Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Mångfacetterad masspektrometrisk undersökning av neuropeptider i Callinectes sapidus

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/63322
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison
* These authors contributed equally

Summary

Masspektrometrisk karakterisering av neuropeptider ger sekvens-, kvantifierings- och lokaliseringsinformation. Detta optimerade arbetsflöde är inte bara användbart för neuropeptidstudier, utan också andra endogena peptider. Protokollen som tillhandahålls här beskriver provberedning, MS-förvärv, MS-analys och databasgenerering av neuropeptider med LC-ESI-MS, MALDI-MS-spotting och MALDI-MS-avbildning.

Abstract

Neuropeptider är signalmolekyler som reglerar nästan alla fysiologiska och beteendemässiga processer, såsom utveckling, reproduktion, matintag och svar på yttre stressfaktorer. Ändå är de biokemiska mekanismerna och det fullständiga komplementet av neuropeptider och deras funktionella roller fortfarande dåligt förstådda. Karakterisering av dessa endogena peptider hindras av den enorma mångfalden inom denna klass av signalmolekyler. Dessutom är neuropeptider bioaktiva vid koncentrationer 100x - 1000x lägre än för neurotransmittorer och är benägna att enzymatisk nedbrytning efter synaptisk frisättning. Masspektrometri (MS) är ett mycket känsligt analysverktyg som kan identifiera, kvantifiera och lokalisera analyter utan omfattande a priori-kunskap . Det är väl lämpat för global profilering av neuropeptider och hjälper till att upptäcka nya peptider. På grund av den låga mängden och den höga kemiska mångfalden i denna klass av peptider har flera provberedningsmetoder, MS-förvärvsparametrar och dataanalysstrategier anpassats från proteomiktekniker för att möjliggöra optimal neuropeptidkarakterisering. Här beskrivs metoder för att isolera neuropeptider från komplexa biologiska vävnader för sekvenskarakterisering, kvantifiering och lokalisering med hjälp av vätskekromatografi (LC)-MS och matrisassisterad laserdesorption/jonisering (MALDI)-MS. Ett protokoll för att förbereda en neuropeptiddatabas från blå krabban, Callinectes sapidus, en organism utan omfattande genomisk information, ingår. Dessa arbetsflöden kan anpassas för att studera andra klasser av endogena peptider i olika arter med hjälp av en mängd olika instrument.

Introduction

Nervsystemet är komplext och kräver ett nätverk av neuroner för att överföra signaler genom en organism. Nervsystemet samordnar sensorisk information och biologiskt svar. De invecklade och invecklade interaktionerna som är involverade i signalöverföring kräver många olika signalmolekyler såsom neurotransmittorer, steroider och neuropeptider. Eftersom neuropeptider är de mest mångsidiga och potenta signalmolekylerna som spelar nyckelroller för att aktivera fysiologiska svar på stress och andra stimuli, är det av intresse att bestämma deras specifika roll i dessa fysiologiska processer. Neuropeptidfunktionen är relaterad till deras aminosyrastruktur, som bestämmer rörlighet, receptorinteraktion och affinitet1. Tekniker som histokemi, vilket är viktigt eftersom neuropeptider kan syntetiseras, lagras och släppas i olika regioner i vävnaden, och elektrofysiologi har använts för att undersöka neuropeptidstruktur och funktion 2,3,4, men dessa metoder begränsas av genomströmning och specificitet för att lösa den stora sekvensdiversiteten av neuropeptider.

Masspektrometri (MS) möjliggör analys av hög genomströmning av neuropeptidstruktur och överflöd. Detta kan utföras genom olika MS-tekniker, oftast vätskekromatografi-elektrosprayjonisering MS (LC-ESI-MS)5 och matrisassisterad laserdesorption/jonisering MS (MALDI-MS)6. Genom att använda massmätningar med hög noggrannhet och MS-fragmentering ger MS möjlighet att tilldela aminosyrasekvens och post-translationell modifiering (PTM) -status till neuropeptider från komplexa blandningar utan förkunskaper för att hjälpa till att fastställa deras funktion 7,8. Förutom kvalitativ information möjliggör MS kvantitativ information om neuropeptider genom etikettfri kvantifiering (LFQ) eller etikettbaserade metoder såsom isotopisk eller isobar märkning9. De främsta fördelarna med LFQ inkluderar dess enkelhet, låga analyskostnader och minskade provberedningssteg som kan minimera provförlusten. Nackdelarna med LFQ inkluderar dock ökade instrumenttidskostnader eftersom det kräver flera tekniska replikat för att hantera kvantitativa fel från körning-till-kör-variabilitet. Detta leder också till en minskad förmåga att exakt kvantifiera små variationer. Etikettbaserade metoder utsätts för mindre systematisk variation eftersom flera prover kan märkas differentiellt med hjälp av en mängd stabila isotoper, kombineras till ett prov och analyseras genom masspektrometri samtidigt. Detta ökar också genomströmningen, även om isotopetiketter kan vara tidskrävande och kostsamma att syntetisera eller köpa. Full scan mass spectra (MS1) spektral komplexitet ökar också när multiplexering ökar, vilket minskar antalet unika neuropeptider som kan fragmenteras och därför identifieras. Omvänt ökar isobar märkning inte spektralkomplexiteten på MS1-nivå, även om den introducerar utmaningar för analyter med låg förekomst, såsom neuropeptider. Eftersom isobar kvantifiering utförs på fragmentjonmasspektranivå (MS2) kan neuropeptider med låg förekomst inte kvantifieras eftersom mer rikliga matriskomponenter kan väljas för fragmentering och de utvalda kanske inte har tillräckligt hög förekomst för att kvantifieras. Med isotopmärkning kan kvantifiering utföras på varje identifierad peptid.

Förutom identifiering och kvantifiering kan lokaliseringsinformation erhållas av MS genom MALDI-MS-avbildning (MALDI-MSI)10. Genom att rastrera en laser över en provyta kan MS-spektra sammanställas till en värmekartbild för varje m/z-värde . Kartläggning av övergående neuropeptidsignalintensitet i olika regioner över förhållanden kan ge värdefull information för funktionsbestämning11. Lokalisering av neuropeptider är särskilt viktigt eftersom neuropeptidfunktionen kan variera beroende på plats12.

Neuropeptider finns i lägre förekomst in vivo än andra signalmolekyler, såsom neurotransmittorer, och kräver därmed känsliga metoder för detektion13. Detta kan uppnås genom avlägsnande av matriskomponenter med högre överflöd, såsom lipider11,14. Ytterligare överväganden för analys av neuropeptider måste göras jämfört med vanliga proteomikarbetsflöden, främst för att de flesta neuropepidiomiska analyser utelämnar enzymatisk matsmältning. Detta begränsar programvarualternativen för neuropeptiddataanalys eftersom de flesta byggdes med algoritmer baserade på proteomikdata och proteinmatchningar informerade av peptiddetektering. Men många program som PEAKS15 är mer lämpade för neuropeptidanalys på grund av deras de novo-sekvenseringsfunktioner. Flera faktorer måste beaktas för analys av neuropeptider från extraktionsmetod till MS-dataanalys.

