Isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris pour les tests respirométriques

Summary

Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour l’isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris et l’analyse ultérieure de la respiration par taux de consommation d’oxygène (OCR) à l’aide de tests respirométriques sur microplaques. Ce pipeline peut être appliqué pour étudier les effets de multiples interventions environnementales ou génétiques sur le métabolisme mitochondrial.

Abstract

La majeure partie de l’énergie de la cellule est obtenue par la dégradation du glucose, des acides gras et des acides aminés par différentes voies qui convergent vers le système de phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS), qui est régulé en réponse aux demandes cellulaires. La molécule lipidique Coenzyme Q (CoQ) est essentielle dans ce processus en transférant des électrons au complexe III dans la chaîne de transport d’électrons (ETC) par des cycles constants d’oxydation /réduction. L’état des mitochondries et, en fin de compte, la santé cellulaire peuvent être évalués en mesurant la consommation d’oxygène ETC à l’aide de tests respirométriques. Ces études sont généralement réalisées dans des lignées cellulaires établies ou primaires qui ont été cultivées pendant plusieurs jours. Dans les deux cas, les paramètres respiratoires obtenus peuvent s’être écartés des conditions physiologiques normales dans un organe ou un tissu donné.

De plus, les caractéristiques intrinsèques des fibres simples cultivées isolées du muscle squelettique entravent ce type d’analyse. Cet article présente un protocole mis à jour et détaillé pour l’analyse de la respiration dans les mitochondries fraîchement isolées du muscle squelettique de la souris. Nous fournissons également des solutions aux problèmes potentiels qui pourraient survenir à n’importe quelle étape du processus. La méthode présentée ici pourrait être appliquée pour comparer les taux de consommation d’oxygène dans divers modèles murins transgéniques et étudier la réponse mitochondriale aux traitements médicamenteux ou à d’autres facteurs tels que le vieillissement ou le sexe. C’est une méthode réalisable pour répondre à des questions cruciales sur le métabolisme et la régulation de la bioénergétique mitochondriale.

Introduction

Les mitochondries sont les principaux organites métaboliques de la ^cellule1. Ces organites spécialisés enfermés dans la membrane utilisent des molécules nutritives pour produire de l’énergie sous forme d’adénosine triphosphate (ATP) par OXPHOS. Ce processus repose sur le transfert d’électrons à partir de molécules donneuses dans une série de réactions redox dans l’ETC2. La CoQ est le seul lipide redox-actif qui est produit de manière endogène dans toutes les membranes cellulaires et les lipoprotéines circulantes qui présente une fonction ^{antioxydante3}. C’est un composant essentiel de l’ETC, transférant des électrons du complexe I dépendant du NADH et du complexe II dépendant du _FADH2 au complexe III, bien que de nombreuses autres réductases puissent conduire à la réduction de la CoQ mitochondriale en ubiquinol comme une étape obligatoire dans de multiples voies métaboliques ^{cellulaires4,5}.

Tout au long du processus, un gradient électrochimique de protons est créé à travers la membrane interne mitochondriale, qui est transformée en énergie biologiquement active par le complexe ATP synthase ^V2. Par conséquent, le dysfonctionnement mitochondrial conduit à une myriade de conditions pathologiques affectant principalement les tissus ayant des besoins énergétiques élevés - le cerveau, le cœur et les muscles ^{squelettiques6,7}. Par conséquent, il est fondamental de développer des méthodes pour analyser avec précision la bioénergétique mitochondriale afin d’étudier son rôle dans la santé et la maladie, en particulier dans les tissus très énergétiques tels que les muscles squelettiques.

L’électrode d’oxygène de type Clark a été classiquement utilisée dans l’étude de la respiration ^{mitochondriale8}. Cependant, ce système a été progressivement remplacé par des technologies à plus haute résolution, les technologies de consommation d’oxygène à base de microplaques telles que les analyseurs Agilent Seahorse XF étant particulièrement ^populaires9. Dans le domaine des muscles squelettiques, ces études sont généralement menées dans des cellules cultivées, principalement dans la lignée cellulaire de myoblastes de souris immortalisés C2C12 ou dans des cultures primaires dérivées de cellules ^{satellites10,11}. Cependant, ces études ne récapitulent pas complètement la situation in vivo, en particulier lorsqu’il s’agit d’étudier la biologie mitochondriale et la fonction au niveau tissulaire lors d’insultes spécifiques, d’interventions non génétiques ou de manipulations génétiques.

En outre, les tests respiratoires dans les cellules sont plus complexes en raison de facteurs supplémentaires, notamment la demande extra-mitochondriale d’ATP et de substrats de dosage ou d’événements de signalisation, ce qui pourrait induire en erreur l’interprétation des résultats. Alternativement, il est également possible d’utiliser des myofibres simples ou des faisceaux de myofibres fraîchement isolés provenant des muscles. Cependant, la méthode d’isolement est techniquement difficile et n’est réalisable que pour quelques types de muscles. Dans ce cas, les muscles fléchisseurs digitorum brevis (FDB) et extenseurs digitorum longus (EDL) sont principalement utilisés10,12,13, bien que quelques rapports décrivent également l’utilisation d’autres types de ^muscles14,15.

Un profilage bioénergétique des sections musculaires squelettiques a également été ^rapporté16. Le principal avantage de cette méthode est que les muscles intacts peuvent être étudiés (les auteurs montrent que le tranchage à travers les fibres ne perturbe pas les résultats par rapport aux myofibres isolés). Cependant, l’accès mitochondrial aux substrats et aux inhibiteurs de dosage est limité et, par conséquent, seuls quelques paramètres peuvent être ^mesurés16. Enfin, des mitochondries isolées peuvent également être ^{utilisées9,17,18,19}. Dans ce cas, les mitochondries perdent leur environnement cytosolique, ce qui pourrait affecter leur fonction. En revanche, cette méthode garantit l’accès aux substrats et aux inhibiteurs, permet l’analyse d’une pléthore de types d’échantillons et nécessite généralement moins de matériel.

Cet article décrit une méthode pour effectuer le profilage bioénergétique de mitochondries isolées du muscle squelettique de souris à l’aide de tests respirométriques sur microplaques (Figure 1). En particulier, trois protocoles sont détaillés: le test de couplage, CA pour évaluer le degré de couplage entre l’ETC et la machine OXPHOS; le test de flux d’électrons, EFA pour mesurer l’activité des complexes ETC individuels; et le test BOX pour déterminer la capacité mitochondriale de β-oxydation. Notamment, seules de petites quantités d’échantillons sont nécessaires par rapport aux méthodes de respirométrie conventionnelles. Le protocole d’isolement utilisé ici a été modifié par rapport à la méthode publiée ^ailleurs18.

Protocol

Le logement des souris et la collecte de tissus ont été effectués à l’aide de protocoles approuvés par le Comité d’éthique de l’Universidad Pablo de Olavide (Séville, Espagne; protocoles 24/04/2018/056 et 12/03/2021/033) conformément au décret royal espagnol 53/2013, à la directive européenne 2010/63/UE et à d’autres directives pertinentes.

