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Chemistry

Étude spectrométrique de masse à multiples facettes des neuropeptides chez Callinectes sapidus

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/63322
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison
* These authors contributed equally

Summary

La caractérisation par spectrométrie de masse des neuropeptides fournit des informations de séquence, de quantification et de localisation. Ce flux de travail optimisé est non seulement utile pour les études de neuropeptides, mais aussi pour d’autres peptides endogènes. Les protocoles fournis ici décrivent la préparation des échantillons, l’acquisition de la SEP, l’analyse de la SEP et la génération de bases de données de neuropeptides à l’aide de l’imagerie LC-ESI-MS, MALDI-MS et MALDI-MS.

Abstract

Les neuropeptides sont des molécules de signalisation qui régulent presque tous les processus physiologiques et comportementaux, tels que le développement, la reproduction, l’apport alimentaire et la réponse aux facteurs de stress externes. Pourtant, les mécanismes biochimiques et l’ensemble des neuropeptides et leurs rôles fonctionnels restent mal compris. La caractérisation de ces peptides endogènes est entravée par l’immense diversité au sein de cette classe de molécules de signalisation. De plus, les neuropeptides sont bioactifs à des concentrations 100x - 1000x inférieures à celles des neurotransmetteurs et sont sujets à la dégradation enzymatique après libération synaptique. La spectrométrie de masse (SEP) est un outil analytique très sensible qui permet d’identifier, de quantifier et de localiser les analytes sans connaissances a priori approfondies. Il est bien adapté pour profiler globalement les neuropeptides et aider à la découverte de nouveaux peptides. En raison de la faible abondance et de la grande diversité chimique de cette classe de peptides, plusieurs méthodes de préparation d’échantillons, paramètres d’acquisition de SEP et stratégies d’analyse de données ont été adaptés à partir de techniques protéomiques pour permettre une caractérisation optimale des neuropeptides. Ici, des méthodes sont décrites pour isoler les neuropeptides de tissus biologiques complexes pour la caractérisation, la quantification et la localisation de séquences à l’aide de la chromatographie liquide (LC)-MS et de la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI)-MS. Un protocole pour la préparation d’une base de données de neuropeptides à partir du crabe bleu, Callinectes sapidus, un organisme sans informations génomiques complètes, est inclus. Ces flux de travail peuvent être adaptés pour étudier d’autres classes de peptides endogènes chez différentes espèces à l’aide d’une variété d’instruments.

Introduction

Le système nerveux est complexe et nécessite un réseau de neurones pour transmettre des signaux dans tout un organisme. Le système nerveux coordonne l’information sensorielle et la réponse biologique. Les interactions complexes et alambiquées impliquées dans la transmission du signal nécessitent de nombreuses molécules de signalisation différentes telles que les neurotransmetteurs, les stéroïdes et les neuropeptides. Comme les neuropeptides sont les molécules de signalisation les plus diverses et les plus puissantes qui jouent un rôle clé dans l’activation des réponses physiologiques au stress et à d’autres stimuli, il est intéressant de déterminer leur rôle spécifique dans ces processus physiologiques. La fonction des neuropeptides est liée à leur structure en acides aminés, qui détermine la mobilité, l’interaction des récepteurs et l’affinité1. Des techniques telles que l’histochimie, qui est importante parce que les neuropeptides peuvent être synthétisés, stockés et libérés dans différentes régions du tissu, et l’électrophysiologie ont été utilisées pour étudier la structure et la fonctiondes neuropeptides 2,3,4, mais ces méthodes sont limitées par le débit et la spécificité pour résoudre la grande diversité de séquences des neuropeptides.

La spectrométrie de masse (SEP) permet l’analyse à haut débit de la structure et de l’abondance des neuropeptides. Cela peut être effectué par différentes techniques MS, le plus souvent la chromatographie liquide-ionisation par électropulvérisation MS (LC-ESI-MS)5 et la désorption/ionisation laser assistée par matrice MS (MALDI-MS)6. En utilisant des mesures de masse de haute précision et la fragmentation de la SEP, la SEP offre la possibilité d’attribuer la séquence d’acides aminés et le statut de modification post-traductionnelle (PTM) aux neuropeptides de mélanges complexes sans connaissance a priori pour aider à déterminer leur fonction 7,8. En plus de l’information qualitative, la SEP permet l’information quantitative des neuropeptides grâce à la quantification sans étiquette (LFQ) ou à des méthodes basées sur l’étiquette telles que le marquage isotopique ou isobare9. Les principaux avantages de LFQ comprennent sa simplicité, son faible coût d’analyse et la diminution des étapes de préparation des échantillons, ce qui peut minimiser la perte d’échantillons. Cependant, les inconvénients de LFQ comprennent l’augmentation des coûts de temps d’instrument, car il nécessite plusieurs répétitions techniques pour traiter les erreurs quantitatives de la variabilité d’une exécution à l’autre. Cela conduit également à une diminution de la capacité à quantifier avec précision les petites variations. Les méthodes basées sur l’étiquette sont soumises à des variations moins systématiques, car plusieurs échantillons peuvent être marqués différemment à l’aide d’une variété d’isotopes stables, combinés en un seul échantillon et analysés simultanément par spectrométrie de masse. Cela augmente également le débit, bien que les étiquettes isotopiques puissent prendre beaucoup de temps et être coûteuses à synthétiser ou à acheter. La complexité spectrale des spectres de masse à balayage complet (MS1) augmente également à mesure que le multiplexage augmente, ce qui diminue le nombre de neuropeptides uniques pouvant être fragmentés et donc identifiés. Inversement, le marquage isobare n’augmente pas la complexité spectrale au niveau MS1, bien qu’il présente des défis pour les analytes de faible abondance tels que les neuropeptides. Comme la quantification isobare est effectuée au niveau des spectres de masse d’ions fragmentaires (MS2), les neuropeptides de faible abondance peuvent ne pas être en mesure d’être quantifiés car des composants de matrice plus abondants peuvent être sélectionnés pour la fragmentation et ceux sélectionnés peuvent ne pas avoir une abondance suffisamment élevée pour être quantifiés. Avec le marquage isotopique, la quantification peut être effectuée sur chaque peptide identifié.

En plus de l’identification et de la quantification, les informations de localisation peuvent être obtenues par MS par le biais de l’imagerie MALDI-MS (MALDI-MSI)10. En raster un laser sur une surface d’échantillon, les spectres MS peuvent être compilés dans une image de carte thermique pour chaque valeur m/z . La cartographie de l’intensité du signal neuroptidique transitoire dans différentes régions à travers les conditions peut fournir des informations précieuses pour la détermination de la fonction11. La localisation des neuropeptides est particulièrement importante car la fonction des neuropeptides peut différer selon l’emplacement12.

Les neuropeptides se trouvent en plus faible abondance in vivo que d’autres molécules de signalisation, telles que les neurotransmetteurs, et nécessitent donc des méthodes sensibles pour la détection13. Cela peut être réalisé par l’élimination des composants de la matrice d’abondance plus élevée, tels que les lipides11,14. Des considérations supplémentaires pour l’analyse des neuropeptides doivent être prises en compte par rapport aux flux de travail protéomiques courants, principalement parce que la plupart des analyses neuropeptidomiques omettent la digestion enzymatique. Cela limite les options logicielles pour l’analyse des données sur les neuropeptides, car la plupart ont été construites avec des algorithmes basés sur des données protéomiques et des correspondances de protéines informées par la détection de peptides. Cependant, de nombreux logiciels tels que PEAKS15 sont plus adaptés à l’analyse des neuropeptides en raison de leurs capacités de séquençage de novo. Plusieurs facteurs doivent être pris en compte pour l’analyse des neuropeptides, de la méthode d’extraction à l’analyse des données sur la SEP.

Les protocoles décrits ici comprennent des méthodes de préparation d’échantillons et de marquage isotopique diméthylique, d’acquisition de données et d’analyse de données de neuropeptides par LC-ESI-MS, MALDI-MS et MALDI-MSI. Grâce aux résultats représentatifs de plusieurs expériences, l’utilité et la capacité de ces méthodes à identifier, quantifier et localiser les neuropeptides des crabes bleus, Callinectes sapidus, sont démontrées. Pour mieux comprendre le système nerveux, des systèmes modèles sont couramment utilisés. De nombreux organismes n’ont pas de génome entièrement séquencé disponible, ce qui empêche la découverte complète de neuropeptides au niveau peptidique. Afin d’atténuer ce défi, un protocole d’identification de nouveaux neuropeptides et d’extraction de transcriptomes afin de générer des bases de données pour les organismes sans informations complètes sur le génome est inclus. Tous les protocoles présentés ici peuvent être optimisés pour des échantillons de neuropeptides de n’importe quelle espèce, ainsi que pour l’analyse de tous les peptides endogènes.

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Protocol

Tous les prélèvements de tissus décrits ont été effectués conformément aux directives de l’Université du Wisconsin-Madison.

1. Analyse LC-ESI-MS des neuropeptides

  1. Extraction et dessalement des neuropeptides
    1. Avant l’acquisition tissulaire, préparer du méthanol acidifié (acMeOH) (90:9:1 MeOH:eau:acide acétique) comme décrit aupoint 16.
    2. Prélever le tissu cérébral du crustacé17 et utiliser une pince pour placer immédiatement un tissu chacun dans un tube de 0,6 mL contenant 20 μL d’acMeOH.
      REMARQUE: Les protocoles de dissection tissulaire varient considérablement selon les animaux et les différents types de tissus. Le lecteur est renvoyé au protocole17 pour une description détaillée sur la façon de disséquer le tissu cérébral et plusieurs autres types de tissus du crustacé. Les échantillons peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à leur utilisation (idéalement dans les 6 mois). Les volumes décrits sont utilisés pour un seul cerveau de Callinectes sapidus. Les volumes doivent être mis à l’échelle en fonction de la taille des tissus. Les tissus peuvent être congelés immédiatement sans solvant, bien que cela ne soit pas recommandé car les enzymes protéolytiques endogènes ne seront pas inhibées et resteront actives, bien qu’à un rythme plus lent à froid.
    3. Ajouter 150 μL d’acMeOH à l’échantillon. Réglez le temps de sonication total à 24 s, le temps d’impulsion à 8 s, le temps de pause à 15 s et l’amplitude à 50% sur un homogénéisateur à ultrasons et homogénéisez les échantillons sur la glace.
      REMARQUE: Il existe différents systèmes d’homogénéisation disponibles. Ajustez les paramètres et les conditions en fonction du type d’échantillon et de l’équipement.
    4. Centrifuger l’échantillon à 4 °C à 20 000 x g pendant 20 min. À l’aide d’une pipette, transférer le surnageant dans un tube et le sécher dans un concentrateur sous vide (266 x g, 1 x 10-4 Torr) à environ 35 °C.
      REMARQUE: Les échantillons séchés peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à leur utilisation (idéalement dans les 6 mois). Le chauffage du concentrateur à vide doit être effectué avec prudence. Alors que la chaleur raccourcit le temps de séchage, l’échantillon doit être retiré du concentrateur immédiatement après que tout le liquide s’est évaporé pour minimiser la dégradation peptidique. Pour éviter cela, le chauffage peut être omis de cette étape et de toutes les étapes suivantes.
    5. Pour le dessalement, reconstituer l’échantillon de tissu extrait dans 20 μL d’acide formique (AF) à 0,1 %, puits vortex et sonicate dans un bain-marie à température ambiante pendant 1 min.
      REMARQUE: Il existe différents matériaux de dessalement disponibles. Ajustez les solutions et les volumes en fonction de l’identité de la résine et de la quantité de neuropeptides. La quantité totale de peptides peut être estimée à l’aide d’un test commercial de quantification des peptides (voir tableau des matériaux).
    6. Appliquer 0,5 μL d’échantillon sur une bande de pH pour confirmer que le pH < 4. Si le pH est plus élevé, ajouter 1 μL aliquotes de 10% FA jusqu’à ce que le pH < 4.
    7. Suivez le protocole du fabricant pour le dessalage18. Préparer une solution mouillante contenant 100 μL d’acétonitrile à 50 % (ACN), une solution d’équilibrage contenant 100 μL de FA à 0,1 %, une solution de lavage contenant 100 μL de 0,1 % d’AF et des solutions d’élution contenant 20 μL d’ACN à 25 %/0,1 % d’AF, 20 μL d’ACN/0,1 % d’AF à 50 % et 20 μL d’ACN/0,1 % d’AF à 75 %.
    8. Obtenez une pointe de dessalement de 10 μL avec de la résine C18 (voir tableau des matériaux).
    9. Placez la pointe de dessalement sur une pipette de 20 μL réglée sur 15 μL. Une fois que la pointe de dessalement est mouillée, empêchez l’air de passer à travers en gardant la pipette enfoncée lorsqu’elle est hors solution jusqu’à ce qu’elle soit jetée.
    10. Aspirer la pointe 3x avec une solution mouillante et 3x avec une solution d’équilibrage. Aspirer dans l’échantillon 10x suivi d’un lavage 3x en solution de lavage, en jetant chaque lavage. Éluez en aspirant 10x dans chacune des solutions d’élution par ordre d’augmentation de l’ACN.
      REMARQUE: Les fractions d’élution peuvent être séparées ou combinées pour des analyses ultérieures.
    11. Jeter la pointe de dessalement usagée et sécher les neuropeptides élués dans un concentrateur sous vide (266 x g, 1 x 10-4 Torr) à environ 35 °C.
      REMARQUE: Cela peut être conservé à -80 ° C jusqu’à utilisation (idéalement dans les 6 mois).
  2. Marquage isotopique des neuropeptides dans l’extrait tissulaire
    REMARQUE: Cette étape est facultative et n’est utilisée que lorsque la quantification est souhaitée.
    1. Préparer la solution de marquage diméthylique isotopique 2-plex dans une hotte : 1 % CH2OH2 (13,5 μL de bouillon 37 % poids/poids (p. %) dans une solution aqueuse dans 486,5 μL d’eau), 1 % CH2OD2 (25 μL de bouillon 20 % en poids de solution dans 475 μL d’eau) et 0,03 M de pyridine borane (3,75 μL de solution mère 8 M dans 996,25 μL d’eau).
      ATTENTION: Le formaldéhyde est toxique, toutes les solutions doivent donc être conservées dans une hotte ventilée. Portez des gants, un manteau de laboratoire, une protection oculaire et des chaussures imperméables. Les lentilles de contact ne doivent pas être portées lorsque vous travaillez avec ce matériau.
      REMARQUE: Il existe différents réactifs isotopiques; sélectionnez les canaux appropriés en fonction du type d’échantillon et du nombre de canaux d’étiquetage souhaités.
    2. Dissoudre l’extrait de neuropeptide brut dans 10 μL d’eau et soniquer pendant 10 min.
    3. Ajouter 10 μL d’une solution de formaldéhyde isotopique différente (c.-à-d. CH2 OH2,CH2OD2, etc.) à chaque condition expérimentale différente à mesurer quantitativement. Vortex pour bien mélanger et centrifuger brièvement chaque échantillon à 2 000 x g.
    4. Ajouter 10 μL de pyridine borane de 0,03 M à chaque tube d’échantillonnage. Vortex pour bien mélanger et centrifuger brièvement chaque échantillon à 2 000 x g.
    5. Incuber les échantillons pendant 15 min à 37 °C au bain-marie.
    6. Retirer les échantillons du bain-marie et ajouter 10 μL de bicarbonate d’ammonium de 100 mM. Vortex pour bien mélanger et centrifuger brièvement chaque échantillon à 2 000 x g.
    7. Mélanger les échantillons marqués pour un échantillon de 2-plex et sécher les neuropeptides dans un concentrateur sous vide (266 x g, 1 x 10-4 Torr) à environ 35 °C.
    8. Dessalez les neuropeptides marqués en reperformant les étapes 1.1.5 - 1.1.10 et stockez-les jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’acquisition de données.
  3. Acquisition de données
    1. Reconstituer les neuropeptides dessalés séchés dans 12 μL de 3 % D’ACN/0,1 % d’AF, bien vortex, sonicer au bain-marie à 37 °C pendant 1 min et centrifuger brièvement à 2 000 x g. Transférer chaque échantillon dans des flacons d’échantillonneur automatique.
      REMARQUE: Ajuster le volume de l’échantillon en fonction de la quantité de neuropeptide à une concentration d’environ 1 μg de peptide par μL. La quantité totale de peptide peut être estimée à l’aide d’un test commercial de quantification des peptides (voir la table des matériaux).
    2. Utilisez un échantillonneur automatique pour injecter 1 μL d’échantillon dans un instrument nano-LC-MS/MS à haute résolution (voir tableau des matériaux).
    3. Utilisez une colonne C18 en phase inversée (RP) d’environ 15 cm de long (voir tableau des matériaux) pour faire fonctionner l’échantillon avec 0,1 % d’AF dans l’eau en phase mobile A et 0,1 % d’AF en ACN en phase B mobile. Exécutez les échantillons avec un gradient de 3 % à 95 % de B à un taux de 300 nL/min pendant plus de 11 min.
    4. Pour l’instrument MS utilisé ici, utilisez des conditions MS courantes de 2,00 kV pour la tension de pulvérisation et de 275 °C pour la température capillaire.
    5. Acquérir des spectres MS dans la gamme de 200 à 2 000 m/z avec une résolution de 60 000, une cible de contrôle automatique du gain (AGC) de 1 x 106 et un temps d’injection d’ions (IT) maximal de 150 ms.
    6. Sélectionnez les 15 ions les plus intenses (intensité minimale de 3,2 x 104) pour la fragmentation par dissociation de collision (HCD) à plus haute énergie en utilisant une énergie de collision normalisée de 30, une fenêtre d’isolement de 2,0 m/z, une résolution de 15 000, une cible AGC de 2 x 105 et une IT maximale de 250 ms.
    7. Définissez une fenêtre d’exclusion dynamique de 30 s. Excluez les ions avec une charge de 1 ou ≥ 8 et les ions avec des états de charge non reconnus.
  4. Identification et quantification des neuropeptides
    REMARQUE: De nombreux logiciels pour la recherche dans les bases de données et la quantification des peptides (open source et commerciaux) sont disponibles. Ici, PEAKS Studio (logiciel de protéomique)15 sera utilisé.
    1. Effectuez une recherche dans la base de données en suivant les étapes décrites aux points 1.4.2 à 1.4.6.
    2. Créez un nouveau projet et ajoutez les données LC-MS en sélectionnant None pour l’enzyme, Orbitrap pour l’instrument, HCD pour le fragment et acquisition dépendante des données (DDA) pour l’acquisition.
      REMARQUE : Sélectionnez les paramètres appropriés en fonction des paramètres d’acquisition de données.
    3. Sélectionnez Identifications et sélectionnez Correct Precursor [DDA] et Mass uniquement.
    4. Sélectionnez Recherche dans la base de données et définissez une tolérance d’erreur de 20,0 ppm en utilisant la masse monoisotopique pour la masse précurseur et 0,02 Da pour la masse ionique fragmentaire, Aucune pour le type d’enzyme, Non spécifique pour le mode digest, 100 pour le clivage maximal manqué, et les PTM variables suivantes avec la variable maximale autorisée PTM par peptide de 3: Amidation, Oxydation (M), Pyro-glu de E, et Pyro-glu de Q.
    5. Sélectionnez la base de données des neuropeptides, estimez le taux de fausse découverte (FDR) avec la fusion de leurres.
      REMARQUE: L’erreur de tolérance de masse doit être ajustée pour correspondre aux données collectées. Utilisez la base de données appropriée pour le type d’exemple. Lorsqu’aucune enzyme n’est sélectionnée, le paramètre max de clivages manqués n’affecte pas la recherche. Toutefois, un grand nombre de clivages manqués est requis si le logiciel n’a pas le mode Digest non spécifié comme option.
    6. Si vous souhaitez une quantification sans étiquette, sélectionnez Quantification, sélectionnez Sans étiquette et définissez une tolérance d’erreur de 20,0 ppm et une tolérance de temps de rétention de 1,0 min.
    7. Effectuer la quantification des ions précurseurs si l’étape 1.2 pour le marquage isotopique a été effectuée.
      1. Sélectionnez Quantification, sélectionnez Quantification des ions précurseurs, utilisez une plage de temps de rétention de 1,0 min et utilisez un seuil FDR de 1 %.
      2. Sélectionnez une méthode de quantification prédéfinie ou personnalisée dans le menu déroulant Sélectionner une méthode .
      3. Pour créer une méthode personnalisée, cliquez sur Configuration de la fenêtre > > Méthode Label Q > Nouveau. Nommez la nouvelle méthode et sélectionnez Quantification des ions précurseurs pour Type de méthode. Sélectionnez Ajouter une ligne et sélectionnez modification dans la liste Options PTM.
      4. Ajoutez les données LC-MS et sélectionnez Condition de référence pour être la modification sur les neuropeptides de l’état de contrôle de l’expérience.
    8. Évaluez les résultats de la recherche comme décrit aux étapes 1.4.9 à 1.4.11.
    9. Filtrez les résultats dans l’onglet récapitulatif pour les peptides et les protéines avec -10lgP ≥ 20, sélectionnez ≥ 1 peptide unique et sélectionnez la case intitulée With Significant Peptides.
    10. Évaluez les résultats de recherche dans la base de données où Protein.csv représente les identifications de neuropeptides et Peptide.csv représente les identifications de fragments de neuropeptides.
    11. Inspectez la recherche dans la base de données pour les scores de protéines et de peptides, la précision de la masse et la couverture de séquence.
      REMARQUE: Chaque logiciel de recherche de base de données utilise des algorithmes de notation uniques et peut devoir être évalué en conséquence. Les identifications peuvent être évaluées en inspectant manuellement les spectres observés pour les peptides identifiés contenant la série complète d’ions fragments.

2. Analyse de repérage MALDI-MS des neuropeptides

  1. Préparation des échantillons
    1. Suivez l’étape 1.1 ou les étapes 1.1 à 1.2 si la quantification est souhaitée, à l’exclusion de l’étape 1.2.8 (le dessalement après marquage isotopique n’est pas nécessaire avant l’analyse MALDI-MS).
    2. Reconstituer les neuropeptides dessalés séchés dans 5 μL de 0,1 % FA, bien vortex, soniquer dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 min, et centrifuger brièvement à 2 000 x g.
    3. Pour repérer les neuropeptides dans les tissus des crustacés, préparer 150 mg/mL d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) dans du méthanol (MeOH) à 50 % / 0,1 % FA (v/v) comme matrice.
    4. Pipeter une gouttelette d’échantillon de 3 μL sur un film hydrophobe (voir Tableau des matériaux) et pipeter 3 μL de la matrice directement sur la gouttelette de l’échantillon. Pipette de haut en bas pour mélanger.
    5. Pipette 1 μL du mélange matriciel de l’échantillon 1:1 dans un puits de la plaque cible en acier inoxydable MALDI. Utilisez la pointe de la pipette pour étaler chaque mélange sur les bords du puits de l’échantillon. L’échantillon doit toucher les bords de la gravure du puits pour faciliter une distribution uniforme (Figure 4A).
    6. Spot 1 μL de mélange calibrant:matrice 1:1 (mélange d’étalonnage commercial ou personnalisé, matériaux polymères (c.-à-d. phosphore rouge dissous dans meOH) ou ions d’amas matriciels communs)12 dans un puits près de l’échantillon.
      REMARQUE: Le phosphore rouge n’a pas besoin d’être mélangé avec la matrice avant de le repérer.
  2. Acquisition de données
    1. Insérez la plaque cible contenant des points d’échantillon séchés dans l’instrument MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF) (voir tableau des matériaux).
    2. Pour la matrice DHB, réglez la puissance du laser sur 95 %, sélectionnez Gain optimal automatique du détecteur et Mode de mouvement du porteur d’échantillon intelligent - Échantillon complet . Acquérir des spectres MS compris entre 200 et 3200 m/z et ajouter plusieurs spectres de chaque point ensemble pour augmenter le rapport signal/bruit des neuropeptides.
      REMARQUE: Optimisez le pourcentage de puissance laser, le gain du détecteur et sélectionnez le mode de mouvement du porteur d’échantillon approprié afin que chaque acquisition couvre à peu près tout le spot et que les acquisitions ultérieures ne remontent pas aux positions précédentes.
    3. Calibrez l’instrument.
      REMARQUE: Ajustez la plage de masse pour englober la gamme de neuropeptides souhaitée.
  3. Analyse des données
    1. Ouvrez le fichier MALDI-MS dans le logiciel d’analyse de données (voir Table des matériaux) et cliquez sur Soustraction de base pour le logiciel utilisé ici.
    2. Effectuez la sélection des pics en cliquant sur Rechercher une liste de masse. S’il y a trop peu de pics, modifiez manuellement la liste de masse en sélectionnant Modifier la liste de masse et cliquez sur les pics du spectre pour les ajouter à la liste de masse.
    3. Effectuez une correspondance de masse précise en comparant la liste de masse avec la base de données de neuropeptides contenant des valeurs [M + H] + m / z (± erreur de 200 ppm). 
      REMARQUE : Les adduits de sel courants, tels que [M+K]+, [M+Na]+ et [M+NH4]+, doivent également être inclus dans la liste précise des cibles de correspondance de masse.
    4. Pour vérifier les pics identifiés, générez une liste de m/z d’intérêt et effectuez des expériences MS/MS.

3. Analyse par imagerie MALDI-MS des neuropeptides

  1. Préparation des échantillons
    REMARQUE: Les étapes d’intégration et de sectionnement ne sont pas nécessaires pour les tissus trop minces pour être sectionnés.
    1. Remplir un demi-gobelet de cryostat avec de la gélatine (37 °C, 100 mg/mL dans de l’eau désionisée) et laisser se solidifier à température ambiante. Gardez les restes de gélatine liquide au chaud dans un bain-marie à 37 °C.
    2. Prélever le tissu neuronal souhaité de l’animal et utiliser une pince pour tremper immédiatement le tissu dans un tube de 0,6 mL contenant de l’eau désionisée pendant 1 s.
      REMARQUE: Reportez-vous à l’étape 1.1.2 NOTE pour la dissection du tissu neuronal.
    3. Placez le tissu sur la gélatine solide et remplissez le reste de la tasse de cryostat avec de la gélatine liquide. Utilisez des pinces pour positionner le tissu.
    4. Placez la tasse de cryostat sur une surface plane et congelez-la avec de la glace carbonique.
      REMARQUE: Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à utilisation (idéalement dans les 6 mois).
    5. Pour la préparation du sectionnement, séparez l’échantillon incorporé à la gélatine du moule de cryostat en coupant le moule.
    6. Montez le tissu incorporé sur un mandrin de cryostat en pipetant une gouttelette d’eau désionisée de 1 mL sur le mandrin et en appuyant immédiatement sur le tissu incorporé sur la gouttelette.
    7. Une fois congelé, pipettez plus d’eau désionisée autour du tissu pour le fixer davantage au mandrin. Effectuez ces étapes à l’intérieur de la boîte de cryostat (voir Tableau des matériaux) réglée à -20 °C.
    8. Couper le tissu à une épaisseur approximative d’une cellule (8-20 μm selon le type d’échantillon) et décongeler monter chaque section sur une lame de verre recouverte d’oxyde d’indium-étain (ITO) en plaçant un côté de la lame près de la section et en plaçant un doigt de l’autre côté de la lame pour réchauffer lentement le verre et permettre à la section de coller à la lame.
      REMARQUE: Les sections de tissu peuvent également être décongelées en ramassant un bord de la gélatine avec une pince à épiler (refroidie à -20 ° C), en la plaçant sur la lame en verre revêtue d’ITO et en plaçant un doigt de l’autre côté de la lame pour réchauffer lentement le verre et permettre à la section de coller à la glissière.
    9. Repérez l’échantillon à utiliser comme calibrant (voir l’étape 2.1.6 pour les options d’étrier) en dessinant un petit cercle près de la section de tissu à l’aide d’un stylo hydrophobe et en repérant l’étrier à l’intérieur du cercle.
    10. Marquez chaque coin de la diapositive avec un stylo blanc avec une petite forme contenant des arêtes vives (c.-à-d. x) à utiliser comme points d’enseignement.
    11. Placez la glissière en verre dans la plaque de l’adaptateur de diapositive MALDI et effectuez une numérisation d’image optique haute résolution (≥2400 DPI) à l’aide d’un scanner.
    12. Matrice de pulvérisation sur la section de tissu à l’aide d’un pulvérisateur automatisé (voir le tableau des matériaux pour les détails et les instructions du pulvérisateur).
    13. Pour le MSI des neuropeptides dans les tissus des crustacés, utilisez 40 mg/mL de DHB dans 50 % de méthanol/0,1 % de FA (v/v) comme matrice, réglez la température de la buse à 80 °C, la vitesse à 1 250 mm/min, le débit à 0,1 mL/min, le nombre de passes à 12 et 30 s entre chaque passage pour le pulvérisateur automatique.
  2. Acquisition de données
    1. Insérez la plaque cible complètement séchée contenant des sections de tissu montées sur le dégel qui ont été pulvérisées avec la matrice.
    2. Configurez les paramètres du fichier d’acquisition d’imagerie MS de sorte que le diamètre du laser soit inférieur à la taille de l’étape raster.
    3. Chargez l’image optique numérisée et calibrez la plaque d’échantillonnage à l’aide des points d’apprentissage x. Définissez les zones tissulaires d’intérêt à mesurer légèrement plus grandes que la section tissulaire réelle pour inclure également les zones contenant uniquement de la matrice.
    4. Calibrez l’instrument et acquérez des spectres compris entre 200 et 3200 m/z. Ajustez la plage de masse pour englober la gamme de neuropeptides souhaitée.
  3. Analyse des données
    1. Pour traiter les données, importez le jeu de données d’imagerie MS dans le logiciel souhaité, sélectionnez un algorithme de suppression de base et normalisez les données à l’aide du nombre total d’ions.
      REMARQUE : La sélection de différents algorithmes de normalisation, tels que la médiane, la valeur quadratique moyenne racine (RMS) ou l’intensité d’une valeur m/z de référence, modifiera probablement la distribution spatiale de nombreuses valeurs m/z . Choisissez l’algorithme de normalisation le mieux adapté aux analytes souhaités.
    2. Pour générer une image pour chaque valeur m/z à partir d’une liste de pics théoriques, téléchargez un fichier CSV (valeurs séparées par des virgules) contenant les neuropeptides [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, etc. Obtenez des valeurs m/z en cliquant sur Fichier > Importer > liste de pics. Nommez la liste des pics.
    3. Pour estimer le seuil d’erreur ppm approprié, identifiez d’abord manuellement un pic de neuropeptide dans le spectre de la SEP et comparez-le avec la masse théorique du neuropeptide. Calculez l’erreur ppm et cliquez sur Fichier > Propriétés du fichier > Largeur d’intervalle et erreur ppm d’entrée.
    4. Sélectionnez la liste des pics dans le menu déroulant et cliquez sur Créer des images m/z pour chaque intervalle de la liste des pics.
    5. Enregistrez chaque image m/z en cliquant sur Enregistrer la capture d’écran de chaque image m/z.
      REMARQUE: L’identification présumée des neuropeptides peut être effectuée en identifiant des images m / z où le signal de l’analyte n’est localisé que dans le tissu et non dans la matrice environnante.
    6. Pour vérifier l’identité des pics, générez une liste de m/z d’intérêt et effectuez des expériences MS/MS.

4. Découverte de nouveaux neuropeptides putatifs à l’aide du séquençage de novo

  1. Effectuez les étapes 1.4.2 à 1.4.5.
  2. Exportez uniquement des peptides de novo.csv du logiciel PEAKS avec un score moyen de confiance locale (ALC) de ≥ 75.
    REMARQUE: Il existe de nombreux logiciels disponibles pour effectuer un séquençage de novo , chacun avec ses propres algorithmes de notation et doit être évalué en conséquence.
  3. Recherchez dans la liste des peptides des motifs de séquence connus indiquant des neuropeptides appartenant à des familles de neuropeptides spécifiques19.
    REMARQUE: Bien que les motifs soient généralement bien conservés dans toutes les espèces, les motifs recherchés doivent être sélectionnés en tenant compte de l’organisme échantillon.

5. Extraction de transcriptome pour les séquences de neuropeptides prédites

REMARQUE: Cette étape est facultative et n’est utilisée que pour ajouter à une base de données de neuropeptides existante ou créer une nouvelle base de données de neuropeptides.

  1. Choisissez une séquence d’acides aminés préprohormone connue qui vous intéresse et utilisez tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
    _LOC=blasthome) pour rechercher une séquence de préprohormones de requête dans des bases de données telles que nr/nt, Refseq_genomes, EST et TSA.
    REMARQUE : Pour rechercher des séquences de requête dans une base de données de protéines, utilisez BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. Sélectionnez l’organisme cible (ID de taxe) et modifiez les paramètres de l’algorithme Expect Threshold à 1000 pour inclure les alignements de score faible.
    2. Exécutez le programme BLAST , puis vérifiez les résultats pour des scores d’homologie élevés entre les séquences de requête et de sujet produisant des alignements significatifs. Enregistrez le fichier FASTA contenant la séquence nucléotidique.
      REMARQUE: S’il existe plusieurs séquences de sujets avec des scores d’homologie similaires, effectuez un alignement MAFFT pour affiner les séquences putatives20,21.
  2. Traduisez la séquence nucléotidique de préprohormone en séquences peptidiques de préprohormone à l’aide de l’outil Expasy Translate (https://web.expasy.org/translate/). Pour C. sapidus, sélectionnez Invertébré mitochondrial pour le code génétique.
  3. Vérifiez la séquence peptidique du signal et les sites de clivage des prohormones dans les séquences peptidiques à l’aide de SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    REMARQUE: L’homologie des schémas connus de traitement des préprohormones peut également être utilisée pour identifier les sites de clivage des prohormones. D’éventuelles modifications post-traductionnelles pour les peptides de signal peuvent être prédites si vous le souhaitez. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) peut être utilisé pour prédire l’état de sulfatation des résidus de tyrosine. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) peut être utilisé pour prédire la connectivité des liaisons disulfures.

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Representative Results

Le flux de travail pour la préparation des échantillons et l’analyse de la SEP est illustré à la figure 1. Après la dissection du tissu neuronal, l’homogénéisation, l’extraction et le dessalement sont effectués pour purifier les échantillons de neuropeptides. Si une quantification isotopique basée sur l’étiquette est souhaitée, les échantillons sont ensuite étiquetés et dessalés à nouveau. L’échantillon résultant est analysé par LC-MS/MS pour l’identification et la quantification des neuropeptides.

Les neuropeptides identifiés par le logiciel de protéomique devraient avoir une bonne couverture de séquence de fragmentation peptidique, mais cela n’est pas défini ou normalisé à l’échelle mondiale. Pour une identification absolue, chaque acide aminé doit produire un fragment d’ion qui fournit une identification et une localisation sans ambiguïté. Celui-ci doit également être comparé à un peptide synthétisé pour confirmer l’intensité de chaque fragment d’ion. Comme le coût de cette opération sur chaque identification putative n’est pas réalisable, l’identification est généralement décrite en fonction de la confiance où plus d’ions fragments observés augmentent la confiance en l’identification peptidique. Alors que la figure 2A,B représente deux neuropeptides qui ont tous deux été identifiés avec une couverture de séquence de 100% et une faible erreur de masse telle que définie par la limite maximale de 0,02 Da, la faible couverture de fragmentation (à partir de seulement trois ions) observée uniquement pour le neuropeptide dans la figure 2B diminue la confiance d’identification d’une isoforme spécifique. La figure 2C représente les chromatogrammes ioniques extraits (XIC), qui est un graphique contenant l’intensité du signal d’une valeur m/z sélectionnée en fonction du temps de rétention, d’un neuropeptide détecté dans deux échantillons utilisés pour le LFQ. Les temps de rétention du neuropeptide diffèrent légèrement parce qu’il a été identifié en deux séries distinctes et consécutives; cependant, la différence se situe dans la valeur seuil fiable de 1 min. Ainsi, le rapport entre l’aire calculée par logiciel sous la courbe du XIC est utilisé pour le LFQ de ce neuropeptide.

Pour la quantification des neuropeptides marqués au diméthyle, le spectre MS1 doit contenir un pic à la valeur théorique du neuropeptide m/z et un pic à la valeur m/z avec un décalage de masse qui correspond à la différence de masse entre les réactifs de marquage isotopiques utilisés. Dans la figure 2D, le changement de masse de cet échantillon marqué au diméthyle 2-plex est de 4,025 Da. L’aire sous la courbe de l’ion précurseur de ses XIC est ensuite calculée par le logiciel et utilisée pour calculer les rapports d’abondance relative. Une version simplifiée du tableau d’exportation du logiciel de protéomique contenant les neuropeptides identifiés et leurs rapports LFQ est présentée dans le tableau 1. Des résultats similaires sont obtenus pour les neuropeptides marqués isotopiquement.

Des algorithmes logiciels permettent le séquençage de novo des spectres pour détecter de nouveaux neuropeptides putatifs. Lorsque l’on revendique la détection de nouveaux neuropeptides putatifs, les identifications à haut niveau de confiance sont des cas idéaux où tous les acides aminés sont identifiés et localisés sans ambiguïté, sur la base de l’observation des fragments d’ions. La figure 3 représente le spectre d’un peptide séquencé de novo contenant le motif -RYamide au C-terminal, un motif de séquence conservé partagé par les neuropeptides connus de la famille des crustacés RYamide22. Un peptide a été apparié à partir de la base de données avec une couverture de séquence de 100%, tous les ions fragments formant des acides aminés observés, une faible erreur de masse d’ions de fragment définie par la limite maximale de 0,02 Da et contenait un profil d’élution gaussien. Ces résultats indiquent qu’un peptide endogène appartenant à la famille des neuropeptides crustacés -RYamide a été observé.

Les mesures ponctuelles MALDI-MS peuvent fournir des identifications de neuropeptides complémentaires à l’identification LC-ESI-MS, ainsi que des capacités de débit plus élevées. Une fois l’homogénat tissulaire brut extrait pour les neuropeptides, dessalé et marqué (si désiré), l’échantillon peut être mélangé à une matrice et repéré sur la plaque cible en acier inoxydable MALDI, comme le montre la figure 4A. Le pipetage réussi des points d’échantillonnage homogènes produit des pics clairement résolus, en particulier dans le spectre d’étalonnage (figure 4B). Lors de l’utilisation d’un instrument MALDI-TOF, l’instrument doit être étalonné au début de chaque expérience. Tous les analytes dont les masses sont connues peuvent être utilisés pour calibrer l’instrument s’il se trouve dans la plage de masse souhaitée de l’échantillon. Ici, le phosphore rouge est utilisé pour l’étalonnage de la masse ionique positive de l’instrument. Il présente des avantages par rapport à l’utilisation de mélanges d’étalonnage peptidique en raison de sa stabilité à température ambiante, de son coût bon marché, de pics abondants en raison de sa polymérisation, de son rapport signal/bruit élevé et de son absence de matrice pour l’ionisation.

Pour l’imagerie MALDI-MS des neuropeptides, l’instrument MALDI TOF/TOF utilisé nécessite un étalonnage manuel de l’image de la lame revêtue d’ITO (étape 3.1.10) pour corréler l’image optique avec l’échantillon. Le diagramme de la figure 5 montre l’emplacement approprié du réticule blanc à utiliser comme points d’apprentissage pour permettre à l’instrument de corréler l’image optique numérisée avec la plaque d’échantillonnage réelle. Il illustre également les zones de la lame revêtue d’ITO qui devraient être évitées par l’utilisateur (c.-à-d. ne contiennent pas d’échantillon ou de matrice). Pour l’étalonnage de masse, le placement du point d’échantillonnage d’étalonnage par rapport à l’échantillon de tissu sur la lame revêtue d’ITO a un impact direct sur l’erreur de masse en raison de la nature inhérente des analyseurs de masse à temps de vol, bien que l’ampleur de ce problème dépende de l’abondance des analytes cibles. Une solution à ce problème consiste à vérifier manuellement les pics des spectres MS1 de différentes sections de tissus pour détecter tout changement de pic. S’il y a un décalage de pointe, envisagez d’ajouter des points d’étalonnage de masse supplémentaires sur la glissière revêtue d’ITO juste à côté de chaque section de tissu. À partir de là, l’utilisateur peut faire la moyenne des spectres des points d’étalonnage ensemble ou effectuer une imagerie MS sur une section de tissu à la fois en utilisant uniquement le point d’étalonnage le plus proche de la section de tissu. Une fois l’échantillon prélevé, vérifier que le signal des valeurs m/z correspondant aux neuropeptides n’est localisé que dans la région tissulaire (Figure 6) avant d’attribuer une identification supposée des neuropeptides.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail de préparation d’échantillons de neuropeptides pour l’analyse par spectrométrie de masse. Pour l’analyse des extraits de tissus, l’homogénat de tissu brut est dessalé, étiqueté avec des étiquettes isotopiques stables, dessalé à nouveau et analysé par MS. Pour l’analyse d’imagerie, les tissus intacts sont incorporés, cryosectionnés, appliqués avec une matrice et analysés par MALDI-MSI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Identification et quantification effectuées à l’aide du logiciel de protéomique. Les neuropeptides sont détectés à travers des spectres de qualité variable avec (A) une bonne ou (B) une mauvaise couverture de fragmentation MS2. L’erreur d’appariement de la masse des ions fragmentaires est indiquée sous les spectres. (C) Les formes de profil XIC et le temps de rétention (RT) peuvent être inspectés manuellement pour les neuropeptides quantifiés par LFQ. (D) Les spectres MS1 sont utilisés pour détecter et quantifier les neuropeptides marqués au diméthyle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Séquençage de novo pour la détection de nouveaux neuropeptides. (A) Le spectre MS2 d’un nouveau RYamide putatif démontre une bonne couverture de fragmentation avec une faible erreur de masse pour chaque fragment. (B) Les ions fragments identifiés sont répertoriés pour inspection manuelle. (C) Le XIC du nouveau neuropeptide est inspecté manuellement pour la forme du pic gaussien. Abréviations : RT = temps de rétention. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Spots MALDI-MS et spectre d’étalonnage. (A) La qualité des spectres MS repose sur une distribution matrice-peptide uniforme dans le puits cible en acier inoxydable MALDI. Les trois taches de gauche sont des exemples de bonnes taches qui touchent les bords de la gravure du puits et les trois taches de droite sont des exemples de mauvaises taches. Les deux taches contiennent α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA) matrice et un mélange standard peptidique. (B) Spectre d’étalonnage utilisant des amas de phosphore rouge de 500 à 3200 m/z. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Représentation de la lame de verre revêtue d’ITO. (A) Schéma avec les zones importantes notées : emplacements pour placer des sections de tissus (rectangles bleu clair), emplacements automatiques des points d’enseignement qui devraient être évités (rectangles rouges), exemples d’endroits où les points d’enseignement peuvent être dessinés (réticule blanc) et où les vis se fixent à la plaque de l’adaptateur et doivent être évitées (ovales bleu foncé). (B) Photo d’une lame de verre contenant deux sections de tissu, une tache contenant un mélange d’étalonnage et des marques de réticule. L’emplacement de la section de tissu et les points d’étalonnage sont indiqués de l’autre côté de la lame de verre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Images de SEP des glandes sinusales de C. sapidus. Les images de distribution des ions neuropeptide [M+H]+ de (A) HL/IGSL/IYRamide (m/z 844,48), (B) Allatostatine A-type NPYAFGLamide ou GGPYAFGLamide (m/z 780,40), (C) Allatostatine A-type GQYAFGLamide (m/z 754,39) et (D) RFamide GRNFLRFamide (m/z 908,52) sont montrées. Les images sont générées à l’aide d’une fenêtre ± de 50 ppm à partir de la valeur théorique m/z. La barre de couleur indique la plage d’intensité du signal de 0 à 100%. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Recherche dans la base de données et résultats LFQ. Neuropeptides identifiés et quantifiés grâce à LC-MS et à un logiciel de protéomique. Les PTM identifiés sont répertoriés avec les intensités des peptides détectés dans les deux échantillons pour LFQ, ainsi que le rapport LFQ résultant. Les masses moyennes et les descriptions de neuropeptides observées dans le fichier FASTA sont répertoriées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

L’identification, la quantification et la localisation précises des neuropeptides et des peptides endogènes présents dans le système nerveux sont cruciales pour comprendre leur fonction23,24. La spectrométrie de masse est une technique puissante qui peut permettre d’accomplir tout cela, même dans des organismes sans génome entièrement séquencé. La capacité de ce protocole à détecter, quantifier et localiser les neuropeptides des tissus prélevés sur C. sapidus par une combinaison de LC-ESI- et malDI-MS est démontrée.

Lors de la préparation de l’échantillon pour l’analyse LC-ESI-MS, des considérations doivent être prises en compte. Bien que la SEP soit une technique sensible, la faible concentration peptidique du tissu neuronal (jusqu’à la gamme femtomolaire25) pose une sérieuse limitation. Une préparation minutieuse des échantillons est nécessaire non seulement pour éliminer les composants de la matrice plus abondants et interférents, tels que les protéines et les lipides, mais aussi pour minimiser la perte de neuropeptides à chaque étape26,27. Par exemple, la perte d’échantillon peut être réduite en utilisant des tubes de microcentrifugation qui résistent à l’adsorption peptidique. Selon la composition du tissu d’intérêt, l’utilisation de divers solvants (pour l’extraction ou la précipitation) ou de matériaux d’extraction en phase solide peut être utilisée pour séparer des biomolécules de différentes tailles et propriétés chimiques. Pour s’assurer que des peptides hydrophiles ou hydrophobes sont présents dans l’extrait de neuropeptide, plusieurs systèmes de solvants d’extraction peuvent être utilisés en option pour cibler des neuropeptides ayant des propriétés physicochimiques différentes. Ceux-ci, ainsi que l’utilisation d’inhibiteurs de la protéase, peuvent devoir être modifiés pour une purification optimisée afin d’améliorer la récupération des neuropeptides28. Les inconvénients de l’utilisation de plusieurs systèmes d’extraction sont que plusieurs tissus neuronaux doivent être regroupés pour répondre à un besoin global plus élevé en peptides, ainsi qu’à un débit réduit. De nombreuses étapes telles que le dessalement, le marquage isotopique et l’injection de SEP recommandent certaines quantités peptidiques de départ. Pour la caractérisation d’échantillons précieux, tels que les neuropeptides, les tests peptidiques sont généralement évités pour éviter la consommation de peptides étrangers. De plus, des tests peptidiques ont été développés pour déterminer une concentration précise de peptides à partir de digestions de protéines, qui ont des propriétés chimiques différentes de celles des peptides endogènes. Pour surmonter les complications d’une concentration inconnue de neuropeptides, un test peptidique initial peut être effectué à l’aide d’extraits de tissus neuronaux groupés, où les résultats sont utilisés comme estimation pour toutes les analyses ultérieures, bien qu’il faille garder à l’esprit que tous les peptides en solution sont mesurés, et tous ne sont pas des neuropeptides29. D’autres limites de cette méthode comprennent les biais potentiels aux neuropeptides non polaires et hydrophobes et le manque de conservation de la structure native. Des modifications aux compositions et aux matériaux des solvants, telles que l’utilisation de solutions plus hydrophobes ou l’omission de l’utilisation de solvants organiques, peuvent être effectuées pour y remédier.

Les mesures MALDI-MS reposent sur des étapes minutieuses de préparation des échantillons pour des résultats cohérents et peuvent avoir des considérations d’échantillon différentes de celles des mesures LC-ESI-MS. Des étapes telles que le maintien de l’extrait de neuropeptide sur la glace avant l’analyse de la SEP sont toujours appliquées. D’autres méthodes de prévention de la dégradation des neuropeptides comprennent le maintien des lames de verre contenant des coupes de tissu montées sur le dégel dans une boîte de dessiccant après la dissection pour empêcher la condensation de s’accumuler30, bien que laisser l’échantillon de tissu dans le dessiccateur après séchage puisse également entraîner une dégradation de l’échantillon. Il est suggéré de placer les lames tissulaires dans un dessiccateur sous vide (pression finale: 1x10-4 Torr à température ambiante) pendant 5 à 10 minutes immédiatement avant l’application de la matrice. Une fois la matrice déposée sur la lame tissulaire, elle peut être conservée au réfrigérateur ou au congélateur pendant la nuit et séchée dans le dessiccateur sous vide avant la mesure d’imagerie MALDI-MS. Pour les mesures ponctuelles MALDI, la structure cristalline matrice-peptide n’est pas également répartie dans la cible MALDI, même si elle le semble. Il existe des moyens d’atténuer les variations des spectres de masse des répliques techniques dues à ce processus. Tout d’abord, acquérez un spectre moyen de chaque puits à l’aide de plusieurs tirs laser (généralement des centaines à des milliers) où le laser est rasterné de manière aléatoire à travers le puits (c.-à-d. en sélectionnant SMART ou Random sample carrier movement dans les paramètres de l’instrument). Acquérir au moins cinq répliques techniques pour chaque type d’échantillon et sélectionner trois répliques techniques où la variation de l’intensité du signal pour les pics souhaités est la plus faible. Le compromis ici est le débit expérimental. Il est nécessaire de garder des paramètres tels que le nombre de tirs laser, le diamètre du laser et d’autres paramètres d’instrument cohérents pour tous les spectres acquis. Idéalement, toutes les répliques techniques et biologiques sont analysées en même temps à l’aide de la même solution matricielle et du même étalonnage d’instrument. L’identification des neuropeptides peut être effectuée par correspondance de masse précise avec une liste de pics contenant des [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, [M+K]+ et d’autres adduits salins produisant des valeurs m/z d’ions chargés individuellement. La normalisation des données est essentielle pour minimiser les artefacts systématiques des expériences MALDI-MS. L’évaluation de la reproductibilité est particulièrement importante lorsque les mesures ponctuelles MALDI-MS sont utilisées pour la quantification des neuropeptides par marquage isotopique stable (SIL). La qualité de la préparation de l’échantillon et de l’acquisition des données peut être évaluée en prenant un étalon peptidique ou un extrait de neuropeptide, en le divisant en deux aliquotes égales, en étiquetant différemment chaque échantillon par SIL et en analysant l’échantillon pour s’assurer que l’intensité relative des pics appariés est de 1: 1. La variation rapportée à partir de ces ratios peut être utilisée pour estimer le niveau de variance dans l’expérience globale attribuée à l’erreur de l’utilisateur.

Il est important de noter que MALDI-MS est également capable de fournir des informations séquentielles et quantitatives; cependant, les ions chargés individuellement généralement produits par MALDI limitent la détection de fragments peptidiques, ce qui rend plus difficile l’obtention de la séquence complète et inhibe les méthodes de quantification discutées pour LC-ESI-MS. Quoi qu’il en soit, MALDI-MS est une modalité attrayante en raison de sa capacité de débit élevé, ainsi que d’une tolérance plus élevée pour les sels et les impuretés dans l’échantillon12,31. De plus, l’imagerie MALDI-MS présente des avantages par rapport aux autres techniques d’imagerie conventionnelles qui nécessitent des anticorps. Dans la plupart des modalités de SEP, l’abaissement de la résolution de masse augmentera la sensibilité, permettant une meilleure détection des neuropeptides de faible abondance. Cette stratégie peut être plus pratique pour les instruments MALDI-TOF/TOF que pour les instruments LC-ESI-MS en raison de la facilité d’étalonnage de l’instrument MALDI pour chaque expérience. Une autre façon dont MALDI peut être avantageux pour les neuropeptidomics est la moyenne des spectres. En règle générale, la moyenne des spectres des mesures LC-ESI-MS n’est pas utilisée car elle annule les avantages de la séparation LC; par conséquent, les logiciels de bioinformatique sont fortement utilisés pour identifier les neuropeptides et les identifications sont vérifiées manuellement. Cependant, il y a moins de conséquences pour la moyenne des spectres des mesures MALDI-MS parce qu’il n’y avait pas de séparation initiale; par conséquent, les données brutes sont plus petites et plus faciles à parcourir manuellement pour un utilisateur. La facilité de gestion des données est importante car elle modifie l’ordre dans lequel l’utilisateur peut aborder les stratégies d’identification et de vérification des neuropeptides. Bien que la confiance dans les identifications de neuropeptides à partir de LC-ESI-MS puisse bénéficier d’une augmentation du niveau de rigueur des seuils dans les logiciels d’analyse de données, cette stratégie est moins susceptible de bénéficier aux identifications MALDI-MS. Dans l’exemple des neuropeptides de crustacés, le fait qu’il y ait moins de 1000 entrées de la base de données construite en laboratoire (c’est-à-dire un maximum de <1000 pics spectraux ou images MS à parcourir manuellement), permet d’abord de filtrer les données MALDI-MS avec un seuil d’erreur de masse généreux, puis de vérifier manuellement ces identifications en examinant les enveloppes isotopiques au niveau MS1, ainsi que d’autres méthodes de vérification abordées dans la section Résultats représentatifs. Les logiciels populaires d’analyse de données d’imagerie de la SEP peuvent effectuer une correspondance de masse précise avec une base de données de masse de neuropeptides et extraire les images de SEP correspondantes. Pour les questions de recherche clinique, telles que la découverte de biomarqueurs, ces logiciels sont capables d’extraire des valeurs m/z uniques à une région tissulaire d’intérêt (généralement appelée analyse de région d’intérêt (ROI)32 et d’effectuer des tests statistiques pour quantifier la différence entre deux régions tissulaires. Il convient également de noter qu’il existe également moins d’options logicielles d’analyse de données pour l’imagerie MS que pour LC-ESI-MS.

Effectuer des recherches dans la base de données LC-ESI-MS pour les neuropeptides implique généralement l’utilisation d’algorithmes logiciels conçus pour l’analyse des peptides digérés. En tant que tel, il existe des limites à la capacité des logiciels à effectuer des recherches non spécifiques dans la base de données d’enzymes ou au temps qu’il faut pour terminer la recherche. Actuellement, les recherches de peptides endogènes sont effectuées avec le nombre maximal de clivages manqués, mais ce nombre est encore limité, ce qui conduit à des identifications potentiellement manquées. Lorsque le génome d’une espèce n’est pas entièrement séquencé, comme avec C. sapidus, un séquençage de novo peut être effectué pour identifier des neuropeptides inconnus/ nouveaux à l’aide de motifs de séquence de neuropeptides conservés connus, bien que cette méthode ne parvienne pas à identifier les neuropeptides qui ont des motifs inconnus ou ne contiennent pas les motifs utilisés comme identificateurs de famille de neuropeptides19. Par exemple, WSSMRGAWamide est un motif de la famille de neuropeptides de type allatostatine B19. C’est là que réside l’importance de l’extraction du transcriptome pour les séquences de neuropeptides prédites pour les espèces sans séquence de génome complètement décodée33. Les identifications de neuropeptides sont ensuite confirmées en synthétisant la séquence peptidique putative et en comparant les spectres MS/MS du peptide synthétique et du tissu biologique34. Même après vérification d’une séquence, on ne sait parfois pas s’il s’agit de la séquence complète de neuropeptides ou d’un produit de dégradation. Il convient de noter que les différences entre les sources d’ionisation MALDI et ESI-MS (ESI est une méthode d’ionisation plus douce que MALDI) peuvent entraîner des taux différents de dégradation artificielle (c.-à-d. fragmentation à l’intérieur de la source). Pour distinguer une version tronquée d’un peptide d’un produit de dégradation induit artificiellement (c.-à-d. non in vivo), la voie de traitement préprohormonique de ce neuropeptide doit être connue. Comme ce n’est souvent pas le cas, une forme synthétique du peptide doit être utilisée dans les tests physiologiques et vérifiée pour son activité biologique.

Dans l’ensemble, le flux de travail illustré ici pour l’analyse des neuropeptides peut bénéficier à une variété de domaines différents. Il comble une lacune technique dans l’analyse moyenne de la SEP des peptides, car il est optimisé pour les peptides endogènes qui sont plus petits que les protéines généralement analysées par des analyses ascendantes ou descendantes de la SEP. Par conséquent, les méthodes de préparation des échantillons utilisées par les neuropeptidomics devraient être largement traduisibles en d’autres peptides endogènes bioactifs, tels que ceux ciblés par les chimistes médicinaux pour les propriétés antibactériennes35. Un avantage de ce protocole est qu’il utilise des instruments courants de fournisseurs populaires offrant également un degré supplémentaire de traduisibilité. De cette façon, le flux de travail peut être utilisé dans des contextes académiques et commerciaux, tels que le dépistage de candidats médicaments pharmaceutiques ou de cibles médicamenteuses.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par la National Science Foundation (CHE-1710140 et CHE-2108223) et les National Institutes of Health (NIH) grâce à la subvention R01DK071801. A.P. a été soutenu en partie par la subvention de formation à l’interface chimie-biologie des NIH (T32 GM008505). N.V.Q. a été soutenu en partie par les National Institutes of Health, dans le cadre du Ruth L. Kirschstein National Research Service Award du National Heart Lung and Blood Institute au Centre de recherche cardiovasculaire de l’Université du Wisconsin-Madison (T32 HL007936). L.L. tient à remercier les subventions R56 MH110215, S10RR029531 et S10OD025084 des NIH, ainsi que le soutien financier d’une chaire Vilas Distinguished Achievement et d’une chaire Charles Melbourne Johnson avec un financement fourni par la Wisconsin Alumni Research Foundation et l’Université du Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals, Reagents, and Consumables
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix Supelco 39319
Acetic acid Fisher Chemical A38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A955-500
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
Borane pyridine Sigma-Aldrich 179752
Bruker peptide calibration mix Bruker Daltonics NC9846988
Capillary Polymicro 1068150019 to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter)
Cryostat cup Sigma-Aldrich E6032 any cup or mold should work
 Microcentrifuge Tubes Eppendorf 30108434
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
Formaldehyde - D2 Sigma-Aldrich 492620
Formic acid Optima LC/MS grade Fisher Chemical A117-50
Gelatin Difco 214340 place in 37 °C water bath to melt
Hydrophobic barrier pen Vector Labs 15553953
Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides Delta Technologies CB-90IN-S107 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness)
LC-MS vials Thermo TFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS Grade Fisher Chemical A456-500
Parafilm Sigma-Aldrich P7793 Hydrophobic film
pH-Indicator strips Supelco 109450
Red phosphorus clusters Sigma-Aldrich 343242
Reversed phase C18 material Waters 186002350 manually packed into nanoflow column
Wite-out pen BIC 150810
ZipTip Millipore Z720070
Instruments and Tools
Automatic matrix sprayer system- M5 HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 R Eppendorf 05-401-205
Cryostat- HM 550 Thermo Fisher Scientific 956564A
Desiccant Drierite 2088701
Forceps WPI 501764
MALDI stainless steel target plate Bruker Daltonics 8280781
Pipet-Lite XLS Rainin 17014391 200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOF Bruker Daltonics
SpeedVac - SVC100 Savant SVC-100D
Ultrasonic Cleaner Bransonic 2510R-MTH for sonication
Ultrasonic homogenizer Fisher Scientific FB120110 FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe
Vaccum pump- Alcatel 2008 A Ideal Vacuum Products P10976 ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr
Vortex Mixer Corning 6775
Water bath (37C) - Isotemp 110 Fisher Scientific 15-460-10
Data Analysis Software
Expasy https://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysis Bruker Daltonics
FlexControl Bruker Daltonics
FlexImaging Bruker Daltonics
PEAKS Studio Bioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Lab https://scils.de/
SignalP 5.0 https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTn http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMS=tblastn&PAGE_
TYPE=BlastSearch&SHOW_
DEFAULTS=on&LINK_LOC
=blasthome

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Chimie numéro 183 neuropeptide spectrométrie de masse purification peptidique marquage isotopique séquençage de novo quantification LC MALDI imagerie par spectrométrie de masse recherche dans une base de données extraction de transcriptome
Étude spectrométrique de masse à multiples facettes des neuropeptides chez <em>Callinectes sapidus</em>
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Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L.… More

Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus. J. Vis. Exp. (183), e63322, doi:10.3791/63322 (2022).

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