Protokollen som beskrivs här inkluderar metoder för provberedning och dimetylisotopmärkning, datainsamling och dataanalys av neuropeptider av LC-ESI-MS, MALDI-MS och MALDI-MSI. Genom representativa resultat från flera experiment demonstreras nyttan och förmågan hos dessa metoder att identifiera, kvantifiera och lokalisera neuropeptider från blå krabbor, Callinectes sapidus. För att bättre förstå nervsystemet används ofta modellsystem. Många organismer har inte ett helt sekvenserat genom tillgängligt, vilket förhindrar omfattande neuropeptidupptäckt på peptidnivå. För att mildra denna utmaning ingår ett protokoll för att identifiera nya neuropeptider och transkriptombrytning för att generera databaser för organismer utan fullständig genominformation. Alla protokoll som presenteras här kan optimeras för neuropeptidprover från vilken art som helst, samt tillämpas för analys av alla endogena peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All vävnadsprovtagning som beskrivs utfördes i enlighet med University of Wisconsin-Madisons riktlinjer.

1. LC-ESI-MS-analys av neuropeptider

  1. Neuropeptid extraktion och avsaltning
    1. Före vävnadsförvärv, förbered surgjord metanol (acMeOH) (90: 9: 1 MeOH: vatten: ättiksyra) enligt beskrivningen i16.
    2. Samla hjärnvävnad från kräftdjuret17 och använd pincett för att omedelbart placera en vävnad vardera i ett 0,6 ml rör som innehåller 20 μl acMeOH.
      OBS: Vävnadsdissektionsprotokoll varierar mycket för olika djur och olika vävnadstyper. Läsaren hänvisas till protokoll17 för en detaljerad beskrivning av hur man dissekerar hjärnvävnad och flera andra vävnadstyper från kräftdjuret. Proverna kan förvaras vid -80 °C tills de används (helst inom 6 månader). De beskrivna volymerna används för en enda hjärna från Callinectes sapidus. Volymer bör skalas för vävnadsstorlek. Vävnad kan blixtfrysas omedelbart utan lösningsmedel, även om detta inte rekommenderas eftersom endogena proteolytiska enzymer inte kommer att hämmas och förbli aktiva, men i långsammare takt när det är kallt.
    3. Tillsätt 150 μL acMeOH till provet. Ställ in den totala ultraljudsbehandlingstiden till 24 s, pulstid till 8 s, paustid till 15 s och amplitud till 50% på en ultraljudshomogenisator och homogenisera proverna på is.
      OBS: Det finns olika homogeniseringssystem tillgängliga. Justera inställningar och förhållanden enligt provtyp och utrustning.
    4. Centrifugera provet vid 4 °C vid 20 000 x g i 20 minuter. Överför supernatanten med pipett i ett rör och torka den i en vakuumkoncentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) vid cirka 35 °C.
      OBS: De torkade proverna kan förvaras vid -80 °C tills de används (helst inom 6 månader). Uppvärmning av vakuumkoncentratorn måste utföras med försiktighet. Medan värme förkortar torrtiden måste provet avlägsnas från koncentratorn omedelbart efter att all vätska har avdunstat för att minimera peptidnedbrytningen. För att undvika detta kan uppvärmning utelämnas från detta och alla efterföljande steg.
    5. För avsaltning, rekonstituera det extraherade vävnadsprovet i 20 μL av 0,1% myrsyra (FA), virvelbrunn och ultraljudsbehandling i ett vattenbad vid rumstemperatur i 1 min.
      OBS: Det finns olika avsaltningsmaterial tillgängliga. Justera lösningarna och volymerna enligt hartsidentiteten och neuropeptidmängden. Den totala peptidmängden kan uppskattas med hjälp av en kommersiell peptidkvantifieringsanalys (se materialtabell).
    6. Applicera 0,5 μl prov på en pH-remsa för att bekräfta att pH-värdet < 4. Om pH-värdet är högre, tillsätt 1 μL alikvoter på 10% FA tills pH < 4.
    7. Följ tillverkarens protokoll för avsaltning18. Bered en vätlösning innehållande 100 μl 50 % acetonitril (ACN), jämviktslösning innehållande 100 μl 0,1 % FA, tvättlösning innehållande 100 μl 0,1 % FA och elueringslösningar innehållande 20 μl 25 % ACN/0,1 % FA, 20 μL 50 % ACN/0,1 % FA och 20 μL 75 % ACN/0,1 % FA.
    8. Skaffa en 10 μL avsaltningsspets med C18-harts (se materialtabell).
    9. Placera avsaltningsspetsen på en 20 μL pipett som är inställd på 15 μL. När avsaltningsspetsen är våt, förhindra att luft passerar genom att hålla pipetten nedtryckt när den är ur lösningen tills den kommer att kasseras.
    10. Aspirera spetsen 3x med vätlösning och 3x med jämviktslösning. Aspirera i provet 10x följt av tvätt 3x i tvättlösning och kassera varje tvätt. Eluera genom att aspirera 10x i var och en av elueringslösningarna i ordning för att öka ACN.
      OBS: Elueringsfraktioner kan hållas åtskilda eller kombineras för ytterligare analyser.
    11. Kassera den använda avsaltningsspetsen och torka de eluerade neuropeptiderna i en vakuumkoncentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) vid cirka 35 °C.
      OBS: Detta kan förvaras vid -80 °C tills det används (helst inom 6 månader).
  2. Isotopmärkning av neuropeptider i vävnadsextrakt
    OBS: Detta steg är valfritt och används endast när kvantifiering önskas.
    1. Bered 2-plex isotopisk dimetylmärkningslösning i en dragskåp: 1%CH2OH2(13,5 μL stam 37 vikt/viktprocent (vikt %) i vattenlösning i 486,5 μl vatten), 1%CH2OD2 (25 μL stam 20 vikt % lösning i 475 μl vatten) och 0,03 M boranpyridin (3,75 μl stamlösning 8 M i 996,25 μl vatten).
      VARNING: Formaldehyd är giftigt, så alla lösningar bör förvaras i en ventilerad huva. Använd handskar, labbrock, ögonskydd och ogenomträngliga skor. Kontaktlinser ska inte bäras när du arbetar med detta material.
      OBS: Det finns olika isotopreagenser; välj lämpliga baserat på provtyp och antal önskade märkningskanaler.