1. Préparation des stocks, tampons et réactifs pour les tests respiratoires

1. Préparez les solutions mères suivantes, qui peuvent être conservées à la température indiquée pendant des mois. Utilisez du _H2O ultrapur dans tous les cas.
   1. Dissoudre les comprimés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans _H2O (1 comprimé pour 200 mL de _H2O) pour préparer 1x PBS. Autoclavez la solution et conservez-la à température ambiante (RT).
   2. Dissoudre 2 g de granulés de NaOH dans 50 mL de _H2O pour préparer 1 M de NaOH.
   3. Préparer des stocks KOH de 0,1 M, 1 M, 5 M et 10 M pour l’étalonnage du pH.
   4. Ajouter 14,612 g d’EDTA à 70 mL de _H2O. Ajouter les granulés de NaOH jusqu’à ce que le pH atteigne 8,0 pour que l’EDTA se dissout complètement. Ajouter _H2O quantum satis (QS) à 100 mL. Autoclavez la solution d’EDTA (pH 8) de 0,5 M résultante et stockez-la à TA.
   5. Ajouter 19 g d’EGTA à 70 mL de _H2O. Ajouter les granulés de NaOH jusqu’à ce que le pH atteigne 8,0 pour permettre à l’EGTA de se dissoudre complètement. Ajouter _H2O QS à 100 mL. Autoclavez la solution EGTA (pH 8) de 0,5 M résultante et stockez-la à TA.
   6. Ajouter 2 mL de 0,5 M EDTA à 98 mL de PBS. Stockez la solution EDTA/PBS de 10 mM résultante à LA RT.
   7. Dissoudre 5,958 g de HEPES dans 40 mL _H2O. Ajuster le pH à 7,2 avec KOH et QS à 50 mL avec _H2O. Filtrer le tampon HEPES de 0,5 M résultant à travers un maillage de 0,45 μm et le stocker à RT.
   8. Dissoudre 3,402 g de _KH2PO4 dans jusqu’à 50 mL de _H2O. Filtrer la solution de _KH2PO4 de 0,5 M obtenue à travers un maillage de 0,45 μm et la stocker à TA.
   9. Dissoudre 9,521 g de _MgCl2 anhydre dans jusqu’à 100 mL de _H2O. Autoclaver la solution 1 M _MgCl2 résultante et la stocker au RT.
      REMARQUE: Comme il s’agit d’une réaction exothermique, procédez avec prudence et dissolvez le _MgCl2 sur la glace.
2. Préparer des solutions mères de substrat et d’inhibiteur (voir tableau 1). Aliquote et conservez-les à -20 °C. Évitez les cycles de gel-dégel. À titre exceptionnel, préparez toujours de l’acide pyruvique immédiatement avant utilisation.
   1. Préparer dans du _H2O ultrapur : 0,5 M de succinate, 0,5 M d’acide pyruvique, 0,5 M d’acide malique, 100 mM d’ADP, 1 M d’acide ascorbique et 50 mM de N,N,N′,N′-tétraméthyl-para-phénylène-diamine (TMPD) (à l’abri de la lumière).
   2. Préparer dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) à 100 % : 50 mM de palmitoyl-L-carnitine, 4 mM de roténone, 20 mM de cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP), 4 mM d’oligomycine et 5 mM d’antimycine A.
      REMARQUE : Ne pas dépasser 0,1 % de concentration finale de DMSO dans les puits de microplaques. Par conséquent, préparez des solutions de stock hautement concentrées pour rester en dessous de cette limite.
3. Préparez les tampons pour l’isolement des mitochondries et la quantification des protéines fraîchement le jour de l’expérience. Utilisez du _H2O ultrapur dans tous les cas et gardez tous les tampons sur la glace, sauf indication contraire.
   REMARQUE: Pour gagner du temps, tous les réactifs peuvent être pesés et conservés dans les récipients appropriés (par exemple, des tubes de 15 ml) à la bonne température la veille.
   1. Pour préparer 10% d’acides gras libres (FFA) BSA, dissoudre soigneusement 150 mg de FFA BSA dans 1,5 mL de _H2O par inversion/ roue rotative. Ne pas vortex pour éviter la mousse.
   2. Pour préparer 1x réactif Bradford, diluez la solution mère commerciale 5x avec _H2O et gardez-la dans l’obscurité à RT.
   3. Pour préparer 8x mitochondria buffer (MB), dissoudre 4,112 g de saccharose et 763 mg de HEPES dans 15 mL de _H2O. Ajuster le pH à 7,2, ajouter 1,6 mL de 10% de FFA BSA et QS à 20 mL avec _H2O.
   4. Pour préparer 20 mL de tampon d’isolement 1 (IB1) (4 mL utilisés par échantillon), dissoudre 400 μL de 0,5 M d’EDTA, 784 mg de D-mannitol et 2,5 mL de 8x MB dans 15 mL de _H2O. Ajuster le pH à 7,2 et le QS avec _H2O.
   5. Pour préparer 5 mL de tampon d’isolement 2 (IB2) (500 μL utilisés par échantillon), dissoudre 30 μL de 0,5 M d’EGTA, 196 mg de D-mannitol et 625 μL de 8x MB dans 4 mL de _H2O. Ajuster le pH à 7,2 et le QS avec _H2O.
   6. Pour préparer 5 mL de tampon de remise en suspension (RB) (200 μL utilisés par échantillon), dissoudre 120 mg de saccharose, 191,3 mg de D-mannitol, 50 μL de 0,5 M HEPES et 10 μL de 0,5 M EGTA dans 4 mL de _H2O. Ajuster le pH à 7,2 et QS avec _H2O.
   7. Pour préparer 2x Solution d’essai mitochondrial-1 (MAS-1), dissoudre 1,199 g de saccharose, 2,8 g de mannitol, 1 mL de 0,5 M _KH2PO4, 250 μL de 1 M _MgCl2, 200 μL de 0,5 M HEPES et 100 μL de 0,5 M EGTA dans 20 mL de _H2O. Ajuster le pH à 7,2 et le QS à 25 mL avec _H2O. Conserver dans la glace pendant de courtes périodes. Pendant de plus longues périodes, maintenez-le à 4 °C pour éviter les précipitations.
   8. Pour préparer 1x milieu de dosage de couplage (CAM), préparez deux tampons différents à base de MAS-1 : 1) CAM+ BSA pour le test CA approprié, et 2) CAM-BSA pour la préparation des inhibiteurs du test. Maintenez toujours le rapport pyruvate:malate à 10:1.
      REMARQUE: Comme le BSA peut obstruer les orifices d’injection, diluez les inhibiteurs dans un CAM sans BSA.
      1. Pour préparer CAM+BSA, diluer 300 μL d’acide pyruvique de 0,5 M, 30 μL d’acide malique de 0,5 M et 7,5 mL de 2x MAS-1 dans 6 mL de _H2O. Ajuster le pH à 7,2. Ajouter 300 μL de 10 % de FFA BSA et QS à 15 mL avec _H2O.
      2. Pour préparer cam-BSA, diluer 120 μL d’acide pyruvique de 0,5 M, 12 μL d’acide malique de 0,5 M et 3 mL de 2x MAS-1 dans 2 mL de _H2O. Ajuster le pH à 7,2 et le QS à 6 mL avec _H2O.
   9. Pour préparer 1x milieu de dosage du flux d’électrons (EFAM), préparez des tampons EFAM contenant du BSA et sans BSA.
      1. Pour préparer EFAM+BSA, diluer 300 μL d’acide pyruvique de 0,5 M, 60 μL d’acide malique de 0,5 M, 3 μL de 20 mM de FCCP et 7,5 mL de 2x MAS-1 dans 6 mL de _H2O. Ajuster le pH à 7,2. Ajouter 300 μL de 10 % de FFA BSA et QS à 15 mL avec _H2O.
      2. Pour préparer l’EFAM-BSA, diluer 120 μL d’acide pyruvique de 0,5 M, 24 μL d’acide malique de 0,5 M, 1,2 μL de 20 mM de FCCP et 3 mL de 2x MAS-1 dans 2 mL de _H2O. Ajuster le pH à 7,2 et le QS à 6 mL avec _H2O.
   10. Pour préparer 1x milieu β-oxydation (BOXM), préparez des solutions BOXM contenant du BSA et sans BSA.
       1. Pour préparer BOXM+BSA, diluer 12 μL de palmitoyl-L-carnitine de 50 mM, 30 μL d’acide malique 0,5 M et 7,5 mL de 2x MAS-1 dans 7 mL de _H2O. Ajuster le pH à 7,2. Ajouter 300 μL de 10 % de FFA BSA et QS à 15 mL avec _H2O.
       2. Pour préparer BOXM-BSA, diluer 4,8 μL de palmitoyl-L-carnitine de 50 mM, 12 μL d’acide malique 0,5 M et 3 mL de 2x MAS-1 dans 2 mL de _H2O. Ajuster le pH à 7,2 et le QS à 6 mL avec _H2O.

