Summary
Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.
Abstract
Het grootste deel van de energie van de cel wordt verkregen door de afbraak van glucose, vetzuren en aminozuren door verschillende routes die samenkomen op het mitochondriale oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS), dat wordt gereguleerd als reactie op cellulaire eisen. Het lipidemolecuul Co-enzym Q (CoQ) is essentieel in dit proces door elektronen over te brengen naar complex III in de elektronentransportketen (ETC) door constante oxidatie/ reductiecycli. Mitochondriale status en, uiteindelijk, cellulaire gezondheid kunnen worden beoordeeld door etc zuurstofverbruik te meten met behulp van respirometrische assays. Deze studies worden meestal uitgevoerd in gevestigde of primaire cellijnen die gedurende meerdere dagen zijn gekweekt. In beide gevallen kunnen de verkregen ademhalingsparameters afwijken van de normale fysiologische omstandigheden in een bepaald orgaan of weefsel.
Bovendien belemmeren de intrinsieke kenmerken van gekweekte enkelvoudige vezels geïsoleerd uit skeletspieren dit type analyse. Dit artikel presenteert een bijgewerkt en gedetailleerd protocol voor de analyse van ademhaling in vers geïsoleerde mitochondriën van muizenskeletspieren. We bieden ook oplossingen voor mogelijke problemen die zich in elke stap van het proces kunnen voordoen. De hier gepresenteerde methode kan worden toegepast om zuurstofverbruikssnelheden in verschillende transgene muismodellen te vergelijken en de mitochondriale respons op medicamenteuze behandelingen of andere factoren zoals veroudering of geslacht te bestuderen. Dit is een haalbare methode om te reageren op cruciale vragen over mitochondriaal bio-energetisch metabolisme en regulatie.
Introduction
Mitochondriën zijn de primaire metabole organellen in de cel1. Deze gespecialiseerde membraan-ingesloten organellen gebruiken voedingsmoleculen om energie te produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP) door OXPHOS. Dit proces is afhankelijk van de overdracht van elektronen van donormoleculen in een reeks redoxreacties in de ETC2. CoQ is het enige redox-actieve lipide dat endogeen wordt geproduceerd in alle celmembranen en circulerende lipoproteïnen die een antioxiderende functie vertoont3. Het is een essentieel onderdeel van de ETC, het overbrengen van elektronen van NADH-afhankelijk complex I en FADH2-afhankelijk complex II naar complex III, hoewel veel andere reductasen de reductie van mitochondriale CoQ naar ubiquinol kunnen stimuleren als een verplichte stap in meerdere cellulaire metabole routes4,5.
Gedurende het hele proces wordt een elektrochemische protongradiënt gecreëerd over het mitochondriale binnenmembraan, dat wordt omgezet in biologisch actieve energie door het ATP-synthasecomplex V2. Bijgevolg leidt mitochondriale disfunctie tot een groot aantal pathologische aandoeningen die voornamelijk weefsels met hoge energiebehoeften beïnvloeden - de hersenen, het hart en de skeletspieren6,7. Daarom is het van fundamenteel belang om methoden te ontwikkelen om mitochondriale bio-energetica nauwkeurig te analyseren om de rol ervan in gezondheid en ziekte te onderzoeken, met name in hoogenergetische weefsels zoals skeletspieren.
De Clark-type zuurstofelektrode is klassiek gebruikt in de studie van mitochondriale ademhaling8. Dit systeem is echter geleidelijk verdrongen door technologieën met een hogere resolutie, waarbij op microplaten gebaseerde zuurstofverbruikstechnologieën zoals Agilent Seahorse XF-analyzers bijzonder populair zijn9. Op het gebied van skeletspieren worden deze studies meestal uitgevoerd in gekweekte cellen, voornamelijk in de C2C12 vereeuwigde muismyoblastcellijn of primaire culturen afgeleid van satellietcellen10,11. Deze studies vatten de situatie echter niet volledig in vivo samen, vooral bij het onderzoeken van mitochondriale biologie en functie op weefselniveau bij specifieke beledigingen, niet-genetische interventies of genetische manipulaties.
Bovendien zijn ademhalingstests in cellen complexer vanwege aanvullende factoren, waaronder extra mitochondriale vraag naar ATP en assaysubstraten of signaalgebeurtenissen, die de interpretatie van de resultaten kunnen misleiden. Als alternatief is het ook mogelijk om enkele of bundels vers geïsoleerde myofibers uit spieren te gebruiken. De isolatiemethode is echter technisch uitdagend en slechts voor enkele spiertypen haalbaar. In dit geval worden voornamelijk flexor digitorum brevis (FDB) en extensor digitorum longus (EDL) spieren gebruikt10,12,13, hoewel enkele rapporten ook het gebruik van andere spiertypen beschrijven14,15.
Bio-energetische profilering van skeletspiersecties is ook gemeld16. Het grote voordeel van deze methode is dat intacte spieren kunnen worden bestudeerd (de auteurs laten zien dat het snijden door vezels de resultaten niet verstoort in vergelijking met geïsoleerde myofiberen). De mitochondriale toegang tot substraten en assayremmers is echter beperkt en dus kunnen slechts enkele parameters worden gemeten16. Ten slotte kunnen geïsoleerde mitochondriën ook worden gebruikt9,17,18,19. In dit geval verliezen mitochondriën hun cytosolische omgeving, wat hun functie kan beïnvloeden. Deze methode garandeert daarentegen toegang tot substraten en remmers, maakt de analyse van een overvloed aan monstertypen mogelijk en vereist doorgaans minder materiaal.
Dit artikel beschrijft een methode om de bio-energetische profilering van geïsoleerde mitochondriën uit de skeletspieren van muizen uit te voeren met behulp van respirometrische assays op basis van microplaten (figuur 1). In het bijzonder zijn drie protocollen gedetailleerd: de koppelingstest, CA om de mate van koppeling tussen de ETC en de OXPHOS-machines te beoordelen; de Electron Flow Assay, EFA om de activiteit van de afzonderlijke ETC-complexen te meten; en de BOX-test om mitochondriale β-oxidatiecapaciteit te bepalen. Met name zijn slechts kleine hoeveelheden monsters vereist in vergelijking met conventionele respirometriemethoden. Het hier gebruikte isolatieprotocol is aangepast ten opzichte van de elders gepubliceerde methode18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Muishuisvesting en weefselverzameling werden uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Spanje; protocollen 24/04/2018/056 en 12/03/2021/033) in overeenstemming met het Spaanse koninklijk besluit 53/2013, de Europese richtlijn 2010/63/EU en andere relevante richtlijnen.
1. Voorbereiding van voorraden, buffers en reagentia voor de ademhalingstests
- Bereid de volgende stamoplossingen voor, die maandenlang bij de aangegeven temperatuur kunnen worden bewaard. Gebruik in alle gevallen ultrapuur H2O.
- Los fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tabletten op in H2O (1 tablet per 200 ml H2O) om 1x PBS te bereiden. Autoclaaf de oplossing en bewaar deze bij kamertemperatuur (RT).
- Los 2 g NaOH-pellets op in 50 ml H2O om 1 M NaOH te bereiden.
- Bereid 0,1 M, 1 M, 5 M en 10 M KOH-voorraden voor op pH-kalibratie.
- Voeg 14,612 g EDTA toe aan 70 ml H2O. Voeg NaOH-pellets toe totdat de pH 8,0 bereikt, zodat EDTA volledig oplost. Voeg H2O quantum satis (QS) toe aan 100 ml. Autoclaaf de resulterende 0,5 M EDTA (pH 8) oplossing en bewaar deze bij RT.