    2. Lös rå neuropeptid extrakt i 10 μL vatten och sonikat för 10 min.
    3. Tillsätt 10 μl av en annan isotopformaldehydlösning (dvs.CH2OH2,CH2OD2 osv.) till varje enskilt experimentellt tillstånd som skall mätas kvantitativt. Virvel för att blanda väl och kort centrifugera varje prov vid 2 000 x g.
    4. Tillsätt 10 μl 0,03 M boranpyridin till varje provrör. Virvel för att blanda väl och kort centrifugera varje prov vid 2 000 x g.
    5. Inkubera proverna i 15 minuter vid 37 °C i ett vattenbad.
    6. Ta bort proverna från vattenbadet och tillsätt 10 μl 100 mM ammoniumbikarbonat. Virvel för att blanda väl och kort centrifugera varje prov vid 2 000 x g.
    7. Kombinera de märkta proverna för ett 2-plexprov och torka neuropeptiderna i en vakuumkoncentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) vid cirka 35 °C.
    8. Avsalta de märkta neuropeptiderna genom att reperforma steg 1.1.5 - 1.1.10 och lagra dem tills de är klara för datainsamling.
  3. Datainsamling
    1. Rekonstituera de torkade avsaltade neuropeptiderna i 12 μL av 3% ACN/0,1% FA, virvelbrunn, ultraljudsbehandling i 37 °C vattenbad i 1 min och centrifugera kort vid 2 000 x g. Överför varje prov till autosamplerflaskor.
      OBS: Justera provvolymen enligt neuropeptidmängden till en koncentration av ~ 1 μg peptid per μL. Total peptidmängd kan uppskattas med hjälp av en kommersiell peptidkvantifieringsanalys (se materialtabell).
    2. Använd en autosampler för att injicera 1 μL prov i ett högupplöst nano-LC-MS/MS-instrument (se materialtabell).
    3. Använd en cirka 15 cm lång C18-kolonn med omvänd fas (RP) (se materialtabell) för att köra provet med 0,1 % FA i vatten som mobil fas A och 0,1 % FA i ACN som mobil fas B. Kör proverna med en gradient på 3 % – 95 % av B med en hastighet av 300 nL/min i över 11 minuter.
    4. För det MS-instrument som används här, använd vanliga MS-förhållanden på 2,00 kV för sprutspänning och 275 °C för kapillärtemperatur.
    5. Skaffa MS-spektra i intervallet 200 - 2 000 m/z med en upplösning på 60 000, mål för automatisk förstärkningskontroll (AGC) på 1 x 106 och maximal joninjektionstid (IT) på 150 ms.
    6. Välj de 15 mest intensiva jonerna (minsta intensitet på 3,2 x 104) för fragmentering av kollisionsdissociation med högre energi (HCD) med en normaliserad kollisionsenergi på 30, isoleringsfönster på 2,0 m /z, upplösning på 15 000, ett AGC-mål på 2 x 105 och max IT på 250 ms.
    7. Ställ in ett dynamiskt uteslutningsfönster på 30 s. Uteslut joner med en laddning på 1 eller ≥ 8 och joner med okända laddningstillstånd.
  4. Neuropeptididentifiering och kvantifiering
    OBS: Många program för databassökning och peptidkvantifiering (både öppen källkod och kommersiell) finns tillgängliga. Här kommer PEAKS Studio (proteomics software)15 att användas.
    1. Utför databassökning med hjälp av stegen som beskrivs i 1.4.2 - 1.4.6.
    2. Skapa ett nytt projekt och lägg till LC-MS-data som väljer Ingen för enzymet, Orbitrap för instrumentet, HCD för fragmentet och databeroende förvärv (DDA) för förvärv.
      Välj lämpliga parametrar baserat på datainsamlingsparametrar.
    3. Välj Identifieringar och välj Korrekt föregångare [DDA] och Endast massa.
    4. Välj Databassökning och ställ in en feltolerans på 20,0 ppm med monoisotopisk massa för prekursormassa och 0,02 Da för fragmentjonmassa, Ingen för enzymtyp, Ospecifik för smältläge, 100 för maximalt missade klyvningar och följande variabla PTM med den maximalt tillåtna variabeln PTM per peptid på 3: Amidation, Oxidation (M), Pyro-glu från E, och Pyro-glu från Q.
    5. Välj Neuropeptide Database, uppskatta falsk upptäcktshastighet (FDR) med lockbete-fusion.
      OBS: Masstoleransfelet bör justeras för att matcha de insamlade uppgifterna. Använd lämplig databas för exempeltypen. När inget enzym väljs påverkar inte parametern max missade klyvningar sökningen. Ett stort antal missade klyvningar krävs dock om programvaran inte har det ospecificerade sammanfattningsläget som ett alternativ.
    6. Om etikettfri kvantifiering önskas väljer du Kvantifiering, väljer Etikettfri och anger en feltolerans på 20,0 ppm och kvarhållningstidstolerans på 1,0 min.
    7. Utför prekursorjonkvantifiering om steg 1.2 för isotopmärkning utfördes.
      1. Välj Kvantifiering, välj Precursor Ion Quantification, använd ett kvarhållningstidsintervall på 1,0 min och använd en FDR-tröskel på 1 %.
      2. Välj en förinställd eller anpassad kvantifieringsmetod i listrutan Välj metod .
      3. Om du vill skapa en ny anpassad metod klickar du på Fönster > Konfiguration > Etikett Q-metod > Ny. Namnge den nya metoden och välj Precursor Ion Quantification för Method Type. Välj Lägg till rad och välj ändring i listan PTM-alternativ.
      4. Lägg till LC-MS-data och välj Referensvillkor som modifiering på neuropeptider från experimentets kontrolltillstånd.
    8. Utvärdera sökresultaten enligt beskrivningen i steg 1.4.9 - 1.4.11.
    9. Filtrera resultaten genom sammanfattningsfliken för peptider och proteiner med -10lgP ≥ 20, välj ≥ 1 unik peptid och välj ruta märkt med signifikanta peptider.
    10. Utvärdera databasens sökresultat där Protein.csv representerar neuropeptididentifieringar och Peptid.csv representerar neuropeptidfragmentidentifieringar.
    11. Inspektera databassökningen efter protein- och peptidpoäng, massnoggrannhet och sekvenstäckning.
      Obs: Varje databassökningsprogramvara använder unika poängalgoritmer och kan behöva utvärderas i enlighet därmed. Identifieringar kan utvärderas genom att manuellt inspektera de observerade spektra för identifierade peptider som innehåller hela fragmentjonserien.