2. Dissection musculaire, homogénéisation et isolement mitochondrial

1. Placez tous les matériaux et tampons sur la glace. Assurez-vous que tous les matériaux sont glacés pendant toute la procédure pour protéger les mitochondries contre les dommages.
2. Placer trois béchers de 50 mL par échantillon sur de la glace et ajouter les solutions suivantes : 10 mL de PBS dans le bécher 1, 10 mL de 10 mM EDTA/PBS dans le bécher 2 et 4 mL d’IB1 dans le bécher 3.
3. Euthanasier la souris par luxation cervicale. Évitez l’euthanasie au _CO2 car les muscles squelettiques pourraient devenir hypoxiques, ce qui interférerait avec les analyses respiratoires.
4. Vaporisez le membre postérieur droit avec 70% d’éthanol pour empêcher la fourrure de perdre et collez le membre sur la planche de dissection en liège. Collez également le membre antérieur gauche.
5. Faites une incision avec un scalpel jetable stérile à travers la peau du genou aux orteils.
6. Saisissez la peau avec une pince dentée au niveau de la cheville et coupez-la avec de fins ciseaux autour de la cheville.
7. Éloignez la peau de la musculature sous-jacente avec une pince à épiler fine dans une main tout en la tirant vers le haut avec une pince dentée dans l’autre main.
8. Disséquez tous les muscles squelettiques de la cheville au genou (Figure 2).
   1. Enlevez tout le tissu conjonctif sur le muscle tibialis antérieur (TA) pour faciliter l’extraction musculaire à l’aide d’une pince à épiler fine et de ciseaux.
   2. Trouvez les quatre tendons distaux du muscle EDL et coupez-les près de leurs insertions dans les orteils. Localisez le tendon distal TA et coupez-le près de son insertion, toujours en dessous de la cheville.
   3. Tirez soigneusement les tendons TA et EDL au-dessus de la cheville pour libérer les extrémités lâches.
   4. Saisissez les extrémités lâches des tendons et éloignez les muscles du reste de la musculature et des os en les tirant vers le haut. Utilisez une pince à épiler fine ou des ciseaux pour faciliter le processus. Procédez avec soin pour éviter la contraction du myofiber.
   5. Coupez le tendon proximal de l’EDL et le muscle TA le plus près possible de la rotule.
   6. Tournez la souris à l’envers pour procéder à l’extraction musculaire gastrocnémienne (GA) et soléaire.
   7. Saisissez la poche formée entre le biceps fémoris et le GA avec une pince dentée. Utilisez des ciseaux fins pour séparer ces muscles et visualiser le tendon PROXImal GA.
   8. Saisissez le tendon d’Achille avec une pince fine et coupez-le soigneusement avec de fins ciseaux. Libérez les muscles GA et soleus de l’os sous-jacent en les tirant vers le haut à travers leurs tendons. Coupez le tendon PROXImal GA en le libérant avec le soléaire sous-jacent.
   9. Disséquez soigneusement les muscles restants de tendon en tendon en suivant la même procédure jusqu’à ce qu’il ne reste que des os.
   10. Épinglez à nouveau la souris dans la position initiale pour disséquer le muscle quadriceps.
   11. Jeter le tissu adipeux sur les quadriceps du côté proximal à l’aide de pinces dentées et de ciseaux fins.
   12. Insérez une pince à épiler fine entre le quadriceps et le fémur et déplacez-les dans les deux sens le long de l’axe du fémur pour séparer le muscle de l’os.
   13. Saisissez les tendons musculaires du quadriceps distal avec une pince dentée et coupez le tendon avec de fins ciseaux aussi près que possible de la rotule.
   14. Tirez le quadriceps vers le haut et libérez-le à l’insertion proximale avec de fins ciseaux.
9. Répétez les étapes 4 à 8 de cette section avec le membre postérieur gauche.
10. Rincez d’abord tous les muscles dans le bécher 1, puis dans le bécher 2.
11. Transférez tous les muscles dans le bécher 3 et hachez finement tous les muscles avec des ciseaux tranchants sur de la glace.
12. Transférez la suspension dans un tube C (couvercle violet), en la gardant toujours dans la glace.
13. Fermez fermement le tube C et fixez-le à l’envers sur le manchon de l’homogénéisateur. Assurez-vous que le matériau de l’échantillon se trouve dans la zone du rotateur/stator. Sélectionnez le programme de 1 min appelé m_mito_tissue_01.
14. Répartir l’homogénat en deux tubes de microcentrifugation précraimentés de 2 mL et centrifuger à 700 × g pendant 10 min à 4 °C dans une centrifugeuse de table.
15. Transférer les surnageants dans de nouveaux tubes précraissés de 2 mL, en évitant soigneusement la graisse et les tissus non homogénéisés. Entreposer les granulés à -80 °C pour déterminer la pureté de la fragmentation (fraction N) (figure 3).
16. Centrifuger les surnageants à 10 500 × g pendant 10 min à 4 °C.
17. Transférez les surnageants dans de nouveaux tubes précoûtés de 2 mL et étiquetez-les comme surnageant numéro 1 (SN1). Conservez-les à -80 °C pour la détermination de la pureté de fragmentation (Figure 3).
18. Remettre en suspension et combiner les deux granulés dans un volume total de 500 μL d’IB2 dans de la glace.
19. Centrifuger à 10 500 × g pendant 10 min à 4°C.
20. Transférez le surnageant dans un nouveau tube précoûté de 2 mL et étiquetez-le comme surnageant numéro 2 (SN2). Conservez-le à -80 °C pour déterminer la pureté de la fragmentation (Figure 3).
21. Remettre en suspension la pastille mitochondriale finale dans 200 μL de RB. Réservez rapidement 10 μL pour la quantification des protéines et ajoutez immédiatement 10 μL de 10% de FFA BSA à la suspension mitochondriale restante pour éviter tout dommage.
22. Déterminer la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford.
    1. Pour la courbe standard, préparer 30 μL de dilutions en série de concentration connue d’une protéine dans un tampon RB. Par exemple, utiliser 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,125 mg/mL, 0,0625 mg/mL et 0 mg/mL de BSA.
    2. Préparer les dilutions en série 1:3 et 1:6 des échantillons mitochondriaux dans un tampon RB.
    3. Dans une plaque à fond plat de 96 puits, chargez d’abord 2,5 μL d’échantillon/étalon par puits. Ensuite, ajoutez 10 μL de 1 M NaOH à chaque échantillon et, enfin, 200 μL de 1x réactif Bradford. Bien mélanger, en évitant les bulles d’air. Vérifiez visuellement que la couleur des échantillons se trouve dans la ligne d’étalonnage. Effectuez toujours l’analyse en trois exemplaires.
    4. Incuber les plaques pendant 5 min à TA dans l’obscurité, et lire l’absorbance à 595 nm dans un spectrophotomètre à microplaques.
    5. Calculer la courbe standard en traçant les valeurs d’absorbance (axe des y) par rapport à la concentration en protéines correspondante des dilutions préparées à l’étape 22.1 de cette section (axe des x).
    6. Calculer la quantité totale de protéines dans les échantillons mitochondriaux par extrapolation avec la courbe standard.

3. Préparation des tests respirométriques à base de microplaques

1. Hydrater le capteur de dosage respirométrique au moins 12 h avant l’expérience avec 1 mL de tampon d’étalonnage par puits. Incuber à 37 °C (pas de _CO2).
   REMARQUE: Les capteurs hydratés peuvent être utilisés jusqu’à 72 h. La cartouche doit être manipulée avec précaution au cours de cette étape : si quelque chose touche les capteurs, la sensibilité de mesure pourrait être affectée.
2. Précérez la centrifugeuse préparative avec le rotor à microplaques à godet oscillant et les adaptateurs de microplaques correspondants à 4 °C.
3. Allumez l’ordinateur, ouvrez le logiciel d’analyse et sélectionnez le protocole souhaité.
   REMARQUE: Un clic se fait entendre lorsque le logiciel se connecte à l’instrument de mesure de la consommation d’oxygène. Le capteur de chauffage doit être vert et à 37 °C avant le début de l’expérience.
4. Préparer les solutions inhibitrices à partir des stocks indiqués à la rubrique 1, étape 2 en fonction du dosage à effectuer. Préparez suffisamment de volume pour chaque solution. Voir les tableaux 1 et 2 pour référence.
5. Ajoutez le volume approprié de chaque inhibiteur dans chaque port, insérez la cartouche dans l’instrument de mesure de la consommation d’oxygène et commencez l’étalonnage.
   REMARQUE: L’ajout d’inhibiteur à la cartouche et l’insertion de la cartouche dans l’instrument prennent 15 à 20 minutes. Assurez-vous que les bons composants de cartouche sont introduits. Le couvercle de la cartouche et l’amplificateur hydro peuvent être jetés alors que la cartouche de capteur et le lieu utilitaire sont nécessaires.
6. Centrifuger la suspension mitochondriale concentrée de la section 2, étape 21 à 10 500 × g pendant 10 min à 4 °C.
7. Remettre en suspension la pastille mitochondriale dans 100 μL de 1x CAM+BSA, 1x EFAM+BSA, ou 1x BOXM+BSA, selon le protocole à effectuer.
8. Diluer davantage l’échantillon mitochondrial concentré à une concentration finale de 0,2 μg/μL dans le milieu d’essai correspondant.
9. Ensemencez 50 μL de la suspension (total 10 μg de protéines) par puits dans une microplaque précélinée de 24 puits sur glace. N’ajoutez pas de mitochondries dans les puits de correction de fond; n’ajoutez que le milieu d’essai correspondant. Conserver la suspension mitochondriale restante à -80 °C pour la détermination de la pureté de la fragmentation (Figure 3).
10. Faire tourner la microplaque dans la centrifugeuse préparative précélinisée à 2 000 × g pendant 20 min à 4 °C. Contrepoids pour équilibrer en conséquence.
11. Réchauffer le milieu d’essai restant à 37 °C pendant la centrifugation des microplaques.
12. Après centrifugation, laisser la microplaque sur le banc pendant 5 min pour équilibrer. Ajouter 450 μL de milieu d’essai chaud pour un volume final de 500 μL par puits à RT. Faites-le lentement et soigneusement, en ajoutant le milieu à la paroi des puits pour éviter de détacher les mitochondries.
13. Placez immédiatement la microplaque dans l’instrument de mesure de la consommation d’oxygène sans couvercle et démarrez le protocole (tableau 3). Assurez-vous que la première étape est une incubation de 10 minutes pour permettre à la microplaque de se réchauffer.
14. Une fois l’expérience terminée, retirez la cartouche et la microplaque, éteignez l’instrument et commencez l’analyse.

4. Analyse des résultats

1. Dans le cas des tests CA et BOX, effectuer les analyses suivantes :
   1. Enregistrer la consommation _d’O2 non-mitochondriale, qui correspond à la moyenne des valeurs obtenues après injection d’antimycine A et de roténone.
      REMARQUE: L’antimycine A et la roténone sont des inhibiteurs des complexes III et I, respectivement.
   2. Calculer la respiration basale en soustrayant la consommation _d’O2 non mitochondriale des valeurs basales (points de mesure 1 et 2).
   3. Soustraire la consommation _d’O2 nonmitochondriale des valeurs après l’injection du substrat complexe V ADP (injection A) pour déterminer l’état mitochondrial III.
   4. Soustraire la consommation _d’O2 nonmitochondriale des valeurs respiratoires après l’injection de l’inhibiteur du complexe V oligomycine (injection B) pour obtenir l’état mitochondrial IVo.
   5. Calculer l’état mitochondrial IIIu en déduisant la consommation _d’O2 non mitochondriale de la respiration après l’injection de FCCP (injection C).
      REMARQUE: FCCP est un puissant découpleur de phosphorylation oxydative mitochondriale. La synthèse de l’ATP est contournée en sa présence et l’ETC atteint une activité maximale.
   6. Soustrayez les valeurs de respiration basale des valeurs iiIu de l’état mitochondrial pour obtenir une capacité de réserve mitochondriale, qui est la capacité de générer de l’ATP supplémentaire en cas d’augmentation de la demande d’énergie.
   7. Divisez l’état mitochondrial IIIu par les valeurs IVo de l’état pour obtenir le rapport de contrôle respiratoire (RCR).
      REMARQUE: Les valeurs RCR négatives ou nulles indiquent que le couplage mitochondrial est affecté.
2. En ce qui concerne l’EPT, effectuez les calculs suivants :
   1. Obtenir l’activité résiduelle en calculant la valeur moyenne après injection de roténone et d’antimycine A (injections A et C).
   2. Calculer l’activité complexe I à IV (CI-CIV) en soustrayant l’activité résiduelle des valeurs basales (points de mesure 1 et 2).
   3. Soustraire l’activité résiduelle des valeurs après injection du succinate de substrat CII (injection B) pour obtenir l’activité CII-CIII-CIV.
   4. Calculer l’activité CIV en déduisant l’activité résiduelle des valeurs obtenues après injection des agents réducteurs du cytochrome c, de l’acide ascorbique et du TMPD (injection D).
3. Représenter tous les résultats à l’aide de diagrammes à barres, comme à la figure 4, pour en extraire les conclusions appropriées.

