Summary
여기에서는 마우스 골격근으로부터의 미토콘드리아를 분리하는 상세한 방법과 마이크로플레이트 기반 호흡 측정법을 사용하여 산소 소모율(OCR)에 의한 호흡의 후속 분석을 설명한다. 이 파이프 라인은 미토콘드리아 대사에 대한 여러 환경 또는 유전 적 개입의 효과를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.
Abstract
대부분의 세포 에너지는 세포 요구에 반응하여 조절되는 미토콘드리아 산화 인산화 (OXPHOS) 시스템에 수렴하는 다양한 경로에 의해 포도당, 지방산 및 아미노산의 분해를 통해 얻어집니다. 지질 분자 코엔자임 Q (CoQ)는 일정한 산화 / 환원 사이클을 통해 전자 수송 사슬 (ETC)의 복합체 III로 전자를 전달함으로써이 과정에서 필수적입니다. 미토콘드리아 상태 및 궁극적으로, 세포 건강은 호흡 측정법을 사용하여 ETC 산소 소비를 측정함으로써 평가될 수 있다. 이들 연구는 전형적으로 수일 동안 배양된 확립된 또는 일차 세포주에서 수행된다. 두 경우 모두에서, 수득된 호흡 파라미터는 임의의 주어진 기관 또는 조직에서 정상적인 생리학적 조건으로부터 벗어났을 수 있다.
추가적으로, 골격근으로부터 분리된 배양된 단일 섬유의 본질적인 특성은 이러한 유형의 분석을 방해한다. 이 논문은 마우스 골격근에서 갓 분리 된 미토콘드리아에서 호흡 분석을위한 업데이트되고 상세한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 프로세스의 모든 단계에서 발생할 수있는 잠재적 인 문제에 대한 솔루션을 제공합니다. 여기에 제시된 방법은 다양한 트랜스제닉 마우스 모델의 산소 소모율을 비교하고 약물 치료 또는 노화 또는 성별과 같은 다른 요인에 대한 미토콘드리아 반응을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 이것은 미토콘드리아 생물 에너지 대사 및 조절에 관한 중요한 질문에 응답하는 실현 가능한 방법입니다.
Introduction
미토콘드리아는 세포의 주요 대사 소기관입니다1. 이 특수 막 밀폐 된 소기관은 영양 분자를 사용하여 OXPHOS에 의한 아데노신 삼인산염 (ATP) 형태로 에너지를 생산합니다. 이 과정은 ETC2에서 일련의 산화 환원 반응에서 공여체 분자로부터의 전자의 전달에 의존합니다. CoQ는 항산화 기능을 나타내는 모든 세포막과 순환 지단백질에서 내인성으로 생산되는 유일한 산화환원 활성 지질입니다3. 그것은 ETC의 필수 구성 요소이며, NADH 의존성 복합체 I 및 FADH2 의존성 복합체 II에서 복합체 III로 전자를 전달하지만, 많은 다른 환원 효소는 여러 세포 대사 경로의 필수 단계로서 미토콘드리아 CoQ를 유비퀴놀로 환원시킬 수 있습니다4,5.
이 과정 전반에 걸쳐, 전기화학적 양성자 구배가 미토콘드리아 내막을 가로질러 생성되며, 이는 ATP 신타제 복합체 V2에 의해 생물학적 활성 에너지로 변환된다. 결과적으로, 미토콘드리아 기능 장애는 주로 높은 에너지 요구 사항, 즉 뇌, 심장 및 골격근에 영향을 미치는 무수한 병리학 적 상태로 이어집니다6,7. 따라서 미토콘드리아 생물 에너지를 정확하게 분석하여 건강과 질병, 특히 골격근과 같은 에너지가 높은 조직에서 그 역할을 조사하는 방법을 개발하는 것이 기본입니다.
클락형 산소전극은 미토콘드리아 호흡8의 연구에 고전적으로 사용되어 왔다. 그러나 이 시스템은 고분해능 기술로 점차 대체되어 왔으며, 애질런트 시호스 XF 분석기와 같은 마이크로플레이트 기반 산소 소비 기술이 특히 인기가 높습니다9. 골격근 분야에서, 이러한 연구는 전형적으로 배양된 세포, 주로 C2C12 불멸화 마우스 근원세포 세포주 또는 위성 세포로부터 유래된 일차 배양물10,11에서 수행된다. 그러나, 이들 연구는 특히 미토콘드리아 생물학을 조사할 때, 특히 특정 모욕, 비유전학적 개입 또는 유전자 조작에 대한 조직 수준에서 기능하는 상황을 완전히 재검토하지 않는다.
또한, 세포의 호흡 분석은 ATP의 미토콘드리아 외 수요 및 분석 기질 또는 신호 전달 사건을 포함한 추가 요인으로 인해 더 복잡하며, 이는 결과의 해석을 오도 할 수 있습니다. 대안적으로, 근육으로부터 갓 분리된 근섬유의 단일 또는 다발을 사용하는 것도 가능하다. 그러나 격리 방법은 기술적으로 도전적이며 몇 가지 근육 유형에서만 가능합니다. 이 경우, 굴곡근 디지토럼 브레비스 (FDB)와 신근 디지토럼 롱 어스 (EDL) 근육이 주로 사용되지만10,12,13, 몇 가지 보고서는 다른 근육 유형의 사용을 설명하지만14,15.
골격근 절편의 생체에너지 프로파일링도 보고되었다16. 이 방법의 가장 큰 장점은 손상되지 않은 근육을 연구 할 수 있다는 것입니다 (저자는 섬유를 통한 슬라이싱이 분리 된 근섬유와 비교할 때 결과를 방해하지 않는다는 것을 보여줍니다). 그러나, 기질 및 분석 억제제에 대한 미토콘드리아 접근은 제한되고, 따라서, 단지 몇 가지 파라미터만이 측정될 수 있다16. 마지막으로, 분리된 미토콘드리아도 마찬가지로 채용될 수 있다9,17,18,19. 이 경우 미토콘드리아는 세포 질 환경을 잃어 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 대조적으로,이 방법은 기질 및 억제제에 대한 접근을 보장하고, 많은 샘플 유형의 분석을 가능하게하며, 일반적으로 더 적은 물질을 필요로합니다.
이 논문에서는 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석을 사용하여 마우스 골격근으로부터 분리된 미토콘드리아의 생체에너지 프로파일링을 수행하는 방법을 설명합니다(그림 1). 특히, 세 가지 프로토콜이 상세하다: ETC와 OXPHOS 기계류 사이의 결합 정도를 평가하는 커플링 어세이, CA; 전자 유동 분석법, 개별 ETC 복합체의 활성을 측정하는 EFA; 및 미토콘드리아 β산화능을 결정하기 위한 BOX 분석법을 포함한다. 특히, 기존의 호흡 측정 방법과 비교하여 소량의 샘플 만 필요합니다. 여기에 사용된 격리 프로토콜은 다른 곳에 공개된 방법18에서 수정되었습니다.
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Protocol
마우스 하우징 및 조직 수집은 스페인 왕실 법령 53/2013, 유럽 지침 2010/63/EU 및 기타 관련 지침에 따라 Universidad Pablo de Olavide 윤리위원회 (Sevilla, Spain; 프로토콜 24/04/2018/056 및 12/03/2021/033)에서 승인 한 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다.
1. 호흡 분석을위한 주식, 완충액 및 시약의 제조
- 몇 달 동안 표시된 온도에서 보관할 수있는 다음 스톡 솔루션을 준비하십시오. 모든 경우에 초순수 H2O를 사용하십시오.
- 인산완충식염수(PBS) 정제를 H2O(H2O 200 mL당 1정)에 녹여 1x PBS를 제조하였다. 용액을 오토클레이브하고 실온 (RT)에 보관하십시오.
- 2 g의 NaOH 펠렛을 50 mL의 H2O에 녹여 1 M NaOH를 제조하였다.
- pH 교정을 위해 0.1M, 1M, 5M 및 10M KOH 스톡을 준비합니다.
- 14.612 g의 EDTA를 70 mL의 H2O에 첨가하십시오. EDTA가 완전히 용해되도록 pH가 8.0에 도달할 때까지 NaOH 펠렛을 첨가하십시오. H2O 양자 사티스 (QS)를 100 mL에 첨가한다. 생성된 0.5 M EDTA (pH 8) 용액을 오토클레이브하고 RT에 저장한다.
- 70 mL의 H2O에 EGTA 19 g을 첨가한다. EGTA가 완전히 용해될 수 있도록 pH가 8.0에 도달할 때까지 NaOH 펠릿을 첨가한다. H2O QS를 100 mL에 첨가하십시오. 생성된 0.5 M EGTA (pH 8) 용액을 오토클레이브하고 RT에 저장한다.
- 2 mL의 0.5 M EDTA를 98 mL의 PBS에 첨가한다. 결과 10 mM EDTA/PBS 용액을 RT에 저장합니다.
- 5.958 g의 HEPES를 40 mL H2O에 녹입니다. H2O로 KOH 및 QS를 사용하여 pH를 50 mL로 pH를 7.2로 조정하십시오. 생성된 0.5 M HEPES 버퍼를 0.45 μm 메쉬를 통해 여과하고 RT에 저장합니다.
- 3.402 g의 KH2PO4를 최대 50 mL의 H2O에 녹인다. 생성된 0.5 M KH2PO4 용액을 0.45 μm 메쉬를 통해 여과하고 RT에 저장한다.
- 9.521 g의 무수 MgCl2를 최대 100 mL의 H2O. 오토클레이브 결과물을 1 M MgCl2 용액에 용해시키고 RT에 저장한다.
참고 : 이것은 발열 반응이므로 조심스럽게 진행하고 MgCl2 를 얼음에 녹입니다.
- 기질 및 억제제 원액을 준비한다( 표 1 참조). 분취량을 -20°C에 보관한다. 동결-해동 사이클을 피하십시오. 예외적으로 항상 사용 직전에 피루브산을 준비하십시오.
- 초순수 H2O로 준비하십시오: 0.5 M 숙시네이트, 0.5 M 피루브산, 0.5 M 말산, 100 mM ADP, 1 M 아스코르브산, 및 50 mM N,N,N' ,N'-테트라메틸-파라페닐렌-디아민 (TMPD) (빛으로부터 보호).
- 100% 디메틸설폭사이드(DMSO)로 제조: 50 mM 팔미토일-L-카르니틴, 4 mM 로테논, 20 mM 카르보닐 시아나이드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존(FCCP), 4 mM 올리고마이신 및 5 mM 안티마이신 A.
참고: 마이크로플레이트 웰에서 최종 DMSO 농도를 0.1% 초과하지 마십시오. 따라서이 한도 이하로 유지하기 위해 고농축 재고 솔루션을 준비하십시오.
- 실험 당일에 미토콘드리아 분리 및 단백질 정량화를 위해 완충액을 신선하게 준비하십시오. 모든 경우에 초순수 H2O를 사용하고 달리 명시되지 않는 한 모든 버퍼를 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 시간을 절약하기 위해 모든 시약을 칭량하고 전날 적절한 온도에서 적절한 용기(예: 15mL 튜브)에 보관할 수 있습니다.- 10% 유리 지방산(FFA) BSA를 준비하려면 150mg의 FFA BSA를 반전/회전 휠로 H2O 1.5mL에 완전히 녹입니다. 거품을 피하기 위해 와류하지 마십시오.
- 1x 브래드 포드 시약을 준비하려면 5x 상업용 원액을 H2O로 희석하고 RT에서 어둠 속에 보관하십시오.
- 8x 미토콘드리아 버퍼(MB)를 준비하려면 15mL의 H2O에 자당 4.112g과 HEPES 763mg을 녹입니다. pH를 7.2로 조정하고 1.6mL의 10% FFA BSA 및 QS를 H2O로 20mL에 첨가합니다.
- 20 mL의 분리 버퍼 1 (IB1) (샘플 당 4 mL 사용)을 준비하기 위해, 400 μL의 0.5 M EDTA, 784 mg의 D-만니톨 및 2.5 mL의 8x MB를 H2O로 용해시킨다.
- 5 mL의 분리 버퍼 2 (IB2) (샘플 당 500 μL 사용)를 준비하기 위해, 30 μL의 0.5 M EGTA, 196 mg의 D-만니톨 및 625 μL의 8x MB를 4 mL의 H2O에 용해시킨다.
- 5 mL의 재현탁 완충액 (RB) (샘플 당 200 μL 사용)을 준비하기 위해, 수크로오스 120 mg, D-만니톨 191.3 mg, 0.5 M HEPES 50 μL, 및 0.5 M EGTA 10 μL를 H2O의 4 mL에 용해시킨다.
- 2x 미토콘드리아 분석 용액-1 (MAS-1)을 제조하기 위해, 1.199 g의 수크로스, 2.8 g의 만니톨, 1 mL의 0.5 M KH2PO4, 250 μL의 1 M MgCl2, 200 μL의 0.5 M HEPES, 및 100 μL의 0.5 M EGTA를 H2O로 용해시킨다. H2O로 pH를 7.2 및 QS를 25 mL로 조정한다. 단기간 동안 얼음에 보관한다. 더 오랜 기간 동안 강수량을 피하기 위해 4 °C로 유지하십시오.
- 1x 커플링 어세이 배지 (CAM)를 준비하기 위해 두 개의 서로 다른 MAS-1 기반 버퍼를 준비하십시오 : 1) CA 분석을위한 CAM + BSA 적절한, 2) 분석 억제제를 제조하기위한 CAM-BSA. 항상 pyruvate:malate 비율을 10:1로 유지하십시오.
참고: BSA는 주입 포트를 막힐 수 있으므로 BSA가 없는 CAM에서 억제제를 희석하십시오.- CAM+BSA를 제조하기 위해, H2O의 6 mL에 0.5 M 피루브산, 30 μL의 0.5 M 말산 및 7.5 mL의 2x MAS-1을 300 μL로 희석하여 pH를 7.2로 조정한다. 300 μL의 10% FFA BSA 및 QS를 H2O로 15 mL에 첨가하십시오.
- CAM-BSA를 제조하기 위해, 120 μL의 0.5 M 피루브산, 12 μL의 0.5 M 말산, 및 3 mL의 2x MAS-1을 H2O로 희석한다.
- 1x 전자흐름 분석 배지(EFAM)를 준비하기 위해 BSA 함유 및 BSA 프리 EFAM 버퍼를 모두 준비합니다.
- EFAM+BSA를 제조하기 위해, H2O의 6 mL에 0.5 M 피루브산, 60 μL의 0.5 M 말산, 3 μL의 20 mM FCCP 및 7.5 mL의 2x MAS-1을 희석하여 300 μL의 H2O. pH를 7.2로 조정한다. 300 μL의 10% FFA BSA 및 QS를 H2O로 15 mL에 첨가하십시오.
- EFAM-BSA를 제조하기 위해, 120 μL의 0.5 M 피루브산, 24 μL의 0.5 M 말산, 1.2 μL의 20 mM FCCP, 및 3 mL의 2x MAS-1을 H2O의 2 mL로 희석하였다.
- 1x β산화 매질(BOXM)을 준비하려면 BSA 함유 및 BSA 프리 BOXM 용액을 준비하십시오.
- BOXM+BSA를 제조하기 위해, 12 μL의 50 mM 팔미토일-L-카르니틴, 30 μL의 0.5 M 말산, 및 7.5 mL의 2x MAS-1을 7 mL의 H2O에 희석한다. 300 μL의 10% FFA BSA 및 QS를 H2O로 15 mL에 첨가하십시오.
- BOXM-BSA를 제조하기 위해, 4.8 μL의 50 mM 팔미토일-L-카르니틴, 12 μL의 0.5 M 말산, 및 3 mL의 2x MAS-1을 H2O의 2 mL로 희석한다.
2. 근육 해부, 균질화 및 미토콘드리아 분리
- 모든 재료와 버퍼를 얼음 위에 놓습니다. 미토콘드리아를 손상으로부터 보호하기 위해 전체 절차 중에 모든 물질이 얼음처럼 차갑게 유지되는지 확인하십시오.
- 시료당 50mL 비커 3개를 얼음 위에 놓고 비이커 1에 PBS 10mL, 비이커 2에 10mM EDTA/PBS 10mL, 비이커 3에 IB1 4mL를 첨가한다.
- 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사시킨다. 골격근이 저산소증이 되어 호흡 분석을 방해할 수 있으므로 CO2 안락사를 피하십시오.
- 모피가 흘리는 것을 방지하기 위해 오른쪽 뒷다리에 70 % 에탄올을 뿌리고 코르크 해부 보드에 사지를 테이프로 붙입니다. 왼쪽 앞다리에도 테이프를 붙입니다.
- 무릎에서 발끝까지 피부를 통해 멸균 된 일회용 메스로 절개하십시오.
- 발목 높이에서 이빨이 달린 포셉으로 피부를 잡고 발목 주위에 미세한 가위로 자릅니다.
- 한 손에는 미세한 팁 핀셋으로 피부를 기저 근육에서 떼어 내고 다른 손에는 이빨이 달린 포셉으로 잡아 당깁니다.
- 발목에서 무릎까지 모든 골격근을 해부합니다(그림 2).
- 미세 핀셋과 가위를 사용하여 근육 추출을 촉진하기 위해 경골 전방 (TA) 근육 위의 모든 결합 조직을 제거하십시오.
- EDL 근육의 네 개의 원위 힘줄을 찾아 발가락에 삽입하는 것과 가깝게 단면화하십시오. TA 원위 힘줄을 찾아 항상 발목 아래에있는 삽입에 가깝게 자릅니다.
- TA와 EDL 힘줄을 발목 위로 조심스럽게 당겨 느슨한 끝을 풀어줍니다.
- 힘줄의 느슨한 끝을 잡고 근육과 뼈의 나머지 부분으로부터 근육을 위로 당겨서 완화시킵니다. 과정을 용이하게하기 위해 미세한 핀셋이나 가위를 사용하십시오. 근섬유 수축을 피하기 위해주의해서 진행하십시오.
- EDL과 TA 근육의 근위 힘줄을 무릎 꿇기에 최대한 가깝게 자릅니다.
- 마우스를 거꾸로 뒤집어 위장관 (GA) 및 발바닥 근육 추출을 진행하십시오.
- 이두박근 대퇴골과 GA 사이에 형성된 포켓을 이빨이 달린 포셉으로 잡으십시오. 미세한 가위를 사용하여 이러한 근육을 분리하고 근위 GA 힘줄을 시각화하십시오.
- 아킬레스 건을 미세한 포셉으로 잡고 조심스럽게 미세한 가위로 자릅니다. GA와 발바닥 근육을 힘줄을 통해 위로 당겨 기본 뼈에서 풀어줍니다. 근위 GA 힘줄을 잘라 밑창과 함께 풀어줍니다.
- 뼈 만 남을 때까지 동일한 절차에 따라 힘줄에서 힘줄까지 남아있는 근육을 조심스럽게 해부하십시오.
- 마우스를 초기 위치에 다시 고정하여 대퇴사두근 근육을 해부합니다.
- 치아가 달린 포셉과 미세한 가위를 사용하여 근위 측의 대퇴사두근 위에 지방 조직을 버리십시오.
- 대퇴사두근과 대퇴골 사이에 미세한 핀셋을 삽입하고 대퇴골 축을 따라 양방향으로 움직여 뼈에서 근육을 분리하십시오.
- 치아가 달린 포셉으로 원위 대퇴사두근 근육 힘줄을 잡고 무릎 뚜껑에 가능한 한 가깝게 미세한 가위로 힘줄을 자릅니다.
- 대퇴사두근을 위로 당기고 미세한 가위로 근위 삽입시 해방하십시오.
- 왼쪽 뒷다리로 이 섹션의 4-8단계를 반복합니다.
- 비커 1의 모든 근육을 먼저 헹구고 비커 2에서 헹구십시오.
- 모든 근육을 비커 3로 옮기고 얼음 위에 날카로운 가위로 모든 근육을 곱게 다듬습니다.
- 현탁액을 C 튜브 (보라색 뚜껑)로 옮기고 항상 얼음 속에 보관하십시오.
- C 튜브를 단단히 닫고 균질 화기의 슬리브에 거꾸로 부착하십시오. 샘플 재료가 회전자/고정자 영역에 있는지 확인하십시오. m_mito_tissue_01라는 1분 프로그램을 선택합니다.
- 균질액을 2 mL 예비 냉각된 마이크로원심분리 튜브 2개로 나누고, 탁상 원심분리기에서 4°C에서 10분 동안 700 × g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 새로운 2 mL 예비 냉각 튜브로 옮겨 지방과 균질화되지 않은 조직을 조심스럽게 피하십시오. 단편화 순도 결정(분획 N)을 위해 펠렛을 -80°C에서 보관한다(그림 3).
- 상층액을 4°C에서 10분 동안 10,500 × g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 새로운 2 mL 예냉 튜브로 옮기고 상청액 번호 1 (SN1)로 표시하십시오. 단편화 순도 결정을 위해 -80°C에 보관하십시오(그림 3).
- 두 펠렛을 얼음 중에 500 μL의 IB2의 총 부피로 재현탁하고 결합시킨다.
- 4°C에서 10분 동안 10,500 × g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 새로운 2 mL 예비냉각된 튜브로 옮기고 상청액 번호 2(SN2)로 라벨을 붙인다. 단편화 순도 결정을 위해 -80°C에 보관하십시오(그림 3).
- 최종 미토콘드리아 펠렛을 200 μL의 RB에 재현탁시킨다. 단백질 정량화를 위해 신속하게 10 μL를 따로 떼어놓고 손상을 방지하기 위해 나머지 미토콘드리아 현탁액에 10% FFA BSA 10 μL를 즉시 첨가한다.
- 브래드포드 분석법을 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오.
- 표준 곡선을 위해, RB 완충액 중의 단백질의 공지된 농도의 30 μL의 연속 희석물을 준비한다. 예를 들어, 1 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.125 mg/mL, 0.0625 mg/mL 및 0 mg/mL의 BSA를 사용하십시오.
- RB 완충액에서 미토콘드리아 샘플의 1:3 및 1:6 연속 희석물을 준비한다.
- 96웰 플랫 바닥 플레이트에서 웰당 2.5μL의 샘플/표준을 먼저 로드합니다. 다음으로, 10 μL의 1 M NaOH를 각 샘플에 첨가하고, 마지막으로 200 μL의 1x 브래드포드 시약을 첨가한다. 기포를 피하면서 잘 섞으십시오. 샘플의 색상이 교정 라인 내에 있는지 시각적으로 확인하십시오. 항상 분석을 세 배로 수행하십시오.
- 플레이트를 어둠 속에서 RT에서 5분 동안 인큐베이션하고, 마이크로플레이트 분광광도계에서 595 nm에서 흡광도를 판독하였다.
- 이 섹션에서 단계 22.1에서 제조된 희석액의 흡광도 값(y축) 대 상응하는 단백질 농도(x축)를 플롯팅하여 표준 곡선을 계산합니다.
- 표준 곡선으로 외삽하여 미토콘드리아 샘플에서 단백질의 총량을 계산하십시오.
3. 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석법의 제조
- 실험 최소 12시간 전에 호흡 분석 센서를 웰당 1 mL의 교정 버퍼로 수화시킨다. 37°C에서 인큐베이션한다(CO2 없음).
참고: 수화 센서는 최대 72시간 동안 사용할 수 있습니다. 이 단계에서 카트리지는 신중하게 다루어야 합니다: 센서에 닿는 것이 있으면 측정 감도가 영향을 받을 수 있습니다. - 분취용 원심분리기를 4°C에서 스윙 버킷 마이크로플레이트 로터 및 대응하는 마이크로플레이트 어댑터로 미리 냉각시킨다.
- 컴퓨터를 켜고 분석 소프트웨어를 연 다음 원하는 프로토콜을 선택합니다.
참고: 소프트웨어가 산소 소비량 측정 장비에 연결되면 클릭이 들립니다. 가열 센서는 실험이 시작되기 전에 녹색이어야하며 37 °C에 있어야합니다. - 수행될 검정에 따라 섹션 1, 단계 2에 지시된 스톡으로부터 억제제 용액을 준비한다. 각 솔루션에 대해 충분한 볼륨을 준비하십시오. 참고로 표 1 및 표 2 를 참조한다.
- 각 포트에 각 억제제의 적절한 부피를 추가하고 카트리지를 산소 소비량 측정 장비에 삽입한 다음 교정을 시작합니다.
주: 카트리지에 억제제를 추가하고 카트리지를 기기에 삽입하는 데 15-20분이 걸립니다. 올바른 카트리지 구성 요소가 도입되었는지 확인하십시오. 카트리지 뚜껑과 하이드로 부스터는 센서 카트리지 및 유틸리티 장소가 필요한 동안 폐기 될 수 있습니다. - 섹션 2, 단계 21의 농축된 미토콘드리아 현탁액을 4°C에서 10분 동안 10,500 × g 에서 원심분리한다.
- 수행될 프로토콜에 따라 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA 또는 1x BOXM+BSA의 100μL에 미토콘드리아 펠릿을 재현탁시킨다.
- 농축된 미토콘드리아 샘플을 상응하는 분석 배지에서 최종 0.2 μg/μL 농도로 더 희석한다.
- 웰 당 현탁액 50 μL(단백질의 총 10 μg)를 얼음 상에서 미리 냉각된 24-웰 마이크로플레이트에 시드한다. 배경 교정 우물에 미토콘드리아를 추가하지 마십시오; 상응하는 분석 배지만 첨가한다. 단편화 순도 결정을 위해 남아있는 미토콘드리아 현탁액을 -80°C에서 보관한다(도 3).
- 마이크로플레이트를 4°C에서 20분 동안 2,000 × g 에서 예비냉각된 분취용 원심분리기에 스핀핑한다. 그에 따라 균형을 맞추기 위해 카운터 웨이트.
- 마이크로플레이트 원심분리 동안 나머지 분석 배지를 37°C에서 가온한다.
- 원심분리 후, 마이크로플레이트를 5분 동안 벤치에 두어 평형화시킨다. RT에서 웰 당 500 μL의 최종 부피를 위해 450 μL의 따뜻한 분석 배지를 첨가한다. 천천히 조심스럽게 미토콘드리아가 분리되는 것을 피하기 위해 우물 벽에 배지를 추가하십시오.
- 마이크로플레이트를 뚜껑이 없는 산소 소비량 측정기에 즉시 놓고 프로토콜을 시작하십시오(표 3). 첫 번째 단계는 마이크로플레이트를 따뜻하게 하기 위해 10분 인큐베이션인지 확인하십시오.
- 실험이 완료되면 카트리지와 마이크로플레이트를 제거하고 기기를 끄고 분석을 시작합니다.
4. 결과 분석
- CA 및 BOX 분석의 경우 다음 분석을 수행합니다.
- 비미토콘드리아 O2 소비량을 기록하며, 이는 안티마이신 A 및 로테논 주사 후에 수득된 값의 평균에 해당한다.
참고: 안티마이신 A와 로테논은 각각 콤플렉스 III 및 I 억제제이다. - 기본 값에서 미토콘드리아 O2 소비량을 빼서 기본 호흡을 계산합니다(측정 지점 1 및 2).
- 미토콘드리아 상태 III을 결정하기 위해 복합 V 기질 ADP(주입 A)의 주입 후 값으로부터 비미토콘드리아 O2 소비량을 뺍니다.
- 콤플렉스 V 저해제 올리고마이신(주사 B)의 주사 후 호흡 값으로부터 비미토콘드리아 O2 소비량을 뺀 후 미토콘드리아 상태 IVo를 얻는다.
- 호흡 후 FCCP 주입 (주입 C)에서 비 미토콘드리아 O2 소비를 공제하여 미토콘드리아 상태 IIIu를 계산하십시오.
참고: FCCP는 강력한 미토콘드리아 산화 인산화 언커플러입니다. ATP 합성은 그 존재하에 우회되고, ETC는 최대 활성을 달성한다. - 미토콘드리아 상태 IIIu 값에서 기저 호흡 값을 빼서 미토콘드리아 예비 용량을 얻는데, 이는 에너지 수요가 증가할 경우 추가 ATP를 생성할 수 있는 용량입니다.
- 미토콘드리아 상태 IIIu를 상태 IVo 값으로 나누어 호흡 조절 비율(RCR)을 구한다.
참고: 음수 또는 null RCR 값은 미토콘드리아 결합이 영향을 받는다는 것을 나타냅니다.
- 비미토콘드리아 O2 소비량을 기록하며, 이는 안티마이신 A 및 로테논 주사 후에 수득된 값의 평균에 해당한다.
- EFA를 참조하여 다음 계산을 수행합니다.
- 로테논 및 안티마이신 A 주사 후 평균값을 계산하여 잔류 활성을 구한다(주사제 A 및 C).
- 기초 값에서 잔류 활성을 빼서 복합 I 대 IV (CI-CIV) 활성을 계산합니다 (측정 지점 1 및 2).
- CII 기질 숙시네이트(주입 B)의 주입 후 값으로부터 잔류 활성을 뺀 값으로 CII-CIII-CIV 활성을 얻는다.
- 시토크롬 c환원제, 아스코르브산 및 TMPD(주입 D)를 주입한 후 얻은 값으로부터 잔류 활성을 공제하여 CIV 활성을 계산한다.
- 그림 4에서와 같이 막대 플롯을 사용하여 모든 결과를 나타내어 적절한 결론을 추출합니다.
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Representative Results
여기에 제시된 프로토콜은 마우스 골격근으로부터 미토콘드리아의 분리를 통해 미토콘드리아 호흡의 생체내 분석을 허용한다. 이 방법의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 뒷다리에서 골격근을 해부한 후(그림 2), 조직은 등장성 조건 하에서 직렬 원심분리를 통해 균질화되고 미토콘드리아가 정제됩니다. 단리 과정 동안 수득된 상이한 분획의 순도는 상이한 소기관 마커에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석될 수 있다. 도 3A는 단리된 분획에서 별개의 단백질 집단을 나타내는 상이한 분획으로부터의 일반적인 단백질 프로파일을 도시한다.
도 3B는 모든 미토콘드리아 함량이 미토콘드리아 분획 내에 있다는 것을 보여주며, 이는 미토콘드리아 분획 외부(VDAC 및 TOMM20) 및 내부(TIMM23)의 마커에 대한 강한 신호에 의해 입증되며, 심지어 핵-관련 단백질(mtTFA)에 대해서도 그러하다. 모든 핵 및 세포 골격 (β-actin)은 핵 및 파괴되지 않은 물질을 나타내는 분획 N에 존재합니다 (그림 3C). 더욱이, 대부분의 소포체(ER)(칼넥신), 원형질막(Na+/K+-ATPaseα1) 또는 세포질 마커(LDHA, HSP70 또는 AKT)는 SN1 또는 SN2 분획에 남아 분리시 얻어진 고순도를 강조한다(도 3C). 그러나, 미토콘드리아 분획에는 ER 오염의 흔적이 몇 가지 있는데, 아마도 이러한 소기관의 근접성 때문일 수 있다. 후속 호흡 분석에서 얻은 결과를 감안할 때, 여기에 설명 된 분리 절차는 매우 순수하고 실행 가능한 미토콘드리아 제제를 산출합니다.
CA 및 BOX 분석 모두 특정 대사 경로를 자극하는 여러 기질의 존재하에 다른 미토콘드리아 상태의 계산을 허용합니다. 구체적으로, 이들 검정은 피루브산 또는 팔미토일-L-카르니틴 클로라이드의 존재 하에 수행된다. 피루브산은 크렙스 사이클의 기질이고; 말산은 크렙스 사이클 중간체 및 NADH 인덕터인 반면, 팔미토일-L-카르니틴은 지방산 β산화 경로의 기질이다. (도 4A,B). 두 분석 모두에서, 측정될 수 있는 첫 번째 상태는 기저 호흡률이며, 이는 분석 매질에 초기에 첨가된 기질의 존재 하에서의 미토콘드리아 호흡을 나타낸다. 이어서, 미토콘드리아 상태 III이 달성되고, 이는 ADP 및 무기 포스페이트로부터의 ATP 생산을 나타내며, 결합된 상태에서 최대의 호흡을 나타낸다. 따라서, 도 4A, B에서 관찰된 바와 같이 ADP 첨가 후 산소 소비의 증가가 존재한다.
또한, 상태 IVo는 올리고마이신에 의한 ATP 합성효소의 억제와 관련된 양성자 누출을 나타내며, 이는 CA 및 BOX 그래프에서 관찰된 바와 같이 호흡의 감소를 유도한다(도 4A, B). FCCP의 첨가는 상태 IIIu로 이어지며, 이는 산소 소비가 이러한 분석에서 최고 수준에 도달했을 때 미토콘드리아가 결합되지 않은 상태에서 나타낼 수 있는 최대 호흡 능력을 보여준다. 이러한 모든 상태를 계산하려면 먼저 산화 호흡을 억제하기 위해 안티마이신 A와 로테논을 주입 할 때 분석이 끝날 때 얻어지는 비 미토콘드리아 호흡을 결정하는 것이 기본입니다. 도 4A,B에 도시된 바와 같이, 이들 값은 항상 기저 호흡 아래에 있어야 하며, 여기에 설명된 바와 같이 단리된 미토콘드리아를 사용한 분석의 경우 0에 매우 근접해야 한다. 마지막으로, RCR 파라미터는 미토콘드리아 완전성을 평가하기 위해 계산되어야 한다. 그것은 미토콘드리아가 낮은 양성자 누출로 높은 속도로 ATP를 생산함으로써 ADP에 반응 할 수 있는지 여부를 반영합니다. CA 및 BOX 분석에서 발견된 평균 RCR 값은 각각 5.78 ± 1.03 및 3.47 ± 0.42 (그림 4A, B)였으며, 이는 이전에 보고된 최적 RCR과 일치합니다21,22,23,24.
추가적으로, EFA는 특정 기질 및 억제제의 주입을 통해 개별적으로 또는 조합하여 ETC 복합체의 활성을 검사한다(도 4C). CI-CIV 활성은 복합체가 억제되지 않을 때 피루베이트 및 말레이트 기질에 기초한 미토콘드리아 호흡을 나타내고; 이 경우 대부분의 전자는 CI를 통과합니다. 로테논은 CI의 특정 억제제이기 때문에, CI는 그것의 첨가 후에 차단되어, 산소 소비를 감소시킨다 (도 4C). CII-CIII-CIV 활성은 CI만이 차단되고 CII가 활성화될 때 호흡을 나타낸다: 포트 B를 통해 주입된 숙시네이트는 콤플렉스 II(숙시네이트 데하이드로게나제)의 특정 기질이다. 따라서, CII는 감소되어 CII에서 CIV로의 전자 흐름을 개시하는 반면, CI는 이전의 로테논 주입에 의해 여전히 억제되어 산소 소비의 증가를 일으킨다(도 4C). 안티마이신 A 또한 CIII를 억제하여 ETC를 통한 전자 흐름을 차단하고 산소 소비를 줄입니다. 또한, CIV 활성은 아스코르브산/TMPD의 첨가에 의해 감소된 후 시토크롬 C 산화에 의해 자극될 때 결정된다; 도 4C는 CIV 활성화가 산소 소비의 증가를 생성한다는 것을 보여준다. 마지막으로, 잔류 활성은 산화적 인산화 사슬이 로테논 및 안티마이신 A 첨가 후 불활성화될 때의 산소 소비를 지칭한다. 이 값은 섹션 4의 프로토콜 단계 2.2-2.4에 표시된 대로 복합체의 활성 계산에 대한 배경을 설정합니다.
그림 1: 방법의 개략적인 시각화. 약어: OCR = 산소 소비율; ADP = 아데노신 디포스페이트; OL = 올리고마이신; FCCP = 카르보닐 시아나이드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존; AntA = 안티마이신 A; Rot = 로테논. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 미토콘드리아 호흡 분석을 위해 뒷다리에서 뮤린 골격근의 해부 및 분리 . (A) 오른쪽 뒷다리를 늘려 테이프로 고정시켰다. (B) 발목 옆에서 피부를 통해 절개하여 무릎에 가까운 부분을 멈췄다. TA를 덮고 있는 결합 조직은 조심스럽게 제거하였다. EDL(C) 및 TA(D) 힘줄은 그들의 삽입에 가깝게 절편화되었다. TA 힘줄을 잡아 당겨 근육을 기저 근육과 뼈로부터 떼어놓았다. 이어서, TA를 경골에 근접하여, 복부 볏에 근접하게 절단하였다. 마찬가지로, EDL 근육은 완화되었고, 근위 힘줄은 무릎 옆에서 꼼꼼하게 절단되었습니다. (F) TA 및 EDL 해부 후 오른쪽 뒷다리. (G) 후부 뒷다리에서, 아킬레스 힘줄은 GA와 발바닥 근육을 해부하기 위해 절개되었다. (H) GA와 발바닥은 경골에서 조심스럽게 해방되었다. (I) 나머지 근육은 비골과 경골 뼈 만 남을 때까지 발목에서 무릎까지 수집되었습니다. (J) 해부 후 뒷다리. (K) 대퇴사두근을 해부하였다. (L) 후부 미토콘드리아 분리를 위해 수집된 모든 골격근. 이 과정은 양쪽 뒷다리에 대해 수행되었다. 약어: TA = 경골 전방; EDL = 신근 디지토럼 경도; GA = 위장관 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 단편화 과정의 순도 . (A) 쿠마시 블루로 염색된 일반 단백질 프로파일. (b) 미토콘드리아 단백질 순도 프로파일. (C) 비미토콘드리아 마커. 미토콘드리아 단리 동안 수득된 상이한 분획을 로딩하고, 특정 세포내 분획에서 상이한 단백질에 대한 항체와 함께 인큐베이션하였다. 약어: 분획 N = 비균질화된 조직 및 핵; SN1 = 상청액 번호 1: 세포질 + 소기관; SN2 = 상청액 번호 2: 세포질 + 소기관; VDAC = 전압-의존적 음이온 채널; TOMM20 = 외부 미토콘드리아 막의 횡단 20; mtTFA = 미토콘드리아 전사 인자 A; TIMM23 = 미토콘드리아 내부 막의 횡단체 23; LDHA = 락테이트 데하이드로게나제 A; HSP70 = 열충격 단백질 70; ER = 소포체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대표적인 결과. 13개월 된 수컷 야생형 C57BL/6N 마우스의 뒷다리 근육으로부터 분리된 미토콘드리아의 생체에너지 프로파일링. 상이한 기질 및 억제제의 주입 지점은 각각의 검정에 표시된다. ETC 및 OXPHOS 기계의 성능은 각각 FA 분석(B)의 커플링 어세이 (A) 또는 β산화에서 기질로서 피루베이트와 말레이트, 또는 팔미토일-L-카르니틴 및 말레이트를 사용하여 분석할 수 있다. (C) 전자 유동 분석은 피루베이트, 말레이트 및 FCCP의 존재하에 개별 미토콘드리아 복합체의 연구를 허용한다; 10 μg의 미토콘드리아를 웰 당 플레이팅하였다. 결과는 집계된 형태로 결과를 시각화하기 위해 중간점 표현 옵션 다음에 표시됩니다. 이는 지점 간 옵션과 대조적으로, 각 측정 단계에서 일반적으로 수행되는 9개의 연속 측정값을 시각화할 수 있습니다. 시각화의 유형은 분석 소프트웨어의 키네틱 꺾은선형 차트 옵션에서 분석을 완료한 후 변경할 수 있습니다. 약어: FA = 지방산; OCR = 산소 소모율; ADP = 아데노신 디포스페이트; FCCP = 카르보닐 시아나이드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존; RCR = 호흡 조절 비; EFA = 전자 유동 분석; BOX = FA의 산화 β. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 커플링 분석 | ||||||
| 항구 | 억제제 | [재고] | [주입 포트] | [결승전] | 처방 | |
| 인히브 | 캠 - 바사 | |||||
| A | 증권 시세 표시기 | 100 밀리미터 | 50 밀리지미터 | 5 밀리지미터 | 650 μL | 650 μL |
| B | 올리고마이신 | 4 밀리지미터 | 31.6 μM | 3.16 μM | 11.3 μL | 1418.7 μL |
| C | 증권 시세 표시기 | 20 밀리지미터 | 60 μM | 6 μM | 4.68 μL | 1555.32 μL |
| D | 안티마이신 A // 로테논 | 5 밀리젼 // 4 밀리세컨드 | 40 μM // 50 μM | 4 μM // 5 μM | 13.52 μL // 21.12 μL | 1655.36 μL |
| 전자 흐름 분석 | ||||||
| 항구 | 억제제 | [재고] | [주입 포트] | [결승전] | 처방 | |
| 인히브 | EFAM-BSA | |||||
| A | 로테논 | 4 밀리지미터 | 50 μM | 5 μM | 16.25 μL | 1283.7 μL |
| B | 숙시네이트 | 500 밀리가바이트 | 100 밀리미터 | 10 밀리지미터 | 286 μL | 1144 μL |
| C | 항 마이신 A | 5mM | 4 μM | 4 μM | 12.48 μL | 1547.5 μL |
| D | 아스코르베이트 // TMPD | 1 M // 50 mM | 100 mM // 1 mM | 10 mM // 100 μM | 169 μL // 33.8 μL | 1487.2 μL |
| β산화 분석 | ||||||
| 항구 | 억제제 | [재고] | [주입 포트] | [결승전] | 처방 | |
| 인히브 | 박스 - BSA | |||||
| A | 증권 시세 표시기 | 100 밀리미터 | 40 밀리지미터 | 4 밀리지미터 | 520 μL | 780 μL |
| B | 올리고마이신 | 4 밀리지미터 | 31.6 μM | 3.16 μM | 11.3 μL | 1418.7 μL |
| C | 증권 시세 표시기 | 20 밀리지미터 | 60 μM | 6 μM | 4.68 μL | 1555.32 μL |
| D | 안티마이신 A // 로테논 | 5 밀리젼 // 4 밀리세컨드 | 40 μM // 20 μM | 4 μM // 2 μM | 13.52 μL // 8.45 μL | 1668 μL |
표 1: 상이한 검정을 위한 억제제 용액의 제조. [스톡] 컬럼은 억제제 컬럼에 표시된 화합물의 스톡 용액의 농도를 나타낸다. [주입 포트] 는 카트리지의 다른 포트에 로딩되는 억제제 용액의 농도를 나타내는 반면, [최종] 컬럼은 웰 내의 억제제의 최종 농도를 나타낸다. 마지막으로, 레시피 열은 주입 포트에 로딩될 용액을 준비하기 위해 혼합되어야 하는 스톡 억제제 용액과 BSA가 없는 배지의 부피를 지정합니다. 약어: ADP = 아데노신 디포스페이트; FCCP = 카르보닐 시아나이드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존; TMPD = N,N,N' ,N'-테트라메틸파라페닐렌디아민; 인히브 = 억제제; BSA = 소 혈청 알부민; CAM-BSA = BSA 무결합 분석 매질; EFAM-BSA = BSA 프리 전자 유동 분석 매질; BOX-BSA = BSA가 없는 지방산 분석 매질의 무함유 β산화.
| 항구 | 주입된 부피 | 재고 준비 (26 웰) |
| A | 50 μL | 1300 μL |
| B | 55 μL | 1430 μL |
| C | 60 μL | 1560 μL |
| D | 65 μL | 1690 μL |
표 2: 주입 부피의 계산.
| 행동 | 시간(분) | 반복 | 항구 |
| 구경을 재다 | 15-20 | ||
| 기다림 | 10 | ||
| 믹스 + 대기 | 1 + 3 | × 2 | |
| 섞다 | 1 | ||
| 측정 + 혼합 | 3 + 1 | × 2 | |
| 주입 | A | ||
| 섞다 | 1 | ||
| 치수를 재다 | 3 | ||
| 섞다 | 1 | ||
| 주입 | B | ||
| 섞다 | 1 | ||
| 치수를 재다 | 3 | ||
| 섞다 | 1 | ||
| 주입 | C | ||
| 섞다 | 1 | ||
| 치수를 재다 | 3 | ||
| 섞다 | 1 | ||
| 주입 | D | ||
| 혼합 + 측정 | 1 + 3 | × 2 |
표 3: 상이한 검정에 대한 프로토콜 설정.
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Discussion
미토콘드리아 호흡을 연구하는 데 사용되는 모든 방법에는 한계가 있습니다. 따라서 특정 실험 질문에 가장 적합한 방법을 선택하는 것이 중요합니다. 이 연구는 미토콘드리아 기능을 조사하기 위해 다양한 호흡 분석을 수행하기 위해 마우스 골격근에서 미토콘드리아를 분리하는 업데이트되고 상세한 프로토콜을 제공합니다. 실제로, 마이크로플레이트 기반 기술을 사용하여 분리된 미토콘드리아에서 미토콘드리아 생물에너지학에 대한 연구는 재현성, 신뢰성 및 복잡성 측면에서 조직 특이적 호흡을 연구하는 데 가치가 있습니다. 또한, 분리된 미토콘드리아의 사용은 기질 가용성에 대한 통제력을 부여하여, 근본적인 생물학적 과정에 대한 이해를 용이하게 한다. 단리된 미토콘드리아를 사용하는 또 다른 긍정적인 측면은 대부분의 막횡단 ATPases가 손실됨에 따라 ADP 주사 후 생성된 ATP가 새로운 ADP로 다시 전환되지 않기 때문에 상태 III을 연구할 수 있다는 것이다. 더욱이, 본원에 기재된 분석에서, 올리고마이신은 잠재적인 비특이적 ATP 합성을 차단하기 위해 첨가된다20.
이 프로토콜에 대해 몇 가지 중요한 고려 사항을 강조 표시해야 합니다. 첫째, 고립 된 미토콘드리아는 매우 민감하므로 조심스럽게 다루어야합니다. 사용된 완충액 중의 수크로오스 및 만니톨의 높은 함량은 분리된 미토콘드리아를 손상으로부터 보호하기 위한 최적의 삼투압 조건을 보장한다. 그럼에도 불구하고, 분석 기간은 미토콘드리아 생존력을 보존하고 일단 시딩되면 마이크로플레이트로부터의 분리를 방지하기 위해 최소한으로 유지되어야 한다. 따라서, 분석 매질 및 기질 및 억제제 용액의 제조, 또는 호흡 분석 카트리지 내의 억제제의 로딩과 같은 프로토콜 단계가 시간이 많이 걸린다는 점을 감안할 때, 모든 단계는 완벽하게 조정되어야 한다. 또한, 효소 소화21,24 및 모르타르 및 페슬 균질화17,19,21,23,24에 기초한 다른 방법과는 달리, 여기에 기술된 방법은 자동화된 균질화기의 사용에 의존하여, 빠르고 효율적인 샘플 균질화를 가능하게 한다. 중요하게도, 미토콘드리아 현탁액은 고도로 농축되면 덜 민감합니다. 따라서 희석액을 사용하기 직전에 희석액 만 준비하십시오. 마지막으로, 적절한 호흡 측정 분석 중에 신속하게 작업하는 것이 필수적입니다. 보통, 이러한 분석에서 배양물에서 세포를 분석할 때, 기질 또는 억제제의 주입 후 세 번의 연속 측정 단계가 수행되며, 이로 인해 40분에서 50분 사이에 연장되는 프로토콜이 생기며, 전체 절차 전반에 걸쳐 격리된 미토콘드리아의 생존 가능성을 보장하기 위해, 측정 단계의 수는 종종 그들의 취약성으로 인해 최소한으로 유지된다19, 23,25, 호흡 분석을 완료하는 데 걸리는 시간을 ~ 20 분으로 줄입니다. 이 작업(표 3)에 설명된 프로토콜은 이전에 발표된 다른 방법들이 더 길고 더 많은 표준 측정 단계26을 갖는 효율적인 OCR 프로파일을 보고함에도 불구하고 이러한 추세를 따른다.
예를 들어, 두 개의 연속 분석이 같은 날에 동일한 샘플 세트로 실행될 경우, 미토콘드리아 희석을 제외한 첫 번째 분석 동안 두 번째 분석을 위한 모든 시약을 준비하십시오: 계측기가 교정되는 동안 두 번째 분석을 시작하기 직전에 희석, 시드 및 스핀 미토콘드리아만 사용하십시오. 일단 실험이 완료되면, 사용된 미토콘드리아 제제의 품질을 평가하기 위해 RCR 파라미터(섹션 4, 단계 1.7)를 계산해야 한다. 보통, RCR 값 3.5와 5 사이의 RCR 값은 미토콘드리아 완전성이 최적이며 기능적 결합 산화 호흡을 나타낸다는 것을 나타낸다25. RCR 값이 낮은 검정은 격리 중에 미토콘드리아 무결성이 손상되었기 때문에 폐기해야 합니다. 이러한 경우, 이전에 보고된 바와 같이, 미토콘드리아 펠릿을 두 번 세척하는 것을 고려한다(섹션 2, 단계 19-21)22.
둘째, 절차 전반에 걸쳐 올바른 pH를 유지하는 것이 성공적인 결과를 얻는 데 중요합니다. 모든 용액의 pH가 표시된 바에 따라, 즉 pH 7.2로 설정되고, 달리 언급되지 않는 한 pH가 항상 KOH로 조정되는지 확인하십시오. 특히, BSA 함유 완충액의 pH는 BSA가 프로브를 손상시킬 수 있으므로 pH 측정기로 직접 측정해서는 안됩니다. 따라서, BSA를 추가하기 전에 상응하는 완충액에서 pH를 조정한다. BSA 첨가로 인한 pH의 변화를 피하려면 항상 FFA BSA를 사용하십시오. 또한, 일부 초순수 H2O 배치는 산성일 수 있으므로 상업적으로 정제된 pH 7 H2O를 사용하는 것이 좋습니다. 또한 pH 측정기가 올바르게 교정되고 준비 할 화학 물질의 pH를 측정하는 데 적절한 모델인지 확인해야합니다.
셋째, 미토콘드리아 파괴를 방지하기 위해 최종 미토콘드리아 현탁액의 단백질 측정을 위한 시료 수집 단계(섹션 2, 단계 21)를 정확하게 수행하는 것이 중요하다. 펠렛을 신속하고 철저하게 재현탁하고, 분취량을 수집하고, 남은 현탁액에 FFA BSA를 첨가하여 삼투 균형을 보존하고 미토콘드리아를 손상으로부터 보호하십시오. FFA BSA가 이미 재현탁 완충액에 존재한다면, 따라서 단백질 정량화 동안, 높은 단백질 함량은 정량화 결과를 혼동할 것이다. 이것이 FFA BSA가 정량화를 위해 분취량을 따로 설정 한 후에 추가되어야하는 이유입니다.
넷째,이 방법은 매우 다양하며 실험자의 요구에 맞게 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 연구 중인 동물 모델이 감소된 근육 질량(예를 들어, 유육종성 마우스)을 특징으로 하는 경우, 추가적인 근육은 미토콘드리아 수율을 증가시킬 수 있다. 성인 야생형 수컷 C57BL/6N 마우스가 이 작업에 사용되었지만, 성별, 연령 또는 유전적 배경과 특정 근육 유형의 동물을 대신 사용할 수 있습니다.
다섯째, 호흡기 값은 매번 신선하게 준비해야하는 완충제와 시약의 조성에 약간의 변화로 인해 실험마다 다를 수 있습니다. 나이, 성별, 유전 적 배경 또는 환경 조건도 결과에 중대한 영향을 줄 수 있습니다. 그러나 성공적인 실험은 ADP 및 숙시네이트와 같은 복합 기질의 주입 후 산소 소비의 증가, 올리고마이신 또는 로테논과 같은 억제제의 주입 후 감소, 그리고 강력한 언커플러 FCCP가 첨가 될 때 현저한 증가를 나타내야합니다. 또한, 높은 기술적 변동성을 방지하기 위해, 마이크로플레이트에 시딩하기 전에 균질한 현탁액을 얻기 위해 미토콘드리아 펠릿의 철저한 재현탁을 보장하십시오.
여섯째, 기저 호흡 값이 낮 으면 시딩을위한 단백질의 양을 조정하기 위해 적정 실험을 수행하는 것을 고려하십시오. 마지막으로,이 연구는 조질 미토콘드리아 추출물을 얻는 방법을 제공하기 때문에 다른 소기관, 주로 ER과 관련된 특정 등급의 불순물이 예상됩니다. 이러한 불순물을 제거하는보다 공격적인 단편화 과정은 미토콘드리아 생존력에 해로울 수 있으며 호흡 분석의 수행을 방해합니다. 순도가 우려되는 경우, 특히 샘플 간에 일관성이 없는 경우, 분석 결과는 다른 소기관 마커에 대해 웨스턴 블롯을 실행한 후 미토콘드리아 순도에 대해 정규화될 수 있습니다(그림 3). 우리의 지식에 따르면, 이것은 조 추출물의 미토콘드리아 순도에 대한 우려를 강조하는 첫 번째 방법입니다. 보통, 분리된 미토콘드리아를 사용한 호흡 측정법을 위한 다른 프로토콜에서, 동일한 양의 미토콘드리아가 모든 경우에 사용된다고 가정할 때, 동일한 양의 단백질 추출물이 샘플을 비교하기 위해 웰에 시딩된다. 이는 분리가 모든 샘플에서 병렬로 수행된다는 점을 고려하면 합리적인 가정입니다. 그러나, 연구중인 샘플의 유전 적 또는 환경 적 배경은 미토콘드리아 추출물의 순도에 상당한 차이를 초래할 수 있습니다. 예를 들어, 주어진 유전 적 돌연변이가 세포질 ER의 발달을 증가시키는 경우,이 동물로부터의 조질 미토콘드리아 추출물은 예상보다 큰 ER 함량을 포함 할 수 있으며, 결과적으로 예상보다 낮은 미토콘드리아 단백질을 포함 할 수 있습니다. 따라서, 대조군 및 돌연변이 샘플로부터의 동일한 양의 총 단백질이 마이크로플레이트에 시딩되더라도, 돌연변이체의 산소 소비는 과소평가될 것이다. 따라서 연구중인 모든 조건의 추출물의 순도를 결정해야합니다. 값을 비교할 수 있는 경우 정규화가 필요하지 않습니다. 그러나 샘플 간의 순도 값이 실험자가 기꺼이 받아 들일 수있는 통계적 오차를 넘어 상당히 다른 경우 산소 소비 결과를 정상화하는 데 사용해야합니다.
본 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 참고로, 이 방법은 마우스로부터 분리된 골격근 조직에 최적화되었다. 다른 종의 다른 조직이나 골격근을 사용하는 경우 조정이 필요할 수 있습니다. 또한, 분리 된 미토콘드리아에 대한 분석이 수행 될 때, 정상적인 세포 미세 환경은 세포 맥락 및 미토콘드리아와 상호 작용할 수있는 다른 소기관의 부재로 인해 손실됩니다. 이것은 생리적 조건에서 약간 벗어난 결과로 이어질 수 있습니다. 마지막으로, 미토콘드리아가 원심 분리됨에 따라, 그들은 우물의 바닥에 달라 붙습니다. 완전히 필요하지만, 원심분리가 정상 상태에 미치는 잠재적 영향은 알려지지 않았습니다.
호흡 분석 분석을 수행 한 후 분리 된 미토콘드리아에서 ATP 연결 또는 FCCP 자극 호흡과 관련된 산소 소비의 감소는 설명 할 수있는 잠재적 인 미토콘드리아 변화를 나타낼 수 있음을 고려하는 것이 중요합니다.20 : 1) 미토콘드리아 내막을 가로 지르는 기질의 제한된 수송, 2) 특정 대사 경로의 속도 제한 반응에 관여하는 효소의 활성 감소 ETC, 크렙스 사이클, 또는 β산화, 또는 3) 다른 가능한 설명들 중에서도 ETC 기능 장애.
요약하면, 여기에 설명된 업데이트된 방법은 골격근 조직으로부터 ETC 및 OXPHOS 기능을 평가하기 위한 적절하고 신뢰할 수 있는 방법을 나타낸다. 유전 적 변형이나 환경이 특정 표현형에 기여하는 미토콘드리아 호흡에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 평가하기 위해 여러 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 현저하게, 본 프로토콜은 다른 모델 유기체에 적응될 수 있거나 인간 질병과 관련된 잠재적인 미토콘드리아 기능장애를 평가하기 위해 인간 샘플과 함께 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 후안 J. 테나 (Juan J. Tena)에게 균질 기와 CABD Proteomics 및 축산 시설을 기술 지원으로 사용해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작업은 스페인 교육, 문화 및 스포츠부에서 FPU16/03264 - J.D.H..C., 협회 Française contre les Myopathies (AFM)를 통해 C.V.-G.에 대한 펠로우십 보조금 #22450, 기관 보조금 MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, CABD의 유전자 규제 및 Morphogenesis 부서) 및 BFU2017-83150-P를 J.J.C에 지원했습니다. Junta de Andalucía 보조금 P18-RT-4572, 유럽 연합의 FEDER 자금 지원 프로그램 및 스페인 과학, 혁신 및 대학부는 RED2018-102576-T를 P.N.에 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
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