2. MALDI-MS spotting analys av neuropeptider

  1. Provberedning
    1. Följ steg 1.1 eller steg 1.1 - 1.2 om kvantifiering önskas, exklusive steg 1.2.8 (avsaltning efter isotopmärkning krävs inte före MALDI-MS-analys).
    2. Rekonstituera de torkade avsaltade neuropeptiderna i 5 μL av 0,1% FA, virvelbrunn, ultraljudsbehandling i ett 37 ° C vattenbad i 1 min och centrifugera kort vid 2,000 x g.
    3. För spotting av neuropeptider i kräftdjursvävnader, förbered 150 mg / ml 2,5-dihydroxibensoesyra (DHB) i 50% metanol (MeOH) / 0,1% FA (v / v) som matrisen.
    4. Pipettera en 3 μL droppe prov på en hydrofob film (se materialtabell) och pipettera 3 μL av matrisen direkt på provdroppen. Pipettera upp och ner för att blanda.
    5. Pipettera över 1 μl av 1:1-provet: matrisblandning till en brunn av MALDI-målplattan i rostfritt stål. Använd pipettspetsen för att sprida ut varje blandning till kanterna på provbrunnen. Provet måste vidröra kanterna på brunnsgravyren för att underlätta en jämn fördelning (figur 4A).
    6. Punkt 1 μL av 1:1 kalibrant:matrisblandning (kommersiell eller anpassad kalibreringsblandning, polymermaterial (dvs. röd fosfor upplöst i MeOH) eller vanliga matrisklusterjoner)12 i en brunn nära provet.
      OBS: Röd fosfor behöver inte blandas med matris innan den spottas.
  2. Datainsamling
    1. Sätt in målplattan med torkade provfläckar i INSTRUMENTET MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (se materialtabell).
    2. För DHB-matris ställer du in lasereffekten på 95 %, väljer Automatisk optimal detektorförstärkning och Smart - Komplett provbärarrörelseläge . Skaffa MS-spektra i intervallet 200 - 3200 m / z och lägg till flera spektra från varje plats tillsammans för att öka neuropeptidsignal-brusförhållandet.
      OBS: Optimera procent lasereffekt, detektorförstärkning och välj lämpligt provbärarrörelseläge så att varje förvärv täcker ungefär hela platsen och efterföljande förvärv inte går till tidigare positioner.
    3. Kalibrera instrumentet.
      OBS: Justera massområdet för att omfatta önskat neuropeptidintervall.
  3. Analys av data
    1. Öppna FILEN MALDI-MS i dataanalysprogramvara (se Materialtabell) och klicka på Baseline Subtraction för den programvara som används här.
    2. Utför toppplockning genom att klicka på Sök masslista. Om det finns för få toppar, redigera masslistan manuellt genom att välja Redigera masslista och klicka på toppar i spektrumet för att lägga till dem i masslistan.
    3. Utför exakt massmatchning genom att jämföra masslistan med neuropeptiddatabasen som innehåller [M +H] + m / z-värden (± 200 ppm-fel). 
      OBS: Vanliga saltaddukter, såsom [M + K] +, [M + Na] + och [M + NH4] +, bör också inkluderas i den exakta massmatchande mållistan.
    4. För att verifiera de identifierade topparna, generera en lista över m / z av intresse och utför MS / MS-experiment.

3. MALDI-MS-avbildningsanalys av neuropeptider

  1. Beredning av prov
    OBS: Inbäddnings- och sektionssteg är inte nödvändiga för vävnader som är för tunna för att kunna sektioneras.
    1. Fyll en halv kryostatkopp med gelatin (37 °C, 100 mg/ml i avjoniserat vatten) och låt stelna vid rumstemperatur. Håll kvarvarande flytande gelatin varmt i ett 37 °C vattenbad.
    2. Samla önskad neuronal vävnad från djuret och använd pincett för att omedelbart doppa vävnaden i ett 0,6 ml rör som innehåller avjoniserat vatten i 1 s.
      OBS: Se steg 1.1.2 OBS för dissektion av neuronal vävnad.
    3. Placera vävnaden ovanpå det fasta gelatinet och fyll resten av kryostatkoppen med flytande gelatin. Använd pincett för att placera vävnaden.
    4. Placera kryostatkoppen på en plan yta och frys med torris.
      OBS: Förvara proverna vid -80 °C tills de används (helst inom 6 månader).
    5. För sektioneringsberedning, separera det gelatininbäddade provet från kryostatformen genom att skära bort formen.
    6. Montera den inbäddade vävnaden på en kryostatchuck genom att pipettera en 1 ml droppe avjoniserat vatten på chucken och omedelbart trycka den inbäddade vävnaden på droppen.
    7. När det är fruset, pipettera mer avjoniserat vatten runt vävnaden för att ytterligare säkra det till chucken. Utför dessa steg inuti kryostatlådan (se materialtabell) inställd på -20 °C.
    8. Sektionera vävnaden med en ungefärlig tjocklek av en cell (8-20 μm beroende på provtyp) och tina montera varje sektion på en indiumtennoxid (ITO) -belagd glasskiva genom att placera ena sidan av bilden nära sektionen och placera ett finger på andra sidan bilden för att långsamt värma glaset och låta sektionen hålla fast vid bilden.
      OBS: Vävnadssektioner kan också tinas genom att plocka upp ena kanten av gelatinet med pincett (kyld till -20 °C), placera den på den ITO-belagda glasskivan och placera ett finger på andra sidan bilden för att långsamt värma glaset och låta sektionen fastna på bilden.
    9. Upptäck provet som ska användas som en kalibrant (se steg 2.1.6 för kalibreringsalternativ) genom att rita en liten cirkel nära vävnadssektionen med hjälp av en hydrofob penna och upptäcka kalibranten inuti cirkeln.
    10. Markera varje hörn av bilden med en whiteout-penna med en liten form som innehåller skarpa kanter (dvs. x) som ska användas som undervisningspunkter.
    11. Placera glasskivan i MALDI-glidadapterplattan och ta en optisk bildskanning med hög upplösning (≥2400 DPI) med en skanner.
    12. Spraymatris på vävnadssektionen med en automatiserad spruta (se materialtabell för sprutdetaljer och instruktioner).
    13. För MSI av neuropeptider i kräftdjursvävnader använd 40 mg / ml DHB i 50% metanol / 0,1% FA (v / v) som matris, ställ in munstyckstemperaturen till 80 ° C, hastighet till 1,250 mm / min, flödeshastighet till 0,1 ml / min, antal pass till 12 och 30 s mellan varje pass för den automatiska sprutan.
  2. Datainsamling
    1. Sätt i den helt torkade målplattan som innehåller tiningmonterade vävnadssektioner som sprutades med matrisen.
    2. Ställ in parametrarna för MS-avbildningsförvärvsfilen så att laserdiametern är mindre än rasterstegets storlek.
    3. Ladda den skannade optiska bilden och kalibrera provplattan med hjälp av x-lärpunkterna. Definiera de vävnadsområden av intresse som ska mätas något större än den faktiska vävnadssektionen för att även inkludera områden som endast innehåller matris.
    4. Kalibrera instrumentet och införskaffa spektra i intervallet 200 - 3200 m/z. Justera massområdet för att omfatta önskat neuropeptidområde.
  3. Analys av data
    1. Om du vill bearbeta data importerar du MS Imaging-datauppsättning till önskad programvara, väljer en algoritm för borttagning av baslinjer och normaliserar data med hjälp av Totalt antal joner.
      OBS: Val av olika normaliseringsalgoritmer, såsom medianvärde, RMS-värde (root mean square) eller intensiteten för ett referens m /z-värde , kommer sannolikt att ändra den rumsliga fördelningen av många m / z-värden . Välj den normaliseringsalgoritm som passar bäst för önskade analyter.
    2. För att generera en bild för varje m /z-värde från en teoretisk topplista, ladda upp en kommaseparerad värdefil (CSV) som innehåller neuropeptid [M + H] +, [M + Na] +, [M + NH4] +, etc. Hämta m/z-värden genom att klicka på Arkiv > Importera > Topplista. Namnge topplistan.
    3. För att uppskatta lämplig ppm-feltröskel, identifiera först manuellt en neuropeptidtopp i MS-spektrumet och jämföra den med den neuropeptidteoretiska massan. Beräkna ppm-felet och klicka på Fil- > filegenskaper > intervallbredd och inmatningsmo ppm-fel.
    4. Välj topplistan i rullgardinsmenyn och klicka på Skapa m/z-bilder för varje intervall i topplistan.
    5. Spara varje m/z-bild genom att klicka på Spara skärmbild av varje m/z-bild.
      OBS: Förmodad neuropeptididentifiering kan utföras genom att identifiera m / z-bilder där analytsignalen endast är lokaliserad i vävnaden och inte i den omgivande matrisen.
    6. För att verifiera toppidentiteten genererar du en lista över m/z av intresse och utför MS/MS-experiment.

