Summary
هنا ، نصف طريقة مفصلة لعزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر والتحليل اللاحق للتنفس بواسطة معدل استهلاك الأكسجين (OCR) باستخدام المقايسات التنفسية القائمة على الصفائح الدقيقة. يمكن تطبيق خط الأنابيب هذا لدراسة آثار التدخلات البيئية أو الجينية المتعددة على استقلاب الميتوكوندريا.
Abstract
يتم الحصول على معظم طاقة الخلية من خلال تحلل الجلوكوز والأحماض الدهنية والأحماض الأمينية من خلال مسارات مختلفة تتلاقى على نظام الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا (OXPHOS) ، والذي يتم تنظيمه استجابة للطلبات الخلوية. جزيء الدهون الإنزيم المساعد Q (CoQ) ضروري في هذه العملية عن طريق نقل الإلكترونات إلى المركب الثالث في سلسلة نقل الإلكترون (ETC) من خلال دورات أكسدة / اختزال ثابتة. يمكن تقييم حالة الميتوكوندريا ، وفي النهاية ، الصحة الخلوية عن طريق قياس استهلاك الأكسجين ETC باستخدام المقايسات التنفسية. عادة ما يتم إجراء هذه الدراسات في خطوط الخلايا الثابتة أو الأولية التي تم زراعتها لعدة أيام. في كلتا الحالتين ، قد تكون معلمات التنفس التي تم الحصول عليها قد انحرفت عن الظروف الفسيولوجية الطبيعية في أي عضو أو نسيج معين.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخصائص الجوهرية للألياف المفردة المستزرعة المعزولة من العضلات الهيكلية تعيق هذا النوع من التحليل. تقدم هذه الورقة بروتوكولا محدثا ومفصلا لتحليل التنفس في الميتوكوندريا المعزولة حديثا من العضلات الهيكلية للفأر. كما نقدم حلولا للمشاكل المحتملة التي يمكن أن تنشأ في أي خطوة من خطوات العملية. يمكن تطبيق الطريقة المعروضة هنا لمقارنة معدلات استهلاك الأكسجين في نماذج الفئران المعدلة وراثيا المتنوعة ودراسة استجابة الميتوكوندريا للعلاجات الدوائية أو عوامل أخرى مثل الشيخوخة أو الجنس. هذه طريقة مجدية للرد على الأسئلة الحاسمة حول استقلاب وتنظيم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا.
Introduction
الميتوكوندريا هي العضيات الأيضية الأساسية في الخلية1. تستخدم هذه العضيات المتخصصة المغلقة بالأغشية جزيئات مغذية لإنتاج الطاقة في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) بواسطة OXPHOS. تعتمد هذه العملية على نقل الإلكترونات من الجزيئات المانحة في سلسلة من تفاعلات الأكسدة والاختزال في ETC2. CoQ هو الدهون الوحيدة النشطة في الأكسدة والاختزال التي يتم إنتاجها داخليا في جميع الأغشية الخلوية والبروتينات الدهنية المتداولة التي تظهر وظيفة مضادات الأكسدة 3. وهو مكون أساسي في ETC ، حيث ينقل الإلكترونات من المجمع I المعتمد على NADH والمجمع الثاني المعتمد على FADH2 إلى المركب الثالث ، على الرغم من أن العديد من المختزلات الأخرى يمكن أن تدفع إلى تقليل CoQ الميتوكوندريا إلى يوبيكوينول كخطوة إلزامية في مسارات التمثيل الغذائي الخلوية المتعددة4,5.
طوال العملية ، يتم إنشاء تدرج بروتون كهروكيميائي عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، والذي يتم تحويله إلى طاقة نشطة بيولوجيا بواسطة مركب ATP synthase V2. وبالتالي ، يؤدي خلل الميتوكوندريا إلى عدد لا يحصى من الحالات المرضية التي تؤثر بشكل رئيسي على الأنسجة ذات المتطلبات العالية للطاقة - الدماغ والقلب والعضلات الهيكلية6,7. لذلك ، من الضروري تطوير طرق لتحليل الطاقة الحيوية للميتوكوندريا بدقة للتحقيق في دورها في الصحة والمرض ، خاصة في الأنسجة عالية الطاقة مثل العضلات الهيكلية.
تم استخدام قطب الأكسجين من نوع كلارك بشكل كلاسيكي في دراسة تنفس الميتوكوندريا8. ومع ذلك، فقد تم استبدال هذا النظام تدريجيا بتقنيات عالية الدقة، مع تقنيات استهلاك الأكسجين القائمة على الصفائح الدقيقة مثل أجهزة تحليل Agilent Seahorse XF التي تحظى بشعبية خاصة9. في مجال العضلات الهيكلية ، يتم إجراء هذه الدراسات عادة في الخلايا المستزرعة ، وخاصة في خط الخلايا العضلية المخلدة للفئران C2C12 أو الثقافات الأولية المشتقة من خلايا الأقمار الصناعية 10,11. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسات لا تلخص بشكل كامل الوضع في الجسم الحي ، خاصة عند التحقيق في بيولوجيا الميتوكوندريا ووظيفتها على مستوى الأنسجة عند إهانات محددة أو تدخلات غير جينية أو تلاعبات جينية.
علاوة على ذلك ، فإن اختبارات التنفس في الخلايا أكثر تعقيدا بسبب عوامل إضافية ، بما في ذلك الطلب خارج الميتوكوندريا على ATP وركائز الفحص أو أحداث الإشارة ، والتي يمكن أن تضلل تفسير النتائج. بدلا من ذلك ، من الممكن أيضا استخدام مفردة أو حزم من الألياف العضلية المعزولة حديثا من العضلات. ومع ذلك ، فإن طريقة العزل صعبة تقنيا وممكنة فقط لعدد قليل من أنواع العضلات. في هذه الحالة ، يتم استخدام العضلات المثنية الرقمية (FDB) والعضلات الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) بشكل رئيسي10،12،13 ، على الرغم من أن بعض التقارير تصف استخدام أنواع العضلات الأخرى أيضا14،15.
كما تم الإبلاغ عن تنميط الطاقة الحيوية لأقسام العضلات الهيكلية 16. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن دراسة العضلات السليمة (يوضح المؤلفون أن التقطيع عبر الألياف لا يزعج النتائج عند مقارنتها بالألياف العضلية المعزولة). ومع ذلك ، فإن وصول الميتوكوندريا إلى الركائز ومثبطات الفحص محدود ، وبالتالي ، لا يمكن قياس سوى عدد قليل من المعلمات16. وأخيرا، يمكن أيضا استخدام الميتوكوندريا المعزولة9،17،18،19. في هذه الحالة ، تفقد الميتوكوندريا بيئتها الخلوية ، مما قد يؤثر على وظيفتها. في المقابل ، تضمن هذه الطريقة الوصول إلى الركائز والمثبطات ، وتمكن من تحليل عدد كبير من أنواع العينات ، وعادة ما تتطلب مواد أقل.
تصف هذه الورقة طريقة لإجراء التنميط الحيوي للميتوكوندريا المعزولة من العضلات الهيكلية للفأر باستخدام المقايسات التنفسية القائمة على الألواح الدقيقة (الشكل 1). وعلى وجه الخصوص، هناك ثلاثة بروتوكولات مفصلة: فحص الاقتران، كاليفورنيا لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC وآلية OXPHOS؛ واختبار الاقتران، CA لتقييم درجة الاقتران بين ETC فحص تدفق الإلكترون ، EFA لقياس نشاط مجمعات ETC الفردية ؛ وفحص BOX لتحديد قدرة الميتوكوندريا على أكسدة β. والجدير بالذكر أن هناك حاجة إلى كميات صغيرة فقط من العينات مقارنة بطرق قياس التنفس التقليدية. تم تعديل بروتوكول العزل المستخدم هنا من الطريقة المنشورة في مكان آخر18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء مبيت الفئران وجمع الأنسجة باستخدام بروتوكولات معتمدة من قبل لجنة أخلاقيات جامعة بابلو دي أولافيد (إشبيلية ، إسبانيا ؛ البروتوكولان 24/04/2018/056 و 12/03/2021/033) وفقا للمرسوم الملكي الإسباني 53/2013 ، والتوجيه الأوروبي 2010/63/EU ، والمبادئ التوجيهية الأخرى ذات الصلة.
1. إعداد المخزونات والمخازن المؤقتة والكواشف لمقايسات التنفس
- قم بإعداد حلول المخزون التالية ، والتي يمكن تخزينها في درجة الحرارة المحددة لعدة أشهر. استخدم H2O فائق النقاء في جميع الحالات.
- قم بإذابة الأقراص المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) في H2O (قرص واحد لكل 200 مل من H2O) لإعداد 1x PBS. قم بتعقيم المحلول وتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT).
- قم بإذابة 2 جم من كريات NaOH في 50 مل من H2O لإعداد 1 M NaOH.
- قم بإعداد مخزون 0.1 M و 1 M و 5 M و 10 M KOH لمعايرة الأس الهيدروجيني.
- أضف 14.612 جم من EDTA إلى 70 مل من H2O. أضف كريات NaOH حتى يصل الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 بحيث يذوب EDTA بالكامل. أضف الساتس الكمومي H2O (QS) إلى 100 مل. قم بتعقيم محلول 0.5 M EDTA (الرقم الهيدروجيني 8) الناتج وقم بتخزينه في RT.
- أضف 19 جم EGTA إلى 70 مل من H2O. أضف كريات NaOH حتى يصل الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 للسماح ل EGTA بالذوبان بالكامل. أضف H2O QS إلى 100 مل. قم بتعقيم محلول 0.5 M EGTA (الرقم الهيدروجيني 8) الناتج وتخزينه في RT.
- أضف 2 مل من 0.5 M EDTA إلى 98 مل من PBS. قم بتخزين حل 10 mM EDTA/PBS الناتج في RT.
- قم بإذابة 5.958 جم من HEPES في 40 مل H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 مع KOH و QS إلى 50 مل مع H2O. قم بتصفية المخزن المؤقت الناتج 0.5 M HEPES من خلال شبكة 0.45 ميكرومتر وقم بتخزينه في RT.
- قم بإذابة 3.402 جم من KH2PO4 في ما يصل إلى 50 مل من H2O. قم بتصفية محلول 0.5 M KH2PO4 الناتج من خلال شبكة 0.45 ميكرومتر وقم بتخزينه في RT.
- قم بإذابة 9.521 جم من MgCl2 اللامائي في ما يصل إلى 100 مل من H2O. قم بأتمتة محلول 1 M MgCl2 الناتج وقم بتخزينه في RT.
ملاحظة: بما أن هذا تفاعل طارد للحرارة ، تابع بحذر وقم بإذابة MgCl2 على الجليد.
- إعداد حلول مخزون الركيزة والمثبطات (انظر الجدول 1). Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان. كاستثناء ، قم دائما بإعداد حمض البيروفيك مباشرة قبل الاستخدام.
- تحضير في H2O فائقة النقاء: 0.5 M سكسينات ، 0.5 M حمض البيروفيك ، 0.5 M حمض الماليك ، 100 mM ADP ، 1 M حمض الأسكوربيك ، و 50 mM N ، N ، N ′ ، N ′ ، N′-رباعي ميثيل بارا فينيلين ديامين (TMPD) (حماية من الضوء).
- تحضير في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO): 50 mM بالميتويل-L-كارنيتين، 4 mM روتينون، 20 mM سيانيد الكربونيل p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)، 4 mM oligomycin، و 5 mM Antimycin A.
ملاحظة: لا تتجاوز 0.1٪ من تركيز DMSO النهائي في آبار الصفائح الدقيقة. لذلك ، قم بإعداد حلول مخزون عالية التركيز للبقاء دون هذا الحد.
- قم بإعداد المخازن المؤقتة لعزل الميتوكوندريا وتحديد كمية البروتين طازجة في يوم التجربة. استخدم H2O فائق النقاء في جميع الحالات واحتفظ بجميع المخازن المؤقتة على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.
ملاحظة: لتوفير الوقت، يمكن وزن جميع الكواشف والاحتفاظ بها في الحاويات المناسبة (على سبيل المثال، أنابيب 15 مل) في درجة الحرارة المناسبة في اليوم السابق.- لإعداد 10٪ من الأحماض الدهنية الحرة (FFA) BSA ، قم بإذابة 150 ملغ من FFA BSA تماما في 1.5 مل من H2O بواسطة عجلة مقلوبة / دوارة. لا دوامة لتجنب الرغوة.
- لإعداد كاشف 1x Bradford ، قم بتخفيف حل المخزون التجاري 5x باستخدام H2O وإبقائه في الظلام في RT.
- لتحضير 8x Mitochondria Buffer (MB) ، قم بإذابة 4.112 جم من السكروز و 763 مجم من HEPES في 15 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 ، وأضف 1.6 مل من 10٪ FFA BSA و QS إلى 20 مل مع H2O.
- لإعداد 20 مل من العزل المؤقت 1 (IB1) (4 مل المستخدمة لكل عينة) ، قم بإذابة 400 ميكرولتر من 0.5 M EDTA ، و 784 ملغ من D-mannitol ، و 2.5 مل من 8x MB في 15 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS مع H2O.
- لإعداد 5 مل من العزل العازل 2 (IB2) (500 ميكرولتر المستخدمة لكل عينة) ، قم بإذابة 30 ميكرولتر من 0.5 M EGTA ، و 196 ملغ من D-mannitol ، و 625 ميكرولتر من 8x MB في 4 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS مع H2O.
- لإعداد 5 مل من المخزن المؤقت لإعادة التعليق (RB) (200 ميكرولتر المستخدمة لكل عينة) ، قم بإذابة 120 ملغ من السكروز ، و 191.3 ملغ من D-mannitol ، و 50 ميكرولتر من 0.5 M HEPES ، و 10 ميكرولتر من 0.5 M EGTA في 4 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS مع H2O.
- لإعداد 2x Mitochondrial Assay Solution-1 (MAS-1) ، قم بإذابة 1.199 جم من السكروز ، و 2.8 جم من مانيتول ، و 1 مل من 0.5 M KH2PO4 ، و 250 ميكرولتر من 1 M MgCl2 ، و 200 ميكرولتر من 0.5 M HEPES ، و 100 ميكرولتر من 0.5 M EGTA في 20 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS إلى 25 مل مع H2O. احتفظ به في الجليد لفترات قصيرة. لفترات أطول ، احتفظ بها عند 4 درجات مئوية لتجنب هطول الأمطار.
- لإعداد وسيط فحص اقتران 1x (CAM) ، قم بإعداد مخزنين مؤقتين مختلفين قائمين على MAS-1: 1) CAM + BSA لفحص CA المناسب ، و 2) CAM-BSA لإعداد مثبطات الفحص. حافظ دائما على نسبة البيروفات: مالات عند 10: 1.
ملاحظة: نظرا لأن BSA يمكن أن يسد منافذ الحقن ، قم بتخفيف المثبطات في كاميرا CAM الخالية من BSA.- لتحضير CAM + BSA ، قم بتخفيف 300 ميكرولتر من 0.5 M من حمض البيروفيك ، و 30 ميكرولتر من 0.5 M من حمض الماليك ، و 7.5 مل من 2x MAS-1 في 6 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2. أضف 300 ميكرولتر من 10٪ FFA BSA و QS إلى 15 مل مع H2O.
- لإعداد CAM-BSA ، قم بتخفيف 120 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض بيروفيك ، و 12 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض الماليك ، و 3 مل من 2x MAS-1 في 2 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS إلى 6 مل مع H2O.
- لإعداد 1x وسيط فحص تدفق الإلكترون (EFAM) ، قم بإعداد كل من المخازن المؤقتة EFAM المحتوية على BSA والخالية من BSA.
- لتحضير EFAM + BSA ، قم بتخفيف 300 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض بيروفيك ، و 60 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض الماليك ، و 3 ميكرولتر من 20 مللي متر FCCP ، و 7.5 مل من 2x MAS-1 في 6 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2. أضف 300 ميكرولتر من 10٪ FFA BSA و QS إلى 15 مل مع H2O.
- لإعداد EFAM-BSA ، قم بتخفيف 120 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض البيروفيك ، و 24 ميكرولتر من 0.5 مليون حمض الماليك ، و 1.2 ميكرولتر من 20 مللي متر FCCP ، و 3 مل من 2x MAS-1 في 2 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS إلى 6 مل مع H2O.
- لإعداد 1x β وسط أكسدة (BOXM) ، قم بإعداد حلول BOXM المحتوية على BSA والخالية من BSA.
- لتحضير BOXM + BSA ، قم بتخفيف 12 ميكرولتر من 50 mM palmitoyl-L-carnitine ، و 30 ميكرولتر من 0.5 m حمض الماليك ، و 7.5 مل من 2x MAS-1 في 7 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2. أضف 300 ميكرولتر من 10٪ FFA BSA و QS إلى 15 مل مع H2O.
- لتحضير BOXM-BSA ، قم بتخفيف 4.8 ميكرولتر من 50 mM palmitoyl-L-carnitine ، و 12 ميكرولتر من 0.5 m من حمض الماليك ، و 3 مل من 2x MAS-1 في 2 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 و QS إلى 6 مل مع H2O.
2. تشريح العضلات ، والتجانس ، وعزل الميتوكوندريا
- ضع جميع المواد والمخازن المؤقتة على الجليد. تأكد من أن جميع المواد باردة أثناء الإجراء بأكمله لحماية الميتوكوندريا من التلف.
- ضع ثلاثة أكواب سعة 50 مل لكل عينة على الجليد ، وأضف الحلول التالية: 10 مل من PBS في الكأس 1 ، و 10 مل من 10 مللي متر من EDTA / PBS في الكأس 2 ، و 4 مل من IB1 في الكأس 3.
- القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم. تجنب القتل الرحيم CO2 لأن عضلات الهيكل العظمي يمكن أن تصبح ناقصة الأكسجين ، مما يتداخل مع تحليلات التنفس.
- رش الطرف الخلفي الأيمن بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع الفراء من التساقط ، وقم بربط الطرف بلوحة تشريح الفلين. قم بتسجيل الطرف الأمامي الأيسر أيضا.
- قم بعمل شق باستخدام مشرط معقم يمكن التخلص منه عبر الجلد من الركبة إلى أخمص القدمين.
- أمسك الجلد بملقط مسنن على مستوى الكاحل وقطعه بمقص ناعم حول الكاحل.
- قم بتخفيف الجلد بعيدا عن العضلات الأساسية باستخدام ملاقط دقيقة في يد واحدة أثناء سحبها باستخدام ملقط مسنن في اليد الأخرى.
- تشريح جميع عضلات الهيكل العظمي من الكاحل إلى الركبة (الشكل 2).
- قم بإزالة جميع الأنسجة الضامة فوق العضلة الأمامية الظنبوبية (TA) لتسهيل استخراج العضلات باستخدام ملاقط ومقص دقيق.
- ابحث عن الأوتار الأربعة البعيدة لعضلة EDL وقسمها بالقرب من إدخالها في أصابع القدم. حدد موقع وتر TA البعيد وقطعه بالقرب من إدخاله ، دائما أسفل الكاحل.
- اسحب أوتار TA و EDL بعناية فوق الكاحل لتحرير الأطراف الفضفاضة.
- أمسك بالأطراف الرخوة للأوتار وقم بتخفيف العضلات بعيدا عن بقية العضلات والعظام عن طريق سحبها لأعلى. استخدم ملاقط أو مقصات دقيقة لتسهيل العملية. المضي قدما بحذر لتجنب تقلص الألياف العضلية.
- قطع الوتر القريب من EDL وعضلة TA أقرب ما يمكن إلى الرضفة.
- اقلب الماوس رأسا على عقب للمضي قدما في gastrocnemius (GA) واستخراج العضلات الوحيدة.
- أمسك الجيب المتشكل بين عظمة الفخذ ذات الرأسين و GA باستخدام ملقط مسنن. استخدم مقص دقيق لفصل هذه العضلات وتصور وتر GA القريب.
- امسك وتر أخيل بملقط ناعم وقطعه بعناية بمقص ناعم. حرر GA والعضلات الوحيدة من العظم الأساسي عن طريق سحبها من خلال الأوتار. قطع وتر GA القريب لتحريره مع النعل الأساسي.
- تشريح العضلات المتبقية بعناية من الوتر إلى الوتر باتباع نفس الإجراء حتى تبقى العظام فقط.
- أعد تثبيت الماوس في الموضع الأولي لتشريح عضلة الفخذ الرباعية.
- تخلص من الأنسجة الدهنية فوق العضلة رباعية الرؤوس في الجانب القريب باستخدام ملقط مسنن ومقص دقيق.
- أدخل ملاقط دقيقة بين الفخذ الرباعي وعظم الفخذ وحركها في كلا الاتجاهين على طول محور عظم الفخذ لفصل العضلات عن العظام.
- أمسك أوتار العضلات رباعية الرؤوس البعيدة بملقط مسنن واقطع الوتر بمقص دقيق أقرب ما يمكن إلى الرضفة.
- اسحب العضلة رباعية الرؤوس لأعلى وحررها عند الإدخال القريب باستخدام مقص دقيق.
- كرر الخطوات من 4 إلى 8 من هذا القسم مع الطرف الخلفي الأيسر.
- شطف جميع العضلات في الكأس 1 أولا ثم في الكأس 2.
- انقل جميع العضلات إلى Beaker 3 وقم بفرم جميع العضلات بدقة باستخدام مقص حاد على الجليد.
- انقل التعليق إلى أنبوب C (غطاء أرجواني) ، مع الاحتفاظ به دائما في الجليد.
- أغلق الأنبوب C بإحكام وقم بإرفاقه رأسا على عقب على كم المجانس. تأكد من أن مادة العينة موجودة في منطقة الدوار / الجزء الثابت. حدد برنامج 1 دقيقة يسمى m_mito_tissue_01.
- قسم المتجانس إلى أنبوبين لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردة مسبقا سعة 2 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 700 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
- انقل المواد الفائقة إلى أنابيب جديدة مبردة مسبقا بسعة 2 مل ، مع تجنب الدهون والأنسجة غير المتجانسة بعناية. تخزين الكريات عند -80 درجة مئوية لتحديد نقاء التجزئة (الكسر N) (الشكل 3).
- أجهزة الطرد المركزي الفائقة عند 10500 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- انقل المواد الفائقة إلى أنابيب مبردة مسبقا جديدة سعة 2 مل وقم بتسميتها على أنها Supernatant Number 1 (SN1). تخزينها في -80 درجة مئوية لتحديد نقاء التجزئة (الشكل 3).
- أعد تعليق ودمج كلا الكريات في حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر من IB2 في الجليد.
- جهاز طرد مركزي عند 10500 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- انقل السوبرناتانت إلى أنبوب جديد مبرد مسبقا بسعة 2 مل وقم بتسميته باسم Supernatant Number 2 (SN2). قم بتخزينه عند -80 درجة مئوية لتحديد نقاء التجزئة (الشكل 3).
- أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا النهائية في 200 ميكرولتر من RB. ضع جانبا بسرعة 10 ميكرولتر لتحديد كمية البروتين وأضف على الفور 10 ميكرولتر من 10٪ FFA BSA إلى تعليق الميتوكوندريا المتبقي لمنع التلف.
- تحديد تركيز البروتين باستخدام فحص برادفورد.
- بالنسبة للمنحنى القياسي ، قم بإعداد 30 ميكرولتر من التخفيفات التسلسلية للتركيز المعروف للبروتين في المخزن المؤقت RB. على سبيل المثال، استخدم 1 ملغم/مل، 0.5 ملغم/مل، 0.25 ملغم/مل، 0.125 ملغم/مل، 0.0625 ملغم/مل، و0 ملغم/مل من BSA.
- قم بإعداد التخفيفات التسلسلية 1:3 و 1:6 لعينات الميتوكوندريا في المخزن المؤقت RB.
- في لوحة ذات قاع مسطح من 96 بئرا ، قم أولا بتحميل 2.5 ميكرولتر من العينة / المعيار لكل بئر. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من 1 M NaOH إلى كل عينة ، وأخيرا ، 200 ميكرولتر من كاشف برادفورد 1x. تخلط جيدا ، وتجنب فقاعات الهواء. تحقق بصريا من أن لون العينات يقع ضمن خط المعايرة. قم دائما بإجراء التحليل في ثلاثة أضعاف.
- احتضن الصفائح لمدة 5 دقائق في RT في الظلام ، واقرأ الامتصاص عند 595 نانومتر في مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة.
- احسب المنحنى القياسي عن طريق رسم قيم الامتصاص (المحور y) مقابل تركيز البروتين المقابل للتخفيفات المحضرة في الخطوة 22.1 في هذا القسم (المحور x).
- احسب الكمية الإجمالية للبروتين في عينات الميتوكوندريا عن طريق الاستقراء باستخدام المنحنى القياسي.
3. إعداد المقايسات التنفسية القائمة على الصفائح الدقيقة
- قم بترطيب مستشعر المقايسة التنفسية قبل 12 ساعة على الأقل من التجربة باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للمعايرة لكل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية (لا CO2).
ملاحظة: يمكن استخدام المستشعرات المائية لمدة تصل إلى 72 ساعة. يجب التعامل مع الخرطوشة بعناية أثناء هذه الخطوة: إذا لمس أي شيء أجهزة الاستشعار ، فقد تتأثر حساسية القياس. - قم بتبريد جهاز الطرد المركزي التحضيري مسبقا باستخدام دوار الجرافة المتأرجحة ومحولات الألواح الدقيقة المقابلة عند 4 درجات مئوية.
- قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج التحليل وحدد البروتوكول المطلوب.
ملاحظة: يتم سماع نقرة واحدة عند اتصال البرنامج بأداة قياس استهلاك الأكسجين. يجب أن يكون مستشعر التسخين أخضر وعند 37 درجة مئوية قبل بدء التجربة. - قم بإعداد المحاليل المثبطة من المخزونات المشار إليها في القسم 1 ، الخطوة 2 وفقا للفحص الذي سيتم إجراؤه. قم بإعداد حجم كاف لكل حل. انظر الجدول 1 والجدول 2 للرجوع إليهما.
- أضف الحجم المناسب لكل مثبط في كل منفذ، وأدخل الخرطوشة في أداة قياس استهلاك الأكسجين، وابدأ المعايرة.
ملاحظة: تستغرق إضافة مثبط إلى الخرطوشة وإدخال الخرطوشة في الجهاز من 15 إلى 20 دقيقة. تأكد من إدخال مكونات الخرطوشة الصحيحة. يمكن التخلص من غطاء الخرطوشة والداعم المائي أثناء الحاجة إلى خرطوشة المستشعر ومكان المرافق. - جهاز الطرد المركزي تعليق الميتوكوندريا المركز للقسم 2 ، الخطوة 21 عند 10500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا في 100 ميكرولتر من 1x CAM + BSA أو 1x EFAM + BSA أو 1x BOXM + BSA ، اعتمادا على البروتوكول الذي سيتم تنفيذه.
- قم بمزيد من التخفيف من عينة الميتوكوندريا المركزة إلى تركيز نهائي قدره 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر في وسط الفحص المقابل.
- بذور 50 ميكرولتر من التعليق (إجمالي 10 ميكروغرام من البروتين) لكل بئر في صفيحة صغيرة مبردة مسبقا من 24 بئرا على الجليد. لا تضيف الميتوكوندريا في آبار تصحيح الخلفية ؛ أضف فقط وسيط الفحص المقابل. قم بتخزين تعليق الميتوكوندريا المتبقي عند -80 درجة مئوية لتحديد نقاء التجزئة (الشكل 3).
- قم بتدوير الصفيحة الدقيقة في جهاز الطرد المركزي التحضيري المبرد مسبقا عند 2000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ثقل الموازنة لتحقيق التوازن وفقا لذلك.
- قم بتسخين وسط الفحص المتبقي عند 37 درجة مئوية أثناء الطرد المركزي للصفائح الدقيقة.
- بعد الطرد المركزي ، اترك الصفيحة الدقيقة على المقعد لمدة 5 دقائق لتحقيق التوازن. أضف 450 ميكرولتر من وسط الفحص الدافئ للحصول على حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر لكل بئر في RT. قم بذلك ببطء وبعناية ، مع إضافة الوسط إلى جدار الآبار لتجنب فصل الميتوكوندريا.
- ضع الصفيحة الدقيقة على الفور في أداة قياس استهلاك الأكسجين بدون غطاء ، وابدأ تشغيل البروتوكول (الجدول 3). تأكد من أن الخطوة الأولى هي حضانة لمدة 10 دقائق للسماح للصفيحة الدقيقة بالتدفئة.
- بمجرد الانتهاء من التجربة ، قم بإزالة الخرطوشة واللوحة الدقيقة ، وقم بإيقاف تشغيل الجهاز ، وابدأ التحليل.
4. تحليل النتائج
- في حالة فحوصات CA و BOX، قم بإجراء التحليلات التالية:
- سجل استهلاك O2 غير الميتوكوندريا ، والذي يتوافق مع متوسط القيم التي تم الحصول عليها بعد حقن Antimycin A و rotenone.
ملاحظة: أنتيمايسين A وروتينون مثبطات معقدة III و I ، على التوالي. - احسب التنفس القاعدي عن طريق طرح استهلاك O2 غير الميتوكوندريا من القيم القاعدية (نقطتا القياس 1 و 2).
- اطرح استهلاك O2 غير الميتوكوندريا من القيم بعد حقن الركيزة المعقدة V ADP (الحقن A) لتحديد حالة الميتوكوندريا III.
- اطرح استهلاك O2 غير الميتوكوندريا من قيم التنفس بعد حقن مثبط V المعقد oligomycin (الحقن B) للحصول على حالة الميتوكوندريا IVo.
- احسب حالة الميتوكوندريا IIIu عن طريق خصم استهلاك O2 غير الميتوكوندريا من التنفس بعد حقن FCCP (الحقن C).
ملاحظة: FCCP هو مفسفرة مؤكسدة قوية للميتوكوندريا. يتم تجاوز توليف ATP في وجوده ، ويحقق ETC أقصى قدر من النشاط. - اطرح قيم التنفس القاعدية من قيم حالة الميتوكوندريا IIIu للحصول على سعة احتياطية للميتوكوندريا ، وهي القدرة على توليد ATP إضافي في حالة زيادة الطلب على الطاقة.
- قسم حالة الميتوكوندريا IIIu على قيم الحالة IVo للحصول على نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR).
ملاحظة: تشير قيم RCR السالبة أو الخالية إلى تأثر اقتران الميتوكوندريا.
- سجل استهلاك O2 غير الميتوكوندريا ، والذي يتوافق مع متوسط القيم التي تم الحصول عليها بعد حقن Antimycin A و rotenone.
- بالإشارة إلى EFA ، قم بإجراء الحسابات التالية:
- الحصول على النشاط المتبقي عن طريق حساب متوسط القيمة بعد حقن الروتينون و Antimycin A (الحقن A و C).
- احسب النشاط المعقد من الأول إلى الرابع (CI-CIIV) عن طريق طرح النشاط المتبقي من القيم القاعدية (نقطتا القياس 1 و2).
- اطرح النشاط المتبقي من القيم بعد حقن سكسينات الركيزة CII (الحقن B) للحصول على نشاط CII-CIII-CIV.
- احسب نشاط CIV عن طريق خصم النشاط المتبقي من القيم التي تم الحصول عليها بعد حقن عوامل تقليل السيتوكروم c وحمض الأسكوربيك و TMPD (الحقن D).
- تمثيل جميع النتائج باستخدام مخططات الشريط، كما في الشكل 4، لاستخراج الاستنتاجات المناسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح البروتوكول المقدم هنا بالتحليل الحي للتنفس الميتوكوندريا من خلال عزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر. ويرد في الشكل 1 مخطط تفصيلي لهذه الطريقة. بعد تشريح العضلات الهيكلية من الأطراف الخلفية (الشكل 2) ، يتم تجانس الأنسجة وتنقية الميتوكوندريا ، في ظل ظروف متساوية التوتر ، من خلال أجهزة الطرد المركزي التسلسلية. يمكن تحليل نقاء الكسور المختلفة التي تم الحصول عليها أثناء عملية العزل بواسطة اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات العضيات المختلفة. ويبين الشكل 3 ألف الملامح العامة للبروتين من الكسور المختلفة التي تبين مجموعات البروتين المتميزة في الكسور المعزولة.
ويبين الشكل 3 باء أن كل محتوى الميتوكوندريا موجود في جزء الميتوكوندريا، كما يتضح من الإشارات القوية لعلامات أغشية الميتوكوندريا الخارجية (VDAC و TOMM20) والداخلية (TIMM23)، وحتى بالنسبة للبروتينات المرتبطة بالنواة (mtTFA). جميع النوى والهيكل الخلوي (β-actin) موجودة في الجزء N ، والذي يمثل النوى والمواد غير المنقطعة (الشكل 3C). علاوة على ذلك ، فإن معظم الشبكة الإندوبلازمية (ER) (Calnexin) أو غشاء البلازما (Na + / K + -ATPaseα1) أو علامات السيتوبلازم (LDHA أو HSP70 أو AKT) تبقى في كسور SN1 أو SN2 ، مما يسلط الضوء على النقاء العالي الذي تم الحصول عليه أثناء العزل (الشكل 3C). ومع ذلك ، هناك بعض آثار تلوث ER في جزء الميتوكوندريا ، ربما بسبب قرب هذه العضيات. بالنظر إلى النتائج التي تم الحصول عليها في اختبارات الجهاز التنفسي اللاحقة ، فإن إجراء العزل الموصوف هنا ينتج عنه مستحضرات ميتوكوندريا نقية للغاية وقابلة للحياة.
تسمح كل من فحوصات CA و BOX بحساب حالات الميتوكوندريا المختلفة في وجود العديد من الركائز التي تحفز مسارات استقلابية محددة. على وجه التحديد ، يتم إجراء هذه الفحوصات في وجود حمض البيروفيك أو كلوريد بالميتويل-إل-كارنيتين. حمض البيروفيك هو ركيزة من دورة كريبس. حمض الماليك هو وسيط دورة كريبس ومحث NADH ، في حين أن بالميتويل-L-كارنيتين هو ركيزة من مسار أكسدة β الأحماض الدهنية. (الشكل 4 ألف، ب). في كلا الفحصين ، فإن الحالة الأولى التي يمكن قياسها هي معدل التنفس القاعدي ، والذي يمثل التنفس الميتوكوندريا في وجود الركائز المضافة في البداية إلى وسط الفحص. بعد ذلك ، يتم تحقيق حالة الميتوكوندريا III ، والتي تمثل إنتاج ATP من ADP والفوسفات غير العضوي ، مما يدل على التنفس الأقصى في حالة مقترنة. وبالتالي ، هناك زيادة في استهلاك الأكسجين بعد إضافة ADP ، كما لوحظ في الشكل 4A ، B.
علاوة على ذلك ، تشير الحالة IVo إلى تسرب البروتون المرتبط بتثبيط سينثاز ATP بواسطة oligomycin، مما يؤدي إلى انخفاض في التنفس ، كما لوحظ في الرسوم البيانية CA و BOX (الشكل 4A ، B). تؤدي إضافة FCCP إلى الحالة IIIu ، والتي تظهر القدرة التنفسية القصوى التي يمكن أن تعرضها الميتوكوندريا في حالة غير مقترنة عندما يصل استهلاك الأكسجين إلى أعلى مستوى له في هذه المقاييس. لحساب كل هذه الحالات ، من الضروري أولا تحديد التنفس غير الميتوكوندريا ، والذي يتم الحصول عليه في نهاية الفحص عند حقن Antimycin A و rotenone لمنع التنفس التأكسدي. كما هو موضح في الشكل 4A ، B ، يجب أن تكون هذه القيم دائما أقل من التنفس القاعدي وقريبة جدا من الصفر في حالة المقايسات مع الميتوكوندريا المعزولة مثل هذه المقايسات الموصوفة هنا. أخيرا ، يجب حساب معلمة RCR لتقييم سلامة الميتوكوندريا. وهو يعكس ما إذا كانت الميتوكوندريا يمكن أن تتفاعل مع ADP عن طريق إنتاج ATP بمعدل مرتفع مع تسرب بروتون منخفض. كان متوسط قيم RCR الموجودة في مقايسات CA و BOX 5.78 ± 1.03 و 3.47 ± 0.42 (الشكل 4A ، B) ، على التوالي ، والتي تتفق مع RCRs الأمثل المبلغ عنها سابقا 21,22,23,24.
بالإضافة إلى ذلك ، يدرس التعليم للجميع نشاط مجمعات ETC بشكل فردي أو مجتمعة من خلال حقن ركائز ومثبطات محددة (الشكل 4C). يمثل نشاط CI-CIV التنفس الميتوكوندريا على أساس ركائز البيروفات والمالات عندما لا يتم تثبيط أي مجمعات. في هذه الحالة ، تمر معظم الإلكترونات عبر CI. نظرا لأن الروتينون هو مثبط محدد ل CI ، يتم حظر CI بعد إضافته ، مما يؤدي إلى انخفاض استهلاك الأكسجين (الشكل 4C). يظهر نشاط CII-CIII-CIV التنفس عندما يتم حظر CI فقط ، ويتم تنشيط CII: السكسينات ، التي يتم حقنها من خلال المنفذ B ، هي ركيزة محددة من المركب II (نازعة هيدروجيناز السكسينات). وبالتالي ، يتم تقليل CII ، مما يؤدي إلى بدء تدفق الإلكترون من CII إلى CIV ، في حين لا يزال CI مثبطا بواسطة حقن الروتينون السابق ، مما يؤدي إلى زيادة في استهلاك الأكسجين (الشكل 4C). Antimycin إضافة تمنع CIII ، مما يمنع تدفق الإلكترون عبر ETC ويقلل من استهلاك الأكسجين. علاوة على ذلك ، يتم تحديد نشاط CIV عندما يتم تحفيزه بواسطة أكسدة السيتوكروم C بعد تقليله بإضافة حمض الأسكوربيك / TMPD ؛ يوضح الشكل 4C أن تنشيط CIV ينتج عنه زيادة في استهلاك الأكسجين. أخيرا ، يشير النشاط المتبقي إلى استهلاك الأكسجين عندما يتم تعطيل سلسلة الفسفرة التأكسدية بعد إضافة الروتينون و Antimycin A. تحدد هذه القيمة الخلفية لحساب نشاط المجمعات كما هو موضح في خطوات البروتوكول 2.2-2.4 في القسم 4.
الشكل 1: التصور التخطيطي للطريقة. الاختصارات: OCR = معدل استهلاك الأكسجين; ADP = الأدينوسين ثنائي الفوسفات; OL = أوليغومايسين; FCCP = سيانيد الكربونيل-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone; AntA = Antimycin A; تعفن = روتينون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تشريح وعزل عضلات الهيكل العظمي الفئرانية عن الأطراف الخلفية لتحليلات التنفس الميتوكوندريا . (أ) تم تمديد الطرف الخلفي الأيمن وشل حركته بالشريط. (ب) تم إجراء شق من خلال الجلد من جانب الكاحل ، وتوقف بالقرب من الركبة. تمت إزالة النسيج الضام الذي يغطي TA بعناية. تم تقسيم أوتار EDL (C) و TA (D) بالقرب من إدخالها. تم سحب وتر TA لأعلى لتخفيف العضلات بعيدا عن العضلات والعظام الكامنة. ثم ، تم قطع TA بالقرب من القمة البطنية إلى الساق. وبالمثل ، تم تخفيف عضلة EDL بعيدا ، وتم قطع الوتر القريب بدقة على جانب الركبة. (و) الطرف الخلفي الأيمن بعد تشريح TA و EDL. (ز) في الطرف الخلفي الخلفي ، تم تقسيم وتر أخيل لتشريح GA والعضلات الوحيدة. (ح) تم تحرير GA والنعل بعناية من عظم الظنبوب. (I) تم جمع العضلات المتبقية من الكاحل إلى الركبة حتى بقيت فقط الشظية وعظام الظنبوب. (ي) الطرف الخلفي بعد التشريح. (ك) تم تشريح الفخذ الرباعي. (L) جميع عضلات الهيكل العظمي التي تم جمعها لعزل الميتوكوندريا الخلفية. تم تنفيذ العملية لكلا الطرفين الخلفيين. الاختصارات: TA = الظنبوب الأمامي; EDL = الباسطة الرقمية طويلة ؛ GA = gastrocnemius. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نقاء عملية التجزئة . (أ) ملف تعريف البروتين العام الملطخ باللون الأزرق Coomassie. (ب) ملف تعريف نقاء بروتين الميتوكوندريا. (ج) علامات غير الميتوكوندريا. تم تحميل الكسور المختلفة التي تم الحصول عليها أثناء عزل الميتوكوندريا وتحضينها بأجسام مضادة ضد بروتينات مختلفة في أجزاء تحت خلوية محددة. الاختصارات: الكسر N = الأنسجة والنوى غير المتجانسة. SN1 = رقم supernatant 1: السيتوبلازم + العضيات. SN2 = رقم supernatant 2: السيتوبلازم + العضيات. VDAC = قناة أنيون تعتمد على الجهد ؛ TOMM20 = ترانسلوكاس غشاء الميتوكوندريا الخارجي 20 ؛ mtTFA = عامل نسخ الميتوكوندريا A ؛ TIMM23 = ترانسلوكاس غشاء الميتوكوندريا الداخلي 23 ؛ LDHA = نازعة هيدروجيناز اللاكتات A ؛ HSP70 = بروتين الصدمة الحرارية 70 ؛ ER = الشبكة الإندوبلازمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية. التنميط الحيوي للميتوكوندريا المعزولة من عضلات الأطراف الخلفية لفأر من النوع البري C57BL/6N يبلغ من العمر 13 شهرا. يشار إلى نقاط الحقن للركائز والمثبطات المختلفة في كل فحص. يمكن تحليل أداء آلات ETC و OXPHOS باستخدام البيروفات والمالات ، أو بالميتويل-L-carnitine و malate كركائز في فحص الاقتران (A) أو أكسدة β لمقايسات FA (B) ، على التوالي. (ج) يسمح فحص تدفق الإلكترون بدراسة مجمعات الميتوكوندريا الفردية في وجود البيروفات والمالات وFCCP؛ تم طلاء 10 ميكروغرام من الميتوكوندريا لكل بئر. يتم عرض النتائج باتباع خيار تمثيل النقطة الوسطى لعرض النتائج في نموذج مجمع. هذا على النقيض من خيار من نقطة إلى نقطة ، والذي من شأنه أن يتيح تصور 9 قياسات متتالية يتم إجراؤها عادة خلال كل خطوة قياس. يمكن تغيير نوع التصور بعد الانتهاء من الفحص ضمن خيارات المخطط الخطي الحركي في برنامج التحليل. الاختصارات: FA = الأحماض الدهنية; OCR = معدل استهلاك الأكسجين; ADP = الأدينوسين ثنائي الفوسفات; FCCP = سيانيد الكربونيل-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone; RCR = نسبة التحكم في الجهاز التنفسي. EFA = فحص تدفق الإلكترون; BOX = β أكسدة FA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| فحص الاقتران | ||||||
| ميناء | المانع | [الأسهم] | [منفذ الحقن] | [نهائي] | وصفة | |
| إنهيب | كام-BSA | |||||
| A | شرطة أبوظبي | 100 مللي متر | 50 مللي متر | 5 مللي متر | 650 ميكرولتر | 650 ميكرولتر |
| B | أوليغوميسين | 4 مللي متر | 31.6 ميكرومتر | 3.16 ميكرومتر | 11.3 ميكرولتر | 1418.7 ميكرولتر |
| C | FCCP | 20 مللي متر | 60 ميكرومتر | 6 ميكرومتر | 4.68 ميكرولتر | 1555.32 ميكرولتر |
| D | أنتيميسين أ // روتينون | 5 ملليمتر // 4 ملليمتر | 40 ميكرومتر // 50 ميكرومتر | 4 ميكرومتر // 5 ميكرومتر | 13.52 ميكرولتر // 21.12 ميكرولتر | 1655.36 ميكرولتر |
| فحص تدفق الإلكترون | ||||||
| ميناء | المانع | [الأسهم] | [منفذ الحقن] | [نهائي] | وصفة | |
| إنهيب | EFAM-BSA | |||||
| A | روتينون | 4 مللي متر | 50 ميكرومتر | 5 ميكرومتر | 16.25 ميكرولتر | 1283.7 ميكرولتر |
| B | سكسينات | 500 مللي متر | 100 مللي متر | 10 مللي متر | 286 ميكرولتر | 1144 ميكرولتر |
| C | أنتيميسين أ | 5 مللي متر | 4 ميكرومتر | 4 ميكرومتر | 12.48 ميكرولتر | 1547.5 ميكرولتر |
| D | أسكوربات // TMPD | 1 م // 50 مللي متر | 100 مللي متر // 1 مللي متر | 10 مللي متر // 100 ميكرومتر | 169 ميكرولتر // 33.8 ميكرولتر | 1487.2 ميكرولتر |
| β الأكسدة | ||||||
| ميناء | المانع | [الأسهم] | [منفذ الحقن] | [نهائي] | وصفة | |
| إنهيب | بوكس-بي إس إيه | |||||
| A | شرطة أبوظبي | 100 مللي متر | 40 مللي متر | 4 مللي متر | 520 ميكرولتر | 780 ميكرولتر |
| B | أوليغوميسين | 4 مللي متر | 31.6 ميكرومتر | 3.16 ميكرومتر | 11.3 ميكرولتر | 1418.7 ميكرولتر |
| C | FCCP | 20 مللي متر | 60 ميكرومتر | 6 ميكرومتر | 4.68 ميكرولتر | 1555.32 ميكرولتر |
| D | أنتيميسين أ // روتينون | 5 ملليمتر // 4 ملليمتر | 40 ميكرومتر // 20 ميكرومتر | 4 ميكرومتر // 2 ميكرومتر | 13.52 ميكرولتر // 8.45 ميكرولتر | 1668 ميكرولتر |
الجدول 1: إعداد المحاليل المثبطة للمقايسات المختلفة. يوضح عمود [المخزون] تركيزات محاليل المخزون للمركب المشار إليه في عمود المثبط . يشير [ منفذ الحقن ] إلى تركيز المحاليل المثبطة المراد تحميلها في المنافذ المختلفة للخرطوشة، بينما يشير العمود [النهائي ] إلى التركيز النهائي للمثبطات في الآبار. وأخيرا، تحدد أعمدة الوصفة أحجام حلول مثبطات المخزون والوسائط الخالية من BSA التي يجب خلطها لإعداد المحاليل المراد تحميلها في منافذ الحقن. الاختصارات: ADP = ثنائي فوسفات الأدينوزين; FCCP = سيانيد الكربونيل-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone; TMPD = N,N,N′ ,N′-رباعي ميثيل-بارا-فينيلين-ديامين; إنهيب = مثبط; BSA = ألبومين مصل البقر. CAM-BSA = وسيط فحص اقتران خال من BSA ؛ EFAM-BSA = متوسط فحص تدفق الإلكترون الخالي من BSA ؛ BOX-BSA = أكسدة خالية من BSA β لوسط فحص الأحماض الدهنية.
| ميناء | حجم حقن | المخزون المحضر (26 بئرا) |
| A | 50 ميكرولتر | 1300 ميكرولتر |
| B | 55 ميكرولتر | 1430 ميكرولتر |
| C | 60 ميكرولتر | 1560 ميكرولتر |
| D | 65 ميكرولتر | 1690 ميكرولتر |
الجدول 2: حساب أحجام الحقن.
| فعل | الوقت (بالدقائق) | تكرار | ميناء |
| معايره | 15-20 | ||
| انتظري | 10 | ||
| مزيج + انتظر | 1 + 3 | × 2 | |
| خلط | 1 | ||
| قياس + مزيج | 3 + 1 | × 2 | |
| حقن | A | ||
| خلط | 1 | ||
| قاس | 3 | ||
| خلط | 1 | ||
| حقن | B | ||
| خلط | 1 | ||
| قاس | 3 | ||
| خلط | 1 | ||
| حقن | C | ||
| خلط | 1 | ||
| قاس | 3 | ||
| خلط | 1 | ||
| حقن | D | ||
| المزج + القياس | 1 + 3 | × 2 |
الجدول 3: إعدادات البروتوكول للمقايسات المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جميع الطرق المستخدمة لدراسة التنفس الميتوكوندريا لها حدودها. وبالتالي ، من الأهمية بمكان اختيار الطريقة التي تناسب سؤالا تجريبيا محددا. يوفر هذا العمل بروتوكولا محدثا ومفصلا لعزل الميتوكوندريا عن العضلات الهيكلية للفأر لإجراء فحوصات تنفسية مختلفة للتحقيق في وظيفة الميتوكوندريا. والواقع أن دراسة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في الميتوكوندريا المعزولة باستخدام التكنولوجيات القائمة على الصفائح الدقيقة أمر قيم لدراسة التنفس الخاص بالأنسجة من حيث قابلية التكاثر والموثوقية والتعقيد. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الميتوكوندريا المعزولة يمنح السيطرة على توافر الركيزة، مما يسهل فهم العمليات البيولوجية الأساسية. جانب إيجابي آخر لاستخدام الميتوكوندريا المعزولة هو أنه من الممكن دراسة الحالة الثالثة لأن ATP المتولد بعد حقن ADP لا يتم تحويله مرة أخرى إلى ADP جديد حيث يتم فقدان معظم ATPases عبر الغشاء. علاوة على ذلك ، في الفحوصات الموضحة هنا ، يضاف oligomycin لمنع توليف ATP غير المحدد المحتمل 20.
وهناك عدة اعتبارات هامة ينبغي إبرازها لهذا البروتوكول. أولا ، الميتوكوندريا المعزولة حساسة للغاية ويجب التعامل معها بعناية. يضمن المحتوى العالي من السكروز والمانيتول في المخازن المؤقتة المستخدمة الظروف التناضحية المثلى لحماية الميتوكوندريا المعزولة من التلف. ومع ذلك ، ينبغي أن تبقى مدة الفحص عند الحد الأدنى للحفاظ على صلاحية الميتوكوندريا ومنع الانفصال عن الصفيحة الدقيقة بمجرد البذور. وبالتالي ، بالنظر إلى أن خطوات البروتوكول ، مثل إعداد وسائط الفحص وحلول الركيزة والمثبطات ، أو تحميل المثبطات في خرطوشة الفحص التنفسي ، تستغرق وقتا طويلا ، يجب تنسيق كل خطوة بشكل مثالي. علاوة على ذلك ، على عكس الطرق الأخرى القائمة على الهضم الأنزيمي21،24 وتجانس الملاط والمدقات17،19،21،23،24 ، تعتمد الطريقة الموصوفة هنا على استخدام مجانس آلي ، مما يتيح تجانس العينات بسرعة وكفاءة. الأهم من ذلك ، أن معلقات الميتوكوندريا أقل حساسية إذا كانت عالية التركيز. وبالتالي ، قم فقط بإعداد التخفيفات مباشرة قبل استخدامها. أخيرا ، من الضروري العمل بسرعة أثناء الفحص التنفسي المناسب. عادة ، عند تحليل الخلايا في الثقافة في هذه الفحوصات ، يتم تنفيذ ثلاث خطوات قياس متتالية بعد حقن الركائز أو المثبطات ، مما يؤدي إلى بروتوكولات تمتد بين 40 و 50 دقيقة ، لضمان بقاء الميتوكوندريا المعزولة طوال الإجراء بأكمله ، غالبا ما يتم الاحتفاظ بعدد خطوات القياس إلى الحد الأدنى بسبب ضعفها19 ، 23,25 ، مما يقلل من الوقت المستغرق لإكمال تحليل قياس التنفس إلى ~ 20 دقيقة. وتتبع البروتوكولات الموصوفة في هذا العمل (الجدول 3) هذا الاتجاه، على الرغم من أن الطرق الأخرى المنشورة سابقا تبلغ عن ملفات تعريف OCR فعالة مع خطوات قياس أطول وأكثر معيارية26.
على سبيل المثال ، إذا كان سيتم إجراء فحصين متتاليين بنفس المجموعة من العينات في نفس اليوم ، فقم بإعداد جميع الكواشف للفحص الثاني خلال الفحص الأول باستثناء تخفيفات الميتوكوندريا: فقط قم بتخفيف الميتوكوندريا والبذور والدوران مباشرة قبل بدء الفحص الثاني ، أثناء معايرة الأداة. بمجرد اكتمال التجربة ، يجب حساب معلمة RCR (القسم 4 ، الخطوة 1.7) لتقييم جودة مستحضرات الميتوكوندريا المستخدمة. عادة ما تشير قيم RCR بين 3.5 و 5 إلى أن سلامة الميتوكوندريا هي الأمثل وتظهر التنفس التأكسدي المقترن الوظيفي25. يجب التخلص من الفحوصات ذات قيم RCR المنخفضة لأن سلامة الميتوكوندريا تعرضت للخطر أثناء العزلة. في هذه الحالات ، فكر في غسل حبيبات الميتوكوندريا مرتين (القسم 2 ، الخطوات 19-21)22 ، كما ذكر سابقا.
ثانيا ، الحفاظ على الرقم الهيدروجيني الصحيح طوال الإجراء أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج ناجحة. تأكد من تعيين الرقم الهيدروجيني لجميع المحاليل كما هو موضح ، أي الرقم الهيدروجيني 7.2 ، وأن الرقم الهيدروجيني يتم ضبطه دائما باستخدام KOH ما لم ينص على خلاف ذلك. والجدير بالذكر أنه لا ينبغي قياس الرقم الهيدروجيني للمخازن المؤقتة المحتوية على BSA مباشرة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني لأن BSA يمكن أن يتلف المسبار. وبالتالي ، اضبط الرقم الهيدروجيني في المخازن المؤقتة المقابلة قبل إضافة BSA. لتجنب التغييرات في درجة الحموضة بسبب إضافة BSA ، استخدم دائما FFA BSA. علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون بعض دفعات H2O فائقة النقاء حمضية ، لذلك يوصى باستخدام درجة الحموضة 7 H2O المنقاة تجاريا. علاوة على ذلك ، من الضروري التأكد من معايرة مقياس الأس الهيدروجيني بشكل صحيح وأنه النموذج المناسب لقياس درجة الحموضة للمواد الكيميائية التي سيتم إعدادها.
ثالثا ، من الأهمية بمكان تنفيذ خطوة جمع العينات بشكل صحيح لقياس البروتين لتعليق الميتوكوندريا النهائي (القسم 2 ، الخطوة 21) لمنع تدمير الميتوكوندريا. أعد تعليق الكريات بسرعة ولكن بدقة ، وجمع أليكوت ، وإضافة FFA BSA إلى التعليق المتبقي للحفاظ على التوازن الاسموزي وحماية الميتوكوندريا من التلف. إذا كان FFA BSA موجودا بالفعل في المخزن المؤقت لإعادة التعليق ، وبالتالي ، أثناء تحديد كمية البروتين ، فإن المحتوى العالي من البروتين سيربك نتائج القياس الكمي. هذا هو السبب في ضرورة إضافة FFA BSA بعد وضع aliquot جانبا للقياس الكمي.
رابعا ، هذه الطريقة متعددة الاستخدامات للغاية ويمكن تعديلها وفقا لاحتياجات المجرب. على سبيل المثال ، إذا كان النموذج الحيواني قيد الدراسة يتميز بانخفاض كتلة العضلات (على سبيل المثال ، الفئران الساركوبينية) ، يمكن للعضلات الإضافية أن تزيد من غلة الميتوكوندريا. على الرغم من استخدام فأر C57BL/6N من النوع البري البالغ في هذا العمل ، إلا أنه يمكن استخدام الحيوانات من أي جنس أو عمر أو خلفية وراثية ، بالإضافة إلى أنواع معينة من العضلات ، بدلا من ذلك.
خامسا ، يمكن أن تختلف قيم الجهاز التنفسي بين التجارب بسبب الاختلافات الطفيفة في تكوين المخازن المؤقتة والكواشف ، والتي تحتاج إلى إعدادها طازجة في كل مرة. يمكن أن يكون للعمر أو الجنس أو الخلفية الوراثية أو الظروف البيئية أيضا تأثير عميق على النتائج. ومع ذلك ، يجب أن تقدم التجربة الناجحة زيادات في استهلاك الأكسجين بعد حقن الركائز المعقدة مثل ADP والسكسينات ، وتنخفض بعد حقن المثبطات مثل oligomycin أو rotenone ، وزيادات ملحوظة عند إضافة FCCP القوي غير المقترن. علاوة على ذلك ، لمنع التباين التقني العالي ، تأكد من إعادة التعليق الشامل لكريات الميتوكوندريا للحصول على معلقات متجانسة قبل بذرها في الصفيحة الدقيقة.
سادسا ، إذا كانت قيم الجهاز التنفسي القاعدية منخفضة ، ففكر في إجراء تجربة معايرة لضبط كمية البروتين للبذر. أخيرا ، نظرا لأن هذا العمل يوفر طريقة للحصول على مستخلصات الميتوكوندريا الخام ، فمن المتوقع وجود درجة معينة من الشوائب المرتبطة بالعضيات الأخرى ، وخاصة ER. إن عملية تجزئة أكثر عدوانية لإزالة هذه الشوائب ستكون ضارة بصلاحية الميتوكوندريا ، مما يعوق أداء اختبارات الجهاز التنفسي. إذا كان النقاء مصدر قلق، خاصة إذا لم يكن متسقا بين العينات، يمكن تطبيع نتائج الفحص بالنسبة إلى نقاء الميتوكوندريا بعد تشغيل بقع غربية ضد علامات عضيات مختلفة (الشكل 3). على حد علمنا ، هذه هي الطريقة الأولى التي تسلط الضوء على المخاوف بشأن نقاء الميتوكوندريا في المستخلصات الخام. عادة ، في بروتوكولات أخرى لاختبارات التنفس مع الميتوكوندريا المعزولة ، يتم زرع نفس الكمية من مستخلص البروتين في الآبار لمقارنة العينات ، على افتراض أن نفس الكمية من الميتوكوندريا تستخدم في جميع الحالات. هذا افتراض معقول بالنظر إلى أن العزل يتم بالتوازي في جميع العينات. ومع ذلك ، فإن الخلفية الجينية أو البيئية للعينات قيد الدراسة قد تؤدي إلى اختلافات كبيرة في نقاء مستخلصات الميتوكوندريا. على سبيل المثال، إذا تسببت طفرة جينية معينة في زيادة تطور ER السيتوبلازمي، فإن مستخلصات الميتوكوندريا الخام من هذه الحيوانات يمكن أن تحتوي على محتوى ER أكبر من المتوقع، وبالتالي أقل من المتوقع بروتين الميتوكوندريا. وبالتالي ، حتى لو تم زرع نفس الكمية من البروتين الكلي من عينات التحكم والمتحورات في الصفيحة الدقيقة ، التقليل من شأن استهلاك الأكسجين للطفرات. وبالتالي ، يوصى بتحديد نقاء مقتطفات جميع الظروف قيد الدراسة. إذا كانت القيم قابلة للمقارنة ، فلا حاجة إلى التطبيع. ومع ذلك ، إذا كانت قيم النقاء بين العينات تختلف اختلافا كبيرا عن الخطأ الإحصائي الذي يرغب المجرب في قبوله ، فيجب استخدامها لتطبيع نتائج استهلاك الأكسجين.
وينطوي هذا البروتوكول على بعض القيود. تجدر الإشارة إلى أن هذه الطريقة قد تم تحسينها للأنسجة العضلية الهيكلية المعزولة من الفئران. قد تحتاج إلى إجراء تعديلات إذا كنت تستخدم أنسجة مختلفة أو عضلات هيكلية من أنواع مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم إجراء التحليلات على الميتوكوندريا المعزولة ، يتم فقدان البيئة الدقيقة الخلوية الطبيعية بسبب عدم وجود سياق خلوي والعضيات الأخرى التي يمكن أن تتفاعل مع الميتوكوندريا. هذا يمكن أن يؤدي إلى نتائج تنحرف قليلا عن الظروف الفسيولوجية. أخيرا ، عندما يتم طرد الميتوكوندريا مركزيا ، فإنها تلتصق بقاع الآبار. في حين أن الآثار المحتملة للطرد المركزي على حالتها الطبيعية غير معروفة على الرغم من ضرورتها تماما.
من المهم أن نأخذ في الاعتبار أنه بعد إجراء تحليلات المقايسة التنفسية ، يمكن أن يشير انخفاض استهلاك الأكسجين المرتبط بالتنفس المرتبط ب ATP أو المحفز FCCP في الميتوكوندريا المعزولة إلى تغيرات محتملة في الميتوكوندريا يمكن تفسيرها من خلال20: 1) النقل المقيد للركائز عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، 2) انخفاض نشاط الإنزيمات المشاركة في تفاعلات الحد من المعدل لمسارات استقلابية محددة مثل ETC ، دورة كريبس ، أو β الأكسدة ، أو 3) ضعف وظيفة ETC ، من بين تفسيرات أخرى محتملة.
باختصار ، تمثل الطريقة المحدثة الموضحة هنا طريقة كافية وموثوقة لتقييم وظيفة ETC و OXPHOS من الأنسجة العضلية الهيكلية. لديها تطبيقات متعددة لتقييم كيف يمكن للتعديلات الجينية أو البيئة أن تؤثر على التنفس الميتوكوندريا مما يساهم في نمط ظاهري معين. ومن اللافت للنظر أن البروتوكول الحالي يمكن تكييفه مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى أو استخدامه مع عينات بشرية لتقييم اختلالات الميتوكوندريا المحتملة المرتبطة بالأمراض البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
ونود أن نشكر خوان ج. تينا على استخدام المجانس ومرافق البروتينات وتربية الحيوانات التابعة ل CABD للحصول على الدعم التقني. تم دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والثقافة والرياضة الإسبانية من خلال زمالة FPU16/03264 إلى J.D.H.C. ، والرابطة الفرنسية لمكافحة اعتلال العضلات (AFM) من خلال منحة الزمالة رقم 22450 إلى C.V.-G. ، ومنحة مؤسسية MDM-2016-0687 (وحدة Maria de Maeztu Excellence ، قسم تنظيم الجينات وتكوين المورفوجينيا في CABD) و BFU2017-83150-P إلى J.J.C. منحة المجلس العسكري في الأندلس P18-RT-4572 ، وبرنامج تمويل FEDER من الاتحاد الأوروبي ، ووزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية تمنح RED2018-102576-T إلى P.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080 (2016).
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