Representative Results

Le protocole présenté ici permet l’analyse in vivo de la respiration mitochondriale par l’isolement des mitochondries du muscle squelettique de la souris. Un aperçu de la méthode est illustré à la figure 1. Après avoir disséqué les muscles squelettiques des membres postérieurs (Figure 2), les tissus sont homogénéisés et les mitochondries purifiées, dans des conditions isotoniques, par des centrifugations en série. La pureté des différentes fractions obtenues au cours du processus d’isolement peut être analysée par transfert western à l’aide d’anticorps dirigés contre différents marqueurs organites. La figure 3A montre le profil protéique général des différentes fractions montrant des populations protéiques distinctes dans les fractions isolées.

La figure 3B montre que tout le contenu mitochondrial se trouve dans la fraction mitochondriale, comme en témoignent les signaux forts pour les marqueurs des membranes mitochondriales externes (VDAC et TOMM20) et internes (TIMM23), et même pour les protéines associées aux nucléoïdes (mtTFA). Tous les noyaux et le cytosquelette (β-actine) sont présents dans la fraction N, qui représente les noyaux et le matériel non perturbé (figure 3C). De plus, la plupart des marqueurs du réticulum endoplasmique (ER) (Calnexin), de la membrane plasmique (Na⁺/K⁺-ATPaseα1) ou du cytoplasme (LDHA, HSP70 ou AKT) restent dans les fractions SN1 ou SN2, soulignant la grande pureté obtenue lors de l’isolement (Figure 3C). Cependant, il y a quelques traces de contamination par les RE dans la fraction mitochondriale, peut-être en raison de la proximité de ces organites. Compte tenu des résultats obtenus lors de tests respiratoires ultérieurs, la procédure d’isolement décrite ici donne des préparations mitochondriales très pures et viables.

Les tests CA et BOX permettent le calcul de différents états mitochondriaux en présence de plusieurs substrats qui stimulent des voies métaboliques spécifiques. Plus précisément, ces tests sont effectués en présence d’acide pyruvique ou de chlorure de palmitoyl-L-carnitine. L’acide pyruvique est un substrat du cycle de Krebs; L’acide malique est un intermédiaire du cycle de Krebs et un inducteur de NADH, tandis que la palmitoyl-L-carnitine est un substrat de la voie d’β-oxydation des acides gras. (Figure 4A,B). Dans les deux essais, le premier état qui peut être mesuré est la fréquence respiratoire basale, qui représente la respiration mitochondriale en présence des substrats initialement ajoutés au milieu d’essai. Ensuite, l’état mitochondrial III est atteint, qui représente la production d’ATP à partir d’ADP et de phosphate inorganique, montrant la respiration maximale dans un état couplé. Ainsi, il y a une augmentation de la consommation d’oxygène après l’ajout d’ADP, comme observé à la figure 4A, B.

En outre, l’état IVo indique la fuite de protons associée à l’inhibition de l’ATP synthase par l’oligomycine, ce qui entraîne une diminution de la respiration, comme observé dans les graphiques CA et BOX (Figure 4A, B). L’ajout de FCCP conduit à l’état IIIu, qui montre la capacité respiratoire maximale que les mitochondries peuvent afficher dans un état non couplé lorsque la consommation d’oxygène atteint son niveau le plus élevé dans ces tests. Pour calculer tous ces états, il est fondamental d’abord de déterminer la respiration non mitochondriale, qui est obtenue à la fin du test lorsque l’antimycine A et la roténone sont injectées pour inhiber la respiration oxydative. Comme le montre la figure 4A, B, ces valeurs doivent toujours être inférieures à la respiration basale et très proches de zéro dans le cas d’essais avec des mitochondries isolées comme ces tests décrits ici. Enfin, le paramètre RCR doit être calculé pour évaluer l’intégrité mitochondriale. Il reflète si les mitochondries peuvent réagir à l’ADP en produisant de l’ATP à un taux élevé avec une faible fuite de protons. Les valeurs moyennes de RCR trouvées dans les essais CA et BOX étaient de 5,78 ± 1,03 et 3,47 ± 0,42 (Figure 4A,B), respectivement, qui sont en accord avec les RCR optimaux signalés précédemment21,22,23,24.

De plus, l’EPT examine l’activité des complexes ETC individuellement ou en combinaison par l’injection de substrats et d’inhibiteurs spécifiques (figure 4C). L’activité CI-CIV représente la respiration mitochondriale basée sur des substrats de pyruvate et de malate lorsqu’aucun complexe n’est inhibé; dans ce cas, la plupart des électrons passent par CI. Comme la roténone est un inhibiteur spécifique de l’IC, l’IC est bloquée après son ajout, ce qui entraîne une diminution de la consommation d’oxygène (Figure 4C). L’activité CII-CIII-CIV montre la respiration lorsque seul l’IC est bloqué, et l’IC est activée : le succinate, injecté par le port B, est un substrat spécifique du complexe II (succinate déshydrogénase). Ainsi, la CII est réduite, initiant le flux d’électrons de la CII vers la CIV, tandis que la CI est toujours inhibée par l’injection précédente de roténone, produisant une augmentation de la consommation d’oxygène (Figure 4C). L’ajout d’antimycine A inhibe le CIII, bloquant le flux d’électrons à travers l’ETC et réduisant la consommation d’oxygène. De plus, l’activité du CIV est déterminée lorsqu’elle est stimulée par l’oxydation du cytochrome C après avoir été réduite par l’ajout d’acide ascorbique / TMPD; La figure 4C montre que l’activation du CIV produit une augmentation de la consommation d’oxygène. Enfin, l’activité résiduelle fait référence à la consommation d’oxygène lorsque la chaîne de phosphorylation oxydative est inactivée après l’ajout de roténone et d’antimycine A. Cette valeur établit le contexte pour le calcul de l’activité des complexes comme indiqué dans les étapes de protocole 2.2-2.4 de la section 4.

Figure 1 : Visualisation schématique de la méthode. Abréviations: OCR = taux de consommation d’oxygène; ADP = adénosine diphosphate; OL = oligomycine; FCCP = cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone; Anta = antimycine A; Pourriture = roténone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dissection et isolement des muscles squelettiques murins des membres postérieurs pour les analyses de la respiration mitochondriale. (A) Le membre postérieur droit a été étiré et immobilisé avec du ruban adhésif. (B) Une incision a été faite à travers la peau à côté de la cheville, s’arrêtant proximal au genou. Le tissu conjonctif recouvrant l’AT a été soigneusement enlevé. Les tendons EDL (C) et TA (D) ont été sectionnés près de leurs insertions. Le tendon TA a été tiré vers le haut pour éloigner le muscle de la musculature et de l’os sous-jacents. Ensuite, le TA a été coupé proximalement, près de la crête ventrale du tibia. De même, le muscle EDL a été soulagé et le tendon proximal a été méticuleusement coupé sur le côté du genou. (F) Membre postérieur droit après dissection TA et EDL. (G) Dans le membre postérieur postérieur, le tendon d’Achille a été sectionné pour disséquer les muscles GA et soleus. (H) L’AG et le soléaire ont été soigneusement libérés de l’os tibial. (I) Les muscles restants ont été recueillis de la cheville au genou jusqu’à ce qu’il ne reste que le péroné et les os du tibia. (J) Membre postérieur après dissection. (K) Le quadriceps a été disséqué. (L) Tous les muscles squelettiques collectés pour l’isolement mitochondrial postérieur. Le processus a été effectué pour les deux membres postérieurs. Abréviations : TA = tibialis antérieur ; EDL = extenseur digitorum longus; GA = gastrocnémien. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Pureté du processus de fragmentation. (A) Profil protéique général coloré avec du bleu de Coomassie. (B) Profil de pureté des protéines mitochondriales. (C) Marqueurs nonmitochondriques. Les différentes fractions obtenues lors de l’isolement des mitochondries ont été chargées et incubées avec des anticorps contre différentes protéines dans des fractions subcellulaires spécifiques. Abréviations : fraction N = tissus et noyaux non homogénéisés ; SN1 = surnageant numéro 1 : cytoplasme + organites ; SN2 = surnageant numéro 2 : cytoplasme + organites ; VDAC = canal anionique dépendant de la tension; TOMM20 = translocase de la membrane mitochondriale externe 20; mtTFA = facteur de transcription mitochondriale A; TIMM23 = translocase de la membrane mitochondriale interne 23; LDHA = lactate déshydrogénase A; HSP70 = protéine de choc thermique 70; ER = réticulum endoplasmique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Résultats représentatifs. Profilage bioénergétique de mitochondries isolées des muscles des membres postérieurs d’une souris mâle sauvage de type C57BL/6N âgée de 13 mois. Les points d’injection des différents substrats et inhibiteurs sont indiqués dans chaque essai. Les performances des machines ETC et OXPHOS peuvent être analysées à l’aide de pyruvate et de malate, ou de palmitoyl-L-carnitine et de malate comme substrats dans le test de couplage (A) ou β-oxydation des tests FA (B), respectivement. (C) Le test de flux d’électrons permet l’étude de complexes mitochondriaux individuels en présence de pyruvate, de malate et de FCCP; 10 μg de mitochondries ont été plaqués par puits. Les résultats sont affichés en suivant l’option de représentation du point médian pour visualiser les résultats sous une forme agrégée. Cela contraste avec l’option point à point, qui permettrait de visualiser les 9 mesures consécutives habituellement effectuées lors de chaque étape de mesure. Le type de visualisation peut être modifié après avoir terminé le test sous les options de graphique linéaire cinétique dans le logiciel d’analyse. Abréviations: FA = acides gras; OCR = taux de consommation d’oxygène; ADP = adénosine diphosphate; FCCP = cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone; RCR = rapport de contrôle respiratoire; EFA = Test de flux d’électrons; BOX = β-oxydation de l’AF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Essai d’accouplement
Port	Inhibiteur	[Stock]	[Port d’injection]	[Finale]	Recette
					Inhib	CAM-BSA
Un	ADP	100 mM	50 mM	5 mM	650 μL	650 μL
B	Oligomycine	4 mM	31,6 μM	3,16 μM	11,3 μL	1418,7 μL
C	Le	20 mM	60 μM	6 μM	4,68 μL	1555,32 μL
D	Antimycine A // Roténone	5 mM // 4 mM	40 μM // 50 μM	4 μM // 5 μM	13,52 μL // 21,12 μL	1655,36 μL
Test de flux d’électrons
Port	Inhibiteur	[Stock]	[Port d’injection]	[Finale]	Recette
					Inhib	EFAM-BSA
Un	Roténone	4 mM	50 μM	5 μM	16,25 μL	1283,7 μL
B	Succinate	500 mM	100 mM	10 mM	286 μL	1144 μL
C	Antimycine A	5 mM	4 μM	4 μM	12,48 μL	1547,5 μL
D	Ascorbate // TMPD	1 M // 50 mM	100 mM // 1 mM	10 mM // 100 μM	169 μL // 33,8 μL	1487,2 μL
β-oxydation
Port	Inhibiteur	[Stock]	[Port d’injection]	[Finale]	Recette
					Inhib	BOÎTE-BSA
Un	ADP	100 mM	40 mM	4 mM	520 μL	780 μL
B	Oligomycine	4 mM	31,6 μM	3,16 μM	11,3 μL	1418,7 μL
C	Le	20 mM	60 μM	6 μM	4,68 μL	1555,32 μL
D	Antimycine A // Roténone	5 mM // 4 mM	40 μM // 20 μM	4 μM // 2 μM	13,52 μL // 8,45 μL	1668 μL

Tableau 1 : Préparation de solutions inhibitrices pour les différents essais. La colonne [Stock] indique les concentrations des solutions mères du composé indiquées dans la colonne Inhibiteur . [Port d’injection] fait référence à la concentration des solutions d’inhibiteurs à charger dans les différents orifices de la cartouche, tandis que la colonne [Final] indique la concentration finale des inhibiteurs dans les puits. Enfin, les colonnes Recette spécifient les volumes de solutions inhibitrices mères et de milieux sans BSA qui doivent être mélangés pour préparer les solutions à charger dans les orifices d’injection. Abréviations: ADP = adénosine diphosphate; FCCP = cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone; TMPD = N,N,N′,N′-tétraméthyl-para-phénylène-diamine; Inhib = inhibiteur; BSA = albumine sérique bovine; CAM-BSA = milieu d’essai de couplage sans BSA; EFAM-BSA = milieu d’essai de flux d’électrons libres de BSA; BOX-BSA = β-oxydation sans BSA du milieu d’essai des acides gras.

Port	Volume injecté	Stock préparé (26 puits)
Un	50 μL	1300 μL
B	55 μL	1430 μL
C	60 μL	1560 μL
D	65 μL	1690 μL

Tableau 2 : Calcul des volumes d’injection.

Action	Temps (minutes)	Répétition	Port
Calibrer	15-20
Attendre	10
Mélanger + Attendre	1 + 3	× 2
Mélanger	1
Mesurer + Mélanger	3 + 1	× 2
Injecter			Un
Mélanger	1
Mesurer	3
Mélanger	1
Injecter			B
Mélanger	1
Mesurer	3
Mélanger	1
Injecter			C
Mélanger	1
Mesurer	3
Mélanger	1
Injecter			D
Mélanger + Mesurer	1 + 3	× 2

Tableau 3 : Paramètres de protocole pour les différents essais.

Discussion

Toutes les méthodes utilisées pour étudier la respiration mitochondriale ont leurs limites; par conséquent, il est crucial de choisir la méthode qui convient le mieux à une question expérimentale spécifique. Ce travail fournit un protocole mis à jour et détaillé pour isoler les mitochondries du muscle squelettique de la souris afin d’effectuer différents tests respiratoires pour étudier la fonction mitochondriale. En effet, l’étude de la bioénergétique mitochondriale dans les mitochondries isolées à l’aide de technologies à base de microplaques est précieuse pour étudier la respiration spécifique aux tissus en termes de reproductibilité, de fiabilité et de complexité. En outre, l’utilisation de mitochondries isolées confère un contrôle sur la disponibilité du substrat, facilitant la compréhension des processus biologiques sous-jacents. Un autre aspect positif de l’utilisation de mitochondries isolées est qu’il est possible d’étudier l’état III car l’ATP généré après l’injection d’ADP n’est pas reconverti en nouveau ADP car la plupart des ATPases transmembranaires sont perdues. De plus, dans les essais décrits ici, l’oligomycine est ajoutée pour bloquer la synthèse potentielle non spécifique de ^l’ATP20.

Plusieurs considérations importantes doivent être soulignées pour ce protocole. Tout d’abord, les mitochondries isolées sont extrêmement sensibles et doivent être manipulées avec soin. La teneur élevée en saccharose et en mannitol dans les tampons utilisés assure des conditions osmotiques optimales pour protéger les mitochondries isolées des dommages. Néanmoins, la durée du test doit être maintenue au minimum pour préserver la viabilité mitochondriale et empêcher le détachement de la microplaque une fois ensemencée. Ainsi, étant donné que les étapes du protocole, telles que la préparation des milieux d’essai et des solutions de substrat et d’inhibiteurs, ou le chargement des inhibiteurs dans la cartouche de dosage respirométrique, prennent beaucoup de temps, chaque étape doit être parfaitement coordonnée. De plus, contrairement à d’autres méthodes basées sur la digestion enzymatique21,24 et l’homogénéisation du mortier et du pilon17,19,21,23,24, la méthode décrite ici repose sur l’utilisation d’un homogénéisateur automatisé, permettant une homogénéisation rapide et efficace des échantillons. Il est important de noter que les suspensions mitochondriales sont moins sensibles si elles sont très concentrées. Ainsi, ne préparez que les dilutions immédiatement avant de les utiliser. Enfin, il est essentiel de travailler rapidement lors du test respirométrique proprement dit. Habituellement, lors de l’analyse des cellules en culture dans ces essais, trois étapes de mesure consécutives sont effectuées après l’injection de substrats ou d’inhibiteurs, ce qui donne des protocoles qui s’étendent entre 40 et 50 min., Pour assurer la viabilité des mitochondries isolées tout au long de la procédure, le nombre d’étapes de mesure est souvent réduit au minimum en raison de leur ^{vulnérabilité19, 23,25}, ce qui réduit le temps nécessaire pour effectuer l’analyse respirométrique à environ 20 min. Les protocoles décrits dans ce travail (tableau 3) suivent cette tendance, même si d’autres méthodes publiées précédemment font état de profils OCR efficaces avec des étapes de mesure plus longues et plus ^standard26.

Par exemple, si deux tests consécutifs doivent être effectués avec le même ensemble d’échantillons le même jour, préparez tous les réactifs pour le deuxième test pendant le premier, à l’exception des dilutions mitochondriales: seulement diluer, semer et spin mitochondriaire immédiatement avant de commencer le deuxième test, pendant que l’instrument est en cours d’étalonnage. Une fois l’expérience terminée, le paramètre RCR (section 4, étape 1.7) doit être calculé pour évaluer la qualité des préparations mitochondriales utilisées. Habituellement, les valeurs RCR comprises entre 3,5 et 5 indiquent que l’intégrité mitochondriale est optimale et montrent une respiration oxydative couplée ^{fonctionnelle25}. Les tests avec des valeurs RCR plus faibles doivent être rejetés car l’intégrité mitochondriale a été compromise pendant l’isolement. Dans ces cas, envisagez de laver la pastille mitochondriale deux fois (section 2, étapes 19-21)²², comme indiqué précédemment.

Deuxièmement, le maintien du pH correct tout au long de la procédure est essentiel pour obtenir des résultats positifs. Assurez-vous que le pH de toutes les solutions est réglé comme indiqué, c’est-à-dire un pH de 7,2, et que le pH est toujours ajusté avec KOH, sauf indication contraire. Notamment, le pH des tampons contenant du BSA ne doit pas être mesuré directement avec le pH-mètre, car le BSA peut endommager la sonde. Ainsi, ajustez le pH dans les tampons correspondants avant d’ajouter du BSA. Pour éviter les changements de pH dus à l’ajout de BSA, utilisez toujours FFA BSA. De plus, certains lots de _H2O ultrapurs pourraient être acides, de sorte que l’utilisation de pH 7 _H2O purifié commercialement est recommandée. En outre, il est nécessaire de s’assurer que le pH-mètre est correctement étalonné et qu’il s’agit du modèle approprié pour mesurer le pH des produits chimiques à préparer.

Troisièmement, il est crucial d’effectuer correctement l’étape de prélèvement de l’échantillon pour la mesure des protéines de la suspension mitochondriale finale (section 2, étape 21) afin d’éviter la destruction mitochondriale. Remettez la pastille rapidement mais soigneusement, collectez une aliquote et ajoutez du FFA BSA à la suspension restante pour conserver l’équilibre osmotique et protéger les mitochondries des dommages. Si le BSA FFA était déjà présent dans le tampon de remise en suspension, et donc, lors de la quantification des protéines, la teneur élevée en protéines confondrait les résultats de la quantification. C’est pourquoi FFA BSA doit être ajouté après avoir mis de côté une aliquote pour la quantification.

Quatrièmement, cette méthode est très polyvalente et peut être ajustée aux besoins de l’expérimentateur. Par exemple, si le modèle animal à l’étude est caractérisé par une réduction de la masse musculaire (p. ex., des souris sarcopéniques), des muscles supplémentaires peuvent augmenter le rendement mitochondrial. Bien qu’une souris mâle adulte de type sauvage C57BL/6N ait été utilisée dans ce travail, des animaux de tout sexe, âge ou origine génétique, ainsi que des types musculaires spécifiques, peuvent être utilisés à la place.

Cinquièmement, les valeurs respiratoires peuvent différer d’une expérience à l’autre en raison de légères variations dans la composition des tampons et des réactifs, qui doivent être préparés frais à chaque fois. L’âge, le sexe, le contexte génétique ou les conditions environnementales peuvent également avoir un impact profond sur les résultats. Cependant, une expérience réussie devrait présenter une augmentation de la consommation d’oxygène après l’injection de substrats complexes tels que l’ADP et le succinate, une diminution après l’injection d’inhibiteurs tels que l’oligomycine ou la roténone, et des augmentations marquées lorsque le puissant découpleur FCCP est ajouté. De plus, pour éviter une grande variabilité technique, assurer une remise en suspension complète des granulés mitochondriaux afin d’obtenir des suspensions homogènes avant de les ensemencer dans la microplaque.

Sixièmement, si les valeurs respiratoires basales sont faibles, envisagez d’effectuer une expérience de titrage pour ajuster la quantité de protéines pour l’ensemencement. Enfin, parce que ces travaux fournissent une méthode pour obtenir des extraits mitochondriaux bruts, une certaine qualité d’impureté associée à d’autres organites, principalement ER, est attendue. Un processus de fragmentation plus agressif pour éliminer ces impuretés serait préjudiciable à la viabilité mitochondriale, entravant la performance des tests respiratoires. Si la pureté est une préoccupation, surtout si elle n’est pas cohérente entre les échantillons, les résultats des tests peuvent être normalisés par rapport à la pureté mitochondriale après avoir exécuté des transferts de Western contre différents marqueurs organites (Figure 3). À notre connaissance, il s’agit de la première méthode qui met en évidence les préoccupations concernant la pureté mitochondriale dans les extraits bruts. Habituellement, dans d’autres protocoles pour les tests respirométriques avec des mitochondries isolées, la même quantité d’extrait de protéine est ensemencée dans les puits pour comparer les échantillons, en supposant que la même quantité de mitochondries est utilisée dans tous les cas. Il s’agit d’une hypothèse raisonnable étant donné que l’isolement est effectué en parallèle dans tous les échantillons. Cependant, le contexte génétique ou environnemental des échantillons étudiés peut entraîner des différences considérables dans la pureté des extraits mitochondriaux. Par exemple, si une mutation génétique donnée provoque un développement accru de la RE cytoplasmique, les extraits mitochondriaux bruts de ces animaux pourraient contenir une teneur en RE supérieure à celle prévue et, par conséquent, une protéine mitochondriale inférieure à celle prévue. Ainsi, même si la même quantité de protéines totales provenant d’échantillons témoins et mutants est ensemencée dans la microplaque, la consommation d’oxygène des mutants serait sous-estimée. Par conséquent, il est recommandé de déterminer la pureté des extraits de toutes les conditions étudiées. Si les valeurs sont comparables, aucune normalisation n’est nécessaire. Cependant, si les valeurs de pureté entre les échantillons diffèrent considérablement au-delà de l’erreur statistique que l’expérimentateur est prêt à accepter, elles doivent être utilisées pour normaliser les résultats de la consommation d’oxygène.

Le protocole actuel comporte certaines limites. Il est à noter que cette méthode a été optimisée pour le tissu musculaire squelettique isolé de souris. Des ajustements peuvent être nécessaires si vous utilisez différents tissus ou muscles squelettiques de différentes espèces. De plus, lorsque des analyses sont effectuées sur des mitochondries isolées, le microenvironnement cellulaire normal est perdu en raison de l’absence de contexte cellulaire et des autres organites qui pourraient interagir avec les mitochondries. Cela pourrait conduire à des résultats qui s’écartent légèrement des conditions physiologiques. Enfin, comme les mitochondries sont centrifugées, elles adhèrent au fond des puits. Bien que tout à fait nécessaire, les effets potentiels de la centrifugation sur leur état normal sont inconnus.

Il est important de prendre en compte que, après avoir effectué les analyses de dosage respirométrique, une réduction de la consommation d’oxygène associée à la respiration liée à l’ATP ou stimulée par le FCCP dans les mitochondries isolées pourrait indiquer des altérations mitochondriales potentielles qui pourraient s’expliquer ^par20: 1) un transport restreint des substrats à travers la membrane mitochondriale interne, 2) une diminution de l’activité des enzymes impliquées dans les réactions limitatives de vitesse de voies métaboliques spécifiques telles que le ETC, cycle de Krebs, ou β-oxydation, ou 3) altération de la fonction ETC, entre autres explications possibles.

En résumé, la méthode mise à jour décrite ici représente un moyen adéquat et fiable d’évaluer la fonction ETC et OXPHOS à partir du tissu musculaire squelettique. Il a de multiples applications pour évaluer comment les modifications génétiques ou l’environnement pourraient affecter la respiration mitochondriale contribuant à un phénotype spécifique. Fait remarquable, le protocole actuel pourrait être adapté à d’autres organismes modèles ou être utilisé avec des échantillons humains pour évaluer les dysfonctionnements mitochondriaux potentiels associés à la maladie humaine.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma	A5285	Stock at -20 °C
AKT antibody	Cell Signaling Technology	C67E7	Rabbit (Host species)
anti-Goat HRP	Sigma	401504	Rabbit (Host species)
anti-Mouse HRP	Cell Signaling	#7076	Horse (Host species)
Antimycin A	Sigma	A8674	Stock at -20 °C
anti-Rabbit HRP	Cell Signaling	#7074	Goat (Host species)
Ascorbic acid	Sigma	A5960	Stock at RT
Bactin antibody	Sigma	MBS4-48085	Goat (Host species)
Bio-Rad Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000002	It includes 5x Bradford reagent and BSA of known concentration for the standard curve
BSA, fraction V, Fatty Acid-Free	Calbiochem	126575	Stock at 4 °C
C tube	Miltenyi Biotec	130-093-237	Purple lid
Calnexin antibody	ThermoFisher	MA3-027	Mouse (Host species)
D-mannitol	Sigma	M4125	Stock at RT
EDTA	BDH	280254D	Stock at 4 °C
EGTA	Sigma	E-4378	Stock at RT
FCCP	Sigma	C2920	Stock at -20 °C
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	Homogenizer
HEPES	Sigma	H3375	Stock at RT
HSP70 antibody	Proteintech	10995-1-AP	Rabbit (Host species)
LDH-A antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC27230	Goat (Host species)
Magnesium chloride	ChemCruz	sc-255260A	Stock at RT
Malic acid	Sigma	P1645	Stock at RT
Microplate spectrophotometer	BMG LABTECH GmbH	POLARstar OMEGA S/N 415-0292	Stock at RT
Milli-Q water	Millipore system	F7HA17757A	Ultrapure water
mtTFA antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC23588	Goat (Host species)
Na+/K+-ATPase α1 antibody	Novus Biologicals	NB300-14755	Mouse (Host species)
Oligomycin	Sigma	O4876	Stock at -20 °C
Palmitoyl-L-carnitine	Sigma	P1645	Stock at -20 °C
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB	1x stock at RT
Potassium dihydrogen phosphate	ChemCruz	sc-203211	Stock at RT
Potassium hydroxide	Sigma	60377	Stock at RT
Pyruvic acid	Sigma	107360	Stock at 4 °C
Rotenone	Sigma	R8875	Stock at -20 °C
Seahorse XF24 mitochondrial flux analyzer	Agilent Technologies	420179	XFe24 model
Seahorse XFe24 FluxPak mini	Agilent Technologies	102342-100	The kit includes cartridges, microplates, and calibrant solution
Succinate	Sigma	S7626	Stock at RT
Sucrose	Sigma	S9378	Stock at RT
TIMM23 antibody	Abcam	ab230253	Rabbit (Host species)
TMPD	Sigma	T7394	Stock at -20 °C
TOMM20 antibody	Abcam	ab56783	Mouse (Host species)
VDAC antibody	Abcam	ab15895	Rabbit (Host species)