4. Upptäcka nya förmodade neuropeptider med de novo-sekvensering

  1. Utför steg 1.4.2 - 1.4.5.
  2. Exportera endast novo peptider.csv från PEAKS-programvaran med ett genomsnitt av lokal konfidenspoäng (ALC) på ≥ 75.
    DET finns många program tillgängliga för att utföra de novo-sekvensering , var och en med sina egna poängalgoritmer och bör utvärderas i enlighet därmed.
  3. Sök i peptidlistan efter kända sekvensmotiv som indikerar neuropeptider som tillhör specifika neuropeptidfamiljer19.
    OBS: Även om motiv vanligtvis är välbevarade över arter, bör de motiv som söks efter väljas med hänsyn till provorganismen.

5. Transkriptombrytning för förutsagda neuropeptidsekvenser

OBS: Detta steg är valfritt och används endast för att lägga till en befintlig neuropeptiddatabas eller bygga en ny neuropeptiddatabas.

  1. Välj en känd preprohormon aminosyrasekvens av intresse och använd tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LÄNK
    _LOC=blasthome) för att söka i frågepreprohormonsekvensen mot databaser inklusive nr/nt, Refseq_genomes, EST och TSA.
    OBS: För att söka frågesekvenser mot proteindatabasen, använd BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. Välj målorganismen (skatte-id) och ändra Parametrarna förvänta tröskelvärdesalgoritm till 1000 för att inkludera justeringar med låga poäng.
    2. Kör BLAST-programmet och kontrollera sedan resultaten för höga homologipoäng mellan fråge- och ämnessekvenser som ger betydande justeringar. Spara FASTA-fil som innehåller nukleotidsekvens.
      OBS: Om det finns flera ämnessekvenser med liknande homologipoäng, utför en MAFFT-justering för att begränsa förmodade sekvenser 20,21.
  2. Översätt preprohormonnukleotidsekvens till preprohormonpeptidsekvenser med hjälp av Expasy Translate-verktyget (https://web.expasy.org/translate/). För C. sapidus väljer du Ryggradslösa mitokondriella som genetisk kod.
  3. Kontrollera om det finns signalpeptidsekvens och prohormonklyvningsställen i peptidsekvenserna med hjälp av SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    OBS: Homologi till kända preprohormon bearbetningsscheman kan också användas för att identifiera prohormon klyvningsställen. Möjliga post-translationella modifieringar för signalpeptider kan förutsägas om så önskas. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) kan användas för att förutsäga sulfateringstillstånd för tyrosinrester. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) kan användas för att förutsäga disulfidbindningsanslutning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arbetsflödet för provberedning och MS-analys visas i figur 1. Efter dissektion av neuronal vävnad utförs homogenisering, extraktion och avsaltning för att rena neuropeptidprover. Om isotopisk etikettbaserad kvantifiering önskas, märks och avsaltas prover igen. Det resulterande provet analyseras genom LC-MS / MS för neuropeptididentifiering och kvantifiering.

Neuropeptider som identifieras genom proteomikprogramvaran bör ha god peptidfragmenteringssekvenstäckning, men detta är inte globalt definierat eller standardiserat. För absolut identifiering bör varje aminosyra producera en fragmentjon som ger entydig identifiering och lokalisering. Detta måste också jämföras med en syntetiserad peptid för bekräftelse av intensiteten hos varje fragmentjon. Eftersom kostnaden för att utföra detta på varje förmodad identifiering inte är genomförbar, beskrivs identifiering vanligtvis baserat på konfidens där fler observerade fragmentjoner ökar peptididentifieringsförtroendet. Medan figur 2A,B visar två neuropeptider som båda identifierades med 100% sekvenstäckning och ett lågt massfel enligt definitionen av maxgränsen på 0,02 Da, minskar den dåliga fragmenteringstäckningen (från endast tre joner) som endast observerats för neuropeptid i figur 2B förtroendet för identifiering av en specifik isoform. Figur 2C visar de extraherade jonkromatogrammen (XICs), som är ett diagram som innehåller signalintensiteten för ett valt m / z-värde som en funktion av retentionstiden, för en neuropeptid detekterad i två prover som används för LFQ. Retentionstiderna för neuropeptid skiljer sig något eftersom den identifierades i två separata och på varandra följande körningar; skillnaden ligger dock inom det tillförlitliga tröskelvärdet på 1 min. Således används förhållandet mellan det mjukvaruberäknade området under kurvan från XIC för LFQ för denna neuropeptid.

För kvantifiering av dimetylmärkta neuropeptider bör MS1-spektrumet innehålla en topp vid det teoretiska neuropeptid m / z-värdet och en topp vid m / z-värdet med en massförskjutning som korrelerar med massskillnaden mellan de isotopmärkningsreagenser som används. I figur 2D är massförskjutningen av detta 2-plex dimetylmärkta prov 4.025 Da. Arean under kurvan för prekursorjonen från dess XIC beräknas sedan av programvaran och används för att beräkna relativa överflödsförhållanden. En förenklad version av exporttabellen för proteomikprogramvara som innehåller identifierade neuropeptider och deras LFQ-förhållanden visas i tabell 1. Liknande resultat erhålls för isotopiskt märkta neuropeptider.

Mjukvarualgoritmer möjliggör de novo-sekvensering av spektra för att detektera nya förmodade neuropeptider. När man hävdar detektion av förmodade nya neuropeptider är identifieringar med hög konfidens idealiska fall där alla aminosyror identifieras och lokaliseras entydigt, baserat på fragmentjonobservation. Figur 3 visar spektrumet av en de novo-sekvenserad peptid innehållande -RYamid-motivet vid C-terminalen, ett bevarat sekvensmotiv som delas av kända neuropeptider av Kräftdjurs-RYamid-familjen22. En peptid matchades från databasen med 100% sekvenstäckning, alla aminosyrabildande fragmentjoner observerades, lågt fragmentjonmassfel enligt definitionen av maxgränsen på 0,02 Da och innehöll en gaussisk elueringsprofil. Dessa resultat indikerar att en endogen peptid som tillhör kräftdjur -RYamide neuropeptidfamiljen observerades.

MALDI-MS spotmätningar kan ge neuropeptididentifieringar som kompletterar LC-ESI-MS-identifiering, samt erbjuda högre genomströmningskapacitet. Efter att råvävnadshomogenat har extraherats för neuropeptider, avsaltats och märkts (om så önskas) kan provet blandas med matris och fläckas på MALDI-målplattan i rostfritt stål, som visas i figur 4A. Framgångsrik pipettering av homogena provfläckar ger tydligt upplösta toppar, särskilt inom kalibreringsspektrumet (figur 4B). Vid användning av ett MALDI-TOF-instrument måste instrumentet kalibreras i början av varje experiment. Alla analyter med kända massor kan användas för att kalibrera instrumentet om det ligger inom det önskade massområdet för provet. Här används röd fosfor för instrumentets positiva jonmasskalibrering. Det har fördelar jämfört med att använda peptidkalibreringsblandningar på grund av dess stabilitet vid rumstemperatur, billig kostnad, rikliga toppar på grund av dess polymerisation, höga signal-brusförhållande, och det kräver ingen matris för jonisering.

För MALDI-MS-avbildning av neuropeptider kräver det ANVÄNDA MALDI TOF/TOF-instrumentet manuell bildkalibrering av den ITO-belagda bilden (steg 3.1.10) för att korrelera den optiska bilden med provet. Diagrammet i figur 5 visar korrekt placering av det vita hårkorset som ska användas som undervisningspunkter så att instrumentet kan korrelera den skannade optiska bilden med den faktiska provplattan. Det illustrerar också områden i den ITO-belagda bilden som bör undvikas av användaren (dvs. innehåller inte prov eller matris). För masskalibrering påverkar placeringen av kalibreringsprovpunkten i förhållande till vävnadsprovet på den ITO-belagda bilden direkt massfelet på grund av den inneboende karaktären hos massanalysatorer för flygtid, även om storleken på denna fråga är beroende av överflödet av målanalyterna. En lösning på detta problem är att manuellt kontrollera toppar från MS1-spektra från olika vävnadssektioner för bevis på toppförskjutning. Om det finns toppförskjutning kan du överväga att lägga till ytterligare masskalibreringsfläckar på den ITO-belagda bilden bredvid varje vävnadssektion. Därifrån kan användaren beräkna spektra från kalibreringsfläckarna tillsammans eller utföra MS-avbildning på en vävnadssektion i taget med endast den kalibreringsplats som ligger närmast vävnadssektionen. Efter att provet har samlats in, kontrollera att signalen från m / z-värden som motsvarar neuropeptider endast är lokaliserad inom vävnadsområdet (figur 6) innan du tilldelar en förmodad neuropeptididentifiering.

Figure 1
Figur 1: Arbetsflöde för beredning av neuropeptidprov för masspektrometrianalys. För vävnadsextraktanalys avsaltas råvävnadshomogenat, märks med stabila isotopetiketter, avsaltas igen och analyseras av MS. För avbildningsanalys inbäddas intakt vävnad, kryosektioneras, appliceras med matris och analyseras av MALDI-MSI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Identifiering och kvantifiering utförd genom proteomikprogramvaran. Neuropeptider detekteras genom spektra av varierande kvalitet med (A) bra eller (B) dålig MS2-fragmenteringstäckning. Matchningsfel för fragmentjonmassa visas under spektra. (C) XIC-profilformer och retentionstid (RT) kan inspekteras manuellt för neuropeptider kvantifierade genom LFQ. (D) MS1-spektra används för att detektera och kvantifiera dimetylmärkta neuropeptider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: De novo-sekvensering för ny neuropeptiddetektion. B) De identifierade fragmentjonerna förtecknas för manuell inspektion. (C) XIC för den nya neuropeptid inspekteras manuellt med avseende på Gaussisk toppform. Förkortningar: RT = retentionstid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: MALDI-MS-fläckar och kalibreringsspektrum. (A) MS-spektrakvalitet är beroende av enhetlig matris-peptidfördelning i MALDI-målbrunnen i rostfritt stål. De tre vänstra fläckarna är exempel på bra fläckar som berör kanterna på brunnsgravyren och de tre högra fläckarna är exempel på dåliga fläckar. Båda fläckarna innehåller α-Cyano-4-hydroxikinnamsyra (CHCA) matris och en peptid standardblandning. (B) Kalibreringsspektrum med röda fosforkluster från 500 till 3200 m/z. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: Avbildning av ITO-belagd glasskiva (A) Schematisk med viktiga områden noterade: platser för att placera vävnadssektioner (ljusblå rektanglar), automatiska undervisningspunkter som bör undvikas (röda rektanglar), exempel på platser där lärpunkter kan ritas (vita hårkors) och var skruvar fästs på adapterplattan och bör undvikas (mörkblå ovaler). (B) Foto av glasskiva som innehåller två vävnadssektioner, en fläck som innehåller en kalibreringsblandning och hårkorsmärken. Placeringen av vävnadssektionen och kalibreringsfläckarna beskrivs på andra sidan glasskivan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: MS-bilder av C. sapidus sinuskörtlar. Neuropeptid [M+H]+ jonfördelningsbilder av (A) HL/IGSL/IYRamid (m/z 844,48), (B) Allatostatin A-typ NPYAFGLamid eller GGPYAFGLamid (m/z 780,40), (C) Allatostatin A-typ GQYAFGLamid (m/z 754,39) och (D) RFamid GRNFLRFamid (m/z 908,52) visas. Bilder genereras med hjälp av ett ± 50 ppm-fönster från det teoretiska m / z-värdet . Färgfältet anger intervallet för signalintensitet från 0 till 100%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Databassökning och LFQ-resultat. Neuropeptider identifierade och kvantifierade genom LC-MS och proteomikprogramvara. Identifierade PTM listas tillsammans med intensiteterna hos detekterade peptider i båda proverna för LFQ, tillsammans med det resulterande LFQ-förhållandet. De genomsnittliga massorna och observerade neuropeptidbeskrivningar från FASTA-filen listas. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den exakta identifieringen, kvantifieringen och lokaliseringen av neuropeptider och endogena peptider som finns i nervsystemet är avgörande för att förstå deras funktion23,24. Masspektrometri är en kraftfull teknik som kan göra det möjligt att åstadkomma allt detta, även i organismer utan ett helt sekvenserat genom. Förmågan hos detta protokoll att detektera, kvantifiera och lokalisera neuropeptider från vävnad som samlats in från C. sapidus genom en kombination av LC-ESI- och MALDI-MS demonstreras.

