Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Mangesidig massespektrometrisk undersøkelse av nevropeptider i Callinectes sapidus

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/63322
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison
* These authors contributed equally

Summary

Massespektrometrisk karakterisering av nevropeptider gir sekvens-, kvantifiserings- og lokaliseringsinformasjon. Denne optimaliserte arbeidsflyten er ikke bare nyttig for nevropeptidstudier, men også andre endogene peptider. Protokollene her beskriver prøvepreparering, MS-anskaffelse, MS-analyse og databasegenerering av nevropeptider ved hjelp av LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting og MALDI-MS-avbildning.

Abstract

Neuropeptider er signalmolekyler som regulerer nesten alle fysiologiske og atferdsprosesser, for eksempel utvikling, reproduksjon, matinntak og respons på eksterne stressfaktorer. Likevel forblir de biokjemiske mekanismene og det fulle komplementet av nevropeptider og deres funksjonelle roller dårlig forstått. Karakterisering av disse endogene peptidene hindres av det enorme mangfoldet i denne klassen av signalmolekyler. I tillegg er nevropeptider bioaktive ved konsentrasjoner 100x - 1000x lavere enn for nevrotransmittere og er utsatt for enzymatisk nedbrytning etter synaptisk frigjøring. Massespektrometri (MS) er et svært følsomt analyseverktøy som kan identifisere, kvantifisere og lokalisere analytter uten omfattende forkunnskaper . Den er velegnet til globalt profilering av nevropeptider og hjelp til oppdagelsen av nye peptider. På grunn av den lave overfloden og det høye kjemiske mangfoldet i denne klassen av peptider, har flere prøveprepareringsmetoder, MS-anskaffelsesparametere og dataanalysestrategier blitt tilpasset fra proteomiske teknikker for å tillate optimal neuropeptidkarakterisering. Her er metoder beskrevet for å isolere nevropeptider fra komplekse biologiske vev for sekvenskarakterisering, kvantifisering og lokalisering ved hjelp av flytende kromatografi (LC)-MS og matriseassistert laseravledning / ionisering (MALDI)-MS. En protokoll for å forberede en nevropeptiddatabase fra den blå krabben, Callinectes sapidus, en organisme uten omfattende genomisk informasjon, er inkludert. Disse arbeidsflytene kan tilpasses for å studere andre klasser av endogene peptider i forskjellige arter ved hjelp av en rekke instrumenter.

Introduction

Nervesystemet er komplekst og krever et nettverk av nevroner for å overføre signaler gjennom en organisme. Nervesystemet koordinerer sensorisk informasjon og biologisk respons. De intrikate og innviklede interaksjonene som er involvert i signaloverføring krever mange forskjellige signalmolekyler som nevrotransmittere, steroider og nevropeptider. Siden nevropeptider er de mest varierte og potente signalmolekylene som spiller nøkkelroller i å aktivere fysiologiske responser på stress og andre stimuli, er det av interesse å bestemme deres spesifikke rolle i disse fysiologiske prosessene. Neuropeptidfunksjon er relatert til deres aminosyrestruktur, som bestemmer mobilitet, reseptorinteraksjon og affinitet1. Teknikker som histokjemi, som er viktig fordi nevropeptider kan syntetiseres, lagres og frigjøres i forskjellige områder av vevet, og elektrofysiologi har blitt brukt til å undersøke nevropeptidstruktur og funksjon 2,3,4, men disse metodene er begrenset av gjennomstrømning og spesifisitet for å løse det enorme sekvensmangfoldet av nevropeptider.

Massespektrometri (MS) muliggjør høy gjennomstrømningsanalyse av nevropeptidstruktur og overflod. Dette kan utføres gjennom forskjellige MS-teknikker, oftest flytende kromatografi-elektrosprayionisering MS (LC-ESI-MS)5 og matriseassistert laseravledning / ionisering MS (MALDI-MS)6. Ved hjelp av massemålinger med høy nøyaktighet og MS-fragmentering gir MS muligheten til å tildele aminosyresekvens og post-translasjonell modifikasjonsstatus (PTM) til nevropeptider fra komplekse blandinger uten forkunnskaper for å hjelpe til med å fastslå deres funksjon 7,8. I tillegg til kvalitativ informasjon muliggjør MS kvantitativ informasjon om nevropeptider gjennom etikettfri kvantsetting (LFQ) eller etikettbaserte metoder som isotopisk eller isobarisk merking9. De viktigste fordelene med LFQ inkluderer enkelhet, lave analysekostnader og reduserte prøveforberedelsestrinn som kan minimere prøvetap. Ulempene med LFQ inkluderer imidlertid økte instrumenttidskostnader, da det krever flere tekniske replikeringer for å løse kvantitativ feil fra kjøre-til-løp-variasjon. Dette fører også til redusert evne til å kvantifisere små variasjoner nøyaktig. Etikettbaserte metoder utsettes for mindre systematisk variasjon, da flere prøver kan merkes differensialt ved hjelp av en rekke stabile isotoper, kombinert i en prøve og analyseres gjennom massespektrometri samtidig. Dette øker også gjennomstrømningen, selv om isotopiske etiketter kan være tidkrevende og kostbare å syntetisere eller kjøpe. Full skanning masse spektra (MS1) spektral kompleksitet øker også som multipleksing øker, noe som reduserer antall unike nevropeptider i stand til å bli fragmentert og derfor identifisert. På den annen side øker isobarisk merking ikke spektral kompleksitet på MS1-nivå, selv om det introduserer utfordringer for lav overflod analytter som nevropeptider. Ettersom isobarisk kvantitet utføres på fragmentionmassespektranivå (MS2), kan det hende at lav overflod av nevropeptider ikke kan kvantifiseres, da mer rikelige matrisekomponenter kan velges for fragmentering, og de utvalgte har kanskje ikke høy nok overflod til å bli kvantifisert. Med isotopisk merking kan kvantasjon utføres på hvert identifisert peptid.

I tillegg til identifisering og kvantifisering kan lokaliseringsinformasjon innhentes av MS gjennom MALDI-MS imaging (MALDI-MSI)10. Ved å rastrere en laser over en prøveoverflate, kan MS-spektra kompileres til et varmekartbilde for hver m/z-verdi . Kartlegging av forbigående nevropeptidsignalintensitet i forskjellige regioner på tvers av forhold kan gi verdifull informasjon for funksjonsbestemmelse11. Lokalisering av nevropeptider er spesielt viktig fordi nevropeptidfunksjonen kan variere avhengig av sted12.

Neuropeptider finnes i lavere overflod in vivo enn andre signalmolekyler, som nevrotransmittere, og krever dermed sensitive metoder for deteksjon13. Dette kan oppnås ved fjerning av høyere overflod matrisekomponenter, for eksempel lipider11,14. Ytterligere hensyn for analyse av nevropeptider må tas sammenlignet med vanlige proteomiske arbeidsflyter, hovedsakelig fordi de fleste nevropepdoniske analyser utelater enzymatisk fordøyelse. Dette begrenser programvarealternativer for nevropeptiddataanalyse ettersom de fleste ble bygget med algoritmer basert på proteomikkdata og proteinmatslag informert av peptiddeteksjon. Imidlertid er mange programvare som PEAKS15 mer egnet til nevropeptidanalyse på grunn av deres de novo-sekvenseringsevner. Flere faktorer må vurderes for analyse av nevropeptider som starter fra utvinningsmetode til MS-dataanalyse.

Protokollene som er beskrevet her inkluderer metoder for prøvepreparering og dimetyl isotopisk merking, datainnsamling og dataanalyse av nevropeptider av LC-ESI-MS, MALDI-MS og MALDI-MSI. Gjennom representative resultater fra flere eksperimenter demonstreres verktøyet og evnen til disse metodene for å identifisere, kvantifisere og lokalisere nevropeptider fra blå krabber, Callinectes sapidus. For bedre å forstå nervesystemet, brukes modellsystemer ofte. Mange organismer har ikke et fullt sekvensert genom tilgjengelig, noe som forhindrer omfattende nevropeptidoppdagelse på peptidnivå. For å dempe denne utfordringen er en protokoll for å identifisere nye nevropeptider og transkripsjonsgruvedrift for å generere databaser for organismer uten fullstendig genominformasjon inkludert. Alle protokoller som presenteres her kan optimaliseres for nevropeptidprøver fra alle arter, samt brukes til analyse av eventuelle endogene peptider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All vevsprøvetaking beskrevet ble utført i samsvar med Retningslinjene fra University of Wisconsin-Madison.

1. LC-ESI-MS analyse av nevropeptider

  1. Neuropeptidutvinning og avsalting
    1. Før vevsanskaffelse, forberede surgjort metanol (acMeOH) (90:9:1 MeOH:vann:eddiksyre) som beskrevet i16.
    2. Samle hjernevev fra krepsdyr17 og bruk tang til umiddelbart å plassere ett vev hver i et 0,6 ml rør som inneholder 20 μL acMeOH.
      MERK: Vevspredningsprotokoller varierer sterkt for forskjellige dyr og forskjellige vevstyper. Leseren henvises til protokoll17 for en detaljert beskrivelse av hvordan man dissekerer hjernevev og flere andre vevstyper fra krepsdyret. Prøver kan lagres ved -80 °C til bruk (ideelt sett innen 6 måneder). Volumene som er beskrevet brukes til en enkelt hjerne fra Callinectes sapidus. Volumer bør skaleres for vevsstørrelse. Vev kan bli flash frosset umiddelbart uten løsningsmiddel, selv om dette ikke anbefales som endogene proteolytiske enzymer vil ikke bli hemmet og forbli aktiv, men i en langsommere hastighet når det er kaldt.
    3. Tilsett 150 μL acMeOH i prøven. Sett den totale sonikeringstiden til 24 s, pulstid til 8 s, pause tid til 15 s, og amplitude til 50% på en ultralyd homogenisator og homogenisere prøvene på is.
      MERK: Det er forskjellige homogeniseringssystemer tilgjengelig. Juster innstillingene og betingelsene i henhold til prøvetype og utstyr.
    4. Sentrifuger prøven ved 4 °C ved 20 000 x g i 20 minutter. Med en pipette, overfør supernatanten i et rør og tørk den i en vakuumkonsentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) ved ca. 35 °C.
      MERK: De tørkede prøvene kan oppbevares ved -80 °C til bruk (ideelt sett innen 6 måneder). Oppvarming av vakuumkonsentratoren må utføres med forsiktighet. Mens varme forkorter tørrtiden, må prøven fjernes fra konsentratoren umiddelbart etter at all væsken har fordampet for å minimere nedbrytning av peptid. For å unngå dette kan oppvarming utelates fra dette og alle etterfølgende trinn.
    5. For desalting, rekonstituer den ekstraherte vevsprøven i 20 μL 0,1% maursyre (FA), virvelbrønn og soniker i et vannbad ved romtemperatur i 1 min.
      MERK: Det finnes forskjellige avsaltingsmaterialer tilgjengelig. Juster løsningene og volumene i henhold til harpiksidentiteten og nevropeptidmengden. Total peptidmengde kan estimeres ved hjelp av en kommersiell peptidmengdeanalyse (se Materialfortegnelse) .
    6. Påfør 0,5 μL prøve på en pH-stripe for å bekrefte at pH < 4. Hvis pH er høyere, tilsett 1 μL aliquots på 10% FA til pH < 4.
    7. Følg produsentens protokoll for avsalting18. Forbered en fuktløsning som inneholder 100 μL 50% acetonitril (ACN), likevektsløsning som inneholder 100 μL 0,1% FA, vaskeoppløsning som inneholder 100 μL 0,1% FA, og elutionløsninger som inneholder 20 μL 25% ACN / 0,1% FA, 20 μL på 50% ACN / 0,1% FA og 20 μL på 75% ACN / 0,1% FA.
    8. Få en 10 μL avsaltingsspiss med C18-harpiks (se Materialfortegnelse).
    9. Plasser avsaltingsspissen på en 20 μL pipette som er satt til 15 μL. Når avsaltingsspissen er våt, må du forhindre at luften passerer gjennom ved å holde pipetten trykket inn når den er ute av oppløsning til den kastes.
    10. Aspirer spissen 3x med fukteløsning og 3x med likevektsløsning. Aspirer i prøven 10x etterfulgt av vasking 3x i vaskeoppløsning, og kast hver vask. Elute ved å aspirere 10x i hver av elution-løsningene for å øke ACN.
      MERK: Elutionfraksjoner kan holdes atskilt eller kombinert for videre analyser.
    11. Kast den brukte avsaltingsspissen og tørk de eluterte nevropeptidene i en vakuumkonsentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) ved ca. 35 °C.
      MERK: Dette kan oppbevares ved -80 °C til bruk (ideelt sett innen 6 måneder).
  2. Isotopisk merking av nevropeptider i vevsekstrakt
    MERK: Dette trinnet er valgfritt og brukes bare når kvantifisering er ønsket.
    1. Forbered den 2-plex isotopiske dimetylmerkingsløsningen i en avtrekkshette: 1% CH2OH2 (13,5 μL lager 37 vekt / vektprosent (wt. %) i vannoppløsning i 486,5 μL vann), 1 % CH2OD2 (25 μL lager 20 wt. % oppløsning i 475 μL vann) og 0,03 M borant pyridin (3,75 μL lager 8 M oppløsning i 996,25 μL vann).
      FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig, så alle løsninger skal oppbevares i en ventilert hette. Bruk hansker, labjakke, øyebeskyttelse og ugjennomtrengelig fottøy. Kontaktlinser må ikke brukes når du arbeider med dette materialet.
      MERK: Det er forskjellige isotopiske reagenser; velg de aktuelle basert på prøvetype og antall ønskede merkekanaler.
    2. Løs opp rå neuropeptidekstrakt i 10 μL vann og soniker i 10 min.
    3. Tilsett 10 μL av en annen isotopisk formaldehydløsning (dvs. CH2OH2, CH2OD2, etc.) til hver enkelt eksperimentell tilstand som skal måles kvantitativt. Virvel for å blande godt og kort sentrifugere hver prøve på 2000 x g.
    4. Tilsett 10 μL 0,03 M borant pyridin i hvert prøverør. Virvel for å blande godt og kort sentrifugere hver prøve på 2000 x g.
    5. Inkuber prøvene i 15 min ved 37 °C i et vannbad.
    6. Fjern prøvene fra vannbadet og tilsett 10 μL 100 mM ammoniumbikarbonat. Virvel for å blande godt og kort sentrifugere hver prøve på 2000 x g.
    7. Kombiner de merkede prøvene for en 2-plex prøve og tørk nevropeptidene i en vakuumkonsentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) ved ca. 35 °C.
    8. Avsalt de merkede nevropeptider ved å gjenta trinn 1.1.5 - 1.1.10 og lagre dem til de er klare for datainnsamling.
  3. Datainnsamling
    1. Rekonstituer de tørkede desalterte nevropeptider i 12 μL 3% ACN / 0,1% FA, virvelbrønn, soniker i 37 ° C vannbad i 1 min, og kort sentrifuge ved 2000 x g. Overfør hver prøve til hetteglass med autosampler.
      MERK: Juster prøvevolumet i henhold til nevropeptidmengden til en konsentrasjon på ~1 μg peptid per μL. Total peptidmengde kan estimeres ved hjelp av en kommersiell peptidmengdeanalyse (se Materialfortegnelse) .
    2. Bruk en autosampler til å injisere 1 μL prøve i et nano-LC-MS/MS-instrument med høy oppløsning (se Materialfortegnelse).
    3. Bruk en ca. 15 cm lang omvendt fase (RP) C18-kolonne (se Materialtabell) for å kjøre prøven med 0,1 % FA i vann som mobil fase A og 0,1 % FA i ACN som mobilfase B. Kjør prøvene med en gradient på 3 % - 95 % av B med en hastighet på 300 nL/min i over 11 minutter.
    4. For MS-instrumentet som brukes her, bruk vanlige MS-forhold på 2,00 kV for sprayspenning og 275 °C for kapillær temperatur.
    5. Skaff DEG MS-spektra i området 200 - 2000 m/z med en oppløsning på 60 000, et MÅL for automatisk forsterkningskontroll (AGC) på 1 x 106 og maksimal ioninjeksjonstid (IT) på 150 ms.
    6. Velg de 15 mest intense ionene (minimumsintensitet på 3,2 x 104) for fragmentering av kollisjonsdissosiasjon (HCD) med en normalisert kollisjonsenergi på 30, isolasjonsvindu på 2,0 m/z, oppløsning på 15 000, et AGC-mål på 2 x 105 og maks IT på 250 ms.
    7. Angi et dynamisk ekskluderingsvindu på 30 s. Utelat ioner med en kostnad på 1 eller ≥ 8 og ioner med ukjente ladetilstander.
  4. Neuropeptididentifikasjon og kvantifisering
    MERK: Mange programvare for databasesøk og peptid kvantifisering (både åpen kildekode og kommersiell) er tilgjengelig. Her vil PEAKS Studio (proteomics software)15 bli brukt.
    1. Utfør databasesøk ved hjelp av trinnene som er beskrevet i 1.4.2 - 1.4.6.
    2. Opprett et nytt prosjekt og legg til LC-MS-data ved å velge Ingen for enzymet, Orbitrap for instrumentet, HCD for fragmentet og dataavhengig anskaffelse (DDA) for anskaffelse.
      MERK: Velg de aktuelle parameterne basert på datainnsamlingsparametere.
    3. Velg Identifikasjoner , og velg Riktig forløper [DDA] og Bare masse.
    4. Velg Databasesøk og angi en feiltoleranse på 20,0 ppm ved hjelp av monoisotopisk masse for forløpermasse og 0,02 Da for fragmentionmasse, Ingen for enzymtype, Uspesifisert for fordøyelsesmodus, 100 for maksimalt antall tapte spaltinger og følgende variable PTMer med maksimal tillatt variabel PTM per peptid på 3: Amidasjon, oksidasjon (M), Pyro-fra lim og Pyro-glu fra Q.
    5. Velg Neuropeptide Database, beregn falsk oppdagelsesrate (FDR) med avledningsfusjon.
      MERK: Massetoleransefeilen bør justeres slik at den samsvarer med dataene som samles inn. Bruk riktig database for eksempeltypen. Når ingen enzym er valgt, påvirker ikke parameteren for maksimalt antall tapte spaltinger søket. Imidlertid er det nødvendig med et stort antall tapte spaltinger hvis programvaren ikke har uspesifisert fordøyelsesmodus som et alternativ.
    6. Hvis etikettfri kvantifisering ønskes, velger du Kvantifisering, velger Etikettfri og angir en feiltoleranse på 20,0 ppm og oppbevaringstidstoleranse på 1,0 min.
    7. Utfør forløper-ion-kvantifisering hvis trinn 1.2 for isotopisk merking ble utført.
      1. Velg Kvantifisering, velg Precursor Ion Quantification, bruk et oppbevaringstidsområde på 1,0 min, og bruk en FDR-terskel på 1%.
      2. Velg en forhåndsinnstilt eller egendefinert kvantifiseringsmetode på rullegardinmenyen Velg metode .
      3. Hvis du vil opprette en ny egendefinert metode, klikker du Vindu > konfigurasjon > Etikett Q-metode > Ny. Gi den nye metoden et navn, og velg Precursor Ion Quantification for Metodetype. Velg Legg til rad , og velg endring fra listen PTM-alternativer.
      4. Legg til LC-MS-dataene og velg Referansebetingelse som skal være modifikasjonen på nevropeptider fra eksperimentets kontrolltilstand.
    8. Evaluer søkeresultatene som beskrevet i trinn 1.4.9 - 1.4.11.
    9. Filtrer resultatene gjennom sammendragsfanen for peptider og proteiner med -10lgP ≥ 20, velg ≥ 1 unikt peptid, og velg boksen merket Med betydelige peptider.
    10. Evaluer databasesøkeresultatene der Protein.csv representerer neuropeptididentifikasjoner og Peptid.csv representerer fragmentidentifikasjoner for nevropeptid.
    11. Inspiser databasesøket etter protein- og peptidpoeng, massenøyaktighet og sekvensdekning.
      MERK: Hver databasesøkprogramvare bruker unike poengalgoritmer og må kanskje evalueres deretter. Identifikasjoner kan evalueres ved å manuelt inspisere det observerte spektraet for identifiserte peptider som inneholder hele fragmentionserien.

2. MALDI-MS spotting analyse av nevropeptider

  1. Prøveforberedelse
    1. Følg trinn 1.1 eller trinn 1.1 - 1.2 hvis kvantifisering er ønsket, unntatt trinn 1.2.8 (avsalting etter isotopisk merking er ikke nødvendig før MALDI-MS-analyse).
    2. Rekonstituer de tørkede desaltede nevropeptider i 5 μL 0,1% FA, virvelbrønn, soniker i et 37 °C vannbad i 1 min, og sentrifuger kort ved 2000 x g.
    3. For spotting av nevropeptider i krepsdyrvev, lag 150 mg/ml 2,5-dihydroksybenzosyre (DHB) i 50% metanol (MeOH)/0,1% FA (v/v) som matrise.
    4. Pipette en 3 μL dråpe prøve på en hydrofob film (se Materialbord) og pipette 3 μL av matrisen direkte på prøvedråpen. Pipette opp og ned for å blande.
    5. Pipette 1 μL av 1:1-prøven: matriseblanding i en brønn av MALDI-målplaten i rustfritt stål. Bruk pipettespissen til å spre hver blanding ut til kantene på prøvebrønnen. Prøven må berøre kantene på brønngraveringen for å lette ensartet fordeling (figur 4A).
    6. Spot 1 μL av 1:1 calibrant:matrix blanding (kommersiell eller tilpasset kalibrering blanding, polymer materialer (dvs. rød fosfor oppløst i MeOH), eller vanlige matrise klynge ioner)12 i en brønn i nærheten av prøven.
      MERK: Rødt fosfor trenger ikke blandes med matrise før du oppdager.
  2. Datainnsamling
    1. Sett inn målplaten som inneholder tørkede prøveflekker, i TOF/TOF-instrumentet (MALDI Tandem Time-of-Flight) (se Materialtabell).
    2. For DHB-matrise setter du laserkraften til 95 %, velger Automatisk optimal detektorforsterkning og Smart - Fullfør prøvebærerbevegelsesmodus. Skaff ms spektra i området 200 - 3200 m / z og legg til flere spektra fra hvert sted sammen for å øke nevropeptid signal-til-støy-forholdet.
      MERK: Optimaliser prosentandelens lasereffekt, detektorforsterkning og velg riktig bevegelsesmodus for prøvebærer, slik at hvert oppkjøp dekker omtrent hele stedet og påfølgende oppkjøp ikke går til de tidligere posisjonene.
    3. Kalibrer instrumentet.
      MERK: Juster masseområdet slik at det omfatter ønsket nevropeptidområde.
  3. Dataanalyse
    1. Åpne filen MALDI-MS i dataanalyseprogramvare (se Tabell over materialer) og klikk Baseline Subtraction for programvaren som brukes her.
    2. Utfør toppplukking ved å klikke Påsøk masseliste. Hvis det er for få topper, redigerer du masselisten manuelt ved å velge Rediger masseliste og klikke på topper i spekteret for å legge dem til i masselisten.
    3. Utfør nøyaktig massesamsvar ved å sammenligne masseliste med nevropeptiddatabase som inneholder [M+H]+ m/z-verdier (± 200 ppm-feil).
      MERK: Vanlige saltantrekk, for eksempel [M+K]+, [M+Na]+, og [M+NH4]+, bør også inkluderes i listen over nøyaktig massetilpasningsmål.
    4. Hvis du vil kontrollere de identifiserte toppene, genererer du en liste over m/z av interesse og utfører MS/MS-eksperimenter.

3. MALDI-MS avbildningsanalyse av nevropeptider

  1. Prøvepreparering
    MERK: Innebyggings- og seksjoneringstrinn er ikke nødvendig for vev som er for tynne til å kunne seksjoneres.
    1. Fyll en halv kryostatkopp med gelatin (37 °C, 100 mg/ml i deionisert vann) og la den størkne ved romtemperatur. Hold rester flytende gelatin varm i et 37 °C vannbad.
    2. Samle ønsket nevronvev fra dyret og bruk tang for å umiddelbart dyppe vevet i et 0,6 ml rør som inneholder deionisert vann i 1 s.
      MERK: Se trinn 1.1.2 MERK for nevronal vevs disseksjon.
    3. Legg vevet på toppen av det faste gelatinet og fyll resten av kryostatkoppen med flytende gelatin. Bruk tang til å plassere vevet.
    4. Legg kryostatkoppen på et flatt underlag og frys med tørris.
      MERK: Oppbevar prøver ved -80 °C til bruk (ideelt sett innen 6 måneder).
    5. For seksjoneringspreparat, skille den gelatin-innebygde prøven fra kryostatformen ved å kutte formen bort.
    6. Monter det innebygde vevet på en kryostatchuck ved å pipettere en 1 ml dråpe deionisert vann på chucken og umiddelbart trykke det innebygde vevet på dråpen.
    7. Når den er frosset, pipette mer deionisert vann rundt vevet for å sikre det ytterligere til chucken. Utfør disse trinnene inne i kryostatboksen (se Materialfortegnelser) satt til -20 °C.
    8. Del vevet med en omtrentlig tykkelse på en celle (8-20 μm avhengig av prøvetypen) og tine hver seksjon på et indium tinnoksid (ITO)-belagt glasssklie ved å plassere den ene siden av lysbildet nær delen og plassere en finger på den andre siden av lysbildet for å sakte varme glasset og la delen holde seg til lysbildet.
      MERK: Vevsseksjoner kan også tines ved å plukke opp den ene kanten av gelatinet med pinsett (kjølt til -20 °C), plassere det på den ITO-belagte glasssklie og plassere en finger på den andre siden av lysbildet for å sakte varme glasset og la delen feste seg til lysbildet.
    9. Se prøven som skal brukes som en kalibrant (se trinn 2.1.6 for alternativer for kalibrant) ved å tegne en liten sirkel i nærheten av vevsdelen ved hjelp av en hydrofob penn og oppdage kalibreringen inne i sirkelen.
    10. Merk hvert hjørne av lysbildet med en whiteout-penn med en liten form som inneholder skarpe kanter (dvs. x) som skal brukes som lærepunkter.
    11. Plasser glassskuffen i MALDI-lysbildeadapterplaten og ta en optisk bildeskanning med høy oppløsning (≥2400 PPT) ved hjelp av en skanner.
    12. Spraymatrise på vevsdelen ved hjelp av en automatisert sprøyter (se Materialtabell for sprøytedetaljer og instruksjoner).
    13. For MSI av nevropeptider i krepsdyrvev brukes 40 mg/ml DHB i 50 % metanol/0,1 % FA (v/v) som matrise, sett dysetemperaturen til 80 °C, hastigheten til 1250 mm/min, strømningshastigheten til 0,1 ml/min, antall passeringer til 12 og 30 s mellom hver passering for den automatiske sprøyten.
  2. Datainnsamling
    1. Sett inn den helt tørkede målplaten som inneholder tintemonterte vevsseksjoner som ble sprayet med matrisen.
    2. Konfigurer parametere for MS-bildebehandlingsanskaffelsesfil slik at laserdiameteren er mindre enn rastertrinnstørrelsen.
    3. Legg det skannede optiske bildet og kalibrer prøveplaten ved hjelp av x-lærepunktene. Definer vevsområdene av interesse som skal måles litt større enn selve vevsdelen for også å inkludere områder som bare inneholder matrise.
    4. Kalibrer instrumentet og skaff deg spektra i området 200 - 3200 m/z. Juster masseområdet for å omfatte ønsket nevropeptidområde.
  3. Dataanalyse
    1. Hvis du vil behandle data, importerer du MS-bildedatasett til ønsket programvare, velger en algoritme for fjerning av grunnlinje og normaliserer data ved hjelp av totalt antall ioner.
      MERK: Valg av forskjellige normaliseringsalgoritmer, for eksempel median, RMS-verdi (root mean square) eller intensiteten til en referanse m/z-verdi , vil sannsynligvis endre den romlige fordelingen av mange m/z-verdier . Velg normaliseringsalgoritmen som passer best for ønskede analytter.
    2. Hvis du vil generere et bilde for hver m/z-verdi fra en teoretisk toppliste, laster du opp en kommadelt fil (CSV) som inneholder nevropeptid [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, etc. Hent m/z-verdier ved å klikke Fil > Importer > Peak List. Gi topplisten et navn.
    3. For å estimere riktig ppm-feilterskel, må du først manuelt identifisere en neuropeptidtopp i MS-spekteret og sammenligne den med nevropeptidteoretisk masse. Beregn ppm-feilen, og klikk Fil > filegenskaper > intervallbredde og inndata-ppm-feil.
    4. Velg topplisten fra rullegardinmenyen, og klikk opprett m/z-bilder for hvert intervall i topplisten.
    5. Lagre hvert m/z-bilde ved å klikke på Lagre skjermbilde av hvert m/z-bilde.
      MERK: Putativ nevropeptididentifikasjon kan utføres ved å identifisere m/z-bilder der analyttsignalet bare lokaliseres i vevet og ikke i den omkringliggende matrisen.
    6. Hvis du vil kontrollere toppidentiteten, genererer du en liste over m/z av interesse og utfører MS/MS-eksperimenter.

4. Oppdage nye putative nevropeptider ved hjelp av de novo sekvensering

  1. Utfør trinn 1.4.2 - 1.4.5.
  2. Eksporter de novo bare peptider.csv fra PEAKS programvare med et gjennomsnitt av lokal tillit (ALC) score på ≥ 75.
    MERK: Det er mange programvare tilgjengelig for å utføre de novo-sekvensering, hver med sine egne scoringsalgoritmer og bør evalueres deretter.
  3. Søk i peptidlisten etter kjente sekvensmotiver som indikerer nevropeptider som tilhører spesifikke nevropeptidfamilier19.
    MERK: Selv om motivene ofte er godt bevart på tvers av arter, bør motivene det søkes etter, velges med hensyn til prøveorganismen.

5. Transkripsjonsgruvedrift for predikerte nevropeptidsekvenser

MERK: Dette trinnet er valgfritt og brukes bare til å legge til en eksisterende nevropeptiddatabase eller bygge en ny nevropeptiddatabase.

  1. Velg en kjent preprohormon aminosyresekvens av interesse og bruk tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
    _LOC=blasthome) for å søke etter forhåndsprohormonsekvens for spørring mot databaser som nr/nt, Refseq_genomes, EST og TSA.
    MERK: Hvis du vil søke i spørringssekvenser mot proteindatabasen, bruker du BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. Velg målorganismen (skatte-ID) og endre parameterne for forventet terskelverdi til 1000 for å inkludere justeringer med lav poengsum.
    2. Kjør BLAST-programmet , og kontroller deretter resultatene for høye homologiresultater mellom spørrings- og emnesekvenser som gir betydelige justeringer. Lagre FASTA-fil som inneholder nukleotidsekvens.
      MERK: Hvis det er flere emnesekvenser med lignende homologiresultater, utfør en MAFFT-justering for å begrense putative sekvenser 20,21.
  2. Oversett preprohormon nukleotidsekvens til preprohormone peptidsekvenser ved hjelp av Expasy Translate-verktøyet (https://web.expasy.org/translate/). For C. sapidus velger du Invertebrate Mitokondrie for genetisk kode.
  3. Se etter signalpeptidsekvens og prohormone spaltingssteder i peptidsekvensene ved hjelp av SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    MERK: Homologi til kjente preprohormone prosesseringsordninger kan også brukes til å identifisere prohormone spaltingssteder. Mulige endringer etter oversettelse for signalpeptider kan forutsies om ønskelig. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) kan brukes til å forutsi sulfatasjonstilstanden til tyrosinrester. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) kan brukes til å forutsi tilkobling av disulfidbinding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arbeidsflyten for prøveforberedelse og MS-analyse er avbildet i figur 1. Etter disseksjon av nevronalt vev utføres homogenisering, ekstraksjon og avsalting for å rense nevropeptidprøver. Hvis det ønskes isotopisk etikettbasert kvantifisering, merkes prøvene og avsaltes igjen. Den resulterende prøven analyseres gjennom LC-MS/MS for nevropeptididentifikasjon og kvantifisering.

Neuropeptider identifisert gjennom proteomics programvare bør ha god peptid fragmentering sekvens dekning, men dette er ikke globalt definert eller standardisert. For absolutt identifikasjon bør hver aminosyre produsere en fragmention som gir entydig identifikasjon og lokalisering. Dette må også sammenlignes med et syntetisert peptid for bekreftelse av intensiteten av hver fragmention. Siden kostnaden for å utføre dette på hver putativ identifikasjon ikke er mulig, beskrives identifikasjon ofte basert på tillit der mer observerte fragmentioner øker peptididentifikasjonssikkerheten. Mens figur 2A,B skildrer to nevropeptider som begge ble identifisert med 100% sekvensdekning og en lav massefeil som definert av maksimumsgrensen på 0,02 Da, reduserer den dårlige fragmenteringsdekningen (fra bare tre ioner) som bare observeres for nevropeptidet i figur 2B, tilliten til identifisering av en bestemt isoform. Figur 2C viser de ekstraherte ionkromatogrammer (XICer), som er et plott som inneholder signalintensiteten til en valgt m/z-verdi som en funksjon av oppbevaringstid, av et nevropeptid som er påvist i to prøver som brukes til LFQ. Oppbevaringstidene for nevropeptidet varierer litt fordi det ble identifisert i to separate og påfølgende løp; Forskjellen er imidlertid innenfor den pålitelige terskelverdien på 1 min. Dermed brukes forholdet mellom det programvareberegnede området under kurven fra XIC for LFQ av dette nevropeptidet.

For kvantum av dimetyl merket neuropeptider, bør MS1-spekteret inneholde en topp på den teoretiske nevropeptid m / z-verdien og en topp på m / z-verdien med et masseskift som korrelerer med masseforskjellen mellom de isotopiske merkingsreagensene som brukes. I figur 2D er masseskiftet av denne 2-plex dimetylmerkede prøven 4.025 Da. Området under kurven av forløperionen fra XICene beregnes deretter av programvaren og brukes til å beregne relative overflodsforhold. En forenklet versjon av eksporttabellen for proteomikkprogramvare som inneholder identifiserte nevropeptider og deres LFQ-forhold, vises i tabell 1. Lignende resultater oppnås for isotopisk merkede nevropeptider.

Programvarealgoritmer gjør det mulig for de novo-sekvensering av spektra å oppdage nye putative nevropeptider. Når du hevder påvisning av putative nye nevropeptider, er høy tillitsidentifikasjon ideelle tilfeller der alle aminosyrer identifiseres og lokaliseres entydig, basert på fragmentionobservasjon. Figur 3 viser spekteret av et de novo-sekvensert peptid som inneholder -RYamide-motivet ved C-terminalen, et bevart sekvensmotiv som deles av kjente nevropeptider i krepsdyret RYamide-familien22. Et peptid ble matchet fra databasen med 100% sekvensdekning, alle aminosyredannende fragmentioner observert, lav fragmentionmassefeil som definert av maksimumsgrensen på 0,02 Da og inneholdt en gaussisk elutionprofil. Disse resultatene indikerer at et endogent peptid som tilhører krepsdyr-RYamid nevropeptidfamilien ble observert.

MALDI-MS-målinger kan gi neuropeptididentifikasjoner som er komplementære til LC-ESI-MS-identifikasjon, samt tilby høyere gjennomstrømningsmuligheter. Etter at råvevshomogenat er ekstrahert for nevropeptider, avsaltet og merket (om ønskelig), kan prøven blandes med matrise og flekket på målplaten i MALDI rustfritt stål, som vist i figur 4A. Vellykket pipettering av homogene prøvepunkter gir klart løste topper, spesielt innenfor kalibreringsspekteret (figur 4B). Ved bruk av et MALDI-TOF-instrument må instrumentet kalibreres i begynnelsen av hvert eksperiment. Eventuelle analytter med kjente masser kan brukes til å kalibrere instrumentet hvis det er innenfor ønsket masseområde av prøven. Her brukes rødt fosfor til positiv ionmassekalibrering av instrumentet. Den har fordeler i forhold til å bruke peptidkalibreringsblandinger på grunn av stabiliteten ved romtemperatur, billig pris, rikelig topper på grunn av polymerisasjon, høyt signal-til-støy-forhold, og det krever ikke en matrise for ionisering.

For MALDIV-MS-avbildning av nevropeptider krever MALDI TOF/TOF-instrumentet som brukes manuell bildekalibrering av det ITO-belagte lysbildet (trinn 3.1.10) for å korrelere det optiske bildet med prøven. Diagrammet i figur 5 viser riktig plassering av bleke trådkors som skal brukes som undervisningspunkter, slik at instrumentet kan korrelere det skannede optiske bildet med den faktiske prøveplaten. Den illustrerer også områder i det ITO-belagte lysbildet som bør unngås av brukeren (dvs. ikke inneholder prøve eller matrise). For massekalibrering påvirker plasseringen av kalibreringsprøvepunktet i forhold til vevsprøven på det ITO-belagte lysbildet direkte massefeilen på grunn av den iboende karakteren av tid-av-fly masseanalysatorer, selv om omfanget av dette problemet er avhengig av overflod av målanalyttene. En løsning på dette problemet er å manuelt sjekke topper fra MS1-spektra fra forskjellige vevsseksjoner for bevis på toppforskyvning. Hvis det er toppforskyvning, bør du vurdere å legge til flere massekalibreringspunkter på den ITO-belagte sklien rett ved siden av hver vevsdel. Derfra kan brukeren gjennomsnittet av spektra fra kalibreringspunktene sammen eller utføre MS-avbildning på en vevsseksjon om gangen ved å bruke bare kalibreringspunktet nærmest vevsdelen. Etter at prøven er samlet inn, må du kontrollere at signalet fra m/z-verdier som tilsvarer nevropeptider, bare er lokalisert innenfor vevsområdet (figur 6) før du tildeler en putativ nevropeptididentifikasjon.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for prøvepreparering av nevropeptid for massespektrometrianalyse. For vevsekstraktanalyse blir råvevshomogenat avsaltet, merket med stabile isotopiske etiketter, avsaltet igjen og analysert av MS. For avbildningsanalyse er intakt vev innebygd, kryoseksjonert, anvendt med matrise og analysert av MALDI-MSI. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Identifisering og kvantifisering utført gjennom proteomikkprogramvaren. Neuropeptider oppdages gjennom spektra av varierende kvalitet med (A) god eller (B) dårlig MS2 fragmenteringsdekning. Fragment ion masse matching feil er vist under spektra. (C) XIC-profilformer og oppbevaringstid (RT) kan inspiseres manuelt for nevropeptider kvantifisert gjennom LFQ. (D) MS1-spektra brukes til å oppdage og kvantifisere dimetylmerkede nevropeptider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: De novo-sekvensering for ny neuropeptiddeteksjon. (A) MS2-spekteret til en putativ roman RYamide viser god fragmenteringsdekning med lav massefeil for hvert fragment. (B) De identifiserte fragmentionene er oppført for manuell inspeksjon. (C) XIC i det nye nevropeptidet inspiseres manuelt for gaussisk toppform. Forkortelser: RT = oppbevaringstid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: MALDI-MS-flekker og kalibreringsspekter. (A) MS spektra kvalitet er avhengig av ensartet matrise-peptid distribusjon i MALDI rustfritt stål målbrønn. De tre venstre flekkene er eksempler på gode flekker som berører kantene på brønngraveringen, og de tre høyre flekkene er eksempler på dårlige flekker. Begge flekkene inneholder α-Cyano-4-hydroksycinnamic acid (CHCA) matrise og en peptid standard blanding. (B) Kalibreringsspekter ved hjelp av røde fosforklynger fra 500 - 3200 m/z. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Skildring av ITO-belagt glasssklie. (A) Skjematisk med viktige områder notert: steder å plassere vevsseksjoner (lyseblå rektangler), automatiske lærepunkter som bør unngås (røde rektangler), eksempelsteder der lærepunkter kan tegnes (hvite trådkors), og hvor skruer festes til adapterplaten og bør unngås (mørkeblå ovaler). (B) Bilde av glasssklie som inneholder to vevsseksjoner, et sted som inneholder en kalibreringsblanding og trådkorsmerker. Plasseringen av vevsdelen og kalibreringspunktene er skissert på den andre siden av glasssklie. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: MS-bilder av C. sapidus sinuskjertler. Neuropeptid [M+H]+ ionfordelingsbilder av (A) HL/IGSL/IYRamide (m/z 844,48), (B) Allatostatin A-type NPYAFGLamide eller GGPYAFGLamide (m/z 2780,40), (C) Allatostatin A-type GQYAFGLamide (m/z 754,39) og (D) RFamide GRNFLRFamide (m/z 908,52) vises. Bilder genereres ved hjelp av et ± 50 ppm vindu fra den teoretiske m / z-verdien . Fargelinjen angir signalintensitetsområdet fra 0 til 100 %. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Databasesøk og LFQ-resultater. Neuropeptider identifisert og kvantifisert gjennom LC-MS og proteomikk programvare. Identifiserte PTMer er oppført sammen med intensitetene til oppdagede peptider i begge prøvene for LFQ, sammen med det resulterende LFQ-forholdet. De gjennomsnittlige massene og observerte neuropeptidbeskrivelser fra FASTA-filen er oppført. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nøyaktig identifisering, kvantifisering og lokalisering av nevropeptider og endogene peptider som finnes i nervesystemet er avgjørende for å forstå deres funksjon23,24. Massespektrometri er en kraftig teknikk som kan tillate alt dette å bli oppnådd, selv i organismer uten et fullt sekvensert genom. Denne protokollens evne til å oppdage, kvantifisere og lokalisere nevropeptider fra vev samlet inn fra C. sapidus gjennom en kombinasjon av LC-ESI- og MALDI-MS er demonstrert.

Under prøvepreparering for LC-ESI-MS-analyse må det tas hensyn. Mens MS er en sensitiv teknikk, utgjør den lave peptidkonsentrasjonen av nevronvev (ned til femtomolarområdet25) en alvorlig begrensning. Forsiktig prøvepreparering er nødvendig for ikke bare å fjerne mer rikelige og forstyrrende matrisekomponenter, for eksempel proteiner og lipider, men også minimere tapet av nevropeptider i hvert trinn26,27. For eksempel kan prøvetap reduseres ved å bruke mikrocentrifuge rør som motstår peptid adsorpsjon. Avhengig av sammensetningen av interessevevet, kan bruk av ulike løsningsmidler (for utvinning eller nedbør) eller fastfase ekstraksjonsmaterialer brukes til å skille biomolekyler med forskjellige størrelser og kjemiske egenskaper. For å sikre at hydrofile eller hydrofobe peptider er til stede i nevropeptidekstraktet, kan flere ekstraksjonsløsningsmiddelsystemer eventuelt brukes til å målrette nevropeptider med forskjellige fysisk-kjemiske egenskaper. Disse, sammen med bruk av proteasehemmere, må kanskje endres for optimalisert rensing for å forbedre nevropeptidgjenoppretting28. Ulempene ved å bruke flere ekstraksjonssystemer er at flere nevronale vev må samles for å oppfylle et generelt høyere krav til peptidinnhold, samt redusert gjennomstrømning. Mange trinn som avsalting, isotopisk merking og MS-injeksjon anbefaler visse startpeptidmengder. For karakterisering av dyrebare prøver, som nevropeptider, unngås peptidanalyser generelt for å forhindre ekstern peptidforbruk. I tillegg ble peptidanalyser utviklet for å bestemme nøyaktig peptidkonsentrasjon fra proteinfordøyelser, som har forskjellige kjemiske egenskaper enn endogene peptider. For å overvinne komplikasjoner fra ukjent nevropeptidkonsentrasjon, kan en innledende peptidanalyse utføres ved hjelp av samlede nevronale vevsekstrakter, hvor resultatene brukes som et estimat for alle etterfølgende analyser, selv om det må huskes at alle peptider i løsningen måles, og ikke alle disse er nevropeptider29. Andre begrensninger ved denne metoden inkluderer potensielle skjevheter til ikke-polare og hydrofobe nevropeptider og mangel på innfødt strukturbevaring. Modifikasjoner på løsemiddelsammensetninger og materialer, for eksempel bruk av løsninger som er mer hydrofobe eller utelater bruk av organiske løsningsmidler, kan utføres for å løse dette.

MALDI-MS-målinger er avhengige av nøye prøveprepareringstrinn for konsistente resultater og kan ha andre utvalgshensyn enn for LC-ESI-MS-målinger. Trinn som å holde nevropeptidekstrakt på is før MS-analyse brukes fortsatt. Ytterligere metoder for å forhindre nevropeptidforringelse inkluderer å holde glasssklier som inneholder tintemonterte vevsseksjoner i en tørkemiddelboks etter avhandling for å forhindre kondens fra å akkumulere30, selv om det å forlate vevsprøven i tørkeapparatet etter at den har tørket, også kan føre til prøveforringelse. Plassering av vevet glir i en vakuumdesiccator (slutttrykk: 1x10-4 Torr ved romtemperatur) i 5-10 min umiddelbart før matrisepåføring foreslås. Etter at matrisen er avsatt på vevsskuffen, kan den oppbevares i kjøleskapet eller fryseren over natten og tørkes i vakuumdesiccatoren før maldiv-MS-bildemåling. For MALDI-målinger er matrisepeptidkrystallstrukturen ikke like fordelt over hele Maldivens målbrønn, selv om det ser ut til å være slik. Det finnes måter å redusere massespektravariasjoner fra tekniske replikeringer på grunn av denne prosessen. Først må du skaffe et gjennomsnittlig spektrum fra hver brønn ved hjelp av flere laserbilder (vanligvis hundrevis til tusenvis) der laseren er tilfeldig rastrert over brønnen (dvs. velge SMART eller Tilfeldig prøvebærerbevegelse i instrumentparametere). Skaff deg minst fem tekniske replikeringer for hver prøvetype, og velg tre tekniske repliker der variasjonen i signalintensiteten for ønskede topper er den laveste. Avveiningen her er eksperimentell gjennomstrømning. Det er nødvendig å holde parametere som antall laserskudd, laserdiameter og andre instrumentinnstillinger konsistente for alle oppkjøpte spektra. Ideelt sett analyseres alle tekniske repliker og biologiske repliker samtidig ved hjelp av samme matriseløsning og instrumentkalibrering. Neuropeptididentifikasjon kan utføres ved nøyaktig massetilpasning til en toppliste som inneholder teoretiske [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, [M+K]+, og andre saltandukter som produserer enkeltladede ion m/z-verdier . Normalisering av data er avgjørende for å minimere systematiske artefakter fra MALDI-MS-eksperimenter. Evaluering av reproduserbarhet er spesielt viktig når MALDI-MS målinger brukes til nevropeptid kvantifisering ved stabil isotopmerking (SIL). Kvaliteten på prøvepreparering og datainnsamling kan evalueres ved å ta en peptidstandard eller neuropeptidekstrakt, dele den i to like aliquots, differensialt merke hver prøve av SIL, og analysere prøven for å sikre at den relative intensiteten av parede topper er 1: 1. Variasjonen som rapporteres fra disse forholdete, kan brukes til å estimere variansnivået i det totale eksperimentet som tilskrives brukerfeil.

Det er viktig å merke seg at MALDI-MS også er i stand til å gi sekvens og kvantitativ informasjon; Imidlertid begrenser de singly ladede ionene vanligvis produsert av MALDI-begrensningen peptidfragmentdeteksjon, noe som gjør det vanskeligere å oppnå hele sekvensen og hemme kvantifiseringsmetodene som er diskutert for LC-ESI-MS. Uansett er MALDI-MS en attraktiv modalitet på grunn av sin evne til høy gjennomstrømning, samt en høyere toleranse for salter og urenheter i prøven12,31. I tillegg har MALDI-MS-avbildning fordeler i forhold til andre konvensjonelle avbildningsteknikker som krever antistoffer. I de fleste MS-modaliteter vil senking av masseoppløsningen øke følsomheten, noe som muliggjør forbedret påvisning av lave overflods neuropeptider. Denne strategien kan være mer praktisk for MALDI-TOF/TOF-instrumenter enn LC-ESI-MS-instrumenter på grunn av hvor enkelt det er å kalibrere Maldiven-instrumentet for hvert eksperiment. En annen måte som MALDI kan være fordelaktig for nevropeptidomikk er gjennom spektra gjennomsnitt. Vanligvis brukes ikke gjennomsnitt av spektra fra LC-ESI-MS-målinger fordi det negerer fordelene med LC-separasjon; Derfor er bioinformatikkprogramvare sterkt avhengig av å identifisere nevropeptider, og identifikasjonene verifiseres manuelt. Det er imidlertid færre konsekvenser for gjennomsnittlig spektra fra MALDI-MS-målinger fordi det ikke var noen innledende separasjon; Derfor er rådataene mindre og enklere for en bruker å kamme manuelt gjennom. Enkel databehandling er viktig da det endrer rekkefølgen brukeren kan nærme seg neuropeptididentifikasjons- og verifiseringsstrategier. Selv om tillit til nevropeptididentifikasjoner fra LC-ESI-MS kan dra nytte av å øke nivået av terskelstrenger i dataanalyseprogramvare, er det mindre sannsynlig at denne strategien vil være til nytte for MALDI-MS-identifikasjoner. I eksempelet med krepsdyr neuropeptider, det faktum at det er mindre enn 1000 oppføringer fra den lab-bygde databasen (dvs. maksimalt < 1000 spektraltopper eller MS-bilder som skal skannes manuelt gjennom), gjør det mulig å først filtrere MALDI-MS-dataene med en sjenerøs massefeilterskel, og deretter manuelt verifisere disse identifikasjonene ved å undersøke isotopiske konvolutter på MS1-nivå, og deretter manuelt verifisere disse identifikasjonene ved å undersøke isotopiske konvolutter på MS1-nivå, og deretter manuelt verifisere disse identifikasjonene ved å undersøke isotopiske konvolutter på MS1-nivå, og deretter manuelt verifisere disse identifikasjonene ved å undersøke isotopiske konvolutter på MS1-nivå, samt andre verifikasjonsmetoder som er omtalt i delen Representative Resultater. Populær MS bildebehandling dataanalyse programvare kan utføre nøyaktig masse matching til en neuropeptid masse database og trekke ut tilsvarende MS-bilder. For klinisk baserte forskningsspørsmål, for eksempel biomarkøroppdagelse, er disse programvarene i stand til å trekke ut m / z-verdier som er unike for et vevsområde av interesse (vanligvis kalt Region of Interest (ROI) analyse)32 og utføre statistiske tester for å kvantifisere hvor forskjellige to vevsregioner er. Det er også verdt å merke seg at det også er færre programvarealternativer for dataanalyse for MS-avbildning enn for LC-ESI-MS.

Å utføre LC-ESI-MS-databasesøk etter nevropeptider innebærer vanligvis bruk av programvarealgoritmer bygget for analyse av fordøyde peptider. Som sådan er det begrensninger for at programvare kan utføre ikke-spesifikke enzymdatabasesøk eller hvor lang tid det tar å fullføre søket. For tiden utføres endogene peptidsøk med maksimalt antall tapte spaltinger, men dette tallet er fortsatt begrenset, noe som fører til potensielt manglende identifikasjoner. Når genomet for en art ikke er fullstendig sekvensert, som med C. sapidus, kan de novo-sekvensering utføres for å identifisere ukjente / nye nevropeptider gjennom kjente bevarte nevropeptidsekvensmotiver, selv om denne metoden ikke klarer å identifisere nevropeptider som har ukjente motiver eller ikke inneholder motivene som brukes som nevropeptidfamilieidentifikatorer19. For eksempel er WSSMRGAWamide et motiv for allatostatin B-type nevropeptidfamilien19. Her ligger betydningen av transkripsjonsgruvedrift for predikerte nevropeptidsekvenser for arter uten en fullstendig dekodet genomsekvens33. Neuropeptididentifikasjoner bekreftes deretter ved å syntetisere putativ peptidsekvens og sammenligne MS/MS-spektra fra syntetisk peptid og biologisk vev34. Selv etter at en sekvens er bekreftet, er det noen ganger ukjent om det er hele nevropeptidsekvensen eller et nedbrytningsprodukt. Det er verdt å merke seg at forskjeller mellom MALDI og ESI-MS ioniseringskilder (ESI er en mykere ioniseringsmetode enn MALDI) kan resultere i forskjellige rater av kunstig nedbrytning (dvs. fragmentering i kilden). For å skille mellom en avkortet versjon av et peptid fra et kunstig indusert (dvs. ikke in vivo) nedbrytningsprodukt, må preprohormone prosesseringsveien for det nevropeptidet være kjent. Siden dette ofte ikke er tilfelle, bør en syntetisk form av peptid brukes i fysiologiske analyser og verifiseres for biologisk aktivitet.

Totalt sett kan arbeidsflyten som eksemplifiseres her for nevropeptidanalyse, være til nytte for en rekke forskjellige felt. Det fyller et teknisk gap innen middel-ned MS analyse av peptider fordi det er optimalisert for endogene peptider som er mindre enn proteiner vanligvis analysert av bottom-up eller ovenfra og ned MS analyser. Derfor bør prøveforberedelsesmetodene som brukes av nevropeptidomikk i stor grad oversettes til andre bioaktive endogene peptider, for eksempel de som er målrettet av medisinske kjemikere for antibakterielle egenskaper35. En fordel med denne protokollen er at den bruker vanlige instrumenter fra populære leverandører som også tilbyr en ekstra grad av overførbarhet. På denne måten kan arbeidsflyten brukes i akademiske og kommersielle omgivelser, for eksempel screening for farmasøytiske legemiddelkandidater eller narkotikamål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av National Science Foundation (CHE-1710140 og CHE-2108223) og National Institutes of Health (NIH) gjennom grant R01DK071801. A.P. ble delvis støttet av NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. ble delvis støttet av National Institutes of Health, under Ruth L. Kirschstein National Research Service Award fra National Heart Lung and Blood Institute til University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. ønsker å anerkjenne NIH-tilskudd R56 MH110215, S10RR029531 og S10OD025084, samt støtte fra et Vilas Distinguished Achievement Professorship og Charles Melbourne Johnson Professorship med finansiering fra Wisconsin Alumni Research Foundation og University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix Supelco 39319
Acetic acid Fisher Chemical A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A955-500
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
Borane pyridine Sigma-Aldrich 179752
Bruker peptide calibration mix Bruker Daltonics NC9846988
Capillary Polymicro 1068150019 to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup Sigma-Aldrich E6032 any cup or mold should work
 Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30108434
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde - D2 Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Optima LC/MS grade Fisher Chemical A117-50
Gelatin Difco 214340 place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen Vector Labs 15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides Delta Technologies CB-90IN-S107 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials Thermo TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade Fisher Chemical A456-500
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 Hydrophobic film
pH-Indicator strips Supelco 109450
Red phosphorus clusters Sigma-Aldrich 343242
Reversed phase C18 material Waters 186002350 manually packed into nanoflow column
Wite-out pen BIC 150810
ZipTip Millipore Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5 HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R Eppendorf 05-401-205
Cryostat- HM 550 Thermo Fisher Scientific 956564A
Desiccant Drierite 2088701
Forceps WPI 501764
MALDI stainless steel target plate Bruker Daltonics 8280781
Pipet-Lite XLS Rainin 17014391 200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100 Savant SVC-100D
Ultrasonic Cleaner Bransonic 2510R-MTH for sonication
Ultrasonic homogenizer Fisher Scientific FB120110 FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A Ideal Vacuum Products P10976 ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer Corning 6775
Water bath (37C) - Isotemp 110 Fisher Scientific 15-460-10
Data Analysis Software
Expasy https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis Bruker Daltonics
FlexControl Bruker Daltonics
FlexImaging Bruker Daltonics
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab https://scils.de/
SignalP 5.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMS=tblastn&PAGE_
TYPE=BlastSearch&SHOW_
DEFAULTS=on&LINK_LOC
=blasthome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
  2. Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
  3. Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, clifton, N.J. 71-101 (1997).
  4. Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
  5. Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
  6. Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
  7. Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
  8. Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
  9. Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
  10. Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
  11. Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
  12. Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
  13. Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
  14. Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
  15. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
  16. Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
  17. Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
  18. Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
  19. DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
  20. Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
  21. Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
  22. Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
  23. DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
  24. Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
  25. Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
  26. Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
  27. Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
  28. Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
  29. Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
  30. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  31. Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
  32. Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
  33. Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
  34. Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
  35. Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).

Tags

Kjemi utgave 183 nevropeptid massespektrometri peptidrensing isotopisk merking de novo-sekvensering kvantifisering LC Maldive massespektrometriavbildning databasesøk transkripsjonsutvinning
Mangesidig massespektrometrisk undersøkelse av nevropeptider i <em>Callinectes sapidus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L.… More

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus. J. Vis. Exp. (183), e63322, doi:10.3791/63322 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter