 eller ≥ 8 og ioner med ikke-anerkendte ladningstilstande.
  4. Neuropeptid identifikation og kvantificering
    BEMÆRK: Mange software til databasesøgning og peptidkvantificering (både open source og kommerciel) er tilgængelige. Her vil PEAKS Studio (proteomics software)15 blive brugt.
    1. Udfør databasesøgning ved hjælp af de trin, der er beskrevet i 1.4.2 - 1.4.6.
    2. Opret et nyt projekt, og tilføj LC-MS-dataene, der vælger Ingen for enzymet, Orbitrap for instrumentet, HCD for fragmentet og dataafhængig erhvervelse (DDA) til erhvervelse.
      BEMÆRK: Vælg de relevante parametre baseret på dataindsamlingsparametre.
    3. Vælg Identifikationer, og vælg Korrekt forløber [DDA] og Kun masse.
    4. Vælg Databasesøgning, og indstil en fejltolerance på 20,0 ppm ved hjælp af monoisotopisk masse for prækursormasse og 0,02 Da for fragmentionmasse, Ingen for enzymtype, Uspecifik for fordøjelsestilstand, 100 for maks. ubesvarede spaltninger og følgende variable PTM'er med den maksimalt tilladte variabel PTM pr. peptid på 3: Amidation, Oxidation (M), Pyro-glu fra E, og Pyro-glu fra Q.
    5. Vælg Neuropeptiddatabasen, estimer falsk opdagelseshastighed (FDR) med lokkeduefusion.
      BEMÆRK: Massetolerancefejlen skal justeres, så den svarer til de indsamlede data. Brug den relevante database til eksempeltypen. Når der ikke vælges et enzym, påvirker parameteren maks. ubesvarede spaltninger ikke søgningen. Der kræves dog et stort antal ubesvarede spaltninger, hvis softwaren ikke har den uspecificerede fordøjelsestilstand som en mulighed.
    6. Hvis der ønskes etiketfri kvantificering, skal du vælge Kvantificering, vælge Etiketfri og indstille en fejltolerance på 20,0 ppm og en opbevaringstidstolerance på 1,0 min.
    7. Udfør prækursorionkvantificering, hvis trin 1.2 for isotopmærkning blev udført.
      1. Vælg Kvantificering, vælg Precursor Ion Quantification, brug et retentionstidsinterval på 1,0 min,og brug en FDR-tærskel på 1%.
      2. Vælg en forudindstillet eller brugerdefineret kvantificeringsmetode i rullemenuen Vælg metode .
      3. Hvis du vil oprette en ny brugerdefineret metode, skal du klikke på Window > Configuration > Label Q Method > Ny. Navngiv den nye metode, og vælg Forløberionkvantificering for Metodetype. Vælg Tilføj række, og vælg ændring på listen PTM-indstillinger.
      4. Tilføj LC-MS-dataene, og vælg Referencebetingelse for at være modifikationen på neuropeptider fra eksperimentets kontroltilstand.
    8. Evaluer søgeresultaterne som beskrevet i trin 1.4.9 - 1.4.11.
    9. Filtrer resultaterne gennem oversigtsfanen for peptider og proteiner med -10lgP ≥ 20, vælg ≥ 1 unikt peptid, og vælg boks mærket med signifikante peptider.
    10. Evaluer databasens søgeresultater, hvor protein.csv repræsenterer neuropeptididentifikationer og peptid.csv repræsenterer identifikationer af neuropeptidfragmenter.
    11. Undersøg databasesøgningen efter protein- og peptidscorer, massenøjagtighed og sekvensdækning.
      BEMÆRK: Hver databasesøgningssoftware bruger unikke scoringsalgoritmer og skal muligvis evalueres i overensstemmelse hermed. Identifikationer kan evalueres ved manuelt at inspicere de observerede spektre for identificerede peptider, der indeholder den komplette fragmentionserie.