Under provberedningen för LC-ESI-MS-analys måste överväganden göras. Medan MS är en känslig teknik, utgör den låga peptidkoncentrationen av neuronal vävnad (ner till det femtomolära intervallet25) en allvarlig begränsning. Noggrann provberedning krävs för att inte bara ta bort mer rikliga och störande matriskomponenter, såsom proteiner och lipider utan också minimera förlusten av neuropeptider i varje steg26,27. Till exempel kan provförlusten minskas genom att använda mikrocentrifugrör som motstår peptidadsorption. Beroende på sammansättningen av vävnaden av intresse kan användningen av olika lösningsmedel (för extraktion eller utfällning) eller fastfasextraktionsmaterial användas för att separera biomolekyler med olika storlekar och kemiska egenskaper. För att säkerställa att hydrofila eller hydrofoba peptider finns i neuropeptidextraktet kan flera extraktionslösningssystem valfritt användas för att rikta in sig på neuropeptider med olika fysikalisk-kemiska egenskaper. Dessa, tillsammans med användningen av proteashämmare, kan behöva modifieras för optimerad rening för att förbättra neuropeptidåterhämtningen28. Nackdelarna med att använda flera extraktionssystem är att flera neuronala vävnader måste poolas för att uppfylla ett övergripande högre peptidinnehållskrav, liksom minskad genomströmning. Många steg som avsaltning, isotopmärkning och MS-injektion rekommenderar vissa startpeptidmängder. För karakterisering av värdefulla prover, såsom neuropeptider, undviks peptidanalyser i allmänhet för att förhindra främmande peptidkonsumtion. Dessutom utvecklades peptidanalyser för att bestämma exakt peptidkoncentration från proteinsmältningar, som har andra kemiska egenskaper än endogena peptider. För att övervinna komplikationer från okänd neuropeptidkoncentration kan en initial peptidanalys utföras med hjälp av poolade neuronala vävnadsextrakt, där resultaten används som en uppskattning för alla efterföljande analyser, även om det måste komma ihåg att alla peptider i lösning mäts, och inte alla dessa är neuropeptider29. Andra begränsningar av denna metod inkluderar potentiella fördomar mot icke-polära och hydrofoba neuropeptider och bristen på bevarande av inhemsk struktur. Modifieringar av lösningsmedelskompositioner och material, såsom att använda lösningar som är mer hydrofoba eller utelämna användningen av organiska lösningsmedel, kan utföras för att hantera detta.

MALDI-MS-mätningar förlitar sig på noggranna provberedningssteg för konsekventa resultat och kan ha andra provöverväganden än för LC-ESI-MS-mätningar. Steg som att hålla neuropeptidextrakt på is före MS-analys tillämpas fortfarande. Ytterligare metoder för att förhindra neuropeptidnedbrytning inkluderar att hålla glasskivor som innehåller tiningmonterade vävnadssektioner i en torkmedelslåda efter dissektion för att förhindra att kondens ackumuleras30, även om att lämna vävnadsprovet i exsickatorn efter att det har torkat kan också leda till nedbrytning av provet. Det föreslås att vävnadsglasen placeras i en vakuumdesickator (sluttryck: 1x10-4 Torr vid rumstemperatur) i 5-10 minuter omedelbart före matrisapplicering. Efter att matrisen har deponerats på vävnadsglaset kan den förvaras i kylen eller frysen över natten och torkas i vakuumdesickatorn före MALDI-MS-avbildningsmätning. För MALDI-punktmätningar är matrispeptidkristallstrukturen inte jämnt fördelad över MALDI-målets brunn även om det verkar så. Det finns sätt att mildra masspektravariationer från tekniska replikat på grund av denna process. Skaffa först ett genomsnittligt spektrum från varje brunn med hjälp av flera laserskott (vanligtvis hundratals till tusentals) där lasern slumpmässigt rastreras över brunnen (dvs. välja SMART eller Slumpmässig provbärarrörelse i instrumentparametrar). Skaffa minst fem tekniska replikat för varje provtyp och välj tre tekniska replikat där variationen i signalintensitet för önskade toppar är lägst. Avvägningen här är experimentell genomströmning. Det är nödvändigt att hålla parametrar som antalet laserskott, laserdiameter och andra instrumentinställningar konsekventa för alla förvärvade spektra. Helst analyseras alla tekniska replikat och biologiska replikat samtidigt med samma matrislösning och instrumentkalibrering. Neuropeptididentifiering kan utföras genom noggrann massmatchning till en topplista som innehåller teoretiska [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, [M+K]+ och andra saltaddukter som producerar enskilt laddade jon m/z-värden . Normalisering av data är avgörande för att minimera systematiska artefakter från MALDI-MS-experiment. Utvärdering av reproducerbarhet är särskilt viktigt när MALDI-MS-punktmätningar används för neuropeptidkvantifiering genom stabil isotopmärkning (SIL). Kvaliteten på provberedning och datainsamling kan utvärderas genom att ta en peptidstandard eller neuropeptidextrakt, dela upp den i två lika alikvoter, differentiellt märka varje prov med SIL och analysera provet för att säkerställa att den relativa intensiteten hos parade toppar är 1: 1. Variationen som rapporteras från dessa förhållanden kan användas för att uppskatta variansnivån i det övergripande experimentet som tillskrivs användarfel.

Det är viktigt att notera att MALDI-MS också kan tillhandahålla sekvens- och kvantitativ information; emellertid begränsar de enskilt laddade jonerna som vanligtvis produceras av MALDI peptidfragmentdetektering, vilket gör det svårare att erhålla hela sekvensen och hämmar kvantifieringsmetoderna som diskuteras för LC-ESI-MS. Oavsett är MALDI-MS en attraktiv modalitet på grund av dess förmåga till hög genomströmning, liksom en högre tolerans för salter och föroreningar i provet12,31. Dessutom har MALDI-MS-avbildning fördelar jämfört med andra konventionella avbildningstekniker som kräver antikroppar. I de flesta MS-modaliteter kommer sänkning av massupplösningen att öka känsligheten, vilket möjliggör förbättrad upptäckt av neuropeptider med låg förekomst. Denna strategi kan vara mer praktisk för MALDI-TOF/TOF-instrument än LC-ESI-MS-instrument på grund av att det är lätt att kalibrera MALDI-instrumentet för varje experiment. Ett annat sätt som MALDI kan vara fördelaktigt för neuropeptidomics är genom spektra medelvärde. Vanligtvis används inte medelvärdesspektra från LC-ESI-MS-mätningar eftersom det förnekar fördelarna med LC-separation; Därför är bioinformatikprogramvara starkt beroende av att identifiera neuropeptider och identifieringarna verifieras manuellt. Det finns dock färre konsekvenser för medelvärdet av spektra från MALDI-MS-mätningar eftersom det inte fanns någon initial separation; därför är rådata mindre och lättare för en användare att manuellt kamma igenom. Enkel datahantering är viktigt eftersom det ändrar ordningen i vilken användaren kan närma sig strategier för identifiering och verifiering av neuropeptid. Medan förtroendet för neuropeptididentifieringar från LC-ESI-MS kan dra nytta av att öka nivån på tröskelstränghet inom dataanalysprogramvara, är det mindre troligt att denna strategi gynnar MALDI-MS-identifieringar. I exemplet med neuropeptider av kräftdjur gör det faktum att det finns mindre än 1000 poster från den laboratoriebyggda databasen (dvs. högst <1000 spektraltoppar eller MS-bilder att manuellt skanna igenom), det möjligt att först filtrera MALDI-MS-data med en generös massfeltröskel och sedan manuellt verifiera dessa identifieringar genom att undersöka isotophöljena på MS1-nivå, samt andra verifieringsmetoder som diskuteras i avsnittet Representativa resultat. Populär MS-bilddataanalysprogramvara kan utföra exakt massmatchning till en neuropeptidmassdatabas och extrahera motsvarande MS-bilder. För kliniskt baserade forskningsfrågor, såsom upptäckt av biomarkörer, kan denna programvara extrahera m / z-värden som är unika för en vävnadsregion av intresse (vanligtvis kallad ROI-analys (Region of Interest)32 och utföra statistiska tester för att kvantifiera hur olika två vävnadsregioner är. Det är också värt att notera att det också finns färre alternativ för dataanalysprogramvara för MS-avbildning än för LC-ESI-MS.

Att utföra LC-ESI-MS-databassökningar efter neuropeptider innebär vanligtvis användning av mjukvarualgoritmer byggda för analys av smälta peptider. Som sådan finns det begränsningar för programvara att kunna utföra ospecifika enzymdatabassökningar eller hur lång tid det tar att slutföra sökningen. För närvarande utförs endogena peptidsökningar med det maximala antalet missade klyvningar, men detta antal är fortfarande begränsat, vilket leder till potentiellt missade identifieringar. När genomet för en art inte är helt sekvenserat, som med C. sapidus, kan de novo-sekvensering utföras för att identifiera okända / nya neuropeptider genom kända konserverade neuropeptidsekvensmotiv, även om denna metod misslyckas med att identifiera neuropeptider som har okända motiv eller inte innehåller de motiv som används som neuropeptidfamiljidentifierare19. Till exempel är WSSMRGAWamid ett motiv för allatostatin B-typ neuropeptidfamilj19. Häri ligger betydelsen av transkriptombrytning för förutsagda neuropeptidsekvenser för arter utan en helt avkodad genomsekvens33. Neuropeptididentifieringar bekräftas sedan genom att syntetisera den förmodade peptidsekvensen och jämföra MS / MS-spektra från syntetisk peptid och biologisk vävnad34. Även efter att en sekvens har verifierats är det ibland okänt om det är den fullständiga neuropeptidsekvensen eller en nedbrytningsprodukt. Det är värt att notera att skillnader mellan MALDI- och ESI-MS-joniseringskällor (ESI är en mjukare joniseringsmetod än MALDI) kan leda till olika hastigheter av artificiell nedbrytning (dvs. fragmentering i källan). För att skilja mellan en stympad version av en peptid från en artificiellt inducerad (dvs. inte in vivo) nedbrytningsprodukt måste preprohormonbehandlingsvägen för den neuropeptid vara känd. Eftersom detta ofta inte är fallet bör en syntetisk form av peptiden användas i fysiologiska analyser och verifieras för biologisk aktivitet.

Sammantaget kan arbetsflödet som exemplifieras här för neuropeptidanalys gynna en mängd olika områden. Det fyller ett tekniskt gap inom ms-analys av peptider eftersom det är optimerat för endogena peptider som är mindre än proteiner som vanligtvis analyseras genom MS-analyser nedifrån och upp eller uppifrån och ner. Därför bör provberedningsmetoderna som används av neuropeptidomics till stor del översättas till andra bioaktiva endogena peptider, såsom de som läkemedelskemister riktar sig till för antibakteriella egenskaper35. En fördel med detta protokoll är att det använder vanliga instrument från populära leverantörer som också erbjuder en ytterligare grad av översättningsbarhet. På så sätt kan arbetsflödet användas i akademiska och kommersiella miljöer, såsom screening för läkemedelskandidater eller läkemedelsmål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av National Science Foundation (CHE-1710140 och CHE-2108223) och National Institutes of Health (NIH) genom bidrag R01DK071801. AP stöddes delvis av NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. stöddes delvis av National Institutes of Health, under Ruth L. Kirschstein National Research Service Award från National Heart Lung and Blood Institute till University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. vill erkänna NIH-bidrag R56 MH110215, S10RR029531 och S10OD025084, samt finansieringsstöd från en Vilas Distinguished Achievement Professorship och Charles Melbourne Johnson Professorship med finansiering från Wisconsin Alumni Research Foundation och University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix Supelco 39319
Acetic acid Fisher Chemical A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A955-500
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
Borane pyridine Sigma-Aldrich 179752
Bruker peptide calibration mix Bruker Daltonics NC9846988
Capillary Polymicro 1068150019 to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup Sigma-Aldrich E6032 any cup or mold should work
 Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30108434
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde - D2 Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Optima LC/MS grade Fisher Chemical A117-50
Gelatin Difco 214340 place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen Vector Labs 15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides Delta Technologies CB-90IN-S107 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials Thermo TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade Fisher Chemical A456-500
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 Hydrophobic film
pH-Indicator strips Supelco 109450
Red phosphorus clusters Sigma-Aldrich 343242
Reversed phase C18 material Waters 186002350 manually packed into nanoflow column
Wite-out pen BIC 150810
ZipTip Millipore Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5 HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R Eppendorf 05-401-205
Cryostat- HM 550 Thermo Fisher Scientific 956564A
Desiccant Drierite 2088701
Forceps WPI 501764
MALDI stainless steel target plate Bruker Daltonics 8280781
Pipet-Lite XLS Rainin 17014391 200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100 Savant SVC-100D
Ultrasonic Cleaner Bransonic 2510R-MTH for sonication
Ultrasonic homogenizer Fisher Scientific FB120110 FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A Ideal Vacuum Products P10976 ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer Corning 6775
Water bath (37C) - Isotemp 110 Fisher Scientific 15-460-10
Data Analysis Software
Expasy https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis Bruker Daltonics
FlexControl Bruker Daltonics
FlexImaging Bruker Daltonics
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab https://scils.de/
SignalP 5.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMS=tblastn&PAGE_
TYPE=BlastSearch&SHOW_
DEFAULTS=on&LINK_LOC
=blasthome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
  2. Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
  3. Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, clifton, N.J. 71-101 (1997).
  4. Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
  5. Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
  6. Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
  7. Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
  8. Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
  9. Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
  10. Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
  11. Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
  12. Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
  13. Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
  14. Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
  15. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
  16. Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
  17. Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
  18. Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
  19. DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
  20. Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
  21. Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
  22. Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
  23. DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
  24. Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
  25. Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
  26. Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
  27. Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
  28. Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
  29. Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
  30. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  31. Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
  32. Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
  33. Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
  34. Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
  35. Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).

Tags

Kemi Utgåva 183 neuropeptid masspektrometri peptidrening isotopmärkning de novo-sekvensering kvantifiering LC MALDI masspektrometriavbildning databassökning transkriptombrytning
Mångfacetterad masspektrometrisk undersökning av neuropeptider i <em>Callinectes sapidus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L.… More

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus. J. Vis. Exp. (183), e63322, doi:10.3791/63322 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter