Summary
Questo articolo introduce un metodo semplice per la produzione rapida di vescicole unilamellari giganti con proteine citoscheletriche incapsulate. Il metodo si rivela utile per la ricostituzione bottom-up delle strutture citoscheletriche nelle interazioni confinamento e citoscheletro-membrana.
Abstract
Le vescicole unilamellari giganti (GUV) sono spesso utilizzate come modelli di membrane biologiche e quindi sono un ottimo strumento per studiare i processi cellulari correlati alla membrana in vitro. Negli ultimi anni, l'incapsulamento all'interno dei GUV ha dimostrato di essere un approccio utile per esperimenti di ricostituzione in biologia cellulare e campi correlati. Imita meglio le condizioni di confinamento all'interno delle cellule viventi, al contrario della ricostituzione biochimica convenzionale. I metodi per l'incapsulamento all'interno dei GUV spesso non sono facili da implementare e le percentuali di successo possono differire significativamente da laboratorio a laboratorio. Una tecnica che ha dimostrato di avere successo nell'incapsulare sistemi proteici più complessi è chiamata incapsulamento continuo dell'interfaccia goccioline che attraversa l'incapsulamento (cDICE). Qui, viene presentato un metodo basato su cDICE per incapsulare rapidamente proteine citoscheletriche in GUV con elevata efficienza di incapsulamento. In questo metodo, in primo luogo, le goccioline lipidiche-monostrato vengono generate emulsionando una soluzione proteica di interesse in una miscela lipidico/oleosa. Dopo essere state aggiunte in una camera rotante stampata in 3D, queste goccioline lipidiche-monostrato passano quindi attraverso un secondo monostrato lipidico in un'interfaccia acqua / olio all'interno della camera per formare GUV che contengono il sistema proteico. Questo metodo semplifica la procedura generale di incapsulamento all'interno dei GUV e accelera il processo, e quindi ci consente di confinare e osservare l'evoluzione dinamica dell'assemblaggio della rete all'interno di vescicole lipidiche a doppio strato. Questa piattaforma è utile per studiare la meccanica delle interazioni citoscheletro-membrana nel confinamento.
Introduction
I compartimenti lipidici a doppio strato sono utilizzati come cellule sintetiche modello per lo studio di reazioni organiche chiuse e processi basati su membrana o come moduli portanti in applicazioni di somministrazione di farmaci 1,2. La biologia bottom-up con componenti purificati richiede sistemi sperimentali minimi per esplorare le proprietà e le interazioni tra biomolecole, come proteine e lipidi 3,4. Tuttavia, con l'avanzamento del campo, c'è una maggiore necessità di sistemi sperimentali più complessi che imitino meglio le condizioni nelle cellule biologiche. L'incapsulamento nei VGV è un approccio pratico che può offrire alcune di queste proprietà simili alle cellule fornendo un doppio strato lipidico deformabile e selettivamente permeabile e uno spazio di reazione ristretto. In particolare, la ricostituzione in vitro di sistemi citoscheletrici, come modelli di cellule sintetiche, può trarre beneficio dall'incapsulamento nei compartimenti di membrana5. Molte proteine citoscheletriche si legano e interagiscono con la membrana cellulare. Poiché la maggior parte degli assemblaggi citoscheletrici formano strutture che coprono l'intera cellula, la loro forma è naturalmente determinata dal confinamento delle dimensioni della cellula6.
Diversi metodi sono utilizzati per generare GUV, come il gonfiore 7,8, la fusione di piccole vescicole 9,10, il trasferimento di emulsione 11,12, il getto pulsato13 e altri approcci microfluidici14,15. Sebbene questi metodi siano ancora utilizzati, ognuno ha i suoi limiti. Pertanto, un approccio robusto e diretto con un alto rendimento di incapsulamento GUV è altamente desiderabile. Sebbene tecniche come il gonfiore spontaneo e l'elettroswelling siano ampiamente adottate per la formazione di GUV, questi metodi sono principalmente compatibili con specifiche composizioni lipidiche16, tamponi a bassa concentrazione salina17, dimensioni molecolari incapsulanti più piccole18 e richiedono un volume elevato dell'incapsulante. La fusione di più piccole vescicole in un GUV è intrinsecamente sfavorevole dal punto di vista energetico, richiedendo quindi specificità nelle composizioni lipidiche cariche9 e / o agenti esterni che inducono la fusione, come peptidi19 o altre sostanze chimiche. Il trasferimento di emulsioni e i metodi microfluidici, d'altra parte, possono richiedere la stabilizzazione delle goccioline attraverso la rimozione di tensioattivi e solventi dopo la formazione di due strati, rispettivamente18,20. La complessità della configurazione sperimentale e del dispositivo nelle tecniche microfluidiche come il getto pulsato impone un'ulteriore sfida21. cDICE è un metodo basato sull'emulsione derivato da principi simili che regolano il trasferimento dell'emulsione22,23. Una soluzione acquosa (soluzione esterna) e una miscela lipidico-olio sono stratificate da forze centrifughe in una camera cilindrica rotante (camera cDICE) formando un'interfaccia satura lipidica. Lo spostamento di goccioline acquose lipidiche monostrato nella camera cDICE rotante provoca la compressione di un doppio strato mentre le goccioline attraversano l'interfaccia satura di lipidi nella soluzione acquosa esterna22,24. L'approccio cDICE è una tecnica robusta per l'incapsulamento GUV. Con il metodo modificato presentato, non solo si ottiene l'elevata resa di vescicole tipica del cDICE con un tempo di incapsulamento significativamente più breve (pochi secondi), ma il tempo di generazione di GUV che consente l'osservazione di processi dipendenti dal tempo (ad esempio, la formazione della rete citoscheletrica di actina) è significativamente ridotto. Il protocollo richiede circa 15-20 minuti dall'inizio alla raccolta e all'imaging GUV. Qui, la generazione di GUV è descritta utilizzando il metodo cDICE modificato per incapsulare l'actina e le proteine leganti l'actina (ABP). Tuttavia, la tecnica presentata è applicabile per incapsulare una vasta gamma di reazioni biologiche e interazioni di membrana, dall'assemblaggio di biopolimeri all'espressione proteica senza cellule al trasferimento del carico basato sulla fusione di membrana.
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Protocol
1. Preparazione della miscela olio-lipidi
NOTA: Il passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante seguendo tutte le linee guida di sicurezza per la manipolazione del cloroformio.
- Prendere 0,5 ml di cloroformio in un flaconcino di vetro da 15 ml. Aggiungere 88 μL di 25 mg/mL di dioleoil-fosfocolina (DOPC), 9,3 μL di 50 mg/mL di colesterolo e 5 μL di 1 mg/mL di dioleoil-fosfoetanolammina-lissamina rodamina B (rodamina PE) (vedere Tabella dei materiali) nel flaconcino di vetro da 15 ml.
NOTA: Le frazioni moli finali di DOPC e colesterolo in olio di silicone / olio minerale sono rispettivamente del 69,9% e del 30%. È stato stabilito che il colesterolo 20-30 mol% è una concentrazione ottimizzata per la fluidità e la stabilità della membrana dei GUV generati utilizzando la tecnica presentata25,26. Fisiologicamente, questi valori sono ben all'interno dell'intervallo di concentrazione di colesterolo trovato nelle membrane plasmatiche delle cellule di mammifero6. Le scorte lipidiche vengono acquisite come soluzioni in cloroformio e conservate a -20 °C. I flaconcini lipidici devono essere acclimatati a temperatura ambiente prima di essere aperti. - Pipetta 7,2 mL di olio di silicone e 1,8 mL di olio minerale in un secondo flaconcino da 15 mL (vedi Tabella dei materiali). Generalmente, questo deve essere fatto in un vano portaoggetti a bassa umidità, principalmente se l'olio minerale viene riutilizzato.
- Mescolare gli oli vorticosamente alla massima velocità di rotazione (3200 giri/min) per 10 s, aggiungere la miscela al flaconcino contenente la miscela lipidico-in-cloroformio e posizionarla immediatamente sul miscelatore a vortice. Vortice per 10-15 s alla massima velocità di rotazione (3200 rpm). La miscela lipidica in olio risultante dovrebbe essere leggermente torbida, poiché i lipidi non sono completamente disciolti nell'olio ma piuttosto dispersi come piccoli aggregati24.
- Mettere la dispersione lipidico-in-olio in un sonicatore da bagno (vedi Tabella dei materiali) con potenza ultrasonica di 80 W e frequenza operativa di 40 kHz a temperatura ambiente per 30 min. Utilizzare immediatamente la miscela o conservare a 4 °C per un massimo di 24 ore.
2. Generazione di vescicole
- Montare l'albero stampato in 3D (file supplementare 1) in resina nera (vedere Tabella dei materiali) sulla piastra di agitazione del piano di lavoro e impostare la velocità di rotazione a 1200 giri / min.
- Montare la camera cDICE stampata in 3D (file supplementare 2) in resina trasparente (vedere Tabella dei materiali) sull'albero (Figura 1A, B).
- Preparare separatamente le soluzioni di actina e proteine leganti l'actina (ABP) in un volume totale di 20 μL.
- Preparare 1-10 μM di actina in tampone globulare di actina (G-buffer), incluso il 10% di atto 488 actina (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: 1x G-buffer comprende 5 mM di Tris-HCl, pH 8,0 e 0,2 mM di CaCl2. - Aggiungere un tampone di polimerizzazione dell'actina filamentosa (F-buffer) per iniziare la polimerizzazione dell'actina sul ghiaccio. Mantenere le soluzioni su ghiaccio per rallentare la polimerizzazione dell'actina prima dell'aggiunta di un reticolante.
NOTA: il 1x F-buffer contiene 50 mM di KCl, 2 mM di MgCl2 e 3 mM di ATP in 10 mM di Tris, pH 7,5. - Attendere 15 minuti per consentire l'inizio della polimerizzazione dell'actina sul ghiaccio prima di aggiungere reticolanti di interesse al rapporto molare desiderato. Tenere la soluzione sul ghiaccio fino all'incapsulamento.
- Preparare le proteine leganti l'actina (ABP) separatamente in un microtubo (Figura 1C).
NOTA: Questo passaggio viene eseguito quando una combinazione di ABP (ad esempio, miosina, α-actinina, fascina, complesso Arp2/3) si incapsula con actina 25,26,27. In questi casi, la quantità desiderata di ciascun ABP viene prelevata dal suo stock e aggiunta al microtubo designato per gli ABP. Poiché la soluzione totale deve essere di 20 μL, le aliquote di riserva degli ABP devono essere preparate in modo che la quantità desiderata della miscela ABP totale non superi i 5-6 μL. L'unico ABP utilizzato nei risultati rappresentativi qui è il fascin, la cui preparazione è menzionata di seguito.- Aliquota 1,57 μL di fascina da 1,75 mg/mL di fascina (vedi Tabella dei materiali) e aggiungere direttamente alla soluzione di actina nella fase 2.7. Ciò corrisponde a 2,5 μM di fascina nella soluzione.
- Preparare 1-10 μM di actina in tampone globulare di actina (G-buffer), incluso il 10% di atto 488 actina (vedere Tabella dei materiali).
- Aggiungere il 7,5% del mezzo con gradiente di densità (vedere Tabella dei materiali) nella soluzione di actina per creare un gradiente di densità tra la fase acquosa esterna e quella interna per facilitare la sedimentazione GUV.
- Erogare 700 μL della soluzione esterna di 200 mM di glucosio nella camera (Figura 1D, a sinistra).
NOTA: L'osmolarità della soluzione interna determina la concentrazione di glucosio. Per questi esperimenti, l'osmolarità della soluzione interna è di ~ 200 mOsm, quindi una soluzione di glucosio da 200 mM viene utilizzata come soluzione esterna. - Aggiungere una quantità sufficiente di miscela lipidico-olio (>3 ml in base alle dimensioni della camera) nella camera fino a riempire il 60%-80% della camera (Figura 1D, a destra). Si formerà un'interfaccia tra la miscela lipidico-olio e la soluzione esterna.
- Trasferire gli ABP (preparati al punto 2.3.4) nella soluzione di actina. Utilizzando una normale pipetta da 100-1000 μL, trasferire immediatamente i 700 μL della miscela lipidico-olio nella miscela actina-ABP (Figura 1E, a sinistra). Pipetta su e giù 8 volte per generare goccioline lipidiche monostrato di dimensioni cellulari con diametro nell'intervallo di 7-100 μm (Figura 1E, al centro).
NOTA: il passaggio 2.7 deve essere completato in pochi secondi per evitare qualsiasi assemblaggio di rete actina prima dell'incapsulamento. Pertanto, prima di eseguire il passaggio, assicurarsi che le punte delle pipette siano già inserite nelle pipette e pronte per trasferire le miscele. - Utilizzando la stessa pipetta da 100-1000 μL, erogare immediatamente l'intera emulsione nella camera rotante. Le goccioline acquisiranno un secondo foglietto di lipidi incrociando il monostrato lipidico all'interfaccia olio-soluzione esterna, formando così GUV (Figura 1E, a destra).
- Rimuovere la camera dalla piastra di agitazione e scartare la maggior parte della miscela lipidico-olio inclinando la camera nel contenitore dei rifiuti in modo che gran parte della miscela lipidico-olio venga drenata dalla grande apertura al centro della camera.
NOTA: In questo modo, la miscela lipidico-olio viene estratta dalla camera, evitando la miscelazione della miscela lipidico-olio con la soluzione esterna nella fase successiva. - Tenere la camera con il coperchio rivolto verso l'utente. Aprire il coperchio della camera e inclinare leggermente la camera verso l'utente. L'interfaccia tra la soluzione esterna contenente GUV e la miscela lipidico-olio è visibile dall'apertura della camera (dove si trova il coperchio).
- Utilizzando una pipetta, raccogliere una soluzione esterna sufficiente contenente GUV ed erogare 50-300 μL della soluzione esterna in una piastra a 96 pozzetti per ottenere una densità appropriata di GUV.
NOTA: Seguendo questo protocollo, un totale di circa 2 x 105 GUV vengono rilasciati nella soluzione esterna all'interno della camera. La dispersione del GUV non è stata quantificata; tuttavia, il diametro di circa il 90% dei VAV è compreso tra 12 e 30 μm. GuV con qualsiasi diametro nell'intervallo di 7-50 μm possono essere trovati nella popolazione. A seconda del mezzo gradiente di densità incapsulato, delle dimensioni GUV e della profondità della soluzione nella piastra del pozzo, ci vogliono 2-15 minuti perché i GUV si depositino sulla superficie. La resa dei GUV con fasci di actina ricostituiti è di circa il 90%.
3. Imaging e ricostruzione di immagini 3D
- Impostare la piastra a 96 pozzetti sul palco di un microscopio invertito dotato di un disco rotante (o scansione laser) un'unità confocale, una fotocamera EMCCD o sCMOS e un obiettivo 60x ad immersione in olio (vedere Tabella dei materiali).
- Concentrati su qualsiasi regione di interesse (ROI) e prendi una sequenza di immagini z-stack dal ROI con un intervallo z-step di 0,5 μm.
NOTA: poiché i VVV possono essere leggermente spostati sulla superficie nel tempo, si consiglia di acquisire un set di immagini a più lunghezze d'onda su ciascun piano z se vengono ripresi più fluorofori, ovvero prendere un gruppo di immagini a 561 nm e 488 nm in ogni corsia z alla volta per acquisire immagini atto 488 actina e Rhod PE. - Salva ogni sequenza di immagini z-stack in .tiff formato.
- Aprire una sequenza di immagini di interesse in un software di elaborazione delle immagini (ImageJ/Fiji). Identifica l'immagine con la massima intensità. Tieni premuto "ctrl + maiusc + c" per aprire la finestra Luminosità e contrasto e fai clic su Ripristina.
- Dal menu ImageJ/Fiji, vai a Analizza > Imposta scala e inserisci la distanza fisica nota e la relativa unità per ogni pixel dell'immagine.
- Dal menu ImageJ/Fiji, vai a Image > Stacks > progetto 3D per ricostruire un'immagine 3D dallo z-stack. Impostate "Metodo di proiezione" come Punto di luminosità, "Spaziatura tra sezioni (μm)" come 0,5 e spuntare il segno di spunta Interpola. Le opzioni predefinite possono essere utilizzate per il resto delle impostazioni.
NOTA: gli intervalli z in alcuni microscopi potrebbero non essere calibrati e il movimento effettivo in direzione z potrebbe differire leggermente dall'intervallo z inserito (cioè 0,5 μm). In questi casi, un campione di calibrazione 3D come microsfere fluorescenti con un diametro noto può essere utilizzato per ottenere l'intervallo z effettivo. Questo valore verrà quindi utilizzato come "Slice Spacing (μm)" per la proiezione 3D.
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Representative Results
Per dimostrare il successo della generazione di GUV citoscheletrici utilizzando il protocollo attuale, sono state ricostituite strutture di fascio di fascina-actina nei GUV. Il fascin è un breve reticolante di filamenti di actina che forma rigidi fasci di actina allineati parallelamente ed è purificato da E. coli come proteina di fusione glutatione-S-transferasi (GST)26. 5 μM di actina sono stati ricostituiti per la prima volta, inclusi 0,53 μM di actina ATTO488 nel tampone di polimerizzazione dell'actina e il 7,5% del mezzo gradiente di densità. Dopo aver aggiunto la fascina ad una concentrazione di 2,5 μM e incapsulando la miscela fascina-actina, si sono formate strutture di fascio di actina in GUV. Le sequenze di immagini confocali Z-stack delle strutture del fascio di actina incapsulate nei GUV marcati con rhodamine PE sono state catturate 1 ora dopo l'incapsulamento (Figura 2A). Usando questo protocollo, la concorrenza intrinseca e l'ordinamento dei reticolanti di actina incapsulati, α-attinina e fascina, che, insieme, formano diversi modelli di fascio di actina in modo dipendente dalle dimensioni GUV, è stato precedentemente dimostrato26.
Come l'approccio a emulsione invertita modificata qui presentato, il tradizionale processo cDICE genera GUV citoscheletrici ad alta resa, ma richiede una pompa a siringa e una configurazione del tubo per l'iniezione controllata di soluzione proteica nella camera rotante a basse portate nell'ordine dei nanolitri al secondo22,28. In questo approccio, l'emulsione viene generata direttamente nella camera cDICE rotante; un sottile capillare viene inserito nella fase oleosa. La soluzione proteica viene iniettata attraverso una pompa a siringa. Le goccioline si formano e vengono tranciate sulla punta capillare prima di viaggiare verso la fase esterna acquosa, dove si trasformano in GUV, simile al metodo sopra descritto. La Figura 2B mostra le vescicole che incapsulano una miscela di reazione usando questo approccio. La miscela di reazione contiene 6 μM di actina che è impacchettata da 0,9 μM di fascina. Qui, i due metodi e i loro risultati non vengono confrontati, ma si noti che entrambi generano un alto rendimento di GUV.
Figura 1: Configurazione sperimentale per la generazione di GUV. (A) Vista dall'alto e sezione laterale della camera cDICE. (B) Foto della configurazione per la camera di filatura. (C-E) Illustrazioni schematiche di procedure graduali per la generazione di GUV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Incapsulamento di strutture di fasci di actina. (A) Le immagini mostrano fette confocali di fluorescenza rappresentative di GUV (a sinistra) e proiezioni massime di una pila z confocale di actina e canali lipidici (a destra). Fascina, 2,5 μM; actina, 5 μM (incluso il 10% atto 488 actina). Barra di scala = 10 μm. (B) Incapsulamento di strutture di fasci di actina utilizzando cDICE convenzionale. L'immagine mostra una proiezione massima rappresentativa di immagini di fluorescenza confocale di fasci di actina incapsulati formati in presenza di fascina. Fascina, 0,9 μM; Actina, 6 μM. Barra di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: progettazione dell'albero stampato in 3D. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: Progettazione per la camera cDICE stampata in 3D. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Sono stati esplorati diversi metodi di generazione di GUV per la creazione di cellule sintetiche Tuttavia, la complessità delle procedure, il tempo prolungato per raggiungere l'incapsulamento, la restrizione dei tipi lipidici e la composizione molecolare dell'incapsulante, la necessità di sostanze chimiche non fisiologiche per facilitare l'incapsulamento, la bassa resa di GUV e le incoerenze nell'efficienza dell'incapsulamento hanno continuato a sfidare i ricercatori in questo campo. Considerando l'ampia gamma di potenziali studi che possono essere intrapresi nella biologia sintetica bottom-up, un approccio di incapsulamento GUV ad alto rendimento senza soluzione di continuità che è compatibile con diverse composizioni lipidiche e può incapsulare qualsiasi molecola indipendentemente dalle dimensioni può stimolare nuove opportunità per studiare complessi sistemi sintetici di biomimiking. Il metodo cDICE ha eliminato la maggior parte delle sfide e delle limitazioni inerenti ai precedenti metodi di generazione GUV.
L'approccio e i principi guida per generare GUV utilizzando il metodo cDICE sono precedenti alla piattaforma e sono stati implementati in tecniche precedenti come il trasferimento di emulsione invertita12. Tuttavia, il metodo di trasferimento dell'emulsione invertita presenta limitazioni come la bassa resa delle vescicole e l'eterogeneità delle vescicole. Per il metodo cDICE qui presentato, i lipidi sono dispersi in olio sotto forma di aggregati di decine di nanometri (la dimensione dell'aggregato lipidico dipende dalla concentrazione complessiva di lipidi)24. La dispersione dei lipidi è in due oli miscibili, dove uno (olio minerale) può sciogliere i lipidi e un secondo olio (olio di silicio) che non è miscibile con i lipidi. Questo crea coacceravati di aggregati lipidici mediante solvent-shifting29. Questo particolare approccio di dispersione facilita la saturazione istantanea del monostrato delle goccioline acquose e il rinnovo più rapido dei lipidi all'interfaccia olio-acquosa mentre le goccioline acquose attraversano continuamente l'interfaccia olio-acquosa satura di lipidi. Ciò migliora anche successivamente la cerniera a doppio strato per formare GUV e aumenta la produttività GUV. Le forze centrifughe generate dalla camera rotante sono ottimali per lo spostamento di goccioline polidisperse attraverso l'interfaccia satura di lipidi. La versione originale del metodo cDICE utilizza un ugello microcapillare per iniettare la soluzione interna nella miscela olio-lipidi. In questo approccio, le forze di taglio create dalla miscela rotante olio-lipidi generano goccioline acquose, trasformandosi infine in GUV come descritto. Tuttavia, con l'intento di ridurre il tempo necessario per preparare la piattaforma di iniezione, particolarmente critico per le reazioni rapide, come l'assemblaggio della rete di actina e il potenziale intasamento del microcapillare, le goccioline acquose con monostrati lipidici vengono ora generate aggiungendo la miscela olio-lipidi direttamente alla soluzione interna e pipettando su e giù. Questo approccio elimina il ritardo nell'incapsulamento GUV per un esperimento di reazione veloce.
Tra le sfide causate dai precedenti metodi di generazione di GUV c'è la restrizione dei tipi lipidici (carica di lipidi e fase di lipidi) a seconda della tecnica di generazione di GUV. Sono stati testati più tipi di lipidi, tra cui DOPC, dioleoil-glicero-hosphoserine (DOPS), dioleoil-glicero-succinato (DGS), dimiristoil-glicero-fosfocolina (DMPC) e combinazioni di diversi lipidi e colesterolo a concentrazioni variabili. Per tutte le condizioni, il metodo cDICE ha dimostrato di formare GUV con un'elevata efficienza di incapsulamento con una resa GUV costantemente elevata. Inoltre, il metodo cDICE ha anche dimostrato di incapsulare efficacemente diversi componenti cellulari, tra cui proteine citoscheletriche, reazioni di espressione senza cellule, agenti di affollamento, coloranti e altre molecole cellulari di diverse dimensioni senza una perdita di efficienza di incapsulamento o una diminuzione del throughput. Inoltre, come i normali metodi di trasferimento di emulsione invertita30, il cDICE modificato può potenzialmente consentire la generazione di GUV asimmetrici per lavori futuri. Diverse composizioni lipidiche possono essere utilizzate per il foglietto interno e il foglietto esterno poiché le goccioline monostrato si formano separatamente (all'interno di un microtubo mediante pipettaggio su e giù) prima di comprimere il doppio strato all'interno della camera cDICE. La sedimentazione dei lipidi si osserva quando la miscela lipidico-olio viene mantenuta a lungo; tuttavia, si può semplicemente vorticare la miscela lipidico-olio prima dell'incapsulamento per ri-disperdere gli aggregati lipidici. È importante notare che la qualità dell'incapsulamento può essere compromessa quando le miscele lipidico-olio vengono mantenute più a lungo, come indicato da aggregati lipidici più significativi del solito nella miscela lipidico-olio. Sebbene non testati, questi aggregati potrebbero potenzialmente causare imperfezioni nella cerniera a doppio strato e gli aggregati potrebbero anche finire per essere incapsulati con una soluzione interna compromettendo l'ambiente chimico desiderato.
Il limite dell'approccio modificato presentato per formare goccioline acquose è nel generare uniformità nella dimensione delle goccioline. Sebbene questo possa essere migliorato utilizzando l'iniezione microcapillare di soluzione interna a diverse portate per regolare le dimensioni del GUV, è meno desiderabile monitorare reazioni rapide come l'assemblaggio dell'actina in GUV incapsulati. Facendo goccioline con pipettaggio su e giù che si traduce in diverse dimensioni GUV, è possibile analizzare popolazioni di vescicole di dimensioni simili. Le preoccupazioni sulla possibile ritenzione di olio nei doppi strati impediscono l'adozione della maggior parte delle tecniche di generazione di GUV, comprese le tecniche di generazione di GUV basate su emulsione come cDICE21. Tuttavia, la quantità di olio rimanente nella membrana può essere ridotta utilizzando agenti organici come l'1-ottanolo, che può essere rimosso dopo aver generato le vescicole 31,32. Devono essere studiate future modifiche al metodo, eventualmente modificando la composizione del solvente.
Ci sono molte aree nella biologia sintetica bottom-up che devono ancora essere studiate e forse richiedono confinamenti di GUV che imitano le cellule. Tali sforzi sperimentali richiedono piattaforme di generazione GUV come cDICE per generare GUV in modo robusto mentre incapsulano in modo efficiente varie molecole di interesse. Molti processi cellulari avvengono più velocemente del tempo necessario per incapsulare le molecole utilizzando tecniche di generazione GUV precedenti. Come descritto qui, le soluzioni di actina sono incapsulate abbastanza rapidamente da osservare la deformazione delle vescicole derivante dall'assemblaggio della rete di actina. Tali cellule sintetiche con citoscheletro di actina ricostituito hanno rivelato caratteristiche di organizzazione della rete di actina in presenza di diversi reticolanti 5,25,33 e rimodellamento della membrana 25,27,28. Ispireranno il lavoro futuro per creare cellule sintetiche più sofisticate.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
APL riconosce il sostegno di una borsa di ricerca Humboldt per ricercatori esperti e della National Science Foundation (1939310 e 1817909) e del National Institutes of Health (R01 EB030031).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 810150C | |
| 96 Well Optical Btm Pit PolymerBase | ThermoFisher Scientific | 165305 | |
| Actin from rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99-A | |
| ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle | Hypermol | 8153-01 | |
| Axygen microtubes (200 µL) | Fisher Scientific | 14-222-262 | for handling ABPs |
| Black resin | Formlabs | RS-F2-GPBK-04 | |
| Cholesterol (powder) | Avanti Polar Lipids | 700100P | |
| Choloroform | Sigma Aldrich | 67-66-3 | |
| Clear resin | Formlabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| CSU-X1 Confocal Scanner Unit | YOKOGAWA | CSU-X1 | |
| Density gradient medium (Optiprep) | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| DOPC lipid in chloroform | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| Fascin | homemade | N/A | |
| F-buffer | homemade | N/A | |
| Fisherbrand microtubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| FS02 Sonicator | Fischer Scientific | FS20 | |
| G-buffer | homemade | N/A | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 158968 | |
| iXon X3 camera | Andor | DU-897E-CS0 | |
| Mineral oil | Acros Organics | 8042-47-5 | |
| Olympus IX81 Inverted Microscope | Olympus | IX21 | |
| Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective | Olumpus | 1-U2B933 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 317667 |
References
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