2. MALDI-MS spotting analyse af neuropeptider

  1. Prøve forberedelse
    1. Følg trin 1.1 eller trin 1.1 - 1.2, hvis kvantificering ønskes, undtagen trin 1.2.8 (afsaltning efter isotopmærkning er ikke påkrævet før MALDI-MS-analyse).
    2. Rekonstituere de tørrede afsaltede neuropeptider i 5 μL af 0,1% FA, hvirvelbrønde, sonikat i et 37 ° C vandbad i 1 minut og kort centrifuge ved 2.000 x g.
    3. Til spotting af neuropeptider i krebsdyrvæv fremstilles 150 mg/ml 2,5-dihydroxybenzoesyre (DHB) i 50 % methanol (MeOH)/0,1 % FA (v/v) som matrix.
    4. Pipette en 3 μL dråbe prøve på en hydrofob film (se tabel over materialer) og pipette 3 μL af matrixen direkte på prøvedråben. Pipette op og ned for at blande.
    5. Pipette 1 μL af 1:1-prøven: matrixblanding i en brønd i MALDI-målpladen i rustfrit stål. Brug pipettespidsen til at sprede hver blanding ud til kanterne af prøvebrønden. Prøven skal berøre kanterne på brøndgraveringen for at lette en ensartet fordeling (figur 4A).
    6. Spot 1 μL af 1:1 calibrant:matrixblanding (kommerciel eller brugerdefineret kalibreringsblanding, polymermaterialer (dvs. rødt fosfor opløst i MeOH) eller almindelige matrixklyngeioner)12 i en brønd nær prøven.
      BEMÆRK: Rødt fosfor behøver ikke blandes med matrix før spotting.
  2. Dataindsamling
    1. Indsæt målpladen indeholdende tørrede prøvepletter i MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) instrumentet (se materialetabellen).
    2. For DHB-matrix skal du indstille lasereffekten til 95 %, vælge Automatisk optimal detektorforstærkning og Smart - Complete Sample sample carrier movement mode. Anskaf MS-spektre i området 200-3200 m/z , og tilføj flere spektre fra hvert sted sammen for at øge forholdet mellem neuropeptidsignal og støj.
      BEMÆRK: Optimer procent lasereffekten, detektorforøgelsen, og vælg den passende prøvebærerbevægelsestilstand, så hver erhvervelse dækker omtrent hele stedet og efterfølgende erhvervelser ikke går til de tidligere positioner.
    3. Kalibrer instrumentet.
      BEMÆRK: Juster masseområdet til at omfatte det ønskede neuropeptidområde.
  3. Analyse af data
    1. Åbn MALDI-MS-filen i dataanalysesoftware (se tabel over materialer), og klik på Baseline Subtraktion for den software, der bruges her.
    2. Udfør topplukning ved at klikke på Find masseliste. Hvis der er for få toppe, skal du redigere masselisten manuelt ved at vælge Rediger masseliste og klikke på toppe i spektret for at føje dem til masselisten.
    3. Udfør nøjagtig massematchning ved at sammenligne masseliste med neuropeptiddatabase indeholdende [M+H]+ m/z-værdier (± 200 ppm-fejl).
      BEMÆRK: Almindelige saltdidukter, såsom [M+K]+, [M+Na]+ og [M+NH4]+, bør også medtages på listen over nøjagtige massematchende mål.
    4. For at verificere de identificerede toppe skal du generere en liste over m / z af interesse og udføre MS / MS-eksperimenter.

3. MALDI-MS billeddannelsesanalyse af neuropeptider

  1. Prøve forberedelse
    BEMÆRK: Indlejrings- og sektioneringstrin er ikke nødvendige for væv, der er for tyndt til at blive sektioneret.
    1. Fyld en halv kryostatkop med gelatine (37 °C, 100 mg/ml i deioniseret vand) og lad den størkne ved stuetemperatur. Hold rester af flydende gelatine varme i et vandbad på 37 °C.
    2. Saml ønsket neuronalt væv fra dyret og brug tang til straks at dyppe vævet i et 0,6 ml rør indeholdende deioniseret vand i 1 s.
      BEMÆRK: Se trin 1.1.2 BEMÆRK for neuronal vævsdissektion.
    3. Læg vævet oven på den faste gelatine og fyld resten af kryostatkoppen med flydende gelatine. Brug tang til at placere vævet.
    4. Placer kryostatkoppen på en plan overflade og frys med tøris.
      BEMÆRK: Opbevar prøver ved -80 °C indtil brug (ideelt set inden for 6 måneder).
    5. Til sektionsforberedelse adskilles den gelatineindlejrede prøve fra kryostatformen ved at skære formen væk.
    6. Monter det indlejrede væv på en kryostatpatron ved at pipettere en 1 ml dråbe deioniseret vand på chucken og straks trykke det indlejrede væv på dråben.
    7. Når det er frosset, pipette mere deioniseret vand omkring vævet for yderligere at fastgøre det til chucken. Udfør disse trin inde i kryostatboksen (se Materialetabellen), der er indstillet til -20 °C.
    8. Udsnit vævet i en omtrentlig tykkelse på en celle (8-20 μm afhængigt af prøvetypen), og optø hver sektion monteres på et indiumtinoxid (ITO)-belagt glasglas ved at placere den ene side af glideren nær sektionen og placere en finger på den anden side af diaset for langsomt at opvarme glasset og lade sektionen klæbe til diaset.
      BEMÆRK: Vævssektioner kan også optøes ved at samle den ene kant af gelatinen op med en pincet (kølet ned til -20 °C), placere den på den ITO-belagte glasrutsjebane og placere en finger på den anden side af glideren for langsomt at opvarme glasset og lade sektionen klæbe til diaset.
    9. Spot den prøve, der skal bruges som kalibrering (se trin 2.1.6 for kalibreringsmuligheder) ved at tegne en lille cirkel nær vævssektionen ved hjælp af en hydrofob pen og få øje på kalibreringsmidlet inde i cirklen.
    10. Marker hvert hjørne af diaset med en whiteout-pen med en lille form, der indeholder skarpe kanter (dvs. x), der skal bruges som undervisningspunkter.
    11. Anbring glasglideren i MALDI-diasadapterpladen, og tag en optisk billedscanning med høj opløsning (≥2400 DPI) ved hjælp af en scanner.
    12. Spraymatrix på vævssektionen ved hjælp af en automatiseret sprøjte (se Materialetabel for sprøjtedetaljer og instruktioner).
    13. For MSI af neuropeptider i krebsdyrvæv anvendes 40 mg/ml DHB i 50 % methanol/0,1 % FA (v/v) som matrix, dysetemperaturen indstilles til 80 °C, hastigheden til 1.250 mm/min.
  2. Dataindsamling
    1. Indsæt den helt tørrede målplade indeholdende optøningsmonterede vævssektioner, der blev sprøjtet med matrixen.
    2. Konfigurer ms-billedoptagelsesfilparametrene, så laserdiameteren er mindre end rastertrinstørrelsen.
    3. Læg det scannede optiske billede i, og kalibrer prøvepladen ved hjælp af x-undervisningspunkterne. Definer de vævsområder af interesse, der skal måles lidt større end den faktiske vævssektion, til også at omfatte områder, der kun indeholder matrix.
    4. Kalibrer instrumentet, og indsamle spektre i området 200-3200 m/z. Juster masseområdet til at omfatte det ønskede neuropeptidområde.
  3. Analyse af data
    1. Hvis du vil behandle data, skal du importere MS-billeddatasæt til den ønskede software, vælge en algoritme til fjernelse af grundlinjen og normalisere data ved hjælp af det samlede antal ioner.
      BEMÆRK: Valg af forskellige normaliseringsalgoritmer, såsom median, RMS-værdi (root mean square) eller intensiteten af en reference m/z-værdi , vil sandsynligvis ændre den rumlige fordeling af mange m/z-værdier . Vælg den normaliseringsalgoritme, der er bedst egnet til ønskede analytter.
    2. Hvis du vil generere et billede for hver m/z-værdi fra en teoretisk topliste, skal du uploade en CSV-fil (kommasepareret værdi), der indeholder neuropeptid [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+ osv. Hent m/z-værdier ved at klikke på Filer > Importer > Peak List. Navngiv toplisten.
    3. For at estimere den relevante ppm-fejltærskel skal du først manuelt identificere en neuropeptidtop i MS-spektret og sammenligne den med den neuropeptidteoretiske masse. Beregn ppm-fejlen, og klik på File > File Properties > Interval Width og input ppm error.
    4. Vælg toplisten i rullemenuen, og klik på Opret m/z-billeder for hvert interval på toplisten.
    5. Gem hvert m / z-billede ved at klikke på Gem skærmbillede af hvert m / z-billede.
      BEMÆRK: Formodet neuropeptididentifikation kan udføres ved at identificere m / z-billeder , hvor analytsignalet kun er lokaliseret i vævet og ikke i den omgivende matrix.
    6. For at bekræfte maksimal identitet skal du generere en liste over m / z af interesse og udføre MS / MS-eksperimenter.

4. Opdagelse af nye formodede neuropeptider ved hjælp af de novo-sekventering

  1. Udfør trin 1.4.2 - 1.4.5.
  2. Eksporter de novo kun peptider.csv fra PEAKS-software med en gennemsnitlig ALC-score (Local Confidence) på ≥ 75.
    BEMÆRK: Der er mange software til rådighed til at udføre de novo-sekventering, hver med sine egne scoringsalgoritmer og bør evalueres i overensstemmelse hermed.
  3. Søg på peptidlisten efter kendte sekvensmotiver, der indikerer neuropeptider, der tilhører specifikke neuropeptidfamilier19.
    BEMÆRK: Mens motiver almindeligvis er velbevarede på tværs af arter, bør de motiver, der søges efter, vælges under hensyntagen til prøveorganismen.

5. Transkriptomminedrift til forudsagte neuropeptidsekvenser

BEMÆRK: Dette trin er valgfrit og bruges kun til at føje til en eksisterende neuropeptiddatabase eller opbygge en ny neuropeptiddatabase.

  1. Vælg en kendt præprohormonaminosyresekvens af interesse og brug tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
    _LOC=blasthome) for at søge forespørgsel præprohormon sekvens mod databaser, herunder nr/nt, Refseq_genomes, EST og TSA.
    BEMÆRK: For at søge forespørgselssekvenser mod proteindatabase skal du bruge BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. Vælg målorganismen (skatte-id), og skift Expect Threshold-algoritmeparametrene til 1000 for at inkludere justeringer med lav score.
    2. Kør BLAST-programmet , og kontroller derefter resultaterne for høje homologiscorer mellem forespørgsels- og emnesekvenser, der producerer betydelige justeringer. Gem FASTA-fil, der indeholder nukleotidsekvens.
      BEMÆRK: Hvis der er flere emnesekvenser med lignende homologiscorer, skal du udføre en MAFFT-justering for at indsnævre formodede sekvenser20,21.
  2. Oversæt preprohormonnukleotidsekvens til præprohormonpeptidsekvenser ved hjælp af Expasy Translate-værktøjet (https://web.expasy.org/translate/). For C. sapidus skal du vælge Hvirvelløse mitokondrier for genetisk kode.
  3. Kontroller for signalpeptidsekvens og prohormonspaltningssteder i peptidsekvenserne ved hjælp af SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    BEMÆRK: Homologi til kendte præprohormonbehandlingsordninger kan også bruges til at identificere prohormonspaltningssteder. Mulige posttranslationelle modifikationer for signalpeptider kan forudsiges, hvis det ønskes. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) kan bruges til at forudsige sulfateringstilstanden for tyrosinrester. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) kan bruges til at forudsige disulfidbindingsforbindelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arbejdsgangen for prøveforberedelse og MS-analyse er afbildet i figur 1. Efter dissektion af neuronalt væv udføres homogenisering, ekstraktion og afsaltning for at rense neuropeptidprøver. Hvis der ønskes isotopetiketbaseret kvantificering, mærkes prøverne derefter og afsaltes igen. Den resulterende prøve analyseres gennem LC-MS / MS til neuropeptididentifikation og kvantificering.

Neuropeptider identificeret gennem proteomics-softwaren skal have god peptidfragmenteringssekvensdækning, men dette er ikke globalt defineret eller standardiseret. For absolut identifikation bør hver aminosyre producere en fragmention, der giver entydig identifikation og lokalisering. Dette skal også sammenlignes med et syntetiseret peptid til bekræftelse af intensiteten af hver fragmention. Da omkostningerne ved at udføre dette på hver formodet identifikation ikke er mulige, beskrives identifikation almindeligvis baseret på tillid, hvor flere observerede fragmentioner øger peptididentifikationstilliden. Mens figur 2A,B viser to neuropeptider, der begge blev identificeret med 100% sekvensdækning og en lav massefejl som defineret ved den maksimale grænse på 0,02 Da, reducerer den dårlige fragmenteringsdækning (fra kun tre ioner), der kun observeres for neuropeptidet i figur 2B, tilliden til identifikation af en specifik isoform. Figur 2C viser de ekstraherede ionkromatogrammer (CIC'er), som er et plot, der indeholder signalintensiteten af en valgt m/z-værdi som funktion af retentionstiden, af et neuropeptid detekteret i to prøver, der anvendes til LFQ. Retentionstiderne for neuropeptidet adskiller sig lidt, fordi det blev identificeret i to separate og på hinanden følgende kørsler; forskellen ligger dog inden for den pålidelige tærskelværdi på 1 min. Således anvendes forholdet mellem det softwareberegnede område under kurven fra XIC til LFQ af dette neuropeptid.

Til kvantation af dimethylmærkede neuropeptider bør MS1-spektret indeholde en top ved den teoretiske neuropeptid m/z-værdi og en top ved m/z-værdien med et masseskift, der korrelerer med masseforskellen mellem de anvendte isotopmærkningsreagenser. I figur 2D er masseforskydningen af denne 2-plex dimethylmærkede prøve 4.025 Da. Arealet under kurven for prækursorionen fra dens IC'er beregnes derefter af softwaren og bruges til at beregne relative overflodsforhold. En forenklet version af eksporttabellen for proteomics-software, der indeholder identificerede neuropeptider og deres LFQ-forhold, er vist i tabel 1. Lignende resultater opnås for isotopisk mærkede neuropeptider.

Softwarealgoritmer gør det muligt for de novo-sekventering af spektre at detektere nye formodede neuropeptider. Når man hævder påvisning af formodede nye neuropeptider, er identifikationer med høj tillid ideelle tilfælde, hvor alle aminosyrer identificeres og lokaliseres entydigt baseret på fragmentionobservation. Figur 3 viser spektret af et de novo-sekventeret peptid indeholdende -RYlamid-motivet ved C-terminalen, et bevaret sekvensmotiv, der deles af kendte neuropeptider af krebsdyr-Rylamid-familien22. Et peptid blev matchet fra databasen med 100% sekvensdækning, alle aminosyrer, der dannede fragmentioner observeret, lav fragmentionmassefejl som defineret ved den maksimale grænse på 0,02 Da og indeholdt en gaussisk elueringsprofil. Disse resultater indikerer, at et endogent peptid tilhørende krebsdyr-RYlamid neuropeptidfamilien blev observeret.

MALDI-MS-spotmålinger kan give neuropeptididentifikationer, der supplerer LC-ESI-MS-identifikation, samt tilbyde højere gennemstrømningsfunktioner. Efter at råvævshomogenat er ekstraheret for neuropeptider, afsaltet og mærket (hvis det ønskes), kan prøven blandes med matrix og spottes på MALDI rustfrit stål målplade, som vist i figur 4A. Vellykket pipettering af homogene prøvepletter producerer klart opløste toppe, især inden for kalibreringsspektret (figur 4B). Når du bruger et MALDI-TOF-instrument, skal instrumentet kalibreres ved begyndelsen af hvert forsøg. Alle analytter med kendte masser kan anvendes til at kalibrere instrumentet, hvis det ligger inden for prøvens ønskede masseområde. Her anvendes rødt fosfor til den positive ionmassekalibrering af instrumentet. Det har fordele i forhold til at anvende peptidkalibreringsblandinger på grund af dets stabilitet ved stuetemperatur, billige omkostninger, rigelige toppe på grund af dets polymerisation, højt signal-støj-forhold, og det kræver ikke en matrix til ionisering.

Til MALDI-MS-billeddannelse af neuropeptider kræver det anvendte MALDI TOF/TOF-instrument manuel billedkalibrering af det ITO-belagte dias (trin 3.1.10) for at korrelere det optiske billede med prøven. Diagrammet i figur 5 viser den korrekte placering af de whiteout-trådkors, der skal bruges som undervisningspunkter, så instrumentet kan korrelere det scannede optiske billede med den faktiske prøveplade. Det illustrerer også områder af det ITO-belagte dias, der bør undgås af brugeren (dvs. ikke indeholder prøve eller matrix). Ved massekalibrering påvirker placeringen af kalibreringsprøvens plet i forhold til vævsprøven på det ITO-belagte dias direkte massefejlen på grund af masseanalysatorers iboende karakter af masseanalysatorer på flyvetid, selv om størrelsen af dette problem afhænger af målanalytternes overflod. En løsning på dette problem er manuelt at kontrollere toppe fra MS1-spektrene fra forskellige vævssektioner for tegn på spidsforskydning. Hvis der er spidsforskydning, kan du overveje at tilføje yderligere massekalibreringspletter på det ITO-belagte dias lige ved siden af hver vævssektion. Derfra kan brugeren sammen sammen foretage et gennemsnit af spektrene fra kalibreringspletterne eller udføre MS-billeddannelse på én vævssektion ad gangen ved kun at bruge kalibreringspunktet tættest på vævssektionen. Når prøven er indsamlet, skal det kontrolleres, at signalet fra m/z-værdier svarende til neuropeptider kun er lokaliseret inden for vævsområdet (figur 6), før der tildeles en formodet neuropeptididentifikation.

Figure 1
Figur 1: Arbejdsgang til forberedelse af neuropeptidprøver til massespektrometrianalyse. Til vævsekstraktanalyse afsaltes råvævshomogenat, mærkes med stabile isotopetiketter, afsaltes igen og analyseres af MS. Til billeddannelsesanalyse indlejres intakt væv, kryosektioneres, påføres med matrix og analyseres af MALDI-MSI. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Identifikation og kvantificering udført gennem proteomics-softwaren. Neuropeptider detekteres gennem spektre af varierende kvalitet med (A) god eller (B) dårlig MS2-fragmenteringsdækning. Fejl ved matchning af fragmentionmasse er vist under spektrene. (C) XIC-profilformer og retentionstid (RT) kan inspiceres manuelt for neuropeptider kvantificeret gennem LFQ. (D) MS1-spektre anvendes til at detektere og kvantificere dimethylmærkede neuropeptider. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: De novo-sekventering til påvisning af nye neuropeptider. (A) MS2-spektret af et formodentligt nyt RYlamid viser god fragmenteringsdækning med lav massefejl for hvert fragment. B) De identificerede fragmentioner er opført med henblik på manuel inspektion. (C) XIC for det nye neuropeptid inspiceres manuelt for gaussisk topform. Forkortelser: RT = opbevaringstid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: MALDI-MS-pletter og kalibreringsspektrum. (A) MS-spektrenes kvalitet er afhængig af ensartet matrixpeptidfordeling i MALDI-målbrønden i rustfrit stål. De tre venstre pletter er eksempler på gode pletter, der berører kanterne på brøndgraveringen, og de tre højre pletter er eksempler på dårlige pletter. Begge pletter indeholder α-Cyano-4-hydroxycinnaminsyre (CHCA) matrix og en peptidstandardblanding. B) Kalibreringsspektrum ved hjælp af røde fosforklynger fra 500-3200 m/z. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Afbildning af ITO-belagt glasrutschebane. (A) Skematisk med vigtige områder noteret: steder at placere vævssektioner (lyseblå rektangler), automatiske undervisningspunkter, der bør undgås (røde rektangler), eksempler på steder, hvor undervisningspunkter kan tegnes (hvide trådkors), og hvor skruer fastgøres til adapterpladen og bør undgås (mørkeblå ovaler). B) Foto af glasrutsjebane indeholdende to vævssektioner, en plet, der indeholder en kalibreringsblanding, og krydshårsmærker. Placeringen af vævssektionen og kalibreringspunkterne er skitseret på den anden side af glasrutschebanen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: MS-billeder af C. sapidus sinuskirtler. Neuropeptid [M+H]+ ionfordelingsbilleder af (A) HL/IGSL/IYRamid (m/z 844,48), (B) Allatostatin A-type NPYAFGLamid eller GGPYAFGLamid (m/z 780,40), (C) Allatostatin A-type GQYAFGLamid (m/z 754,39) og (D) RFamid GRNFLRFamid (m/z 908,52) er vist. Billeder genereres ved hjælp af et ± 50 sider/min.-vindue fra den teoretiske m/z-værdi . Farvebjælke angiver området for signalintensitet fra 0 til 100%. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Databasesøgning og LFQ-resultater. Neuropeptider identificeret og kvantificeret gennem LC-MS og proteomics software. Identificerede PTM'er er opført sammen med intensiteten af detekterede peptider i begge prøver for LFQ sammen med det resulterende LFQ-forhold. De gennemsnitlige masser og observerede neuropeptidbeskrivelser fra FASTA-filen er angivet. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nøjagtige identifikation, kvantificering og lokalisering af neuropeptider og endogene peptider, der findes i nervesystemet, er afgørende for at forstå deres funktion23,24. Massespektrometri er en kraftfuld teknik, der kan gøre det muligt at opnå alt dette, selv i organismer uden et fuldt sekventeret genom. Denne protokols evne til at detektere, kvantificere og lokalisere neuropeptider fra væv indsamlet fra C. sapidus gennem en kombination af LC-ESI- og MALDI-MS er demonstreret.

Under prøveforberedelsen til LC-ESI-MS-analysen skal der tages hensyn herover. Mens MS er en følsom teknik, udgør den lave peptidkoncentration af neuronalt væv (ned til det femtomolære område25) en alvorlig begrænsning. Omhyggelig prøveforberedelse er nødvendig for ikke kun at fjerne mere rigelige og interfererende matrixkomponenter, såsom proteiner og lipider, men også minimere tabet af neuropeptider i hvert trin26,27. For eksempel kan prøvetab reduceres ved hjælp af mikrocentrifugerør, der modstår peptidadsorption. Afhængigt af sammensætningen af vævet af interesse kan anvendelsen af forskellige opløsningsmidler (til ekstraktion eller udfældning) eller fastfaseekstraktionsmaterialer anvendes til adskillelse af biomolekyler med forskellige størrelser og kemiske egenskaber. For at sikre, at hydrofile eller hydrofobe peptider er til stede i neuropeptidekstraktet, kan flere ekstraktionsopløsningsmiddelsystemer eventuelt anvendes til at målrette neuropeptider med forskellige fysisk-kemiske egenskaber. Disse, sammen med brugen af proteasehæmmere, skal muligvis modificeres til optimeret oprensning for at forbedre neuropeptidgendannelsen28. Ulemperne ved at bruge flere ekstraktionssystemer er, at flere neuronale væv skal samles for at opfylde et samlet krav til højere peptidindhold samt nedsat gennemstrømning. Mange trin såsom afsaltning, isotopmærkning og MS-injektion anbefaler visse startpeptidmængder. Til karakterisering af dyrebare prøver, såsom neuropeptider, undgås peptidassays generelt for at forhindre fremmed peptidforbrug. Derudover blev peptidassays udviklet til at bestemme nøjagtig peptidkoncentration fra proteinfordøjelser, som har forskellige kemiske egenskaber end endogene peptider. For at overvinde komplikationer fra ukendt neuropeptidkoncentration kan et indledende peptidassay udføres ved hjælp af poolede neuronale vævsekstrakter, hvor resultaterne anvendes som et estimat for alle efterfølgende analyser, selvom det skal huskes, at alle peptider i opløsning måles, og ikke alle disse er neuropeptider29. Andre begrænsninger ved denne metode omfatter potentielle forstyrrelser til ikke-polære og hydrofobe neuropeptider og manglen på indfødt strukturbevarelse. Ændringer af opløsningsmiddelsammensætninger og -materialer, f.eks. anvendelse af opløsninger, der er mere hydrofobe, eller udeladelse af anvendelsen af organiske opløsningsmidler, kan udføres for at imødegå dette.

MALDI-MS-målinger er afhængige af omhyggelige prøveforberedelsestrin for ensartede resultater og kan have andre prøveovervejelser end for LC-ESI-MS-målinger. Trin som at holde neuropeptidekstrakt på is før MS-analyse anvendes stadig. Yderligere metoder til forebyggelse af neuropeptidnedbrydning omfatter at holde glasdias indeholdende optøningsmonterede vævssektioner i en tørremiddelkasse efter dissektion for at forhindre kondens i at akkumulere30, selvom det også kan resultere i nedbrydning af prøverne at lade vævsprøven være i ekssikkatoren, efter at den er tørret. Det foreslås at placere vævsglider i en vakuumtørrer (sluttryk: 1x10-4 Torr ved stuetemperatur) i 5-10 minutter umiddelbart før matrixpåføring. Når matricen er deponeret på vævsdiaset, kan den opbevares i køleskabet eller fryseren natten over og tørres i vakuumtørreren inden MALDI-MS-billeddannelsesmåling. For MALDI-spotmålinger er matrixpeptidkrystalstrukturen ikke ligeligt fordelt i hele MALDI-målet godt, selvom det ser sådan ud. Der er måder at afbøde massespektrevariationer fra tekniske replikater på grund af denne proces. Først skal du erhverve et gennemsnitligt spektrum fra hver brønd ved hjælp af flere laserskud (typisk hundreder til tusinder), hvor laseren tilfældigt rasteres over brønden (dvs. vælge SMART eller tilfældig prøvebærerbevægelse i instrumentparametre). Få mindst fem tekniske replikater for hver prøvetype, og vælg tre tekniske replikater, hvor variationen i signalintensiteten for de ønskede toppe er den laveste. Afvejningerne her er eksperimentel gennemstrømning. Det er nødvendigt at holde parametre som antallet af laserskud, laserdiameter og andre instrumentindstillinger konsistente for alle erhvervede spektre. Ideelt set analyseres alle tekniske replikater og biologiske replikater på samme tid ved hjælp af den samme matrixopløsning og instrumentkalibrering. Neuropeptididentifikation kan udføres ved nøjagtig massematchning til en topliste, der indeholder teoretiske [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, [M+K]+ og andre salttildukter, der producerer individuelt ladede ion-m/z-værdier . Normalisering af data er afgørende for at minimere systematiske artefakter fra MALDI-MS-eksperimenter. Evaluering af reproducerbarhed er især vigtig, når MALDI-MS-spotmålinger anvendes til neuropeptidkvantificering ved stabil isotopmærkning (SIL). Kvaliteten af prøveforberedelse og dataindsamling kan evalueres ved at tage en peptidstandard eller neuropeptidekstrakt, opdele den i to lige store alikvoter, differentieret mærke hver prøve med SIL og analysere prøven for at sikre, at den relative intensitet af parrede toppe er 1: 1. Den variation, der rapporteres fra disse forhold, kan bruges til at estimere variansniveauet i det samlede eksperiment, der tilskrives brugerfejl.

Det er vigtigt at bemærke, at MALDI-MS også er i stand til at levere sekvens og kvantitativ information; De entalligt ladede ioner, der typisk produceres ved MALDI, begrænser imidlertid peptidfragmentdetektion, hvilket gør det vanskeligere at opnå den komplette sekvens og hæmmer de kvantationsmetoder, der diskuteres for LC-ESI-MS. Uanset hvad er MALDI-MS en attraktiv modalitet på grund af dens evne til høj gennemstrømning samt en højere tolerance for salte og urenheder i prøven12,31. Derudover har MALDI-MS-billeddannelse fordele i forhold til andre konventionelle billeddannelsesteknikker, der kræver antistoffer. I de fleste MS-modaliteter vil sænkning af masseopløsningen øge følsomheden, hvilket muliggør forbedret påvisning af neuropeptider med lav overflod. Denne strategi kan være mere praktisk for MALDI-TOF/TOF-instrumenter end LC-ESI-MS-instrumenter på grund af den lette kalibrering af MALDI-instrumentet for hvert forsøg. En anden måde, hvorpå MALDI kan være fordelagtig for neuropeptidomics, er gennem spektregennemsnit. Typisk anvendes gennemsnitlige spektre fra LC-ESI-MS-målinger ikke, fordi det negerer fordelene ved LC-adskillelse; derfor er bioinformatiksoftware stærkt afhængig af at identificere neuropeptider, og identifikationerne verificeres manuelt. Der er dog færre konsekvenser for gennemsnitlige spektre fra MALDI-MS-målinger, fordi der ikke var nogen indledende adskillelse; derfor er de rå data mindre og lettere for en bruger at kæmme manuelt igennem. Nem datastyring er vigtig, da det ændrer den rækkefølge, hvori brugeren kan nærme sig neuropeptididentifikations- og verifikationsstrategier. Mens tilliden til neuropeptididentifikationer fra LC-ESI-MS kunne drage fordel af at øge niveauet af tærskelstrenghed inden for dataanalysesoftware, er denne strategi mindre tilbøjelig til at gavne MALDI-MS-identifikationer. I eksemplet med krebsdyrneuropeptider gør det faktum, at der er mindre end 1000 poster fra den laboratoriebyggede database (dvs. maksimalt < 1000 spektrale toppe eller MS-billeder til manuel scanning igennem), det muligt først at filtrere MALDI-MS-dataene med en generøs massefejltærskel og derefter manuelt verificere disse identifikationer ved at undersøge isotopkonvolutterne på MS1-niveau, samt andre verifikationsmetoder, der diskuteres i afsnittet Repræsentative resultater. Populær MS-billeddannelsesdataanalysesoftware kan udføre nøjagtig massematchning til en neuropeptidmassedatabase og udtrække de tilsvarende MS-billeder. For klinisk baserede forskningsspørgsmål, såsom biomarkøropdagelse, er denne software i stand til at udtrække m/ z-værdier, der er unikke for en vævsregion af interesse (typisk kaldet Region of Interest (ROI) analyse)32 og udføre statistiske tests for at kvantificere, hvor forskellige to vævsregioner er. Det er også værd at bemærke, at der også er færre muligheder for dataanalysesoftware til MS-billeddannelse end til LC-ESI-MS.

Udførelse af LC-ESI-MS-databasesøgninger efter neuropeptider indebærer almindeligvis brugen af softwarealgoritmer bygget til analyse af fordøjede peptider. Som sådan er der begrænsninger for, at software kan udføre uspecifikke enzymdatabasesøgninger eller den tid, det tager at fuldføre søgningen. I øjeblikket udføres endogene peptidsøgninger med det maksimale antal ubesvarede spaltninger, men dette antal er stadig begrænset, hvilket fører til potentielt ubesvarede identifikationer. Når genomet for en art ikke er fuldt sekventeret, som med C. sapidus, kan de novo-sekventering udføres for at identificere ukendte/nye neuropeptider gennem kendte konserverede neuropeptidsekvensmotiver, selvom denne metode ikke identificerer neuropeptider, der har ukendte motiver eller ikke indeholder de motiver, der anvendes som neuropeptidfamilieidentifikatorer19. For eksempel er WSSMRGAWamide et motiv for allatostatin B-type neuropeptidfamilien19. Heri ligger betydningen af transkriptomminedrift for forudsagte neuropeptidsekvenser for arter uden en fuldstændig afkodet genomsekvens33. Neuropeptididentifikationer bekræftes derefter ved at syntetisere den formodede peptidsekvens og sammenligne MS / MS-spektrene fra syntetisk peptid og biologisk væv34. Selv efter at en sekvens er verificeret, er det undertiden ukendt, om det er den fulde neuropeptidsekvens eller et nedbrydningsprodukt. Det er værd at bemærke, at forskelle mellem MALDI og ESI-MS-ioniseringskilder (ESI er en blødere ioniseringsmetode end MALDI) kan resultere i forskellige hastigheder af kunstig nedbrydning (dvs. fragmentering i kilden). For at skelne mellem en afkortet version af et peptid og et kunstigt induceret (dvs. ikke in vivo) nedbrydningsprodukt skal præprohormonbehandlingsvejen for det pågældende neuropeptid være kendt. Da dette ofte ikke er tilfældet, bør en syntetisk form af peptidet anvendes i fysiologiske assays og verificeres for biologisk aktivitet.

Samlet set kan arbejdsgangen eksemplificeret her til neuropeptidanalyse gavne en række forskellige felter. Det udfylder et teknisk hul inden for mellem-down MS-analyse af peptider, fordi det er optimeret til endogene peptider, der er mindre end proteiner, der typisk analyseres ved bottom-up eller top-down MS-analyser. Derfor bør de prøveforberedelsesmetoder, der anvendes af neuropeptidomics, stort set kunne oversættes til andre bioaktive endogene peptider, såsom dem, der er målrettet af medicinske kemikere for antibakterielle egenskaber35. En fordel ved denne protokol er, at den bruger almindelige instrumenter fra populære leverandører, der også tilbyder en ekstra grad af oversættelighed. På denne måde kan arbejdsgangen bruges i akademiske og kommercielle sammenhænge, såsom screening for farmaceutiske lægemiddelkandidater eller lægemiddelmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af National Science Foundation (CHE-1710140 og CHE-2108223) og National Institutes of Health (NIH) gennem tilskud R01DK071801. A.P. blev delvist støttet af NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. blev delvist støttet af National Institutes of Health under Ruth L. Kirschstein National Research Service Award fra National Heart Lung and Blood Institute til University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. vil gerne anerkende NIH-tilskud R56 MH110215, S10RR029531 og S10OD025084 samt finansieringsstøtte fra et Vilas Distinguished Achievement Professorat og Charles Melbourne Johnson Professorat med finansiering fra Wisconsin Alumni Research Foundation og University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix Supelco 39319
Acetic acid Fisher Chemical A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A955-500
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
Borane pyridine Sigma-Aldrich 179752
Bruker peptide calibration mix Bruker Daltonics NC9846988
Capillary Polymicro 1068150019 to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup Sigma-Aldrich E6032 any cup or mold should work
 Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30108434
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde - D2 Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Optima LC/MS grade Fisher Chemical A117-50
Gelatin Difco 214340 place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen Vector Labs 15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides Delta Technologies CB-90IN-S107 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials Thermo TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade Fisher Chemical A456-500
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 Hydrophobic film
pH-Indicator strips Supelco 109450
Red phosphorus clusters Sigma-Aldrich 343242
Reversed phase C18 material Waters 186002350 manually packed into nanoflow column
Wite-out pen BIC 150810
ZipTip Millipore Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5 HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R Eppendorf 05-401-205
Cryostat- HM 550 Thermo Fisher Scientific 956564A
Desiccant Drierite 2088701
Forceps WPI 501764
MALDI stainless steel target plate Bruker Daltonics 8280781
Pipet-Lite XLS Rainin 17014391 200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100 Savant SVC-100D
Ultrasonic Cleaner Bransonic 2510R-MTH for sonication
Ultrasonic homogenizer Fisher Scientific FB120110 FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A Ideal Vacuum Products P10976 ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer Corning 6775
Water bath (37C) - Isotemp 110 Fisher Scientific 15-460-10
Data Analysis Software
Expasy https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis Bruker Daltonics
FlexControl Bruker Daltonics
FlexImaging Bruker Daltonics
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab https://scils.de/
SignalP 5.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMS=tblastn&PAGE_
TYPE=BlastSearch&SHOW_
DEFAULTS=on&LINK_LOC
=blasthome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
  2. Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
  3. Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, clifton, N.J. 71-101 (1997).
  4. Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
  5. Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
  6. Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
  7. Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
  8. Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
  9. Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
  10. Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
  11. Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
  12. Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
  13. Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
  14. Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
  15. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
  16. Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
  17. Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
  18. Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
  19. DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
  20. Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
  21. Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
  22. Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
  23. DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
  24. Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
  25. Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
  26. Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
  27. Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
  28. Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
  29. Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
  30. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  31. Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
  32. Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
  33. Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
  34. Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
  35. Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).

Tags

Kemi udgave 183 neuropeptid massespektrometri peptidrensning isotopmærkning de novo-sekventering kvantificering LC MALDI massespektrometribilleddannelse databasesøgning transkriptomminedrift
Mangesidet massespektrometrisk undersøgelse af neuropeptider i <em>Callinectes sapidus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L.… More

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus. J. Vis. Exp. (183), e63322, doi:10.3791/63322 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter