Summary

Extração e Purificação da Proteína FAHD1 do fígado de rim suíno e rato

Published: February 18, 2022
doi:

Summary

Este protocolo descreve como extrair a proteína de domínio de hidrolase 1 (FAHD1) de rim suíno e fígado de camundongo. Os métodos listados podem ser adaptados a outras proteínas de interesse e modificados para outros tecidos.

Abstract

Fumarylacetoacetate hydrolase proteína contendo domínio 1 (FAHD1) é o primeiro membro identificado da superfamília FAH em eucariotes, agindo como oxaloacetate decarboxylase em mitocôndrias. Este artigo apresenta uma série de métodos para a extração e purificação do FAHD1 a partir de fígado de rim suíno e rato. Os métodos cobertos são cromatografia de troca iônica com cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), filtragem de gel preparatório e analítico com FPLC e abordagens proteômicas. Após a extração total da proteína, a precipitação de sulfato de amônio e a cromatografia de troca iônica foram exploradas, e o FAHD1 foi extraído através de uma estratégia sequencial usando troca iônica e cromatografia de exclusão de tamanho. Esta abordagem representativa pode ser adaptada a outras proteínas de interesse (expressas em níveis significativos) e modificada para outros tecidos. A proteína purificada do tecido pode apoiar o desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade e/ou potentes e específicos inibidores farmacológicos.

Introduction

A proteína de domínio fah eucariótico 1 (FAHD1) atua como oxaloacetato bifuncional (OAA) decarboxylase (ODx)1 e hidrolase acylpyruvate (ApH)2. Está localizada nas mitocôndrias2 e pertence à ampla superfamília FAH de enzimas 1,2,3,4,5,6. Embora sua atividade de ApH seja apenas de menor relevância, a atividade ODx do FAHD1 está envolvida na regulação do fluxo de ciclo TCA 1,7,8,9. OAA não é apenas necessário para a reação de sinthase citrato central no ciclo do ácido tricarboxílico, mas também age como um inibidor competitivo de succinato desidrogenase como parte do sistema de transporte de elétrons e como metabólito catapleótico. A redução da expressão genética FAHD1 nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) resultou em uma redução significativa na taxa de proliferação celular10, e inibição significativa do potencial da membrana mitocondrial, associada a uma mudança concomitante para a glicólise. O modelo de trabalho refere-se à senescência associada à disfunção mitocondrial (MiDAS)11-like fenótipo8, onde os níveis mitocondrial de OAA são fortemente regulados pela atividade FAHD1 1,8,9.

A proteína recombinante é mais fácil de obter através da expressão e purificação de bactérias12 em vez de tecido. No entanto, uma proteína expressa em bactérias pode ser tendenciosa por possível falta de modificações pós-translacionais, ou pode ser simplesmente problemática (ou seja, devido à perda de plasmídeos, respostas de estresse bacteriano, ligações de dissulfeto distorcidas/não formadas, nenhuma ou má secreção, agregação de proteínas, decote protelítico, etc.). Para determinadas aplicações, a proteína precisa ser obtida a partir de lisesto celular ou tecido, a fim de incluir tais modificações e/ou excluir possíveis artefatos. A proteína purificada do tecido suporta o desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade e/ou inibidores farmacológicos potentes e específicos para enzimas selecionadas, como para FAHD113.

Este manuscrito apresenta uma série de métodos para a extração e purificação do FAHD1 a partir de fígado de rim suíno e rato. Os métodos descritos requerem cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), mas de outra forma usam equipamentos de laboratório comuns. Métodos alternativos podem ser encontrados em outros lugares 14,15,16,17. Após a extração total da proteína, o protocolo proposto envolve uma fase de teste, na qual são discutidos sub-protocolos para precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica (Figura 1). Após a definição desses subtítnicos, a proteína de interesse é extraída através de uma estratégia sequencial usando troca iônica e cromatografia de exclusão de tamanho com FPLC. Com base nessas diretrizes, o protocolo final pode ser adaptado individualmente para outras proteínas de interesse.

Figure 1
Figura 1: A estratégia global deste protocolo. De cima para baixo: A proteína é extraída de tecidos. A homogeneidade do tecido é preparada, centrifugada e filtrada. Para cada par de amostras supernascidas e derivadas de pelotas, os testes para precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica (FPLC) precisam ser realizados para sondar para condições ideais. Após a criação desses sub-protocolos, a proteína pode ser extraída através de um procedimento sequencial de precipitação de sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica e cromatografia de exclusão de tamanho repetitivo (FPLC) em diferentes concentrações de pH e sal. Todos os passos precisam ser controlados por mancha ocidental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais. O rim suíno foi obtido fresco do supermercado local. Os tecidos hepáticos foram colhidos de camundongos do tipo selvagem C57BL6 mantidos no Instituto de Pesquisa de Envelhecimento Biomédico da Universidade de Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Áustria sob a supervisão da Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, coberto pela permissão ética como líder do projeto emitido em 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). A manutenção e o …

Representative Results

A proteína FAHD1 foi extraída do fígado de rim e camundongo suíno usando o protocolo apresentado. Para o tecido do rato, vários órgãos são necessários para obter vários μg após a etapa final de purificação. Por essa razão, este artigo se concentra na extração do FAHD1 dos rins suínos, que é um experimento muito mais exemplar. A extração de FAHD1 do fígado do camundongo é realizada para apresentar as dificuldades e possíveis armadilhas deste protocolo. É geralmente recomendado o uso de órgãos qu…

Discussion

Passos críticos no protocolo
Seguir diretrizes comuns para o manuseio de proteínas é essencial, como trabalhar no gelo e em condições moderadas de pH e sal. O uso de inibidores de protease é benéfico para o método, enquanto o uso de inibidores proteasso é altamente recomendado. Congelar e descongelar a amostra pode sempre resultar em precipitação proteica (pelo menos parcialmente), por isso qualquer alíquota descongelada de lisato de proteína inicial (etapa 2) deve ser processada continua…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem muito a assistência técnica de Ayse Öztürk e Eva Albertini. Os camundongos utilizados para a geração de tecido hepático foram mantidos sob a supervisão da Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Instituto de Pesquisa de Envelhecimento Biomédico da Universidade de Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Áustria).

Materials

0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
15 mL Falcon tubes VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon tubes VWR 734-0448 centrifugal tubes
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) BIO-RAD #1610147 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences / Cytiva using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC901024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL
Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC801024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL
Ammonium sulfate powder MERCK A4418 ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0%
Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% MERCK 215589 Catalyst for acrylamide gel polymerization.
Coomassie Brilliant blue R 250 MERCK 1125530025 Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C)
Dialysis tubing cellulose membrane MERCK D9277 Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
HiLoad 26/600 Superdex 75 pg GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 28989334 HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins
Immun-Blot PVDF Membrane BIO-RAD #1620177 PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD #1703930 Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BIO-RAD #1658004 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516701 Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516901 Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo-Fischer 23225 A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.
Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter Branson New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf
Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) Agilent Dako P0399 The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.
TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA MERCK T9281 TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.
Tube Roller A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71
Tube Rotator A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123
ULTRA-TURRAX; T 25 digital IKA 0003725000 New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/

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Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., Holzknecht, M., Weiss, A. K. H. Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver. J. Vis. Exp. (180), e63333, doi:10.3791/63333 (2022).

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