- Voeg 19 g EGTA toe aan 70 ml H2O. Voeg NaOH-pellets toe totdat de pH 8,0 bereikt om de EGTA volledig te laten oplossen. Voeg H2O QS toe aan 100 ml. Autoclaaf de resulterende 0,5 M EGTA (pH 8) oplossing en bewaar deze bij RT.
- Voeg 2 ml 0,5 M EDTA toe aan 98 ml PBS. Bewaar de resulterende 10 mM EDTA/PBS-oplossing bij RT.
- Los 5,958 g HEPES op in 40 ml H2O. Stel de pH in op 7,2 met KOH en QS op 50 ml met H2O. Filtreer de resulterende HEPES-buffer van 0,5 M door een gaas van 0,45 μm en bewaar deze bij RT.
- Los 3,402 g KH2PO4 op in maximaal 50 ml H2O. Filtreer de resulterende KH2PO4-oplossing van 0,5 M door een gaas van 0,45 μm en bewaar deze bij RT.
- Los 9,521 g watervrij MgCl2 op in maximaal 100 ml H2O. Autoclaaf de resulterende 1 M MgCl2-oplossing en bewaar deze bij RT.
OPMERKING: Aangezien dit een exotherme reactie is, ga voorzichtig te werk en los de MgCl2 op ijs op.
- Bereid substraat- en inhibitorstockoplossingen voor (zie tabel 1). Aliquot en bewaar ze bij -20 °C. Vermijd vries-dooicycli. Bereid bij wijze van uitzondering pyruvinezuur altijd direct voor gebruik.
- Bereid in ultrapuur H2O: 0,5 M succinaat, 0,5 M pyruvinezuur, 0,5 M appelzuur, 100 mM ADP, 1 M ascorbinezuur en 50 mM N,N,N′,N′-tetramethyl-para-fenyleen-diamine (TMPD) (beschermen tegen licht).
- Bereid in 100% dimethylsulfoxide (DMSO): 50 mM palmitoyl-L-carnitine, 4 mM rotenon, 20 mM carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyfenylhydrazon (FCCP), 4 mM oligomycine en 5 mM Antimycine A.
OPMERKING: Overschrijd de uiteindelijke DMSO-concentratie van 0,1% in de microplaatputten niet. Bereid daarom sterk geconcentreerde voorraadoplossingen voor om onder deze limiet te blijven.
- Bereid de buffers voor mitochondriale isolatie en eiwitkwantificering vers voor op de dag van het experiment. Gebruik in alle gevallen ultrapuur H2O en bewaar alle buffers op ijs tenzij anders vermeld.
OPMERKING: Om tijd te besparen, kunnen alle reagentia worden gewogen en bewaard in de juiste containers (bijv. 15 ml buizen) op de juiste temperatuur op de vorige dag.- Om 10% vrije vetzuren (FFA) BSA te bereiden, lost u 150 mg FFA BSA grondig op in 1,5 ml H2O door inversie/ draaiwiel. Draai geen vortex om schuimvorming te voorkomen.
- Om 1x Bradford-reagens te bereiden, verdunt u de 5x commerciële voorraadoplossing met H2O en bewaart u deze in het donker bij RT.
- Om 8x Mitochondria Buffer (MB) te bereiden, lost u 4,112 g sucrose en 763 mg HEPES op in 15 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2, voeg 1,6 ml 10% FFA BSA en QS toe aan 20 ml met H2O.
- Om 20 ml isolatiebuffer 1 (IB1) (4 ml per monster) te bereiden, lost u 400 μl 0,5 M EDTA, 784 mg D-mannitol en 2,5 ml 8x MB op in 15 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2 en QS met H2O.
- Om 5 ml isolatiebuffer 2 (IB2) (500 μL gebruikt per monster) te bereiden, lost u 30 μL 0,5 M EGTA, 196 mg D-mannitol en 625 μL van 8x MB op in 4 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2 en QS met H2O.
- Om 5 ml Resuspension Buffer (RB) (200 μL gebruikt per monster) te bereiden, lost u 120 mg sucrose, 191,3 mg D-mannitol, 50 μL 0,5 M HEPES en 10 μL 0,5 M EGTA op in 4 ml H2O. Stel de pH in op 7,2 en QS met H2O.
- Om 2x Mitochondrial Assay Solution-1 (MAS-1) te bereiden, los je 1,199 g sucrose, 2,8 g mannitol, 1 ml 0,5 M KH2PO4, 250 μl 1 M MgCl2, 200 μL 0,5 M HEPES en 100 μL 0,5 M EGTA in 20 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2 en QS op 25 ml met H2O. Blijf kort in ijs. Houd het gedurende langere perioden op 4 °C om neerslag te voorkomen.
- Om 1x Coupling Assay medium (CAM) voor te bereiden, bereidt u twee verschillende MAS-1-gebaseerde buffers voor: 1) CAM + BSA voor de CA-assay zelf en 2) CAM-BSA voor het bereiden van de assayremmers. Houd de verhouding pyruvaat:malaat altijd op 10:1.
OPMERKING: Aangezien BSA de injectiepoorten kan verstoppen, verdunt u de remmers in BSA-vrije CAM.- Om CAM +BSA te bereiden, verdun 300 μL 0,5 M pyruvic acid, 30 μL 0,5 M appelzuur en 7,5 ml 2x MAS-1 in 6 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2. Voeg 300 μL van 10% FFA BSA en QS toe aan 15 ml met H2O.
- Om CAM-BSA te bereiden, verdun 120 μL 0,5 M pyruvinezuur, 12 μL 0,5 M appelzuur en 3 ml 2x MAS-1 in 2 ml H2O. Stel de pH in op 7,2 en QS op 6 ml met H2O.
- Om 1x Electron Flow Assay medium (EFAM) te bereiden, bereidt u zowel BSA-bevattende als BSA-vrije EFAM-buffers voor.
- Om EFAM+BSA te bereiden, verdunt u 300 μL 0,5 M pyruvinezuur, 60 μL 0,5 M appelzuur, 3 μL 20 mM FCCP en 7,5 ml 2x MAS-1 in 6 ml H2O. Stel de pH in op 7,2. Voeg 300 μL van 10% FFA BSA en QS toe aan 15 ml met H2O.
- Om EFAM-BSA te bereiden, verdun 120 μL 0,5 M pyruvic acid, 24 μL van 0,5 M appelzuur, 1,2 μL van 20 mM FCCP en 3 ml van 2x MAS-1 in 2 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2 en QS op 6 ml met H2O.
- Om 1x β-oxidatiemedium (BOXM) te bereiden, bereidt u BSA-bevattende en BSA-vrije BOXM-oplossingen.
- Om BOXM+BSA te bereiden, verdunt u 12 μL 50 mM palmitoyl-L-carnitine, 30 μL 0,5 M appelzuur en 7,5 ml 2x MAS-1 in 7 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2. Voeg 300 μL van 10% FFA BSA en QS toe aan 15 ml met H2O.
- Om BOXM-BSA te bereiden, verdun 4,8 μL van 50 mM palmitoyl-L-carnitine, 12 μL van 0,5 M appelzuur en 3 ml van 2x MAS-1 in 2 ml H2O. Pas de pH aan op 7,2 en QS op 6 ml met H2O.
2. Spierdissectie, homogenisatie en mitochondriale isolatie
- Leg alle materialen en buffers op ijs. Zorg ervoor dat alle materialen ijskoud zijn tijdens de hele procedure om mitochondriën te beschermen tegen schade.
- Plaats drie bekers van 50 ml per monster op ijs en voeg de volgende oplossingen toe: 10 ml PBS in bekerglas 1, 10 ml 10 mM EDTA/PBS in bekerglas 2 en 4 ml IB1 in bekerglas 3.
- Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie. Vermijd CO2-euthanasie omdat skeletspieren hypoxisch kunnen worden en ademhalingsanalyses kunnen verstoren.
- Spuit de rechter achterpoot met 70% ethanol om te voorkomen dat de vacht afstoot en plak de ledemaat op de kurkstlesectieplaat. Plak ook de linker voorpoot af.
- Maak een incisie met een steriel wegwerp scalpel door de huid van knie tot teen.
- Pak de huid vast met een getande tang op enkelhoogte en knip deze met een fijne schaar om de enkel.
- Maak de huid weg van de onderliggende musculatuur met een pincet met fijne punt in de ene hand en trek het omhoog met een getande tang in de andere hand.
- Ontleed alle skeletspieren van enkel tot knie (figuur 2).
- Verwijder al het bindweefsel over de tibialis anterieure (TA) spier om spierextractie te vergemakkelijken met behulp van een fijn pincet en een schaar.
- Zoek de vier distale pezen van de EDL-spier en snijd ze dicht bij hun inserties in de tenen. Lokaliseer de TA-distale pees en snijd deze dicht bij het inbrengen, altijd onder de enkel.
- Trek voorzichtig de TA- en EDL-pezen boven de enkel om de losse eindjes vrij te maken.
- Pak de losse eindjes van de pezen vast en verlicht de spieren weg van de rest van de spieren en botten door ze omhoog te trekken. Gebruik een fijn pincet of schaar om het proces te vergemakkelijken. Ga voorzichtig te werk om myofiber-contractie te voorkomen.
- Snijd de proximale pees van de EDL en de TA-spier zo dicht mogelijk bij de knieschijf.
- Draai de muis ondersteboven om verder te gaan met gastrocnemius (GA) en soleus spierextractie.
- Pak de pocket gevormd tussen de biceps femoris en de GA vast met een getande tang. Gebruik een fijne schaar om deze spieren te scheiden en de proximale GA-pees te visualiseren.
- Pak de achillespees vast met een fijne tang en knip deze voorzichtig af met een fijne schaar. Laat de GA- en soleusspieren los van het onderliggende bot door ze via hun pezen omhoog te trekken. Snijd de proximale GA-pees door en bevrijd deze samen met de onderliggende soleus.
- Ontleed voorzichtig de resterende spieren van pees tot pees volgens dezelfde procedure totdat alleen botten overblijven.
- Pin de muis opnieuw vast in de beginpositie om de quadricepsspier te ontleden.
- Gooi het vetweefsel over de quadriceps aan de proximale zijde met behulp van een getande tang en een fijne schaar.
- Plaats een fijn pincet tussen de quadriceps en het dijbeen en beweeg ze in beide richtingen langs de dijbeenas om de spier van het bot te scheiden.
- Pak de distale quadriceps spierpezen vast met een getande tang en knip de pees met een fijne schaar zo dicht mogelijk bij de knieschijf.
- Trek de quadriceps omhoog en bevrijd deze bij het proximaal inbrengen met een fijne schaar.
- Herhaal stap 4-8 uit dit gedeelte met de linkerachterpoot.
- Spoel eerst alle spieren in Bekerglas 1 en daarna in Bekerglas 2.
- Breng alle spieren over naar Beaker 3 en hak alle spieren fijn met een scherpe schaar op ijs.
- Breng de suspensie over naar een C Tube (paars deksel) en houd deze altijd in ijs.
- Sluit de C Tube goed af en bevestig deze ondersteboven aan de sleeve van de homogenisator. Zorg ervoor dat het monstermateriaal zich in het gebied van de rotator/stator bevindt. Selecteer het programma van 1 minuut genaamd m_mito_tissue_01.
- Verdeel het homogenaat in twee voorgestreepte microcentrifugebuizen van 2 ml en centrifugeer bij 700 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C in een tafelcentrifuge.
- Breng de supernatanten over naar nieuwe 2 ml voorgechilleerde buizen, waarbij vet en niet-gehomogeniseerd weefsel zorgvuldig worden vermeden. Bewaar de pellets bij -80 °C voor de bepaling van de fragmentatiezuiverheid (fractie N) (figuur 3).
- Centrifugeer de supernatanten bij 10.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Breng de supernatanten over naar nieuwe 2 ml voorgechilleerde buizen en label ze als Supernatant Number 1 (SN1). Bewaar ze bij -80 °C voor de bepaling van de fragmentatiezuiverheid (figuur 3).
- Resuspend en combineer beide pellets in een totaal volume van 500 μL IB2 in ijs.
- Centrifugeer bij 10.500 × g gedurende 10 min bij 4°C.
- Breng het supernatant over naar een nieuwe voorgechilleerde buis van 2 ml en label het als Supernatant Number 2 (SN2). Bewaar het bij -80 °C voor de bepaling van de fragmentatiezuiverheid (figuur 3).
- Resuspend de uiteindelijke mitochondriale pellet in 200 μL RB. Zet snel 10 μL opzij voor eiwitkwantificering en voeg onmiddellijk 10 μL 10% FFA BSA toe aan de resterende mitochondriale suspensie om schade te voorkomen.
- Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test.
- Bereid voor de standaardcurve 30 μL seriële verdunningen van de bekende concentratie van een eiwit in RB-buffer. Gebruik bijvoorbeeld 1 mg / ml, 0,5 mg / ml, 0, 25 mg / ml, 0, 125 mg / ml, 0, 0, 0625 mg / ml en 0 mg / ml BSA.
- Bereid 1:3 en 1:6 seriële verdunningen van de mitochondriale monsters in RB-buffer.
- In een 96-well platbodemplaat laad je eerst 2,5 μL monster/standaard per put. Voeg vervolgens 10 μL van 1 M NaOH toe aan elk monster en ten slotte 200 μL 1x Bradford-reagens. Meng goed en vermijd luchtbellen. Controleer visueel of de kleur van de monsters zich binnen de kalibratielijn bevindt. Voer de analyse altijd in drievoud uit.
- Incubeer de platen gedurende 5 minuten bij RT in het donker en lees de absorptie bij 595 nm in een microplaatspectrofotometer.
- Bereken de standaardcurve door de absorptiewaarden (y-as) uit te zetten ten opzichte van de overeenkomstige eiwitconcentratie van de verdunningen die zijn bereid in stap 22.1 in deze sectie (x-as).
- Bereken de totale hoeveelheid eiwit in de mitochondriale monsters door extrapolatie met de standaardcurve.
3. Bereiding van de respirometrische assays op basis van microplaten
- Hydrateer de respirometrische assaysensor ten minste 12 uur voor het experiment met 1 ml kalibratiebuffer per put. Incubeer bij 37 °C (geen CO2).
OPMERKING: Gehydrateerde sensoren kunnen tot 72 uur worden gebruikt. De cartridge moet tijdens deze stap voorzichtig worden behandeld: als er iets de sensoren raakt, kan de meetgevoeligheid worden beïnvloed. - Prechill de preparatieve centrifuge met de zwenkbak microplaatrotor en de bijbehorende microplaatadapters bij 4 °C.
- Schakel de computer in, open de analysesoftware en selecteer het gewenste protocol.
OPMERKING: Er wordt een klik gehoord wanneer de software verbinding maakt met het zuurstofverbruiksmeetinstrument. De verwarmingssensor moet groen zijn en bij 37 °C voordat het experiment begint. - Bereid de remmende oplossingen uit de in rubriek 1, stap 2, aangegeven voorraden volgens de uit te voeren test. Bereid voldoende volume voor elke oplossing. Zie tabel 1 en tabel 2 ter referentie.
- Voeg het juiste volume van elke inhibitor toe in elke poort, plaats de patroon in het meetinstrument voor zuurstofverbruik en start de kalibratie.
OPMERKING: Het toevoegen van een remmer aan de cartridge en het plaatsen van de cartridge in het instrument duurt 15-20 minuten. Zorg ervoor dat de juiste cartridgeonderdelen zijn geïntroduceerd. Het deksel van de cartridge en de hydrobooster kunnen worden weggegooid terwijl de sensorcartridge en de plaats van het hulpprogramma nodig zijn. - Centrifugeer de geconcentreerde mitochondriale suspensie van sectie 2, stap 21 bij 10.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Resuspend de mitochondriale pellet in 100 μL van 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA of 1x BOXM+BSA, afhankelijk van het uit te voeren protocol.
- Verdun het geconcentreerde mitochondriale monster verder tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 μg/μl in het overeenkomstige testmedium.
- Zaad 50 μL van de suspensie (totaal 10 μg eiwit) per put in een vooraf geprechilleerde 24-well microplaat op ijs. Voeg geen mitochondriën toe in de achtergrondcorrectieputten; voeg alleen het bijbehorende testmedium toe. Bewaar de resterende mitochondriale suspensie bij -80 °C voor bepaling van de fragmentatiezuiverheid (figuur 3).
- Draai de microplaat in de voorgekookte preparatieve centrifuge op 2.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Contragewicht om dienovereenkomstig te balanceren.
- Verwarm het resterende testmedium bij 37 °C tijdens het centrifugeren van microplaten.
- Laat na het centrifugeren de microplaat 5 minuten op de bank liggen om in evenwicht te brengen. Voeg 450 μL warm testmedium toe voor een eindvolume van 500 μL per put bij RT. Doe dit langzaam en voorzichtig en voeg het medium toe aan de wand van de putten om te voorkomen dat mitochondriën worden losgemaakt.
- Plaats de microplaat onmiddellijk in het zuurstofverbruiksmeetinstrument zonder deksel en start het protocol (tabel 3). Zorg ervoor dat de eerste stap een incubatie van 10 minuten is om de microplaat te laten opwarmen.
- Zodra het experiment is voltooid, verwijdert u de cartridge en microplaat, schakelt u het instrument uit en start u de analyse.
4. Analyse van de resultaten
- Voer in het geval van de CA- en BOX-assays de volgende analyses uit:
- Registreer niet-mitochondriale O2-consumptie , wat overeenkomt met het gemiddelde van de waarden verkregen na Antimycine A en rotenoninjectie.
OPMERKING: Antimycine A en rotenon zijn respectievelijk complexe III- en I-remmers. - Bereken de basale ademhaling door het niet-kathododrische O2-verbruik af te trekken van de basale waarden (meetpunten 1 en 2).
- Trek het niet-isochondriële O2-verbruik af van de waarden na de injectie van het complexe V-substraat ADP (injectie A) om mitochondriale toestand III te bepalen.
- Trek de niet-mitochondriale O2-consumptie af van de ademhalingswaarden na injectie van de complexe V-remmer oligomycine (injectie B) om mitochondriale toestand IVo te verkrijgen.
- Bereken mitochondriale toestand IIIu door het niet-mitochondriale O2-verbruik af te trekken van de ademhaling na FCCP-injectie (injectie C).
OPMERKING: FCCP is een krachtige mitochondriale oxidatieve fosforyleringsontkoppeling. ATP-synthese wordt in zijn aanwezigheid omzeild en de ETC bereikt maximale activiteit. - Trek basale ademhalingswaarden af van de mitochondriale toestand IIIu-waarden om mitochondriale reservecapaciteit te verkrijgen, wat de capaciteit is om extra ATP te genereren in geval van verhoogde energievraag.
- Deel mitochondriale toestand IIIu door toestand IVo-waarden om de respiratoire controleverhouding (RCR) te verkrijgen.
OPMERKING: Negatieve of null RCR-waarden geven aan dat mitochondriale koppeling wordt beïnvloed.
- Registreer niet-mitochondriale O2-consumptie , wat overeenkomt met het gemiddelde van de waarden verkregen na Antimycine A en rotenoninjectie.
- Voer met betrekking tot EFA de volgende berekeningen uit:
- Verkrijg restactiviteit door de gemiddelde waarde na rotenon en Antimycine A-injectie (injecties A en C) te berekenen.
- Bereken complexe I tot IV (CI-CIV) activiteit door restactiviteit af te trekken van de basale waarden (meetpunten 1 en 2).
- Trek restactiviteit af van de waarden na injectie van het CII-substraatsuccinaat (injectie B) om CII-CIII-CIV-activiteit te verkrijgen.
- Bereken de CIV-activiteit door de restactiviteit af te trekken van de waarden die worden verkregen na injectie van de cytochroom c-reducerende middelen, ascorbinezuur en TMPD (injectie D).
- Geef alle resultaten weer met behulp van staafdiagrammen, zoals in figuur 4, om de juiste conclusies te trekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier gepresenteerde protocol maakt de in vivo analyse van mitochondriale ademhaling mogelijk door de isolatie van mitochondriën van de skeletspieren van muizen. Een overzicht van de methode is weergegeven in figuur 1. Na het ontleden van skeletspieren uit de achterpoten (figuur 2), worden weefsels gehomogeniseerd en mitochondriën gezuiverd, onder isotone omstandigheden, door seriële centrifubaties. De zuiverheid van de verschillende fracties verkregen tijdens het isolatieproces kan worden geanalyseerd door western blot met behulp van antilichamen tegen verschillende organelmarkers. Figuur 3A toont het algemene eiwitprofiel van de verschillende fracties met verschillende eiwitpopulaties in de geïsoleerde fracties.
Figuur 3B laat zien dat alle mitochondriale inhoud zich in de mitochondriale fractie bevindt, zoals blijkt uit de sterke signalen voor markers van de buitenste (VDAC en TOMM20) en binnenste (TIMM23) mitochondriale membranen, en zelfs voor nucleoïde-geassocieerde eiwitten (mtTFA). Alle kernen en cytoskelet (β-actine) zijn aanwezig in fractie N, die kernen en ongestoord materiaal vertegenwoordigt (figuur 3C). Bovendien blijven de meeste endoplasmatisch reticulum (ER) (Calnexine), plasmamembraan (Na+/K+-ATPaseα1) of cytoplasmamarkers (LDHA, HSP70 of AKT) in de SN1- of SN2-fracties, wat de hoge zuiverheid benadrukt die tijdens isolatie wordt verkregen (figuur 3C). Er zijn echter enkele sporen van ER-besmetting in de mitochondriale fractie, mogelijk als gevolg van de nabijheid van deze organellen. Gezien de resultaten die in latere respiratoire assays worden verkregen, levert de hier beschreven isolatieprocedure zeer zuivere, levensvatbare mitochondriale preparaten op.
Zowel CA- als BOX-assays maken de berekening van verschillende mitochondriale toestanden mogelijk in de aanwezigheid van verschillende substraten die specifieke metabole routes stimuleren. In het bijzonder worden deze testen uitgevoerd in de aanwezigheid van pyruvinezuur of palmitoyl-L-carnitinechloride. Pyruvinezuur is een substraat van de Krebs-cyclus; appelzuur is een Krebs-cyclusintermediair en een NADH-inductor, terwijl palmitoyl-L-carnitine een substraat is van de vetzuur- β-oxidatieroute. (Figuur 4A,B). In beide assays is de eerste toestand die kan worden gemeten de basale ademhalingssnelheid, die mitochondriale ademhaling vertegenwoordigt in aanwezigheid van de substraten die aanvankelijk aan het testmedium zijn toegevoegd. Vervolgens wordt mitochondriale toestand III bereikt, die ATP-productie uit ADP en anorganisch fosfaat vertegenwoordigt, waarbij de maximale ademhaling in een gekoppelde toestand wordt weergegeven. Er is dus een toename van het zuurstofverbruik na ADP-optelling, zoals waargenomen in figuur 4A,B.
Verder duidt State IVo op het protonlek geassocieerd met de remming van ATP-synthase door oligomycine, wat leidt tot een afname van de ademhaling, zoals waargenomen in de CA- en BOX-grafieken (figuur 4A, B). De toevoeging van FCCP leidt tot State IIIu, die de maximale ademhalingscapaciteit laat zien die mitochondriën kunnen vertonen in een ontkoppelde toestand wanneer het zuurstofverbruik zijn hoogste niveau bereikt in deze assays. Om al deze toestanden te berekenen, is het fundamenteel om eerst de niet-mitochondriële ademhaling te bepalen, die wordt verkregen aan het einde van de test wanneer Antimycine A en rotenon worden geïnjecteerd om oxidatieve ademhaling te remmen. Zoals te zien is in figuur 4A,B, moeten deze waarden altijd onder de basale ademhaling liggen en zeer dicht bij nul in het geval van assays met geïsoleerde mitochondriën zoals deze hier beschreven assays. Ten slotte moet de RCR-parameter worden berekend om de mitochondriale integriteit te beoordelen. Het weerspiegelt of mitochondriën kunnen reageren op ADP door ATP met een hoge snelheid te produceren met een laag protonenlek. De gemiddelde RCR-waarden gevonden in de CA- en BOX-assays waren respectievelijk 5,78 ± 1,03 en 3,47 ± 0,42 (figuur 4A,B), die in overeenstemming zijn met optimale RCR's die eerder zijn gerapporteerd21,22,23,24.
Daarnaast onderzoekt de EFA de activiteit van de ETC-complexen afzonderlijk of in combinatie door de injectie van specifieke substraten en remmers (figuur 4C). CI-CIV-activiteit vertegenwoordigt mitochondriale ademhaling op basis van pyruvaat- en malaatsubstraten wanneer er geen complexen worden geremd; in dit geval gaan de meeste elektronen door CI. Omdat rotenon een specifieke remmer van CI is, wordt CI na toevoeging geblokkeerd, wat resulteert in een verminderd zuurstofverbruik (figuur 4C). CII-CIII-CIV-activiteit toont ademhaling wanneer alleen CI wordt geblokkeerd en CII wordt geactiveerd: succinaat, geïnjecteerd via poort B, is een specifiek substraat van complex II (succinaatdehydrogenase). Cii wordt dus verminderd, waardoor de elektronenstroom van CII naar CIV wordt geïnitieerd, terwijl CI nog steeds wordt geremd door de vorige rotenoninjectie, waardoor het zuurstofverbruik toeneemt (figuur 4C). Antimycine A-toevoeging remt CIII, blokkeert de elektronenstroom door de ETC en vermindert het zuurstofverbruik. Verder wordt de CIV-activiteit bepaald wanneer deze wordt gestimuleerd door cytochroom C-oxidatie na te zijn verminderd door de toevoeging van ascorbinezuur / TMPD; Figuur 4C laat zien dat CIV-activering een toename van het zuurstofverbruik veroorzaakt. Ten slotte verwijst restactiviteit naar zuurstofverbruik wanneer de oxidatieve fosforyleringsketen wordt geïnactiveerd na toevoeging van rotenon en antimycine A. Deze waarde vormt de achtergrond voor de berekening van de activiteit van de complexen zoals aangegeven in protocolstappen 2.2-2.4 in paragraaf 4.
Figuur 1: Schematische visualisatie van de methode. Afkortingen: OCR = zuurstofverbruik; ADP = adenosinedifosfaat; OL = oligomycine; FCCP = carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon; AntA = Antimycine A; Rot = rotenon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Dissectie en isolatie van muriene skeletspieren uit achterpoten voor mitochondriale ademhalingsanalyses. (A) De rechter achterpoot werd uitgerekt en geïmmobiliseerd met tape. (B) Er werd een incisie gemaakt door de huid van naast de enkel, waardoor proximaal tot aan de knie werd gestopt. Bindweefsel boven de TA werd zorgvuldig verwijderd. EDL (C) en TA (D) pezen werden dicht bij hun inserties gesneden. De TA-pees werd omhoog getrokken om de spier weg te halen van de onderliggende musculatuur en bot. Vervolgens werd de TA proximaal gesneden, dicht bij de ventrale top van het scheenbeen. Op dezelfde manier werd de EDL-spier weggesneden en werd de proximale pees zorgvuldig aan de zijkant van de knie doorgesneden. (F) Rechterachterpoot na TA- en EDL-dissectie. (G) In de achterste achterlimb werd de achillespees gesneden om GA- en soleusspieren te ontleden. (H) GA en soleus werden zorgvuldig bevrijd van het scheenbeen. (I) De resterende spieren werden verzameld van enkel tot knie totdat alleen het kuitbeen en de tibiale botten overbleven. (J) Hindlimb na dissectie. (K) Quadriceps werd ontleed. (L) Alle skeletspieren verzameld voor posterieure mitochondriale isolatie. Het proces werd uitgevoerd voor beide achterpoten. Afkortingen: TA = tibialis anterior; EDL = extensor digitorum longus; GA = gastrocnemius. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Zuiverheid van het fragmentatieproces. (A) Algemeen eiwitprofiel gekleurd met Coomassie-blauw. (B) Mitochondriaal eiwitzuiverheidsprofiel. (C) Niet-kathododrische markers. De verschillende fracties verkregen tijdens mitochondriale isolatie werden geladen en geïncubeerd met antilichamen tegen verschillende eiwitten in specifieke subcellulaire fracties. Afkortingen: fractie N = niet-gehomogeniseerd weefsel en kernen; SN1 = supernatant nummer 1: cytoplasma + organellen; SN2 = supernatant nummer 2: cytoplasma + organellen; VDAC = spanningsafhankelijk anionkanaal; TOMM20 = translocase van het buitenste mitochondriale membraan 20; mtTFA = mitochondriale transcriptiefactor A; TIMM23 = translocase van het binnenste mitochondriale membraan 23; LDHA = lactaatdehydrogenase A; HSP70 = heat shock eiwit 70; ER = endoplasmatisch reticulum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten. Bio-energetische profilering van mitochondriën geïsoleerd uit de achterste spieren van een 13 maanden oude mannelijke wilde type C57BL / 6N muis. De injectiepunten van de verschillende substraten en remmers worden in elke test aangegeven. De prestaties van de ETC- en OXPHOS-machines kunnen worden geanalyseerd met behulp van pyruvaat en malaat, of palmitoyl-L-carnitine en malaat als substraten in respectievelijk de Koppelingstest (A) of β-oxidatie van FA-assays (B). (C) De elektronenstroomtest maakt de studie van individuele mitochondriale complexen mogelijk in aanwezigheid van pyruvaat, malaat en FCCP; Per put werd 10 μg mitochondriën geplateerd. Resultaten worden weergegeven volgens de middelste puntweergaveoptie om resultaten in een geaggregeerde vorm te visualiseren. Dit in tegenstelling tot de point-to-point-optie, die de visualisatie van de 9 opeenvolgende metingen mogelijk zou maken die gewoonlijk tijdens elke meetstap worden uitgevoerd. Het type visualisatie kan worden gewijzigd na het voltooien van de test onder de kinetische lijndiagramopties in de analysesoftware. Afkortingen: FA = vetzuren; OCR = zuurstofverbruik; ADP = adenosinedifosfaat; FCCP = carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon; RCR = respiratoire controleverhouding; EFA = elektronenstroomtest; BOX = β-oxidatie van FA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Koppelingstest | ||||||
| Haven | Inhibitor | [Voorraad] | [Injectiepoort] | [Definitief] | Recept | |
| Inhib | CAM-BSA | |||||
| Een | ADP | 100m | 50 meter | 5 meter | 650 μl | 650 μl |
| B | Oligomycine | 4 meter | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | Fccp | 20 meter | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimycine A // Rotenon | 5m // 4mm | 40 μM // 50 μM | 4 μM // 5 μM | 13,52 μL // 21,12 μL | 1655,36 μL |
| Elektronenstroomtest | ||||||
| Haven | Inhibitor | [Voorraad] | [Injectiepoort] | [Definitief] | Recept | |
| Inhib | EFAM-BSA | |||||
| Een | Rotenon | 4 meter | 50 μM | 5 μM | 16,25 μL | 1283,7 μL |
| B | Succinaat | 500 meter | 100m | 10 meter | 286 μl | 1144 μL |
| C | Antimycine A | 5mm | 4 μM | 4 μM | 12,48 μL | 1547,5 μL |
| D | Ascorbaat // TMPD | 1 m // 50 mm | 100m // 1mm | 10m // 100 μm | 169 μL // 33,8 μL | 1487,2 μL |
| β-oxidatietest | ||||||
| Haven | Inhibitor | [Voorraad] | [Injectiepoort] | [Definitief] | Recept | |
| Inhib | BOX-BSA | |||||
| Een | ADP | 100m | 40 meter | 4 meter | 520 μL | 780 μL |
| B | Oligomycine | 4 meter | 31,6 μM | 3,16 μM | 11,3 μL | 1418,7 μL |
| C | Fccp | 20 meter | 60 μM | 6 μM | 4,68 μL | 1555,32 μL |
| D | Antimycine A // Rotenon | 5m // 4mm | 40 μM // 20 μM | 4 μM // 2 μM | 13,52 μL // 8,45 μL | 1668 μl |
Tabel 1: Bereiding van inhibitoroplossingen voor de verschillende assays. De kolom [Voorraad] toont de concentraties van de stamoplossingen van de verbinding die in de kolom Inhibitor zijn aangegeven. [Injectiepoort] verwijst naar de concentratie van de inhibitoroplossingen die in de verschillende poorten van de patroon moeten worden geladen, terwijl de kolom [Laatste] de uiteindelijke concentratie van de remmers in de putjes aangeeft. Ten slotte worden in de kolommen Recept de volumes voorraadremmeroplossingen en BSA-vrije media opgegeven die moeten worden gemengd om de oplossingen voor te bereiden die in de injectiepoorten moeten worden geladen. Afkortingen: ADP = adenosinedifosfaat; FCCP = carbonylcyanide-p-trifluormethoxyfenylhydrazon; TMPD = N,N,N′,N′-tetramethyl-para-fenyleen-diamine; Inhib = remmer; BSA = runderserumalbumine; CAM-BSA = BSA-vrij koppelingstestmedium; EFAM-BSA = BSA-vrij elektronenstroomtestmedium; BOX-BSA = BSA-vrij β-oxidatie van vetzuurtestmedium.
| Haven | Geïnjecteerd volume | Voorraad voorbereid (26 putten) |
| Een | 50 μL | 1300 μL |
| B | 55 μL | 1430 μL |
| C | 60 μl | 1560 μL |
| D | 65 μl | 1690 μl |
Tabel 2: Berekening van de injectievolumes.
| Actie | Tijd (minuten) | Herhaling | Haven |
| Kalibreren | 15-20 | ||
| Wachten | 10 | ||
| Mix + Wachten | 1 + 3 | × 2 | |
| Mengen | 1 | ||
| Meten + Mixen | 3 + 1 | × 2 | |
| Injecteren | Een | ||
| Mengen | 1 | ||
| Meten | 3 | ||
| Mengen | 1 | ||
| Injecteren | B | ||
| Mengen | 1 | ||
| Meten | 3 | ||
| Mengen | 1 | ||
| Injecteren | C | ||
| Mengen | 1 | ||
| Meten | 3 | ||
| Mengen | 1 | ||
| Injecteren | D | ||
| Mix + Meten | 1 + 3 | × 2 |
Tabel 3: Protocolinstellingen voor de verschillende assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle methoden die worden gebruikt om mitochondriale ademhaling te bestuderen, hebben hun beperkingen; daarom is het cruciaal om de methode te kiezen die het beste past bij een specifieke experimentele vraag. Dit werk biedt een bijgewerkt en gedetailleerd protocol om mitochondriën te isoleren van de skeletspieren van muizen om verschillende ademhalingstests uit te voeren om de mitochondriale functie te onderzoeken. Inderdaad, de studie van mitochondriale bio-energetica in geïsoleerde mitochondriën met behulp van microplaatgebaseerde technologieën is waardevol om weefselspecifieke ademhaling te bestuderen in termen van reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en complexiteit. Verder verleent het gebruik van geïsoleerde mitochondriën controle over de beschikbaarheid van substraat, waardoor het begrip van de onderliggende biologische processen wordt vergemakkelijkt. Een ander positief aspect van het gebruik van geïsoleerde mitochondriën is dat het mogelijk is om State III te bestuderen omdat de ATP die na ADP-injectie wordt gegenereerd, niet opnieuw wordt omgezet in nieuwe ADP omdat de meeste transmembraan ATPasen verloren gaan. Bovendien wordt in de hier beschreven testen oligomycine toegevoegd om potentiële niet-specifieke ATP-synthese20 te blokkeren.
Voor dit protocol moeten een aantal belangrijke overwegingen worden benadrukt. Ten eerste zijn geïsoleerde mitochondriën extreem gevoelig en moeten ze met zorg worden behandeld. Het hoge gehalte aan sucrose en mannitol in de gebruikte buffers zorgt voor de optimale osmotische omstandigheden om de geïsoleerde mitochondriën te beschermen tegen schade. Niettemin moet de duur van de test tot een minimum worden beperkt om de mitochondriale levensvatbaarheid te behouden en loslating van de microplaat na het zaaien te voorkomen. Aangezien protocolstappen, zoals de bereiding van assaymedia en substraat- en inhibitoroplossingen, of het laden van de inhibitoren in de respirometrische assaycartridge, tijdrovend zijn, moet elke stap dus perfect worden gecoördineerd. Verder, in tegenstelling tot andere methoden op basis van enzymatische vergisting21,24 en mortel- en stamperhomogenisatie17,19,21,23,24, vertrouwt de hier beschreven methode op het gebruik van een geautomatiseerd homogenisator, waardoor snelle en efficiënte monsterhomogenisatie mogelijk is. Belangrijk is dat mitochondriale suspensies minder gevoelig zijn als ze sterk geconcentreerd zijn. Bereid dus alleen verdunningen voor onmiddellijk voordat u ze gebruikt. Ten slotte is het essentieel om snel te werken tijdens de respirometrische assay zelf. Meestal worden bij het analyseren van cellen in cultuur in deze testen drie opeenvolgende meetstappen uitgevoerd na de injectie van substraten of remmers, wat resulteert in protocollen die zich uitstrekken tussen 40 en 50 min., Om de levensvatbaarheid van de geïsoleerde mitochondriën gedurende de hele procedure te garanderen, wordt het aantal meetstappen vaak tot een minimum beperkt vanwege hun kwetsbaarheid19, 23,25, waardoor de tijd die nodig is om de respirometrische analyse te voltooien wordt teruggebracht tot ~20 min. De protocollen die in dit werk worden beschreven (tabel 3) volgen deze trend, hoewel andere eerder gepubliceerde methoden efficiënte OCR-profielen rapporteren met langere en meer standaard meetstappen26.
Als bijvoorbeeld twee opeenvolgende assays op dezelfde dag met dezelfde set monsters worden uitgevoerd, bereid dan alle reagentia voor op de tweede assay tijdens de eerste, behalve de mitochondriale verdunningen: alleen verdunnen, zaaien en spin mitochondriën onmiddellijk voordat de tweede test wordt gestart, terwijl het instrument wordt gekalibreerd. Zodra het experiment is voltooid, moet de RCR-parameter (rubriek 4, stap 1.7) worden berekend om de kwaliteit van de gebruikte mitochondriale preparaten te beoordelen. Gewoonlijk geven RCR-waarden tussen 3,5 en 5 aan dat mitochondriale integriteit optimaal is en vertonen ze functioneel gekoppelde oxidatieve ademhaling25. Assays met lagere RCR-waarden moeten worden weggegooid omdat de mitochondriale integriteit tijdens de isolatie werd aangetast. Overweeg in deze gevallen om de mitochondriale pellet tweemaal te wassen (sectie 2, stappen 19-21)22, zoals eerder gemeld.
Ten tweede is het handhaven van de juiste pH gedurende de hele procedure van cruciaal belang voor het verkrijgen van succesvolle resultaten. Zorg ervoor dat de pH van alle oplossingen is ingesteld zoals aangegeven, dat wil zeggen pH 7,2, en dat de pH altijd wordt aangepast met KOH, tenzij anders vermeld. Met name de pH van BSA-bevattende buffers mag niet direct met de pH-meter worden gemeten, omdat BSA de sonde kan beschadigen. Pas dus de pH in de bijbehorende buffers aan voordat u BSA toevoegt. Om veranderingen in de pH als gevolg van BSA-toevoeging te voorkomen, gebruikt u altijd FFA BSA. Verder kunnen sommige ultrazuivere H2O-batches zuur zijn, dus het gebruik van commercieel gezuiverde, pH 7 H2O wordt aanbevolen. Bovendien moet ervoor worden gezorgd dat de pH-meter correct is gekalibreerd en dat dit het juiste model is om de pH van de voor te bereiden chemicaliën te meten.
Ten derde is het van cruciaal belang om de monsterverzamelingsstap voor eiwitmeting van de uiteindelijke mitochondriale suspensie (sectie 2, stap 21) correct uit te voeren om mitochondriale vernietiging te voorkomen. Resuspend de pellet snel maar grondig, verzamel een aliquot en voeg FFA BSA toe aan de resterende suspensie om de osmotische balans te behouden en de mitochondriën te beschermen tegen schade. Als FFA BSA al aanwezig was in de resuspensiebuffer, en dus tijdens eiwitkwantificering, zou het hoge eiwitgehalte de kwantificeringsresultaten verstoren. Dit is de reden waarom FFA BSA moet worden toegevoegd na het opzij zetten van een aliquot voor kwantificering.
Ten vierde is deze methode zeer veelzijdig en kan deze worden aangepast aan de behoeften van de experimentator. Als het bestudeerde diermodel bijvoorbeeld wordt gekenmerkt door verminderde spiermassa (bijvoorbeeld sarcopenische muizen), kunnen extra spieren de mitochondriale opbrengst verhogen. Hoewel een volwassen wilde mannelijke C57BL / 6N-muis in dit werk werd gebruikt, kunnen dieren van elk geslacht, leeftijd of genetische achtergrond, evenals specifieke spiertypen, in plaats daarvan worden gebruikt.
Ten vijfde kunnen ademhalingswaarden verschillen tussen experimenten als gevolg van kleine variaties in de samenstelling van buffers en reagentia, die elke keer opnieuw moeten worden bereid. Leeftijd, geslacht, genetische achtergrond of omgevingscondities kunnen ook een diepgaande invloed hebben op de resultaten. Een succesvol experiment zou echter een toename van het zuurstofverbruik moeten opleveren na de injectie van complexe substraten zoals ADP en succinaat, afnames na de injectie van remmers zoals oligomycine of rotenon, en duidelijke stijgingen wanneer de krachtige uncoupler FCCP wordt toegevoegd. Om een hoge technische variabiliteit te voorkomen, moet u bovendien zorgen voor een grondige resuspensie van mitochondriale pellets om homogene suspensies te verkrijgen voordat ze in de microplaat worden gezaaid.
Ten zesde, als de basale ademhalingswaarden laag zijn, overweeg dan om een titratie-experiment uit te voeren om de hoeveelheid eiwit voor zaaien aan te passen. Ten slotte, omdat dit werk een methode biedt om ruwe mitochondriale extracten te verkrijgen, wordt een bepaalde graad van onzuiverheid geassocieerd met andere organellen, voornamelijk ER, verwacht. Een agressiever fragmentatieproces om deze onzuiverheden te verwijderen zou schadelijk zijn voor de mitochondriale levensvatbaarheid, waardoor de uitvoering van respiratoire assays wordt belemmerd. Als zuiverheid een probleem is, vooral als het niet consistent is tussen monsters, kunnen testresultaten worden genormaliseerd ten opzichte van mitochondriale zuiverheid na het uitvoeren van western blots tegen verschillende organelmarkers (figuur 3). Voor zover wij weten, is dit de eerste methode die zorgen over mitochondriale zuiverheid in ruwe extracten benadrukt. Meestal wordt in andere protocollen voor respirometrische assays met geïsoleerde mitochondriën dezelfde hoeveelheid eiwitextract in de putten gezaaid om monsters te vergelijken, ervan uitgaande dat in alle gevallen dezelfde hoeveelheid mitochondriën wordt gebruikt. Dit is een redelijke veronderstelling gezien het feit dat isolatie in alle monsters parallel wordt uitgevoerd. De genetische of milieu-achtergrond van de onderzochte monsters kan echter leiden tot aanzienlijke verschillen in de zuiverheid van de mitochondriale extracten. Als een bepaalde genetische mutatie bijvoorbeeld een verhoogde ontwikkeling van cytoplasmatisch ER veroorzaakt, kunnen ruwe mitochondriale extracten van deze dieren een groter dan verwacht ER-gehalte bevatten en bijgevolg een lager dan verwacht mitochondriaal eiwit. Dus zelfs als dezelfde hoeveelheid totaal eiwit uit controle- en mutantenmonsters in de microplaat wordt gezaaid, zou het zuurstofverbruik van de mutanten worden onderschat. Daarom wordt aanbevolen dat de zuiverheid van de extracten van alle bestudeerde omstandigheden moet worden bepaald. Als de waarden vergelijkbaar zijn, is er geen normalisatie nodig. Als de zuiverheidswaarden tussen monsters echter aanzienlijk verschillen van de statistische fout die de experimentator bereid is te accepteren, moeten ze worden gebruikt om de resultaten van het zuurstofverbruik te normaliseren.
Het huidige protocol heeft enkele beperkingen. Van belang is dat deze methode is geoptimaliseerd voor skeletspierweefsel geïsoleerd van muizen. Aanpassingen kunnen nodig zijn als verschillende weefsels of skeletspieren van verschillende soorten worden gebruikt. Bovendien, wanneer analyses worden uitgevoerd op geïsoleerde mitochondriën, gaat de normale cellulaire micro-omgeving verloren als gevolg van de afwezigheid van cellulaire context en de andere organellen die kunnen interageren met mitochondriën. Dit kan leiden tot resultaten die enigszins afwijken van fysiologische omstandigheden. Ten slotte, als de mitochondriën worden gecentrifugeerd, hechten ze zich aan de bodem van de putten. Hoewel volledig noodzakelijk, zijn de mogelijke effecten van centrifugeren op hun normale toestand onbekend.
Het is belangrijk om er rekening mee te houden dat, na het uitvoeren van de respirometrische assayanalyses, een vermindering van het zuurstofverbruik geassocieerd met ATP-gebonden of FCCP-gestimuleerde ademhaling in geïsoleerde mitochondriën kan wijzen op potentiële mitochondriale veranderingen die kunnen worden verklaard door20: 1) beperkt transport van substraten over het binnenste mitochondriale membraan, 2) verminderde activiteit van de enzymen die betrokken zijn bij de snelheidsbeperkende reacties van specifieke metabole routes zoals de ETC, Krebs-cyclus, of β-oxidatie, of 3) verminderde ETC-functie, naast andere mogelijke verklaringen.
Samenvattend is de hier beschreven bijgewerkte methode een adequate en betrouwbare manier om de ETC- en OXPHOS-functie van skeletspierweefsel te beoordelen. Het heeft meerdere toepassingen om te evalueren hoe genetische modificaties of de omgeving de mitochondriale ademhaling kunnen beïnvloeden die bijdraagt aan een specifiek fenotype. Opmerkelijk is dat het huidige protocol kan worden aangepast aan andere modelorganismen of kan worden gebruikt met menselijke monsters om potentiële mitochondriale disfuncties geassocieerd met menselijke ziekten te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben om bekend te maken.
Acknowledgments
We willen Juan J. Tena bedanken voor het gebruik van de homogenisator en de CABD Proteomics en Veeteelt faciliteiten voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Spaanse ministerie van Onderwijs, Cultuur en Sport via fellowship FPU16/03264 aan J.D.H.C., de Association Française contre les Myopathies (AFM) via fellowship grant #22450 aan C.V.-G., een Institutional Grant MDM-2016-0687 (Maria de Maeztu Excellence Unit, Department of Gene Regulation and Morphogenesis bij CABD) en BFU2017-83150-P aan J.J.C. De Junta de Andalucía-subsidie P18-RT-4572, het FEDER-financieringsprogramma van de Europese Unie en het Spaanse ministerie van Wetenschap, Innovatie en Universiteiten verlenen RED2018-102576-T aan P.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A5285 | Stock at -20 °C |
| AKT antibody | Cell Signaling Technology | C67E7 | Rabbit (Host species) |
| anti-Goat HRP | Sigma | 401504 | Rabbit (Host species) |
| anti-Mouse HRP | Cell Signaling | #7076 | Horse (Host species) |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | Stock at -20 °C |
| anti-Rabbit HRP | Cell Signaling | #7074 | Goat (Host species) |
| Ascorbic acid | Sigma | A5960 | Stock at RT |
| Bactin antibody | Sigma | MBS4-48085 | Goat (Host species) |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve |
| BSA, fraction V, Fatty Acid-Free | Calbiochem | 126575 | Stock at 4 °C |
| C tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Purple lid |
| Calnexin antibody | ThermoFisher | MA3-027 | Mouse (Host species) |
| D-mannitol | Sigma | M4125 | Stock at RT |
| EDTA | BDH | 280254D | Stock at 4 °C |
| EGTA | Sigma | E-4378 | Stock at RT |
| FCCP | Sigma | C2920 | Stock at -20 °C |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Homogenizer |
| HEPES | Sigma | H3375 | Stock at RT |
| HSP70 antibody | Proteintech | 10995-1-AP | Rabbit (Host species) |
| LDH-A antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC27230 | Goat (Host species) |
| Magnesium chloride | ChemCruz | sc-255260A | Stock at RT |
| Malic acid | Sigma | P1645 | Stock at RT |
| Microplate spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH | POLARstar OMEGA S/N 415-0292 | Stock at RT |
| Milli-Q water | Millipore system | F7HA17757A | Ultrapure water |
| mtTFA antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC23588 | Goat (Host species) |
| Na+/K+-ATPase α1 antibody | Novus Biologicals | NB300-14755 | Mouse (Host species) |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | Stock at -20 °C |
| Palmitoyl-L-carnitine | Sigma | P1645 | Stock at -20 °C |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | 1x stock at RT |
| Potassium dihydrogen phosphate | ChemCruz | sc-203211 | Stock at RT |
| Potassium hydroxide | Sigma | 60377 | Stock at RT |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | Stock at 4 °C |
| Rotenone | Sigma | R8875 | Stock at -20 °C |
| Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer | Agilent Technologies | 420179 | XFe24 model |
| Seahorse XFe24 FluxPak mini | Agilent Technologies | 102342-100 | The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution |
| Succinate | Sigma | S7626 | Stock at RT |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Stock at RT |
| TIMM23 antibody | Abcam | ab230253 | Rabbit (Host species) |
| TMPD | Sigma | T7394 | Stock at -20 °C |
| TOMM20 antibody | Abcam | ab56783 | Mouse (Host species) |
| VDAC antibody | Abcam | ab15895 | Rabbit (Host species) |
References
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).
- Alberts, B., et al. The mitochondrion. Molecular Biology of the Cell, 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
- Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. Metabolism and function of coenzyme Q. Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).
- Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency. Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).
- Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology. The FEBS Journal. , (2021).
- Gorman, G. S., et al.
- Villalba, J. M., Navas, P. Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes. Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).
- Li, Z., Graham, B. H. Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode. Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS One. 6 (7), 21746 (2011).
- Pala, F., et al. Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis. Journal of Cell Science. 131 (14), 212977 (2018).
- Shintaku, J., et al. MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
- Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).
- Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).
- Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
- Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).
- Shintaku, J., Guttridge, D. C. Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry. Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350 (2015).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Das, K. C., Muniyappa, H. Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2. Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).
- Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Methods. 3 (2), 42 (2016).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research. Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).
- Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Sperling, J. A., et al. Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies. Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).
- Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216 (2015).
